（动物学专业论文）活细胞荧光成像研究蓝藻光合膜蛋白的动态变化和生理功能.pdf

独创声明 本人声明所呈变的学位论文是本人在导师指导p 进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：；马拍娟 聊繇却面 导师签字：召，f 调色彩 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂蕉可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 导师签字：承 签字日期：2 0 0 5 年6 月5 e l 签字日期：2 0 06 年月 丽彩 v 6 臼 山东师范人学项l 学位论义 摘要 本i c - 艾j ：要分：i 部分：址利l 】激此 1 描聚焦显微镜尢螗藻细胞内建z 两 种活体内。欠兜成像技术斗f ：荧比漂j 7 j 恢复技术( f l l _ l o r e s c e n c cr e c o v e r ya f t e r p h o t o b l e a c h i n g ，f r a p ) 和荧光共振能量转移技术( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r , f r e t ) ：二是利用f r a p 技术研究与蓝藻状态转换有关的藻胆体的动态 扩散及其驱动力和调控因素；三是利用活体内f r e t 技术初步探讨了蓝藻 n a d ( p ) h 脱氢酶复合物的亚基之间的距离及相互作用。 后基因组时代的到来要求对生物大分子尤其是蛋白质的结构、特点及其相互 作用的研究由体外转向体内。活体内荧光成像技术的出现使得研究活细胞生理状 态下蛋白质的动态变化成为可能。本论文分别利用两种模式蓝藻：5 梦n e c h o c o e c u s s pp c c 7 9 4 2 和s y n e c h o c y s t i s p c c 6 8 0 3 建立了在蓝藻活细胞内进行f r a p 和 f r e t 实验的技术平台，用以研究活细胞生理状态下蓝藻光合膜蛋白的动态变化。 在蓝藻活体内利用f r a p 技术的研究已经表明藻胆体可以在类囊体膜上快 速的自由扩散，且该动态扩散对蓝藻的状态转换是必需的。但是藻胆体扩散的驱 动力及调控因素仍然未知。f r a p 是在细胞生物学中被广泛用于测定生物体系动 态性包括生物膜组分动态扩散的一种技术，其原理是利用高强度激光将细胞内一 小部分区域的荧光分子漂白，然后通过记录该区域随后的荧光恢复，检测周围未 漂白区域内的荧光分子与漂白区域荧光分子的交互扩散。本文利用f r a p 技术和 7 7 k 低温荧光发射谱研究了p q 的结构类似物一对苯醌( b q ) 对蓝藻 s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 的状态转换和藻胆体动态扩散的影响。结果表明：b q 在暗中可以诱导蓝藻向状态1 转换，且将蓝藻固定在状态1 。同时，b q 处理显 著影响了藻胆体在类囊体膜上的动态扩散，使多数藻胆体被固定在类囊体膜上， 不能进行自由扩散。据此我们推测p q 库的氧化还原状态参与调控藻胆体的动态 扩散，并提出了e e 库氧化还原状态调控藻胆体动态扩散及状态转换的假想模型。 n a d ( p ) h 脱氢酶复合物f n d h ) 是近年来在蓝藻和高等植物等的类囊体膜上 发现的另一类膜蛋白复合体，在蓝藻中参与n 乎吸和循环电子传递及参与c 0 2 的 吸收，对于蓝藻许多重要生理过程是必需的。但蓝藻n d h 复合物的体外完整分 离尚未实现，其完整的亚基组成也存有争议。本论文利用绿色荧光蛋白( g r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 的变种黄色荧光蛋白( y e l l o wf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，y f p ) 1 1 东帅范夫学颁i 学位论文 和菏色荧光蛋白( c y a nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，c f p ) 分别标记, s v n e c h o c y s t i s p c c 6 8 0 3 n d h 复合物的d 4 亚基和c u p b 哑基，利用f r e t 技术拟研究这两个亚基在活细 帆 。j = ! 祭什_ 卜的相忆衍： 丰j7 2 m1 、7 i - 胖j r 念卜的j 【! t 离。e f e 即n d h 复合物 j 1 ，陶 的动态变化。利用i 种不l 叫n 。方法舱测f r e t 信号：激活发射，受体光漂白，u ! 体漂白动力学方法。结果表明：蓝藻活体内进行f r e t 研究干扰因素很多，背景 荧光较强，由于转入的荧光蛋白的表达量相对于背景荧光较弱，致使信噪比很低， f r e t 实验的初步结果不理想。另外，在实验过程中，通过4 0 5 r i m 激光的x y t 扫描，在4 6 5 - - 5 6 5 r m a 范围内发现一个类似光激活的现象，猜测该现象可能与强 光胁迫下类胡萝h 素的光保护作用有关。 关键词：活细胞荧光成像、荧光漂白恢复、荧光共振能量转移、蓝藻、状态 转换、藻胆体动态扩散、n a d ( p ) h 脱氢酶复合物 山东帅范人学顺i 学位论文 a b s t r a c t t h i sw o r kc o n s i s t so ft h r e ep a r t sf i r s t l y , 1 w ot y p e so fl i 、r ec e l lf l u o r e s c e n t i m a g i n gt e c h n i q u e s f l u o r e s c e n c e r e c o e r y a f t e rp h o t o h l e a c h i n g ( f r a p ) a n d f l u o r e s c e n c er e s o n a l l c e e n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) w e r ed e v e l o p e d i n l i v i n g c y a n o b a c t e r i ac e l l su s i n gl a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e s e c o n d l nf r a pw a s u s e dt od e t e c tt h ed i f f u s i o no fp h y c o b i l i s o m e so nt h y l a k o i dm e m b r a n e sa n dt h e d r i v i n gf o r c e ( o rt h er e g u l a t o r yf a c t o r s ) o ft h i sd i f f u s i o n t h i r d l y , f r e tw a su s e dt o d e t e c tt h ei r i t e r a c t i o no ft w os u b u n i t so fn a d ( p ) hd e h y d r o g e f l a s e c o m p l e xi n c y a n o b a c t e r i a t h ea r r i v i n go ft h ep o s t g e n o m ee r ar e q u i r e st h e s t u d y i n go ft h es t r u c t u r e s ， c h a r a c t e r i s t i c sa n di n t e r a c t i o n so fb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s e s p e c i a l l y p r o t e i n s t u m i n gf r o mi nv i t r ot o i nv i v o t h i s s t u d yu s e dt w om o d e lc y a n o b a c t e r i a s y n e c h o c o c c u ss pp c c 7 9 4 2a n ds y n e c h o c y s t i s p c c 6 8 0 3t od e v e l o pf r a pa n d f r e tt e c h n i q u e si n l i v i n gc y a n o b a c t e r i ac e l l s ，w h i c hc a nb e u s e dt os t u d yt h e d y n a m i c so f p h o t o s y n t h e t i cm e m b r a n ep r o t e i n s s t u d i e s u s i n g f r a pi n l i v i n gc y a n o b a c t e r i a c e l l sh a v es h o w nt h a t p h y c o b i l i s o m e sd i f f u s er a p i d l yo nt h y l a k o i dm e m b r a n e s ，a n dt h i sd i f f u s i o ni sr e q u i r e d f o rs t a t et r a n s i t i o n si nc y a n o b a c t e r i a h o w e v e r , t h ed r i v i n gf o r c ea n dt h er e g u l a t o r y f a c t o r so f p h y c o b i l i s o m ed i f f u s i o na r ey e tu n k n o w n f r a pi sa t e c h n i q u ew i d e l yu s e d i nc e l lb i o l o g yt oo b s e r v et h ed y n a m i c so fb i o l o g i c a ls y s t e m s ，i n c l u d i n gt h ed i f f u s i o n o fm e m b r a n ec o m p o n e n t s t h i s t e c h n i q u ei n v o l v e s t h eu s eo fah i g h l y - f o c u s e d c o n f o c a ll a s e rs p o tt os e l e c t i v e l yb l e a c ht h ef l u o r o p h o r e si nas m a l lr e g i o no f t h ec e l l t h ed i f f u s i o no ft h ef l u o r o p h o r e sc a nt h e nb em o n i t o r e db yo b s e r v i n gt h es p r e a da n d r e c o v e r yo ft h eb l e a c h i nt h i ss t u d y , w eu s ef r a pa n d7 7 kf l u o r e s c e n c es p e c t r at o i n v e s t i g a t et h ee f f e c t so f1 ，4 - b e n z o q u i n o n e ( b q ) ，o n eo f t h eb e n z o q u i n o n ea n a l o g u e s ， o ns t a t et r a n s i t i o n sa n dp h y c o b i l i s o m e sm o b i l i t yi ns y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 t h e r e s u l t ss h o wt h a tb 0c a ni n d u c eat r a n s i t i o nf r o ms t a t e2t os t a t e1i nt h ea b s e n c eo f a c t i n i cl i g h ta n dc e l l st r e a t e dw i t hb qw e r el o c k e di ns t a t e1a tt h es a m et i m e ，b q a f f e c t st h ed i f f u s i o no fp h y c o b i l i s o m e s d r a s t i c a l l y m o s tp h y c o b i l i s o m e sa r e ! ! 蔓竺! ! 叁堂婴f 竺坚堕兰 i m m o b i l i z e do nt h y a l k o i dm e m b r a n e si ti ss u g g e s t e dt h a tt h er e d o xs t a t eo fp q p o o l c a nr e g u l a t et h ep h y c o b i l i s o m cd i f f u s i o ni nc y a n o b a c t e r i a n a d ( p ) t td e h y d r o g e n a s ec o l l p i e x e s f n d h ) i sa n o t h e rp h o t o s y n t h e t i cm e m b r a n e c o m p l e xf o u n di nt h y l a k o i dm e m b r a n e si nc y a n o b a c t e r i aa n dg r e e np l a n t si nr e c e n t y e a r s i th a ss p e c i f i cf u n c t i o n si nr e s p i r a t i o na n dc y c l i ce l e c t r o nf l o wa sw e l ta si n a c t i v ec 0 2u p t a k e a t t e m p t st oi s o l a t ei n t a c tn d h c o m p l e x e sf r o mc y a n o b a c t e r i ao r p l a n tc h l o r o p l a s t sh a v em e ts e v e r ed i f f i c u l t i e sd u et ot h ef r a g i l i t yo ft h ee n z y m ea n d t h el o wq u a n t i t yp r e s e n ti nt h et h y l a k o i dm e m b r a n e a l s o ，t h ei n t a c ts u b u n i t s c o m p o s i t i o ni sy e tu n k n o w n i nt h i sw o r k ，t w ov a r i a n t so fg r e e nf l u o r e s c e n t p r o t e i n ( g f p ) 一y e l l o wf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( y f p ) a n dc y a nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( c f p l w e r eu s e dt ol a b e ld 4a n dc u p bs u b u n i t so fn d h c o m p l e x e sr e s p e c t i v e l y t h e n f r e tw a su s e d 幻d e t e c tt h ei n t e r a c t i o n so ft h e s e t w os u b u n i t sa n dt h e c o n f o r m a t i o n a lc h a n g e so fn d hc o m p l e x e si nd i f f e r e n tp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s ， t h r e ed i f f e r e n tm e t h o d si n c l u d i n gs e n s i t i z e de m i s s i o n ，a c c e p t o rp h o t o b l e a c h i n ga n d d o n o rp h o t o b l e a c h i n gd y n a m i c sw e r eu s e dt od e t e c tf r e ts i g n a l s h o w e v e r , t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tm a n yf a c t o r sc a ni n t e r f e r ef r e ts t u d i e si nc y a n o b a c t e r i a t h e a u t o f l u o r e s e e n e eo f t h ec e l li sh i 曲a n dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f t h ef l u o r e s c e n tp r o t e i n s i sl o wr e l a t i v et ot h ec e l la u t o f l u o r e c e n c e ，w h i c hm a k e st h er a t i oo f s i g n a lt on o i s et o o l o wt ob ed e t e c t e d i nt h i ss t u d y , w ea l s of o u n dap h o t o a c t i v a t i o n l i k ep h e n o m e n o ni n t h er a n g eo f4 6 5 5 6 5n n lu s i n g4 0 5m nl a s e rf o rx y t s c a n n i n g t h i sm a yb er e l a t e d t ot h ea c t i v i t yo fc a r o t e n o i d s ，w h i c hc a np r o t e c tt h ep h o t o s y s t e m si nt h eh i ；i l l i g h t m e n a c e k e yw o r d s ：l i v ec e l lf l u o r e s c e n t i m a g i n g ；f l u o r e s c e n c er e c o v e r y a f t e r p h o t o b l e a c h i n g ； f l u o r e s c e n c er e s o n a n c e e n e r g yt r a n s f e r ；c y a n o b a c t e r i a ； s t a t e t r a n s i t i o n s ；p h y c o b i l i s o m ed i f f u s i o n ；n a d ( p ) hd e h y d r o g e n a s ec o m p l e x e s 4 山东师范人学硕 ：学位论文 一 常用缩略语表 英文简称 英文全称 a p c a l l o p h y c o c y a n m bq 1 , 4 一b e n z o q u i n o n e c h l c h l o r o p h y l l c p 4 3 c h l o r o p h y l l b i n d i n gp r o t e i n4 3k d a ， p r o d u c t so f p s bc c p 4 7 c h l o r o p h y l l b i n d i n gp r o t e i n4 7k d a ， p r o d u c t so f p s bb c f p c y a nf l u o r e s c e n tp r o t e i n l h c l i g h th a r v e s t i n gc o m p l e x n d hn a d ( p ) hd e h y d r o g e n a s e s p b s p h y c o b i l i s o m e p c p h y c o c y a n i n p e p h y c o e r y t h r i n p e c p h y c o e r y t h r o c y a n i n p qp l a s t o q u i n o n e p si p h o t o s y s t e m i p si i p h o t o s y s t e m i i q a 、q bp l a s t o q u i n o n ee l e c t r o na c c e p t o r si np s t t 中文全称 别藻蓝蛋白 1 ，4 一苯醌 叶绿素 叶绿素结合蛋白4 3k d a ， p s b c 基因产物 叶绿素结合蛋白4 7k d a ， p s b b 基因产物 青色荧光蛋白 捕光复合物 n a d ( p ) h 脱氢酶 藻胆体 藻蓝蛋白 藻红蛋白 藻红蓝蛋白 质体醌 光系统i 光系统i i 光系统i i 内的p q 电子受体 y f p y e l 坦翌。垒竺2 堡! ! ! 呈! 旦1 2 1 1 1 堡薹鱼茎堂垩皂 w _ _ _ 日h _ h - _ m h _ _ h _ _ _ _ _ _ - _ “_ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - _ _ h _ 一一一一一 d i 东帅范大学硕上学位论文 第一章引言 1 1 光合作用 1 1 1 光合作用概述 光合作用是光合生物( 包括绿色植物、藻类和光合细菌) 将光能转变为化 学能，同时将无机物转变成有机物贮存在生物体内的过程。光合作用可以分为两 大类。植物、藻类和蓝细菌以h 2 0 为电子供体还原c 0 2 ，合成碳水化合物；同 时h 2 0 被氧化，释放出0 2 。这种光合作用称为放氧光合作用( o x v 2 e n i c p h o t o s y n t h e s i s ) 。而其他种类的光合细菌，则以其它化合物如硫化氢、琥珀酸益 作为电子供体，利用光能还原c 0 2 合成有机物，不产生0 2 。相应地，这类光合 作用被称为厌氧光合作用( a n o x y g e n i cp h o t o s y n t h e s i s ) 。营厌氧光合的细菌主要 包括紫色细菌、绿硫细菌和格兰氏阳性细菌等。光合作用的总反应可以表示如下： 2 h 2 a + c 0 2 骂( c h2 0 ) + 2 a + h2 0 这里( c h 2 0 ) 代表碳水化合物，例如葡萄糖。在有氧光合作用中，a 代表 氧元素o ，2 a 即0 2 ；在厌氧光合作用中，根据电子供体的不同，a 的含义也不 同。例如，当h 2 s 充当电子供体时，a 代表硫元素s ；当琥珀酸盐充当电子供体 时，a 代表延胡索酸盐。 光合作用为地球上所有生命提供了能量和物质基础，是地球上最重要的生物 化学反应。它不仅是食物链的初级生产者，而且也是最初产生和如今维持大气中 0 2 的制造者。从这个意义上说明：没有光合作用就没有生物丰富多彩的演化和 繁荣，也不可能有人类社会的生存和持续发展。光合作用不仅是生命科学的重大 基础理沧问题，而且与当今人类面临的粮食、能源和环境等问题都密切相关【”。 例如，提高粮食产量的最有潜力和效率的途径应是提高作物的光能转化和利用效 率；通过揭示光合作用高效传能和转能的机理，开辟太阳能利用的新途径将是本 世纪解决能源匮缺的重要途径之一：光合器官内的许多氧化还原组分和电子传递 分_ f 机构都表现m 明显的双稳态特征，以此制造单电子操作的分子逻辑器件，将 成为未来计算机的理想功能材料；此外，光合作用吸收二氧化碳释放氧气，对调 节日益恶化的大气环境起着至关重要的作用。 山东师范人学硕1 ：学位论迁 1 1 2 光合作用的过程 北合作用一般分光反j 6 i 干情反m 两个步骤一光反j 、j ! 必须有光照，在类囊体睽 i ：进汀，光能被色素分j 7 吸l 救，通过乐列电r 和质j ，f 递过程后转化为化学能， 终产物为n a d p h 和a t p ；暗反应不需要光照，在u t 绿体基质中进行，通过一。系 列的酶促反应( c a l v i n 循环) ，利用n a d p h 和a t p 将c 0 2 转化为葡萄糖和其他 产物。类囊体膜由蛋白复合物、电子载体和脂分子组成，经过形式多样的空问折 叠后形成一个密闭的曲面，将腔内和腔外的水相隔离。这种拓扑空间结构对于光 合作用至关重要。类囊体膜上主要分布着四种与光合作用有关的蛋白复合物，即 光系统i i ( p h o t o s y s t e mi i ，p s i i ) 、细胞色素b 6 f ( c y tb 6 f ) 、光系统i ( p h o t o s y s t e m i ，p s i ) 和a t p 合成酶。前三种蛋白复合物均参与光反应的电子传递过程。脂溶 性的有机小分子p q ( p o ) 能够在类囊体膜上快速扩散，把p s i i 氧化h 2 0 获得 的电子交给c y t b 。f 。此外，腔内的质体蓝素和基质中的铁氧还蛋白( f d ) 也参与 了这个电子传递过程。质体蓝素负责把c y t b 6 f 接收的电子传递给p s i 。f d 从p s i 接受电子后，经过酶促反应交给n a d p + 。如图1 1 所示。 图1 - 1 叶绿体的结构和光合作用的主要过程 ( 引自h t t p ：p h o t o s c i e n c el aa s u e d u p h o t o s y n p h o t o w e b d e f a u l t h t m l ) 东师范人学碗l 学位论z 放氧光合生物种类繁多。仅植物而占，种类就多达3 0 ，0 0 0 5 0 ，0 0 0 种。试图 埘所有这些物种的光合作用机制进行逐个研究，拜实足不可能的。所卓的是， 迄今为i f 的研究成果部丧明：所仃放氧光介牛物的圯i i 作片j 过程都仃疆葺的中玎似 性。最突出的例f 是原核7 三物监藻的光合作川机带i 和高等植物十分类似。人们据 此提出了内共生假说，认为蓝藻和所有营放氧光合作用的真核生物的叶绿体有共 同的祖先1 2 , 3 】。 1 2 蓝藻的光合作用 作为地球上最古老的光合放氧原核生物，蓝藻已经在地球上生存了3 0 亿年。 w i l m o t t e 认为，蓝藻是地球上第一种放氧生物【4 】。原始的地球大气和海洋是还原 性的，通过光合作用，蓝藻不断释放氧气，逐渐改造了地球大气和海洋，对生命 的进化产生了积极的影响。尽管蓝藻个体微小，但是分布极广、数量十分惊人。 地球上蓝藻的生物量巨大。远古的蓝藻经过地质作用，形成了今天人类使用的石 油、天然气等重要能源。 对蓝藻的光合作用的研究具有十分重要的理论和应用价值。一方面，蓝藻有 很高的经济价值。它可以用作保健食品，一些特定的产物可以应用于医药领域。 经过基因改造的蓝藻就象微型的生产车间，能够合成人们所需要的蛋白质。另一 方面，蓝藻对环境有着深刻的影响。它的光合作用能够有效降低大气中的c 0 2 浓度，有利于维护地球的生态平衡。但在局部地区，蓝藻可能引起突出的环境问 题。例如，富含有机物的工业污水排放到水体中后，水体中的蓝细菌能够利用这 些有机物快速生长，成为优势种群，破坏水体原来的生态系统。如何抑制蓝藻在 污染水体中的恶性增殖，已经成为环境治理的一个重要研究内容。此外，由于蓝 藻结构简单、适于基因操作，常被作为一种模型生物用于放氧光合作用的研究， 以阐明高等植物光合作用的机理。因此，近二十年来关于蓝细菌光合作用的研究 十分活跃，进展很快。 蓝藻的光合作川j 真核藻类、高等植物一样，都是通过类囊体膜上的p s i 、 p s i i 、c y t b 6 f 复合物和a t p 合酶等光合器进行的吐蓝藻类囊体膜上光合器的分 布如图1 2 所示，这些蛋白复合物在结构和功能上与植物和绿藻类的都很相似【2 1 。 山东师范人学坝1 ：学位论芷 内共生假说很好的解释了蓝藻与高等植物光台蛋白复合物结构和功能上 的相似性，即蓝藻和所有营放氧光合作用的叶绿体有共同的祖先2 ，”。然而，作 为地球上最古老的光合放氧原核生物，蓝藻的光合作用与高等植物还存在一定区 别，其主要的区别在于： 1 ) 蓝藻中不含叶绿素b ，没有叶绿素a b 捕光天线复合物，它们含有一种特殊的 光合色素藻胆素，与蛋白质共价结合形成藻胆蛋白。各种藻胆蛋白有机的组 装成藻胆体( p h y c o b i l i s o m e ，p b s ) ，锚合在类囊体膜的外表面，充当捕光天 线，功能上类似于高等植物中跨膜分布的叶绿素a b 捕光天线复合物1 6 j 。 2 ) 在类囊体膜的组成上，蓝藻的类囊体膜上不仅分布了光合电子传递链，还含 有呼吸电子传递链的组分，如n a d ( p ) h 脱氢酶( n d h ) 和c y t 氧化酶( c y t o x ) 。 两条电子传递链共用的组分包括p q 库、c y t b 6 f 和质体蓝素。这种光合电子传 递链和呼吸电子传递链的交叉，反映了这种原核生物的原始性。 3 ) 蓝藻的类囊体膜也没有基质和基粒类囊体的分别。 1 3 蓝藻的主要捕光天线一藻胆体 藻胆体( p h y c o b i l i s o m e p b s ) 是蓝藻和红藻中特有的超分子捕光色素蛋白复 合体，是由藻胆蛋白( p h y c o b i l i p r o t e i n s ，8 5 ) 和连接蛋白( 1 i n k e rp o l y p e p t i d e s ， 山东师范大学硕【学佗沦) 1 5 ) 以特定的顺序构筑的超分子复合物( 分了量约6 7 1 0 6d a l t o n ) ，它们有序 地分布在类囊体膜的举质一删，将吸收的光能几乎百分之向的传递给两个光合作 ，二宦t 0 ”。 1 3 1 藻胆体的结构 在蓝藻和红藻中，藻胆体一般是半盘状的。半盘状藻胆体由“核”( c o r e ) 和 “棒”( r o d ) 两部分组成( 图1 3 ) 。 力p ( 曲州1 u 1 ，7 0 0 2 口i 衅、”l t r 7 。9 1 一 t l 罅k h 。m p c 冉h 8 i 罅k ”1 m ” 豁 t “# ，f l n - _ _ 一一 】二j 0n m i 二：0 m 【 妇s ti g ( ，( 阳也1 5 i t # t i l l u 划 1 1 - 0 h 气 ：( 邮b p ，：0 ： 路8i - c m 4 ：h 1 0 ，1 a 纷l r 图1 3 藻胆体结构示意图。图注中的数字上标表示多肽的分子量，单位是k d a 。在不 同种类的蓝细菌中，同种多肽的分子量略有不同。 “核”通常由三个圆柱体垛叠成三角形。底部的两个圆柱体与两个p s i i 颗粒分 别紧密相连( 参见图1 2 ) 。每个圆柱体由四个高为3 5 n m 的盘状亚单位垛叠而 成。在蓝细菌集球藻s y n e c h o c o c c u s6 3 0 1 中，藻胆体的核缺失上面的一个核圆柱 体，只由底部两个核圆柱体组成1 7 。最近的研究发现，在层理鞭枝藻 ( m a s t i g o c l a d u s l a m i n o s ) 、鱼腥藻a n a b a e n a7 1 2 0 等蓝细菌中，藻胆体的“核” 除了个垛叠成三角形的阋柱体外，还有两个半圆柱体。这两个半圆枷体由两个 盘状哑单位垛喾而成，紧依着位于“核”中- f l , 的其它奠个刚柱体【h 1 ”。 “棒”在“核”外幽氅辐射状排列。一般的半盘状藻胆体t j 有 根“棒”。 o 东j j 【f j 范大学倾 j 学位论文 而在层理鞭枝藻、鱼腥藻7 l o o 等蓝藻中，“核”外凼排列着八根“棒”。每根“棒” 【1 】高6 i q m 、直径1 11 1 1 1 1 的盘状亚单位垛叠而成。“棒”的长度随藻种、生长条件 n 0 变化而变化m 】。) 外，监藻中的藻胆体还仃束状的和：i ， 椭圆的。束状藻眦体 仪在蓝藻g l e o o b a c t e rv i o l a c e u s 一 - 发现】。这种蓝藻没有类囊体膜，藻胆体分布 在细胞质膜的内表面。一个束状藻胆体由六根“棒”( r o d ) 组成。每根“棒”长 5 0 7 0n m ，直径为1 0 1 2r i m ，由8 1 2 个盘状亚单位( 厚度为6n m ) 垛叠而成。 g u g l i e l m i 和c o h e n b a z i r 发现蓝藻p s e u d a n a b a e n al a u t e r b o r n 的藻胆体是半椭圆 形的 ”】。l a n g e 等认为半椭圆形藻胆体由两排“棒”组成，每排有六根“棒” 1 3 1 。 1 3 2 藻胆体的组成 藻胆体由多种藻胆蛋白和联结多肽组成 1 。藻胆蛋白约占藻胆体总分子量 的8 0 9 0 ，盘状的藻胆蛋白三聚体或六聚体垛叠成藻胆体核或棒的圆柱体，是 藻胆体的主要组分。联结多肽是藻胆体中不含发色基( 少数例外) 的多肽组分， 约占藻胆体总分子量的1 0 2 0 。它们的主要功能是参与藻胆体的装配和固着， 在藻胆蛋白三聚体聚合成六聚体、三聚体或六聚体垛叠成核和棒的圆柱体、圆柱 体之间的联系以及藻胆体和类囊体膜的偶联过程中起引导、识别和固着作用。 ( 1 ) 藻胆蛋白 藻胆蛋白是一种色素蛋白，在多肽链上共价结合着藻胆素分子。藻胆素是 一种开链四吡咯化合物，常见的有藻红素( p e b ) 、藻蓝素( p c b ) 、藻尿素( p u b ) 、 藻紫素( p x b ) 。这些色素分子的化学结构略有差异，因此有不同吸收光谱特性 能够捕收不同波长的光能。各种藻胆素的特征吸收峰如表1 一l 。 表1 1 四种藻胆素的特征吸收峰 藻胆素通过其吡咯环上的乙叉基与蛋白多肽链上的丝氨酸残基之间形成共 价硫醚键i ”】。藻胆蛋白的蛋白部分由毡和p 亚基组成，在某些藻胆蛋白中还存在y 亚基。每个亚基连接l 4 个藻胆素分子 ”。藻胆蛋白根据其光谱性质、结构特征 可分为别藻蓝蛋白( a p c ) 、藻蓝蛋白( p c ) 、藻红蓝蛋白( p e c ) 和藻红蛋白( p e ) 四类。 山东帅范人学坝l 学 立论文 ( 2 ) 联结多肽 联结多肽t 要他j 二盘状藻胆蚩门穴聚体或? 聚体的中心洞穴中它们棚，i 连接，形成藻鹏f - 汁裟系统敝赫 i 4 p ，襄i f # i t 吖向分靠和f 二用，町以0 。已 分成棒联结多肽( l r ) 、棒核联结多肽( l r c ) 、核联结多肽( l c ) 和核膜联结多 肽( l ( m ) 四类旧1 。各联结多肽的分子量及其功能如表1 2 。 表1 - 2 各种联结多肽的分子量及其功能 近年来藻胆体结构研究中的一个重要进展就是对l c m 的深入了解。每个藻 胆体中有两个l 分子。l c m 是唯一含有藻胆素分子的联结多肽。其多肽链町以 分成3 5 个区域，每个区域约有2 2 0 个氨基酸残基。l c m 的氨基端是藻胆蛋白区 域，含有个p c b 分子，与1 8 6 位丝氨酸共价相连。这一区域与藻胆蛋白家族 的亚基序列同源性大约为3 5 ，比它们多3 8 个氨基酸残基。这3 8 个氨基酸残基 彤成一个l o o p 区，可能在藻胆体与光系统的结合过程中起作用【3 】。 1 3 3 藻胆体的功能 藻胆体在蓝藻和红藻中主要起捕光天线的作用，捕收并有效地向光系统传 山东f i j i 范人学顾f 学位论文 递光能。在藻细胞中，类囊体膜上的叶绿素a ( 闭环p q 吡咯化合物) 吸收可见光 k 的红光和蓝光藻胆体中的藻胆素( 开链四毗咯化合物) 吸收绿光、茸光和橙 p 比两名的吸 k 比l 酱 i 钋，增强了藻细胞利f | 光能的能力，随着埘藻类比f i 作用研究的深入，藻胆体的助能研究也日益受到重视。 根据藻胆体各组分的吸收光谱、荧光发射光谱和时间分辨光谱等光谱技术， 现在已经确定光能在藻胆体中的传递途径：p e ( 或p e c ) 斗p c j a p c 斗l c m 和 a p b - - - r p s i i 、p s i ( 如图1 4 ) ，全程传递时间约为1 2 0 1 5 0 p s 。以无辐射偶极诱 导共振方式( 即f 6 r s t e r 方式) 在各个特定取向、特定位置的藻胆素之间进行能 量传递。在同类藻胆蛋白之间，主要是靠联结多肽调制藻胆蛋白最低激发单线态 的能量以形成能量阶梯，保证激发能由藻胆体周边向核心传递。 图1 - 4 藻胆体的光能传递途径 1 4 蓝藻的状态转换 为了适应环境中光照的变化，光台生物通过调节捕光天线的能量传递方向， 保持激发能在p s i 和p s i i 之间均衡分配，提高光合作用的效率。这个过程称为 状态转换2 们。状态转换实际上是捕光天线对外界环境的一个较快的生理适应过 程，导致激发能在两个光系统间的重新分配。近年来，有关叶绿体状态转换的调 控机制的研究取得了很大进展1 2 1 , 2 2 j 。高等植物的状态转换涉及到捕光天线蛋白 l h c i i 与p s i 和p s i i 的可逆结合，该过程是由光合电子传递链中电子传递载体 的氧化还原状态激发，通过l h c i i 的磷酸化和去磷酸化实现的。还原型质体醌 ( p q h 2 ) 与细胞色素b 6 f ( c y tb 6 f ) 的q 。t c i 点结合后，可以驱动r i e s k e 蛋白从 远端位置移动到近端位置，c y tb 6 f 复合物的结构进行跨膜重组，激活l h c i i 激 东师、乜大学颂f 学位论文 酶活性，使l h c i i 磷酸化，磷酸化的l h c i i 与p s i i 脱离并从类囊体膜的基粒区 转移到基质区与p s i 结台，n f 绿体进入状态2 ：氧化型质体醌( p 0 ) 使蛋i i 激喻 欠活，此时磷酸化的i 。h c h 九：磷酸嘴哺的作引f 点膦酸化，与p s i 悦离川l ，j p s i i 的结合位点，时绿体逐渐进入状态1 【2 ”。 藻胆体是蓝藻和红藻的主要捕光天线复合物，它是由藻胆蛋白和连接蛋白以 特定的顺序构筑的超分子蛋白复合物，结合在类囊体膜的基质侧，能够有效的将 捕获的光能传递给光系统i 和光系统反应中心【2 4 - 2 5 。尽管蓝藻没有l h c i i ，但 是也能象高等植物一样，进行状态转换口“。蓝藻的状态转换是将藻胆体捕获的 光能在p s i 和p s i i 之问重新分配的过程。如果照射光优先激发p s i ( 例如远红光) ， 则蓝藻进入状态l ，藻胆体主要充当p s i i 的捕光天线，把吸收的光能更多地传递 给p s i i ；如果照射光优先激发p s i i ( 如6 0 0n l n 附近的橙光) ，则蓝藻进入状态2 ， 此时藻胆体主要向p s i 传递激发能。由于呼吸链的作用，在黑暗中适应了一段时 间后蓝藻将进入状态2 【2 7 】。 关于蓝藻状态转换的机制，已经提出了很多模型，但都是基于以下两种基本 模型：一种是流动藻胆体模型，认为蓝藻通过藻胆体在p s i 和p s i i 之间的扩散 调整与两个光系统的相互作用，从而进行状态转换。在状态l ，藻胆体与p s i i 连接并将其激发能传递给p s i i ，在状态2 ，藻胆体与p s i i 解离，并与p s i 重新结 合 28 1 。另一种是溢出模型，认为在藻类状态转换过程中，藻胆体始终与p s i i 连 接，并且藻胆体向p s i i 的传能效率并不受状态转换的影响，状态转换是通过p s i i 与p s i 之间距离的改变从而改变p s i i 向p s i 传能的效率实现的 2 3 1 】。已证明蓝 藻的状态转换由p q 库的氧化还原状态调控，