（内科学专业论文）粥样硬化血管能量代谢障碍的初步研究.pdf

1 ， 1 洲1 1 1 1 1 洲1 1 l l i 似。 l y 1 7 8 5 ( 。 粥样硬化血管能量代谢障碍的初步研究 摘要 目的：本实验主要观察在动脉粥样硬化的发生过程中能量负荷值的变 化，用阿托伐他汀及曲美他嗪进行干预，探讨能量代谢障碍对动脉粥样硬 化的影响。方法：1 4 0 只6 周龄雄性w i s t a r 大鼠，随机分为( 1 ) a 组( 空白 对照组) ：饲以普通饲料；( 2 ) b 组( 动脉粥样硬化组) ：饲以高脂饲料( 含 普通饲料9 2 9 ，胆固醇1 ，胆酸钠o 5 ，丙硫氧嘧啶o 6 ，猪油5 ) ， 并分别于第一、二、三天腹腔注射总量为7 0 万以g 的维生素d 注射液。 ( 3 ) c 组( 阿托伐他汀干预组) ：饲以高脂饲料，分别于第一、二、三天腹腔 注射总量为7 0 万瞻的维生素d 注射液，并每天灌胃阿托伐他汀o 5 m 只。( 4 ) d 组( 曲美他嗪干预组) ：饲以高脂饲料，分别于第一、二、三天腹 腔注射总量为7 0 万u l ( g 的维生素d 注射液，并每天灌胃曲美他嗪1 5 m 只。2 1 2 周末抽取活体大鼠心腔内血液2 1 i l l ，注入含o 5 枸橼酸钠的检测 管中，离心后行甘油三脂及总胆固醇检测。3 将大鼠主动脉从主动脉开口 处分离至腹主动脉分支处，分为三份。4 一份行h e 染色光镜下观察组织 病变情况。5 一份剪碎后用o 2 5 胰酶消化3 5 h ，制成细胞悬液，用荧光 探针d c f h d a 标记，经流式细胞仪检测活性氧含量。6 一份于冰上制成组 织匀浆，用高效液相色谱法检测能量负荷值。7 统计方法：结果采用均数 加减标准差( x 士s ) 表示，进行方差齐性检验，o n e w a y a o n v r a 方差分析， 组间均数两两比较用l s d 法，组问数据相关性分析采用直线相关分析，所 有统计工作均由统计学软件s p s s l 7 o 完成。结果：1 病理切片可见：b 组 管壁向管腔突出明显，内皮下大量泡沫细胞形成，表面纤维增生紊乱；c 组及d 组内皮下泡沫细胞形成，平滑肌细胞增生。2 b 组甘油三酯及总 固醇水平较a 组明显增高，经阿托伐他汀及曲美他嗪干预后，其水平均 意义的下降。3 活性氧含量在b 组较a 组明显升高，经药物干预后，其 平明显下降。4 胄邑量负荷值在b 组较a 组明显下降，经药物干预后，其 平明显增高。结论：1 喂养高脂饲料及注射维生素d 可成功复制动脉粥 硬化模型。2 在动脉粥样硬化模型大鼠主动脉组织中，活性氧明显升高 说明氧化应激是动脉粥样硬化形成的机制之一。3 在动脉粥样硬化模型 鼠主动脉组织中，其细胞内能量负荷明显降低，提示能量代谢障碍参与 动脉粥样硬化的形成。4 5 可托伐他汀干预后，细胞内活性氧及能量负荷 显改善，表明阿托伐他汀除降脂作用外，还能改善粥样硬化血管能量代谢 障碍。5 曲美他嗪干预后，细胞内活性氧降低，能量负荷升高，显示曲美 他嗪具有改善粥样硬化动脉能量代谢障碍的作用。 关键词：动脉粥样硬化、能量代谢障碍、活性氧、阿托伐他汀、曲美他嗪 t h e i n i t i a t o r yr e s e a r c ha b o u te n e r 科m e t a b o h s m i m p a i r m e n ti na t h e r o s c l e r o s i s a b s t r a c t ：o b j e c t i v e ：i h em a i np u 叩o s eo ft 1 1 i se x p e r i m e mi st oo b s e r v e t h ec h a n g eo fe n e 唱ec h a 略ei nt h ep r o c e s so f a t h e r o s c l e r o s i s ，a n di n t e r f e r i n g t h ep r o c e s sw i ma t o r v a s t a t i na n d t h m e t a z i d i n e ，t oi n v e s t i g a t ew h e t h e rt h e r ei sa p o s s i b l em e c h a n i s mt h a te n e 玛ec h a 玛ec a ni n d u c i n ga t h e r o s c l e r o s i s m e t h o d s ： 1 f o i t ys i x w e e k s o l dw i s t a rr a t sd i s t d b u t ei n t of o u rg r o u p sr a m d o m l y ：( 1 ) g t o u p a ( b l a c k ) ：t ob r e e dw i t he c u m e l l i cf e e d ；( 2 ) g r o u pb ( s u p e r l i p o i df e e d ) ：t ob r e e d w i t h s u p e r l i p o i df e e d ( i n c l u d e9 2 9 e c u m e n i c f e e d ，1 c h o l e s t e r 0 1 ，o 5 s o d i u mc h o l a t e ，o 6 p r o p y l t l l i o u r a c i la n d5 l a r d ) ，a n dt o i n j e c tv i t a n = l i nd w h i c hv 0 1 u m ed o s ei s7 0 0t h o u s a n d 以gi nt h ef i r s t 、s e c o n da n dt h i r dd a yi n p e d t o n e a lc a v i t y ( 3 ) g r o u pc ( a t o n ，a s t a t i n ) ：t ob r e e dw i t l ls u p e n i p o i df e e d ，a n d t oi n j e c tv i t 锄i ndw h i c hv o l u m ed o s ei s7 0 0 t h o u s a n d 以gi nt h ef i r s t 、s e c o n d a n dm i r dd a yi n p e r i t o n e a lc a v i t y a n dt oi n t r a g a s t r i ca d n l i n i s t m t i o nw i t h a t o r v a s t a t i nw h i c hd o s ei so 5 m 鲋p e ro n er a t ( 4 ) g r o u pd ( t h m e t a z i d i n e ) ：t o b r e e dw i t hs u p e 订i p o i df e e d ，a 1 1 dt oi n j e c tv i t a m i nd w h i c hv 0 1 u m ed o s ei s7 0 0 t h o u s a n du 瓜gi nt h ef i r s t 、s e c o n da n dt h i r dd a yi n p e r i t o n e a lc a v i 坝a n dt o i n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o nw i t h7 i h m e t a z i d i n e 、v h i c hd o s ei s 1 5 m g dp e ro n e r a t 2 a r e r l2w e e k s ，2 n l lb l o o dw a se x t r a c t e d 舶mc h a m b e r so fh e 抓o f a l i v er a t ，i n j e c t e di n t oap i p ew i t ho 5 s o d i u mc i t r a t e ，d e t e c t e dt h ec o n t e mo f 嘣9 1 y c e r i d ea n dt o t a lc h o l e s t e r o la r e rb e i n gc e n t r i 如g a t e d 3 t h ea o n ao fr a t w a ss 印a r a t e d 舶mt h eo p e n i n gt o ，h e r et h ed e s c e n d i n ga o r t ah a st h ef i r s t 3 a r b o r i z a t i o n ，a 1 1 ds 印a r a t e di n t ot 1 1 r e ep i e c e s 4 o n ep i e c ew a so b s e r v e dm e c o n d i t i o no f p a t h o l o g i c a lc h a n g e s a f t e rh ec o l o r e t u rw i t h l i g h t m i c r o s c o p e 5 o n ep i e c ew a s c u t t e di n t o f j r a g m e n t s ，d i g e s t e d w i t ho 2 5 p a n c r e a t i nf o r3 5h o u r s ，f a b r i c a t e di n t oc e ns u s p e n s i o n ，m a r k e dw i t hn u o r e s c e n t p r o b ed c f h d a ，o b s e r v e dt h ec o n t e mo fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sb yf l o w c y t o m e t e r 6 o n ep i e c ew a sf l a b r i c a t e di n t ot i s s u eh o m o g e n a t eo ni c e ，o b s e r v e d t h ee n e 昭ec h a r g eb yh i g hp e 墒m l a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y 7 s t a t i s t i c a l m e t h o d ：t h er e s u l t sw e r es h o w e db ym e a n sp l u so r s u b 仃a c t i n gs t a n d a r d ， o b s e r v e dm eh o m o s c e d a s t i c i t y ，o n e 一，a ya o n 、，a ，t h ed e v i a t i o no fb e t w e e n g r o u p sm e a n s w e c o r n p a r e db yl s d t h es o 脚a r es p s s17 of o r 谢n d o w sw a s u s e dt oa n a l y z et h ed a t a r e s u l t s ：1 1 1p a t h o l o g i c a ls e c t i o n sw es a wt h a tv e s s e l w a l lp r o t m d e di n t ol u m e n sa p i p a r e n t l y ，al o to ff o 锄c e l l sf - o m e du n d e r e n d o t h e l i a lc e u s ，s u p e r f i c i a lf i b e i 葛i n c i e a s e da n db e c a m em u s s yi ng r o u p b ；s o m ef o a mc e l l sf o m e du n d e re n d o t h e l i a l 曲l l sa 1 1 ds m o o t l lm u s c l ec e l l i n c r e a s e di ng r o u pca n dd 2 1 1 1 el e v e lo f g l y c 甜d ea n dt o t a lc h o l e s t e r o li n g r o u pw a s 印p a r e n t l yh i g h e rt h a l lg r o u pa ，a 1 1 da r e rt h ei n t e r v e n t i o no f a t o r v a s t a t i na n d 嘶m e t a z i d i n e ，i td e c r a e s e ds i g l l i f i c a t i v e l y 3 t 1 l ec o n t e n to f r o si ng r o u pbw a s a p p a r e n t l yh i g h e rt h a ng r o u pa ，a n da r e rt h ei 1 1 t e r v e n t i o n o fd r u g s ，i sw a sd e c r a e s e da p p a r e n t l y 4 t h el e v e lo fe n e r g ec h a r g ei n 债o u pb w a sw a s 印p a r e n t l yl o w e rt h a ng r o u pa ，a n da a e rt h ei m e r v e n t i o no fd m g s ，i s w a sr a i s e d 印p a r e m l y c o n c l u s i o n ：1 t 1 1 em o d e lo fa t h e r o s c l e r o s i sc a nb e c o p i e ds u c c e s s 如1 l yb yb r e e d i n gs u p e 订i p o i df e e da n di n j e c t i n gv i t a n l i nd 2 t h e e x p l a i n e dt 1 1 a to x i d a t i v es t r e s sw 弱o n em e c h a n i s mi nt h ef o m a t i o no f a t h e r o s c l e r o s i s 3 t h el e v e lo fe n e 喀ec h a 唱ew a s 印p a r e n t l yd e c r e a s e di nm e a o r t ao fa t h e r o s c l e r o s i s ，i tw a se x p l a i n e dt h a te n e 玛ym e t a b o l i s mi m p a i m e n t w a so n em e c h a n i s mi nt h ef o n i l a t i o n o fa t h e r o s c l e r o s i s 4 a t o a s t a t i nc a n i m p r o v et h el e v e lo fr o sa n de n e 唱ec h a 玛e 印p a r e n t l y ，i tw a se ) 【p l a i n e dt h a t a t o a s t a t i nc a ni m p r o v ee n e 玛ym e t a b 0 1 i s mo fa o r t ab e s i d e si t s e f f e c to f r e d u c i n gb l o o df a t 5 晰m e t a z i d i n ec a nd e c r e a s et h el e v e lo fr o sa i l dr a i s et h e l e v e lo fe h e 玛ec h a 唱e ，i tw a se x p l a i n e dt h a tt r i m e t a z i d i n eh a v em e e 酋f e c to f i m p r o v ee n e 唱ym e t a b o l i s mi m p a i m e n ti na t h e r o s c l e r o s i s k e y w o r d s ：a t h e r o s c l e r o s i s 、e h e 玛ec h a 玛e 、r o s 、a t o n r a s t a t i n 、t r i m e t a z i d i n e 5 j 上- 一 刖吾 动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s ，a s ) 是一组动脉硬化的血管病中常见 的最重要的一种，其特点是受累动脉病变从内膜开始。一般先有脂质和复 合糖类积聚、出血及血栓形成，纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层 的逐渐蜕变和钙化，病变常累及弹性及大中等肌性动脉，一旦发展到足以 阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。由于在动脉内 膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为动脉粥样硬化。 动脉粥样硬化可累及冠状动脉、脑动脉、肾动脉、肠系膜动脉、胭动 脉等全身各重要动脉。累及冠状动脉时可导致冠状动脉硬化性心脏病，造 成心肌供血不足，引起心绞痛乃至心肌梗死；脑动脉粥样硬化可引起脑供 血不足、眩晕、头痛，后期脑萎缩时，可有精神异常、痴呆等。脑动脉内 血栓形成或因动脉粥样硬化引起的小动脉瘤破裂出血引起脑卒中，造成意 识丧失、偏瘫、失语等严重后果；肾动脉粥样硬化可引起顽固性高血压； 肠动脉粥样硬化可引起消化不良、便秘、腹泻；下肢动脉粥样硬化可引起 间歇跛行，严重时发生肢端缺血坏死。所以，动脉粥样硬化是严重危害人 民健康的重大疾病。在我国，冠心病发病近年呈迅速增长趋势，因此，研 究动脉粥样硬化的病因、致病机制及有效防治方法是当今医学界面临的重 要课题。 目前发现粥样硬化发病机制众多，如：氧化应激、血管内皮功能障碍、 脂质浸润、胰岛素抵抗等。但是在这众多机制的背后似乎隐藏着一条通路 细胞能量代谢障碍，即细胞对供能物质a t p 的生成利用障碍，并由此 衍生出的一系列病理生理变化。 能量代谢障碍是众多急性和慢性疾病共同的病理生理基础，如：心肌 、脑梗塞、阿尔茨海默病、扩张| 生心肌病、脂肪肝等 旧。能量代谢障 以通过多种途径大量产生活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 。r o s 年来发现的信息分子家族中的新成员。研究表明，r o s 在高血压、动 样硬化、糖尿病血管病变等疾病的发病机制中发挥重要的调控作用。 中r o s 和抗氧化能力之间的不平衡即氧化应激，并可能由此导致细胞 。氧化应激已被公认为是动脉粥样硬化发生、发展的中心环节。 但在动脉粥样硬化的发生发展过程中，血管病变、能量代谢障碍、氧 激三者的相关性并未见确切报道。因此，本实验设想通过检测直接反 胞可利用能量的指标能量负荷( e n e r g yc h a r g e ，e c ) ，来观察能量， 变化在动脉粥样硬化发生发展过程中的变化，由此探索可能的抗动脉粥样 硬化的新治疗方案。 1实验材料与仪器 1 1实验动物 材料与方法 6 周龄健康雄性晰s t a r 大鼠，体重( 1 6 0 1 0 ) g ，共4 0 只，购自四川大学 华西医学动物中心。 1 2 主要实验试剂 试剂名称生产厂家产品批号 阿托伐他汀钙( 立普妥)美国辉瑞公司h 2 0 0 5 1 4 0 7 曲美他嗪( 万爽力)法国施维雅公司 h 2 0 0 5 5 4 6 5 丙硫氧嘧啶苏州东瑞公司 h 2 0 0 1 3 3 3 l 胆固醇上海蓝季公司 胆酸钠上海蓝季公司 维生素d 注射液上海通用公司 h 31 0 2 1 4 0 4 三磷酸腺苷( a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ，a t p )上海生工公司纯度9 5 分析纯 生产厂家 美国c o u l t e r 公司 美国戴安公司 统德国e p p e n d o r f 日本奥林巴斯 德国s i g n l a 公司 日本株式会社三广医疗 产品型号 e p i c sx l u 3 0 0 0 t r a n s f e r m a nn k 2 5 1 3 k 3 0 东芝t b a 4 0 f r 微量移液器法国g i l s o np 2 0 0 2 实验方法 2 1 建立模型 2 1 14 0 只w i s t a r 大鼠随机分为a 、b 、c 、d4 组，每组1 0 只。 2 1 2a 组( 空白对照组) ：饲以普通颗粒状饲料。 2 1 3b 组( 动脉粥样硬化组) ：饲以高脂饲料( 含普通颗粒状饲料9 2 9 ， 、胆固醇1 ，胆酸钠o 5 ，丙硫氧嘧啶o 6 ，猪油5 ) ，并分别于第一、 二、三天腹腔注射总量为7 0 万u l 【g 的维生素d 注射液。 2 1 4 c 组( 阿托伐他汀干预组) ：饲以高脂饲料( 含普通颗粒状饲料9 2 9 ， 胆固醇1 ，胆酸钠o 5 ，丙硫氧嘧啶o 6 ，猪油5 ) ，分别于第一、二、 三天腹腔注射总量为7 0 万以g 的维生素d 注射液，并每天灌胃阿托伐他 汀o 5 m 只。 2 1 5 d 组( 曲美他嗪干预组) ：饲以高脂饲料( 含普通颗粒状饲料9 2 9 ， 胆固醇l ，胆酸钠o 5 ，丙硫氧嘧啶o 6 ，猪油5 ) ，分别于第一、二、 三天腹腔注射总量为7 0 万u l 【g 的维生素d 注射液，并每天灌胃曲美他嗪 1 5 m 只。 2 2 实验步骤和取材 2 2 1 1 2 周末将1 0 0 乙醚浸润的纱布放入透明的密封罐中，将大鼠置于 容器中，观察动物的行为。开始时动物出现兴奋，进而出现抑制，自行倒 下，反应迟钝、肌紧张降低，取出大鼠，用布条将大鼠四肢及门牙分别系 紧，采取仰卧位固定于手术台上。 2 2 2 将中指及食指放置于大鼠左侧胸腔，感受大鼠心脏搏动最强处。用 5 m l 无菌空针，自搏动最强处，从肋骨间隙垂直皮肤指向脊柱进针。 2 2 3 进针约2 c m 后轻轻回抽空针推杆，使空针内形成负压，再缓慢回抽 针筒，见血液进入针筒即停止拔针，回抽推杆，待采集2 “血液后拔出针 筒。 2 2 4 将针筒内血液缓慢注入含o 5 枸橼酸钠的生化检测管中，编号，静 置待检。 2 2 5 用直镊提起大鼠腹部皮毛，直剪沿腹中线剪破皮肤，并沿腹中线延 长至胸部。 2 2 6 用直镊提起大鼠腹部肌肉，直剪剪破肌肉，暴露腹腔，并沿腹中线 延长，沿左侧肋骨与胸骨结合处剪断肋骨，暴露胸腔，破口延长至至胸腔 顶端。 2 2 7 换眼科镊及眼科剪，拨开左肺，在脊柱旁找到沿脊柱走行的主动脉， 向上用眼科镊钝性分离至主动脉开口处，向下分离至腹主动脉分出肝、脾、 观察主动脉粥样硬化病变情况：取降主动脉起始段部分行h e 染色， 光镜下观察内皮、平滑肌细胞、泡沫细胞、内膜形态学变化。 2 5 活性氧检测 2 5 1荧光探针d c f h d a 检测：2 ，7 二氯二乙酸荧光素( 2 ，7 d i c h l o r o n u o r e s c e i nd i a c e t a t e ，d c f h d a ) 进入细胞后在细胞内酯酶的作用下 脱去乙酸盐基团，原来无荧光的d c f h 可被细胞内r o s 氧化生成d c f ( 2 ， 7 d i c h l o r o n u o r e s c e i n ) ，后者可被4 8 8r u l l 波长的光激发，发射出绿色的荧 光，其荧光强度与细胞内r o s 的水平呈线性关系，是目前公认的检测r o s 的敏感指标。 2 5 2样品处理： 2 5 2 1将主动脉组织置于冰面放置的铝箔上，用眼科剪剪碎，碎片大小 在1m m 1l m 左右。 2 5 2 2 精确称取组织4 m g ，装入含o 2 5 胰酶的玻璃培养瓶中于3 7 条 件下消化。 2 5 2 3当在显微镜下观察组织块表面出现大量细胞时立即加入血清终止 消化( 消化时间3 5h ) 。 2 5 2 4 终止消化后将玻璃培养瓶置于3 7 空气摇床振摇1 01 1 1 i n ，继续吹 打组织块，使组织块表面的细胞尽可能脱落。待细胞从组织块脱离后，1 2 0 目细胞筛过滤，转入离心管内离心，弃上清，加入含2 0 小牛血清的d m e m 培养基，继续吹打细胞，制成细胞悬液。 2 5 3 标记及检测： 2 5 3 1每组加入1 0u m o l ld c f h d a11 1 1 l ，3 7 孵育3 0m i n 后，p b s 洗涤2 次，用p b so 5m l 使细胞重新混悬，避光置于冰上待检。 2 5 3 2 流式细胞仪以激发波长4 8 8m ，发射波长5 2 5 i 姐检测，每个样本 计数1 0o o o 个细胞，以c e l lq u e s t t m 软件分析细胞平均荧光强度( m e a j l f l u o r e s c e n c ei n t e n s i 哆，m f i ) 。 2 6a t p 、a d p 、a m p 检、狈0 2 6 1腺苷酸对照品溶液的配制：经电子秤精确称取对照品a t p 、a d p 、 a m p 各1 0m g ，分别置于同一1 0 0 m 1 容量瓶中，用流动相溶解并定容，再 吸取a t p 、a d p 、舢唧溶液各1 i i d ，一并置于2 5 1 1 1 1 容量瓶中，加入2 2 “ 蒸馏水，混匀并定容，配制成4 u g m 1 腺苷酸混合对照品溶液。 2 6 2 流动相的配制： 2 6 2 1 电子秤精确称取磷酸二氢钾( k h 2 p 0 4 ) 2 5 8 5 9 ，溶于3 8 0 i i l l 蒸馏 水中，再加入2 0 m l 甲醇，配成o 0 5 m m o 儿的磷酸二氢钾甲醇( 9 5 ：5 ) 缓冲液。 2 6 2 2 在p h s 3 c 型酸度计检测下，用n a o h 滴定液调节p h 值为6 5 。 2 6 2 3将流动相负压抽吸过滤，a u t os c i e i l c ea s1 0 2 0 0 超声仪脱气 l o m i l l 。 2 6 3色谱条件：d 妇ak m m a s i lc 1 8 色谱柱( 4 6m m 1 5 0 m m ，5 啪) ；流 动相：甲醇磷酸二氢钾缓冲液( p h = 6 5 ) ，流速为o 5 m l m 砒柱温为2 5 ， 检测波长2 5 4n m ，进样量1 5u l 。 2 6 4 样品处理：主动脉称重后立即置于预冷的玻璃组织匀浆器中，按1 0 “g 加人预冷的o 5 m o l l 的h c l ，在冰上抽提3 0 m i l l ，制成匀浆液， 7 0 0 0r m i i l4 离心1 5m i i l ，取上清液，加入上清液体积一半的1m o l l 的n a 2 肿0 4 ，调p h 至6 5 左右，再次7 0 0 0r m i l l 离心1 5m i i l ，取1 5 u l 上清液进样，进行色谱分析。 3 统计学分析 实验结果中的计量资料以均数标准差( x 士s ) 表示，进行方差齐性 检验，结果的组间比较采用单因素方差分析( o n e w a ya o n v ：a ) ，组间 均数两两比较用l s d 法，选定p o 0 5 为有统计学意义。组间数据相关性 分析采用直线相关分析。 所有统计工作均由统计学软件s p s s l 7 o 完成。 结果 1 病理结果 1 1a 组：血管内皮完整，弹力纤维结构清晰，未见泡沫细胞。 1 2b 组：可见血管内皮连续性破坏，管壁局部向管腔突出明显，表面纤 维增生，多数内弹力板分离，可见大量泡沫细胞。 1 3c 组：可见动脉壁增厚，内皮下见较多量泡沫细胞，中膜平滑肌细胞 增生。 1 4d 组：可见血管内膜增厚，管壁局部向管腔突出，内皮下见较多量泡沫 细胞，中膜平滑肌细胞增生。 ( 分别见图1 4 ) 图1 ：a 组大鼠主动脉( 1 2 周，脏，4 0 0 ) f i gl ：t h ea o n ao f a r a ti n 觚u p a ( 1 2 - w e e k ，髓，4 0 0 ) f i g2 ：t l l e 椭0 f a r a ti n 咖u pb ( 1 2 - w c e k ，脏，4 0 0 ) f i g3 ：t h ea o n a 。f a r a ti ng m u pc ( 1 2 - w e e k ，既，4 0 0 ) 1 5 图4 ：d 组大鼠主动脉( 1 2 刷末，脏，4 0 0 ) f 追4 ：t h c a o n a o f ar a t i n u pd ( 1 2 - w e e k ，脏，4 0 0 ) 2 生化指标结果 - ：t j ， 由表l 可以看出： 一 甘油三酯( t g ) ：a 组与b 组、c 组、d 组比较，差异具有统计学意 义( p = o o o o ) ，b 组与c 、d 组比较，差异有统计学意义( p = o o o o ) ，c 组 与d 组比较，差异没有统计学意义( p = 0 0 7 1 ) 总胆固醇( t c ) ：a 组与b 组、c 组、d 组比较，差异具有统计学意 义( p = o o o o ) ，b 组与c 组、d 组比较，差异有统计学意义( p = 0 o o o ) ，c 组与d 组比较，差异有统计学意义( p = o o l o ) 。 表1 ：不同组血清中t g 及t c 的含量 1 a b l e1 ：t h ec o n t e n to f 秭四y c e r i d e 锄dt b t a lc h o l e s t e r o li nd i 脏r e m g r o u p s 组另0n t g ( 姗o l l ) t c ( m m o l l ) a 组 1 0 3 1 2 0 1 3 2 2 5 0 1 4 b 组1 0 3 8 6 o 1 9 3 0 1 0 1 0 c 组 1 0 3 5 l o 1 7 2 6 8 0 1 4 d 组l o 3 3 9 0 1 0 2 5 4 o 1 1 f 值4 3 4 5 36 8 9 5 l p 值o o o o0 0 0 0 注：与a 组比较；：与b 组比较； ：与c 组比较 _ ， ： 4 一l q 3 5 7 _ l c = 一 3 i l _ 2 5 7 b r 一 27 t g ( 衄0 1 l ) 1 5 ， l t c 血l l ) l o 0 5ol l k 。 k k 一 图5 ：t g 及t c 在不同组含量的直方图 f i g5 ：t h el l i s t o 鲫no f 喇g l y c e r i d e 锄d1 抛lc h o l e s t e r o li nd i 虢r e mg r o u p s 3 r o s 荧光结果 a 组视野中可见极少量荧光；b 组可见大量荧光；c 组及d 组视野中可见 中等量荧光。见图6 、7 、8 、9 。 1 7 3 1荧光照片 图6 ：a 组照片 f 噜6 ：m p i c t u r e o f a 觚u p 图8 ：c 组照片 f 培8 ：t l l ep i c t u r eo f c 觚u p 图7 ：b 组照片 f i 9 7 ：1 1 1 e p i c t u r eo f b 咖 图9 ：d 组照片 f i g9 ：t h ep i c t u 他o f dg u p 3 2r o s 平均荧光强光结果： 由表2 可以看出a 组与b 组、c 组、d 组比较，差异具有统计学意义( p = o 0 0 0 ) ， 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 0 a 组b 组 c 组d 组 图1 0 ：r o s 在不同组含量的直方图 f i gl o ：t h eh i s t o g r 锄o f r o si nd i 疵r e i l tg r o u p s 1 9 4 能量负荷值结果 4 1 图1 1 为4 u 咖l 浓度的a r p 、a d p 、6 山伊对照品溶液的色谱图。可见 a t p 、a d p 、a 的出峰时间( m i l l ) 分别是4 2 5 、4 8 8 、7 0 9 。曲线形态 良好，无明显拖尾及干扰峰。 图1 1 ：标准品色谱图 f i g1 1 ：t l l ec h r o m a t o 鲫no f s t 舡l d a r ds u b s 伽c e 图1 2 ：a 组样品色谱图 f i g1 2 ：t h ec h r o m a t 0 铲锄o f s 锄p l ei na g r o u p 2 l 4 3 图1 3 为b 组样品色谱图。可见a t p 、a d p 、a 出峰良好，无明显拖 尾及干扰峰。a r p 峰高o 2 7 n a u ，面积o 0 4 1 2 i n a u 枣m i i l ，总量为 o 0 5 3 2 u 咖l 。a d p 峰高7 7 5 i n a u ，面积1 6 8 5 4 m a u 宰m i l l ，总量为 1 5 4 2 3 u 酌：1 1 l 。砧岬峰高1 0 8 8m a u ，面积3 1 2 6 3 i i a u 宰m i l l ，总量为2 7 1 9 2 u m l 。 图1 3 ：b 组样品色谱图 f i g1 3 ：mc h r o m a t o 肿o f s 锄p l e i nb g r o u p 图1 4 ：c 组样品色谱图 f i g1 4 ：t h ec h r o m a t 0 踟o f s 锄p l ei ncg r o u p 4 5 图1 5 为d 组样品色谱图。可见a t p 、a d p 、灿汩出峰良好，无明显 拖尾及干扰峰。a t p 峰高o 0 5 l l a u ，面积o 0 0 4 7 n a u 母m i n ，总量为 o 0 1 0 3 u 咖l 。a d p 峰高1 4 8 5 0m a u ，面积2 3 9 3 m a u 木础，总量为 2 9 5 4 u g m l 。a 御峰高1 9 7 6m a u ，面积o 5 4 1 n u 木m i i l ，总量为o 4 9 4 u 咖l 。 图1 5 ：d 组样品色谱图 f i g1 5 ：t h ec h r o m a t o 伊锄o f s 锄p l ei ndg r o u p 2 4 p 值o 0 0 0 _ - - - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - _ - - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - - - _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ 一一一一 注：与a 组比较；：与b 组比较； ：与c 组比较 4 7 由图1 6 可以看出，m f i 与e c 具有直线相关性。( 相关系数为o 9 4 8 ， p = 0 o o o ) 图1 6 ：m f i 与e c 的关系 t 抽1 e16 ：t h er e l a t i o n s l l i pb e m e 锄m e 狮n u o r e s c e l l c e n e l l s i 姒m f i ) 锄de 1 1 e 唱ec h a r g e ( e c ) 高 义 儿 1a s 的形成 讨论 1 1 a s 的易患因素 1 1 1 高血压：高压血流长期冲击动脉壁引起动脉内膜机械性损伤，造成 血脂易在动脉壁沉积，形成脂肪斑块并造成动脉硬化狭窄。 1 1 2 高脂血症：血中脂肪量过高较易沉积在血管内壁形成斑块，造成动 脉硬化狭窄。 1 1 3 糖尿病：糖尿病人的糖、脂代谢紊乱，血液中低密度脂蛋白( 1 0 w d e n s 时l i p o p r o t e i n ，l d l ) 、极低密度脂蛋白( v e 巧l o wd e n s i t y l i p o p r o t e i n ，v l d l ) 明显增加，容易沉积在血管内壁形成脂肪斑块。 1 1 4 抽烟：香烟中的尼古丁、一氧化碳等会损伤动脉内壁，导致血脂易 于沉积在血管壁，引起血小板堆积形成脂肪斑块。同时，抽烟也会引起冠 状动脉收缩痉挛，减少血流量。 1 1 5 缺少运动：运动可以增加高密度脂蛋白( h i g hd e n s 时1 i p o p r o t e i n ， h d l ) ，减少l d l ，把多余胆固醇从胆道与肠道排出体外，避免过剩胆固 醇沉积在血管内壁。此外，运动可以促进血液循环，增加血管弹性，降低 血压，消耗过剩热量，使身体脂肪比重减少，肌肉比重增加，而减轻体重。 因此缺乏运动的人很容易得到粥状动脉硬化。 1 1 6 肥胖：肥胖或体重过重的人，心脏负荷加重，血脂异常的机率也较 高，因而增加粥状动脉硬化风险。肥胖易促发高血压、糖尿病、高血脂症、 胰岛素阻抵抗症候群。 1 1 7 过大压力：人会因为压力而增加肾上腺素的分泌，于是引起血压升 动脉血管内壁。 a s 的发生与脂质代谢失常密切相关，血浆中增高的 入动脉壁：( 1 ) 内皮细胞直接吞饮；( 2 ) 透过内皮细胞间 的l d l 受体；( 4 ) 通过受损后通透性增加的内皮细胞； 失而直接暴露在血流的内膜下组织。脂蛋白进到中膜 胞间、胶原和弹力纤维上，引起平滑肌细胞增生，平 的单核细胞吞噬大量脂质成为泡沫细胞；脂蛋白又降 固醇酯、甘油三酯和其他脂质，l d l 还与动脉壁的蛋 性沉淀，刺激纤维组织增生，形成粥样斑块。 1 2 2 血栓形成和血小板聚集学说动脉内膜损伤后，血小板活化因子 ( p l a t e l e ta c t i v a t i n gf a c t o r ，p a f ) 增多，血小板在该处粘附、聚集，随后发 生纤维蛋白沉积，形成微血栓。血小板聚集后释出一些活性物质。其中血 栓烷a 2 ( t h r o m b o x 锄ea 2 ，黜) 能对抗血管壁合成的前列环素 ( p r o s t a c y c l i n e ，p g l 2 ) 所具有的使血小板解聚和血管扩张的作用，而促进 血小板进一步聚集和血管收缩；血小板源生长因子( p l a t e l e td 商v e dg r o 、釉 f a c t o r ) 可刺激平滑肌的细胞增生、收缩并向内膜游移；5 羟色胺和纤维母 细胞生长因子( 助r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ) 可刺激纤维母细胞、平滑肌细胞和 内皮细胞增生，肾上腺素和二磷酸腺苷可促使血小板迸一步聚集；第因 子使血小板进一步粘附；血小板第4 因子( p l a t e l e tf a c t o r4 ) 可使血管收缩； 纤溶酶原激活剂抑制物( 附) 使血栓的溶解受到抑制。这些物质使内皮细 胞进一步损伤，从而导致l d l 、纤维蛋白原进入内膜和内膜下；使单核细 胞聚集于内膜，发展成为泡沫细胞；使平滑肌细胞增生，移入内膜，吞噬 脂质；并使内皮细胞增殖。这些都有利于粥样硬化的形成。 1 2 3 损伤反应学说动脉内膜损伤可表现为内膜功能紊乱如内膜渗透过 增加，表面容易形成血栓。也可表现为内膜的完整性受到破坏。长期高脂 血症，由于血压增高、动脉分支的特定角度和走向、血管局部狭窄等引起 的血流动力学改变所产生的湍流、剪切应力，以及由于糖尿病、吸烟、细 菌、病毒、毒素、免疫性因子和血管活性物质如儿茶酚胺、5 羟色胺、组 织胺、激肽、内皮素、血管紧张素等的长期反复作用，均可损伤内膜或引 起功能变化，有利于脂质的沉积和血小板的粘附和聚集，而形成粥样硬化。 2大鼠动脉粥样硬化模型的建立方法 高脂饲料结合维生素d 注射液，最快4 周即可成功复制大鼠动脉粥样 硬化模型。本实验参考国内外相关文献【3 - 5 1 ，喂养高脂饲料( 普通颗粒状饲 料9 2 9 ，胆固醇1 ，胆酸钠o 5 ，丙硫氧嘧啶o 6 ，猪油5 ) 及腹 腔注射总量为7 0 万u l ( g 的维生素d 注射液，喂养1 2 周，成功复制了大鼠 动脉粥样硬化模型。其可能的机制为： 2 1胆固醇及猪油可明显增高血清t c 和t g 水平。越来越多证据表明 t g 对冠状疾病的发生有重要促进作用，眦s 和c l a s 研究认为高甘油 三脂血症可预测a s 的形成。高甘油三脂血症可能通过以下几种机制参与 动脉粥样硬化的发病