（微生物学专业论文）极端嗜盐菌的研究.pdf

摘要 本文主要研究了两株盐生盐杆菌b 和s 9 的一些生理生化特征 及培养条件的优化。 这两株菌都是革兰氏染色阴性，在牛奶一盐一琼脂培养基上， 菌落为红色。菌b 大小为0 6 9 一o 9 6 2 7 6 4 1 岬，s 9 大小为0 9 7 1 1 0 x3 9 4 2 哪。最适n a c l 浓度均为2 0 ，最适温度是3 8 ， 都含有菌红素( 类胡萝卜素类色素) 。 验证了菌株b 和s 9 紫膜产生的条件、分离及其纯化。 利用p l a c k e a - b u r m a n 法和正交试验设计筛选和优化菌株b 和 s 9 的培养条件与用单因子试验法优化培养条件得到的结果相一致。 优化后的培养条件是： b 培养基( 玑) ： m g s 0 4 7 h 2 02 0 ，酪蛋白氨基酸5 ，n a c l2 0 0 ，酵母浸膏1 0 ， 柠檬酸钠2 2 5 ，f e s 0 4 7 h 2 0 0 0 5 ，k c l2 5 ，甘油1 0 ，p h6 5 。 装瓶量为瓶体积的1 3 一l 4 ，1 8 0r p m ，光照培养。 s 9 培养基( g l ) m g s 0 4 7 h 2 02 5 ，酪蛋白氨基酸1 0 ，n a c l2 0 0 ，酵母浸膏5 ， 柠檬酸钠2 2 5 ，f e s 0 4 - 7 h 2 00 1 ，k c l2 5 ，甘油l o ，p h7 0 。 装瓶量为瓶体积的1 3 1 4 ，1 8 0r p m ，光照培养。、j 关键词：极端嗜盐菌；紫膜ip l a c k e t t b u r m a n 法；正交试验法； 培养条件 i i 亘j e 盔兰塑主堂焦迨塞一 a b s t r a c t 心a s t e rd e g r e ed i s s e r t a t i o n s t u d y 0 1 1h a l o b a c t e r i a ( c o l l e l l g eo f l i f es c i e n c e ，n o r t h w e s t u n i v e r s i t y , c h i n a ) x u j i n - g u i ( m i c r o b i o l o g y ) d i r e c t e db yg u oa i 1 i a n s o m eb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r sa n do p t i c a lc u l t u r ec o n d i t i o no f t w o s t r a i n sh a l o b a c t e r i u mh a l o b i u mba n ds 9w e r em a i n l ys t u d i e di nt h i s t h e s i s t h et w os t r a i n sw e r ea l l g r a m - n e g a t i v e - b a c t e r i a t h e c o l o ro f c o l o n yi nm i l k s a l t a g a r m e d i u mw a sr e d t h es i z eo fbw a s0 6 9 一 o 9 6x2 7 6 4 1p a n ，a n ds 9w a s0 9 7 1 1 0 3 9 4 2 阻n t h eb e s t c o n c e n t r a t i o no f n a c lw a s2 0 a n dt e m p e r a t u r ew a s3 8 b o t hs t r a i n s c o n t a i n e db a c t e r i o r u b e r i n t h ec u l t u r e s e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o no fp u r p l em e m b r a n ew e r e t e s t e di nt h i st h e s i s t h er e s u l t ss c r e e n i n ga n do p t i m i z i n gb yp l a c k e t t - b u r m a nd e s i g n a n do r t h o g o n a lt e s ta c c o r d e dw i t ht h er e s u r so p t i m i z i n gb yt h es i n g l e f a c t o rt e s t t h eb e s tr e s u l t sa sf o l l o w i n g ： c u l t u r em e d i u mo fb ( g l ) ：m g s 0 4 7 h 2 02 0 ，c a s a m i n oa c i d5 ， n a c l2 0 0 ，y e a s te x t r a c t i o n1 0 ，t r i s o d i u mc i t r a t e2 2 5 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 5 ， k c l 2 5 ，g l y c e r o l1 0 ，p h 6 5 t h ec u l t u r ev o l u m ew a sf r o m1 4t o1 3o f t h ec o r d c a tf l a s kv o l u m e ，a n ds h a k i n g s p e e d w a s1 8 0 r p mw i t h i l l u m i n a t i o n c u l t u r em e d i u mo f s 9 ( g l ) ：m g s 0 4 7 h 2 02 5 ，c a s a m i n oa c i d1 0 ， n a c l2 0 0 ，y e a s te x t r a c t i o n5 ，t r i s o d i u mc i t r a t e2 2 5 ，f e s 0 4 - 7 h 2 00 1 ， k c l 2 5 ，g l y c e r o l1 0 ，p h 7 0 t h ec u l t u r ev o l u m ew a sf r o m1 4t o1 3o f t h ec o n i c a lf l a s k v o l u m e ，a n ds h a k i n gs p e e d w a s18 0 r p mw i t h i i l u m i n a t i o n k e y w o r d s ：h a l o b a c t e r i a ，p u r p l em e m b r a n e ，p l a c k e t t - b u r m a nd e s i g n ， o r t h o g o n a lt e s t ，c u l t u r ec o n d i t i o n y 2 97 97 亘j 盔堂堡主堂焦兰塞二一 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得 酉j 量太堂 或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名 梅食粮 签字日期：删略年芗月日 西北大学硕士学位论文 第一章前言 1 嗜盐菌的生态习性及分类 1 1 生态习性 地球表面除广阔的海洋( 海水盐浓度为3 5 一3 8 ) 之外，陆地上还嵌布着 许多盐池、盐湖和盐碱湖。闻名于世的死海含盐量高达3 5 ，我国西藏、青海 和内蒙古等地都有数量众多的含盐量高的盐湖和盐碱湖。初步调查，在这些盐 域环境中都有微生物生长，且盐碱湖中生活的菌量往往高于盐湖川。 嗜盐菌除需钠盐外，还需钾盐( k c i ) ，镁盐( m g c l 2 或m g s 0 4 ) 等。嗜盐 菌多是好气化能异养，以氨基酸或碳水化合物为能源。细胞含类胡萝h 素，菌 体呈红、桃红、紫色，不运动或丛生鞭毛运动，革兰氏染色阴性。嗜盐菌形态 多样，除常见的杆状、球状外( 随盐浓度和生长时间的不同，杆菌的形态常发 生变化) ，还有方形、盘状和三角形态的细胞。 1 2 分类 根据细菌与盐浓度之间的关系，k u s h e r n e r t 2 】等人将细菌分为三类，见表1 ： 表1 不同的微生物对n a c i 的反应 t a b ie f f e c to nn a c io f d i f f e r e n t m i c r o b i o l o g y 表中将生长在0 2 - - 5 2m o l l ( 1 1 7 一3 0 4 2 ) n a c i 浓度中的细菌统称为 嗜盐菌。在微生物学的范畴内，e x t r e m l yh a l o p h l i eb a c t e r i a 或h a l o p h l i cb a t e r i a 或h a l o b a c t e r i a 同属一个意义的学术名词，即指对2 5m o l l ( 1 4 6 3 ) 以f - n a c l 的浓度有特殊适应能力的细菌。 极端嗜盐菌为古细菌类引，属于盐杆菌目( h a l o b a c t e r i a l e s ) ：细胞呈杆状或 西北大学硕士学位论文 球状，并出现了许多退化的类型，从圆盘形到三角形都有。不运动或靠丛生极 端鞭毛运动。革兰氏染色阴性或革兰氏阳性( 在2 乙酸固定后) 。好氧或兼性 厌氧。所谓极端嗜盐菌是指这些细菌不仅嗜盐，而且需要很高浓度的盐，某些 菌株甚至要求接近于饱和的盐浓度。它们的生长至少需要1 5m o l ln a c l ，但 大多数菌种在3 5 4 0m o l ln a c i 生长最好。由于细胞内含有c 5 0 类胡萝h 素 ( 菌红素) ，使其菌落具有各种红色色调，并使得该菌在自然环境中群体生长时 呈现红颜色。视黄醛类色素在这类细菌中可能是普遍存在的，它们能使离子运 动并穿过细胞膜。这些色素中的一种称为菌视紫素( b a t e r i o p u r p u r i n ) ，可作为 质子泵，被光能所驱动。含有这种特殊色素的嗜盐菌能够利用所产生的质子梯 度合成a t p 。最适的生长温度为3 5 - - 5 0 。化能有机营养，利用氨基酸或碳水 化合物作为碳源。在细胞内，通过积累高浓度的k c l 来实现其渗透调节。茵体 内含有a b b c 型的r n a 聚合酶，其d n a 通常含有较大组分和较小组分，较 小组分接近总d n a 的含量( b d ) 的3 0 。含有较小组分d n a 的菌株一般含 有大质粒( l o o k b ) 。较大组分d n a 的m 0 1 g + c 是6 1 - - 7 1 ，较小d n a 的 t 0 0 1 g + c 是5 l 一5 9 ( b d ) 。极端嗜盐菌普遍分布在高盐浓度的自然界，例如 盐湖、盐碱湖和盐场，也常见于晒制的粗盐和用晒盐腌制的蛋白制品( 咸鱼和 皮革) 。 本目含一科，盐杆菌科( h a l o b a c t e r i a c e a e ) 。本科包括六个属，根据其最适 生长p h 值可分为两群：一群生长在中性或偏中性条件下( p h 5 - - 8 ) ，并需要至 少5m m o l lm 9 2 + 离予( 第1 4 属) ；另一群是嗜盐嗜碱杆菌，仅生长在高p h ( p h 8 5 1 1 o ) ，只需要很低浓度的m g ”( f oo ，因素影响特别显 著，记为”；f o l o f a f o0 5 ，因素影响显著，记为f a f 0 1 0 ，影响不显著。 由表6 可看出因素d ( 甘油) 对盐生盐杆菌b 菌体生长的影响极其显著， 因素a ( n a c l ) 、c ( 酪蛋白氨基酸) 对盐生盐杆菌b 菌体生长影响显著，而因 素b ( 柠檬酸钠) 对盐生盐杆菌b 菌体生长影响不显著。因而，在实验中应主 要考虑甘油、n a c l 和酪蛋白氨基酸等对盐生盐杆菌b 菌体生长的影响。 3 9 菌s 9 的p l a e k e t t b u r m a n 设计和正交试验优化结果 3 9 1p l a e k e t t b u r m a n 设计筛选影响菌s 9 生长的重要因子的结果 表7s 9 的p l a c k e t t - b u r m a n ( n = 1 6 ) 设计表和实验结果 t a b 7p l a c k e t t - b u r m a m d e s i g n ( n = 1 6 ) a n d r e s u l t so fs t r a i ns 9 实验号a bcdef ( g ) ( h ) i jklm ( n ) ( o ) 评价指标 ( o d 6 6 0 ) i +一 + 一+一一+ 一 一一0 5 2 0 2 +一+一+一一+ 一 一 一+ 0 5 5 5 3 十+一+一 +一 一 + 一 一一+ 0 5 3 6 4 +一+一+ + 一 一+ 一一一+ +05 3 2 5 一 十 一 +一一+一一一+0 5 1 7 6 4 - 一+4-一一+一一 一+ 一0 4 6 4 7 一+一一+一 一 一 +一 +0669 8 +一一+ 一 一一+ +一+一0 6 8 1 9 +一一 +一一一+ 一+一 + 0 4 6 3 l o 一一+一一一+一 +一+ 0 5 9 5 1 1 一 十一一一十+ 一+一+一 0 8 2 3 1 2 4 - 一一 一+一+ 一+ 一 一03 3 6 1 3 一一一+ 一+ 一+ 一一+ 0 8 1 2 1 4 一一十+ +一+一+一 一+一 0 7 8 0 1 5 一 十+ 一十一+一 一+一一 0 7 7 9 1 6 一一一一一一 一一一一一 一 一 一 一0 4 4 6 - 2 7 - 西北大学硕士学位论文 选用n = 1 6 的p l a c k e t t b u r m a n 设计对1 1 个因素进行研究，另外剩余的4 个因素为空项，作为误差分析项。每个因素取两个水平：低水平“一”，常为出 发培养基组成及原始培养条件；高水平“+ ”，依据经验选取，一般不超过低水 平的2 倍。实验结果见表7 。各因素所代表的参数、水平及结果分析见表8 。结 果分析参照s t o w e 和m a y e r 的方法。 由表8 的结果分析可知，可信度大于7 0 的因素为影响盐生盐杆菌s 9 生 长的重要因素。它们分别是n a c i 、酪蛋白氨基酸、甘油和m g s 0 4 7 1 - 1 2 0 。其 它小于7 0 的因素不是重要因素，其水平取低水平，不做进一步的研究。在4 个重要因素中，n a c l 以低水平为好，而酪蛋白氨基酸、m g s 0 4 7 h 2 0 和甘油 以高水平为好。 表8s 9 的因素、水平及其影响效果 t a b 8f a c t o r s l e v e l sa n dr e s u l t so fs t r a i n8 9 3 9 2 正交实验设计结果及其分析 ( 1 ) 对于p l a c k e t t - b u r m a n 法筛选的4 个重要因素中，根据经验知，各因 素间的交互作用极小，可以忽略，故采用如o 。j 正交表进行研究。表头设计 西北大学硕士学位论文 及实验结果与分析见表9 。根据各因素的极差( r ) 大小，可确定各因素的最优水 平。由此得出各因素的最优水平为n a c i2 0 0g l ，酪蛋白氨基酸1 0g l ， m g s 0 4 7 h 2 0 2 5g l ，甘油1 0g l 。由此初步确定最优组合为：a 3 b i c 2 d 3 。 表9s 9 的厶f ，) 正交表与实验结果 t a b 9 o r t h o g o n a l t a b l eo f 翩a n dr e s u l t so fs t r a i ns 9 实验号 a n a c l b 酪蛋白氨基酸 c m g s 0 4 。7 h 2 0 d 甘油 评价指标 o d 6 6 0 1 ( 2 3 0el ) 1 ( 2 3 0 9 l ) 1 ( 2 3 0 9 l ) 2 ( 1 7 0 9 l ) 2 ( 1 7 0 9 l ) 2 ( 1 7 0 9 l ) 3 ( 2 0 0 9 l ) 3 ( 2 0 0 9 l ) 1 0 0 9 l ) 2 ( 5 0 9 l ) 3 仃5g l ) 1 ( 1 0 9 l ) 2 ( 5 0 9 i ) 3r 7 5 9 l ) i ( 1 0 9 l ) 2 ( 5 0g l ) l ( 1 5g l ) 2 ( 2 5 9 l ) 3 ( 2 0 9 l ) 2 ( 2 5g l ) 3 ( 2 0g l ) 1 0 5 9 l ) 3 ( 2 0 9 l ) 1 ( 1 5g l ) 1 f 5 0g l ) 2 ( 7 5 9 几) 3 ( 1 0g l ) 3 ( 1 0 9 l ) ir 5 0g l ) 2 ( 7 5g l ) 2 ( 7 5g l ) 3 ( 1 0 9 ，l ) 0 1 9 6 0 2 1 2 o 2 7 l 0 3 7 0 0 2 0 6 0 3 3 0 0 3 5 3 0 2 6 4 9 3 ( 2 0 0 9 l )3 ( 7 5g l )2 ( 2 5g l ) 1 ( 5 0 9 l ) 0 2 9 5 k 10 6 7 90 9 1 9 0 7 9 0o 6 9 7 k 2o 9 0 6o 6 8 2 o 8 7 70 8 9 52 4 9 7 k 30 9 1 2 0 8 9 60 8 3 0 0 9 0 5 r0 2 3 30 2 3 7 0 0 8 70 2 0 8 优化组合a 3b 1 c 2d 3 ( 2 ) 极差分析 由表9 中的极差可看出，酪蛋白氨基酸的r 值最大，其次是n a c i ，再次是 甘油，最小的是m g s 0 4 7 h 2 0 ，这代表了它们对菌s 9 生长影响的大小。所以 选择a 3 b l c 2 d 3 为最佳条件。 3 1 0 单因子试验优化菌b 和s 9 的实验结果 3 1 0 1m g s 0 4 7 h 2 0 浓度对菌b 和s 9 生长的影响 实验结果见图9 。对于菌b ，在小于2 0g l 的浓度下， m g s 0 4 7 h 2 0 可 以促进其菌体的生长，而高于2 0g ，l 时，反而有抑制作用。而菌s 9 则需要更 高浓度的m 9 2 + ，低浓度的m g ! + 反而不利于其菌体生长，所以其最佳浓度为2 5 巩。 - 2 9 堕j e 盔堂堡主堂垡鲨塞一一 在极端嗜盐菌中，m 9 2 + 有保持细胞结构和硬度的作用。另外，镁还是一些 酶的激活剂。镁还起到稳定核糖体、细胞膜和核膜的作用。缺乏镁，细胞生长 就会停止。菌b 和s 9 需要高浓度的m 矿，这也与其原始生长环境有关7 2 1 。 o51 01 52 02 53 0 + 菌b + 菌s 9 浓度( 扎) 图9 m g s 0 4 7 h 2 0 浓度对菌b 和s 9 生长的影响 f i g 9e f f e c to fm g s 0 4 7 h 2 0 c o n c e n t r a t i o no nt h eg r o w t ho fs t r a i n sba n ds 9 3 1 0 2 酪蛋白氨基酸的浓度对菌b 和s 9 生长的影响【7 2 1 结果见图1 0 ，由图可知，对于菌b ，酪蛋白氨基酸的浓度选用5g l 为最 佳，过高或过低的浓度均不适宜其生长的。对于s 9 ，酪蛋白氨基酸的浓度则以 1 0 l 为最佳。说明，s 9 比b 需要更高浓度的酪蛋白氨基酸。生长中如果没有 酪蛋白氨基酸，则菌b 和s 9 的生长都很缓慢，而且通过显微镜的观察，形态 多样。盐生盐杆菌以氨基酸为其主要的碳源，从氨基酸中获得能量【7 3 1 ，所以缺 少氨基酸，则其生长受阻碍。而酪蛋白氨基酸的主要成分是各类氨基酸，这为 其生长提供了充分的碳源和能源。同时，酪蛋白氨基酸也是其主要的氮源，其 所含的氨基酸可直接被吸收而参与代谢。 3 1 0 3n a c i 浓度对菌b 和s 9 生长的影响 结果见图1 l ，结果指出，菌b 和s 9 的最适n a c l 浓度为2 0 。在低于1 0 的浓度下生长，菌b 和s 9 生长很弱。在显微镜下观察，5 的浓度中，菌体多 球状，而且数量不多；1 0 的浓度中，亦是球状多于杆状；而在3 0 的浓度中， 虽然菌体数量较1 5 的少，但菌体形态正常，多杆状。在2 0 的浓度中，菌体 数量多，且杆状居主导地位。这说明这两株菌是极端嗜盐菌。在嗜盐菌中，n a + 有通过维持细胞渗透压而维持细胞结构的作用，同时还与营养物质的吸收有关 西北大学硕士学位论文 【7 4 j 0 8 o 6 苔o 4 o 0 2 o 0 2 55 7 51 0 1 2 5 + 菌b+ 菌s 9浓度( 扎) 图1 0 酪蛋白氨基酸对菌b 和s 9 生长的影响 f i g 1 0e f f e c to f c a s a m i n oa c i dc o n c e n t r a t i o no nt h eg r o w t h o f s t r _ i n sba n ds 9 5 l o1 5 2 0 2 5 3 0 浓度( ) + 菌b + 菌s 9 图i i n a c i 浓度对菌b 和s 9 生长的影响 f i g 1 1e f f e c to f n a c ic o n c e n t r a t i o no nt h eg r o w t ho f s t r a i n s b _ ds 9 3 1 0 4 酵母浸膏浓度对菌b 和s 9 生长的影响【7 5 l 结果见图1 2 。酵母浸膏为菌体的生长提供了有机氮源，其功能是提供细胞 原生质和其它结构物质中的氮素。结果指出，对于菌b ，最适酵母浸膏浓度是 - 3 l - o 咕o o 西北大学硕士学位论文 1 0g l ，过高和过低均不适于其生长。而对于菌s 9 来说，其最适浓度是5g l 低于5 班，则生长缓慢，太高，反而不利于s 9 的生长。 0 8 0 6 8 吕o 4 o 0 2 o o2 55 + 葡b 7 5 + 菌s 9 1 01 2 5 浓度( g ，l ) 图1 2 酵母浸膏浓度对菌b 和s 9 生长的影响 f i l l 2e f f e c to fy e a s te x t r a t i o nc o n c e n t r a t i o no nt h eg r o w t ho fs t r a i n sba n ds 9 3 1 0 5 柠檬酸钠浓度对菌b 和s 9 生长的影响 结果见图1 3 ，对于菌b 和s 9 ，柠檬酸钠的浓度均以2 2 5g ，l 为最适。 0 0 5l1 5 22 53 3 5 + 菌b + 菌s 9浓度( g l ) 图1 3 柠檬酸钠浓度对苗b 和s 9 生长的影响 f i g 1 3e f f e c to f t r i s o d i u mc i t r a t ec o n c e n t r a t i o no nt h eg r o w t ho f s t r a i n sb a n ds 9 3 2 6 5 4 3 2 o 0 o o o 0 o o 心心o o 亘j ! 盔堂堡主堂垡鲨塞 3 1 0 6f e s 0 4 7 h 2 0 的浓度对菌b 和s 9 生长的影响1 7 6 i 结果见图1 4 ，f e 2 + 是微量元素，是过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素和 细胞色素氧化酶的组成元素。在极端嗜盐菌中与细胞色素的形成有关。由结果 看出，对于菌b 的生长，f e s 0 4 7 h 2 0 的浓度应选择5 0m g ，l 。而菌s 9 应选 择1 0 0m g l 的浓度为其最佳浓度。 05 01 0 01 5 02 0 0 浓度( r a g l ) + 菌b+ 菌s 9 图1 4 f e s 0 4 7 h 2 0 的浓度对菌b 和s 9 生长的影响 f i g 1 4e f f e c to f f e s 0 4 7 h 2 0c o n c e n t r a t i o no nt h eg r o w t ho f s t r a i n sb a n ds 9 3 1 0 7 初始p h 值对菌b 和s 9 生长的影响 结果见图1 5 ，c m 培养基未调p h 值时，其自然p h 是5 ，在该p h 条件下， 不利于菌b 和s 9 的生长，因为过酸的条件会造成菌体的裂解。随着d h 值的增 大，酸性降低，菌b 和s 9 的生长条件逐渐变优。从结果看出，菌b 的初始p h 以6 5 为最佳，其适宜生长的p h 范围在6 0 到7 5 之间，过高或过低均不利于 其菌体生长。而s 9 在p h 6 5 到8 o 之间均可生长良好，其最适初始p h 值为7 o 。 这也正说明了盐生盐杆菌适宜生长在中性或弱酸性的条件下。 3 1 0 8k c ! 浓度对菌b 和s 9 生长的影响1 7 7 】 结果见图1 6 ，k + 是盐生盐杆菌体内的主要阳离子，其功能是用来维持核糖 体结构的完整和蛋白质的合成，并且是对保持细胞内各种酶类的活性需要的多 种离子之一。结果指出，在无k c l 时，菌b 和s 9 的生长均很弱，低浓度下， 菌体生长比无k c l 的条件下好，随着k c l 浓度的升高，而菌体生长逐渐转好。 两株菌的最适k c l 浓度都是2 5g ，l 。在低于1g ，l 浓度下，不利于菌体生长。 o 均崎凸。 西北大学硕士学位论文 55 56 6 577 58 + 菌b + 菌s 9 p h 图1 5 初始p h 值对菌b 和s 9 生长的影响 f i g 1 5e f f e c to f o r i g i n a lp h o nt h eg r o w t ho f s t r a i n sba n ds 9 00 5 11 5 22 53 + 菌b + 菌s 9 浓度( g l ) 图1 6 k c i 浓度对菌b 和s 9 生长的影响 f i g 1 6e f f e c to f k c ic o n c e n t r a t i o no nt h eg r o w t ho f s t r a i n sba n ds 9 3 1 0 9 甘油浓度对菌b 和s 9 生长的影响 结果见图1 7 ，对于菌b 和s 9 来讲，在1 0g l 的浓度下，菌体生长要优于 其它浓度下。虽然在无甘油的条件下，菌b 和s 9 都能生长良好，但加入甘油 后，其生长被明显促进。伯杰手册第八版中指出，一定浓度的甘油能够促进紫 膜的形成 7 2 】。 o o o 一一 塑j e 盔堂塑主堂焦迨塞 + 菌b+ 菌s 9 浓度( 扎) 图1 7 甘油浓度对菌b 和s 9 生长的影响 f i g 1 7e f f e c to f g l y c e r o lc o n c e n t r a t i o no nt h e g r o w t ho f s t r a i n sb _ n d s 9 3 i o 1 0 蔗糖浓度对菌b 和s 9 生长的影响 结果见图1 8 ，蔗糖对菌b 和8 9 的生长影响不明显，这也说明菌b 和s 9 不能利用或很少利用蔗糖作为其碳源，这也与文献报道相一致r 7 3 1 。故采用原始 水平，即在培养中不加蔗糖。 浓度( 以) + 菌b + 菌s 9 图1 8 蔗糖浓度对菌b 和s 9 生长的影响 f j g 1 8e m 。l 。fs a c r o s ec o n c e n t r a t i 。n 。nt h e g r o w t h 。f s t r a t i 。n sba n ds 9 - 3 5 - o o o o 崞心口。 璺j 盔堂堡圭堂垡坠茎 一 3 1 0 1 1 葡萄糖浓度对菌b 和s 9 生长的影响 结果见图1 9 ，葡萄糖对菌b 和s 9 的生长影响不明显，这也说明菌b 和s 9 不能利用或很少利用葡萄糖作为其碳源，这也与文献报道相一致【7 3 】。故采用原 始水平，即在培养中不加葡萄糖。 057 51 01 2 5 浓度( 班) + 菌b + 菌s 9 图1 9 葡萄糖浓度对菌b 和s 9 生长的影响 f i g 1 9e f f e c to f g l u c o s ec o n c e n t r a t i o no nt h eg r o w t ho fs t r a i n sba n ds 9 3 1 0 1 2 鱼粉蛋白胨浓度对菌b 和s 9 生长的影响 7 4 , 7 5 , 7 6 】 结果见图2 0 ，鱼粉蛋白胨含有丰富的氨基酸，可为菌b 和s 9 的生长提供 碳源和氮源。从结果上看，无蛋白胨的培养基与添加蛋白胨的培养基对于菌体 的生长的影响不是很大，这可能是由于酪蛋白氨基酸存在的原故( 各浓度梯度 中均含有7 5g l 酪蛋白氨基酸) ，即酪蛋白氨基酸在给菌b 和菌s 9 提供碳源 和氮源方面的能力可能优于鱼粉蛋白胨的。而且二者混合后，在鱼粉蛋白胨浓 度高的时候，反而会抑制菌体的生长。因而，在实验中，鱼粉蛋白胨和酪蛋白 氨基酸不同时加入，只有其一即可。 3 1 0 1 3 通气量对菌b 和s 9 生长的影响【9 l 实验结果见图2 1 ，三角烧瓶中的装瓶量决定了在培养过程中培养液中的溶 氧量。在培养过程中发现，在6 0m l 的装瓶量，培养完毕后会有盐粒析出，这 是由于培养温度是3 8 ，转速是1 8 0r p m ，而且培养液中盐浓度很高的缘故， 而造成水分的过度蒸发。而其余的三个装瓶量，这种现象则没有。这说明装瓶 量大，可减少水分的蒸发。由结果可看出，对于菌b 和s 9 ，其装瓶量均以8 0m l 为最佳。而太大的装瓶量虽能有效的防止水分蒸发，但却减少了溶氧量而使菌 - 3 6 - o 协o o 西北大学硕士学位论文 体在生长过程中缺氧而致使生长不好。 0 8 0 6 苫0 4 o 0 2 o o2 5 7 5l o 1 2 5 浓度( g l ) + 菌b + 菌s 9 图2 0 鱼粉蛋白胨对菌b 和s 9 生长的影响 f 培2 0e f f e c to fp e p t o n ec o n c e n t r a t i o no nt h eg r o w t ho fs t r a i n sba n ds 9 o 8 o 6 0 4 o 2 0 6 0 7 0 8 09 01 0 0 + 菌b+ 菌s 9 装瓶量( m l ) 图2 1 通气量对菌b 和s 9 生长的影响 f i g 2 1e f f e c to fc u l t u r ev o l u m eo nt h eg r o w t ho fs t r a i n sba n ds 9 3 1 l 优化组合的实验结果 结合p l a k e t t b u r m a n 法和正交试验法筛选和优化菌株b 和s 9 生长条件的 结果与单因子试验法优化b 和s 9 的结果，得出b 和s 9 的优化组合的实验结果 如下： - 3 7 o 岫岫o o 西北大学硕士学位论文 菌b ：培养基( g l ) m g s 0 4 。7 h 2 02 0 ，酪蛋白氨基酸5 ，n a c l2 0 0 ，酵母浸膏1 0 ，柠檬酸钠 2 2 5 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 5 ，k c l2 5 ，甘油1 0 ，口h6 5 。 装瓶量为瓶体积的1 3 一l 4 ，光照，1 8 0r p m 培养。 菌s 9 ：培养基( g l ) m g s 0 4 7 h 2 02 5 ，酪蛋白氨基酸1 0 ，n a c i2 0 0 ，酵母浸膏5 ，柠檬酸钠 2 2 5 ，f e s 0 4 7 h ：o0 1 ，k c l2 5 ，甘油1 0 ，d h7 o 。 装瓶量为瓶体积的1 3 1 4 ，光照，1 8 0r p m 培养。 3 1 2 优化组合的验证结果 验证结果见表，由表可知，优化后的条件比原始条件的确优良。 表l o 菌b 和s 9 的验证结果 t a b 1 0r e s u l t st e s t e do fs t r a i n sb a n ds 9 原始条件 优化后条件 b ( o d 6 6 0 ) 0 6 7 0 9 0 s 9 ( o d 6 6 0 ) 0 4 2 0 6 3 一 3 1 3 扩大实验的结果 表1 1 菌b 和s 9 扩大实验结果 t a b 1 1r e s u l t s o f m a g n i f y i n ge x p e r i m e n to f s t r a i n sba n ds 9 3 y ( o d 6 6 0 ) 0 3 2 o 5 8 0 4 1 一 由表中结果可知，在利用加气泵进行大量培养时，通气量应选择ll m i n 的为最佳，因为这样的通气量可以保证i l 的培养液中的溶氧量处于饱和状态， 利于菌体的早期生长。在到达对数生长末期时，减缓通气量，这样可以使培养 液处于缺氧状态，利于菌体细胞中紫膜的生长。在通气时，为避免培养液的过 度蒸发，因而，空气在未进入培养液前需要先流过蒸馏水。培养液中可以喷雾 微量抗泡剂，以防止泡沫的大量形成。 第三章小结 1 极端嗜盐菌是古细菌，由于其生长环境需要高浓度的n a c l ，因而，其有 关特性引起了人们的注意。它们能够生产许多有意义的物质，如盐杆菌属中产 生的淀粉酶，需要6 n a c l 来维持它的酶活性，而其产生的蛋白酶却需要1 2 一2 4 的n a c l 来维持酶活，这些特性决定了其是工业上耐盐酶的主要来源。盐 丰产菌属中的有些菌株可以生产聚羟基丁酸。而自从六十年代，人们在盐杆菌 属中发现紫膜后，关于紫膜的研究就多了起来，主要集中在紫膜结构及其机理 和用途等方面的研究。盐生盐杆菌能够利用紫膜进行光合作用，与叶绿素参与 的光合作用相比，这一种更为简单。随着对紫膜的深入研究，其结构已经很清 楚，其用途也更加广泛。 2 关于极端嗜盐菌的研究，主要集中在紫膜、新种的发现以及分类等，而 在盐杆菌的培养条件方面显得就不多了。鉴于紫膜的用途广泛，因而，有必要 优化其培养条件，增加生物量，提高其紫膜产量。然而，由于菌盐生盐杆菌的 生长环境高盐，其代时又长，所以菌体的生长并不旺盛。本文正是基于这一基 础而进行研究的。文中在确定了盐生盐杆菌产紫膜的规律后，利用菌体的生物 量作为优化培养条件的评价指标，来推导出紫膜产量的高低，这可减少大量的 工作量。 3 本文采用了p l a c k e t t b u r m a n 法筛选出了影响这两株菌生长的重要因子， 而后利用正交试验法将其优化，这既可以节省人力、物力，又能从众多的因素 中快速筛选出重用因子供进一步实验用，从而可以提高实验效率。 4 本文为进行进一步的实验打下了基础，如果条件允许，将在菌种选育和 发酵罐生产紫膜以及耐盐酶等方面作进一步的试验研究。 堕j 盔兰堕主兰垒堡塞 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 i 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 参考文献 周培瑾嗜盐细菌微生物学通报，1 9 8 9 ，1 6 ( 1 ) ：3 i - - 3 4 k u s h n e r ，d j l i f ei nh i g hs a l ta n ds o l u t ec o n c e n t r a t i o n s ，i n m i c r o b i a ll i f ei ne x t r e m e n v i r o n m e n t s ”a c d e m i c p r e s s l o n d o n , 1 9 7 8 3 1 7 3 6 8 杨苏声编细菌分类学北京：中国农业大学出版社，1 9 9 7 ，1 3 0 1 3 2 田新玉，周培瑾，王大珍极端嗜盐菌和耐盐菌的区别微生物学报，1 9 9 0 ，3 0 ( 4 ) ： 3 1 4 3 1 7 b r o w n a d ，s h o r e yc d ，t u r n e r h p a na l t e r n a t i v em e t h o do f i s o l a t i n g t h em e m b r a n e o f a h a l o p h i l i cb a c t e r i u m j g e n m i c r o b i 0 1 1 9 6 5 ，4 1 ( 2 ) ：2 2 5 3 1 k u s h n e r d j h a l o p h i l i c b a c t e r i a a d v a p p l m i c r o b i o l r e v i e w ，1 9 6 8 ，1 0 ：7 3 - 9 9 k a t e sm e t h e rl i p i d s 。c h e m i s t r ya n db i o l o g y a e d e m i cp r e s s ，n e wy b r ka n dl o n d o n , 1 9 7 2 3 5 1 3 9 8 t o m a b e n et g ，k a t e s m ，g e l p ie ，o r o j o c c u r r e n c eo f s q u a l e n e ，d i a n d t e t r a h y d r u s q u a l e n e s ，a n d v i t a m i nm k 8i na n e x t r e m e l yh a l o p h i l i cb a c t e r i u m ， h a l o b a c t e r i u mc u t i r u b r u m j l i p i dr e s ，1 9 6 9 ，1 0 ( 3 ) ：2 9 4 3 0 3 焦瑞身，周德庆编微生物生理代谢实验技术北京：科学出版社，1 9 9 0 1 5 8 1 5 9 g e r b e rg e ，a n d e r e g g r j ，h e r l i h yw c p a r t i a lp r i m a r ys t r u c t u r eo fb a c t e r i o r h o d o p s i n ： s e q u e n c i n gm e t h o d sf o rm e m b r a n ep r o t e i n s p r o en a t la c a ds c iu sa ，1 9 7 9 ，7 6 ( 1 ) ： 2 2 7 - 2 3 1 刘岳峰嗜盐微生物的应用现状和展望微生物学通报，1 9 9 2 ，1 9 ( 2 ) ：1 0 8 一1 1 1 罗文生，沈萍盐生盐杆菌灭活原生质体融合的研究武汉大学学报( 自然科学 版) ，1 9 9 5 ，4 1 ( 6 ) ：7 5 1 7 5 6 傅学奇，王今堆，周勇亮等细菌视紫红质的分离提纯及鉴定吉林大学自然科 学学报，1 9 9 5 ，( 1 ) ：8 4 8 6 辛化伟，阎章才，周培瑾盐生盐杆菌在不同营养条件下紫膜蛋白形成的差异微 生物学报，1 9 9 9 ，3 9 ( 3 ) ：2 2 0 2 2 5 k u s h w a h as c ，k a t e sm i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n o f ”b a c t e r i o r h o d o p s i n ”a n d m i n o rc 4 0 一c a r o t e n o i d si nh a l o b a c t e r i u mc u t i r u b r u m b i o c h i mb i o p h y sa c t a 1 9 7 3 ， 31 6 ( 2 ) ：2 3 5 - 4 3 b l a u r o c ka e ，s t o e c k e n i u sw s t r u c t u r eo f t h ep u r p l em e m b r a n e n a t u r e ，1 9 7 1 ，2 3 3 ： - 4 0 亘! 盔堂亟主堂垡量奎 1 5 2 - 1 5 3 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 3 0 3 k h o r a n ah g ，g e r b e