（微生物学专业论文）极端嗜热古菌—硫化叶菌拓扑异构酶的研究.pdf

摘要 硫化叶菌( s u l f o l o b u s ) 是一种极端嗜热古菌，其最适生长温度为8 0 。c ，最适 生长p h 为3 左右，基因组d n a 被认为呈松弛状态或略带正超螺旋。本文通过 qs e p h a r o s e 、h e p a r i n 柱层析，结合s d s p a g e 纯化、变性、复性等步骤，从 芝田硫化叶菌( s j f 6 4 缸p ) 中分离纯化了一种反旋转酶。s d s p a g e 显示，纯 化的反旋转酶分子量为1 2 6 k d a ，在m 9 2 + 或c a 2 + 存在的情况下可利用a t p 水 解的能量在低盐浓度下( 1 0 m mn a c i ) 向d n a 分予中引入正超螺旋。n 一末端 序列及同源性搜索发现，该酶的编码基因为t o p r l ，而非先前从该菌中克隆得 到的t o p r 基因。 拓扑异构酶i 是在细菌、古菌和真核生物中普遍存在的一种拓扑异构酶。已 完成全序列测定的硫磺矿硫化叶菌( ss o l f a t a r i c u s ) 编码一个推测的拓扑异构 酶i ( s s ot o p oi ) 。本文克隆并在大肠杆菌中表达了编码s s ot o p oi 的基因，采用 一个包括热处理的简单纯化程序纯化了重组蛋白。活性分析表明，重组蛋白能 够松弛负超螺旋d n a ，因此是拓扑异构酶i 。定点突变实验证实3 18 位的酪氨 酸是该酶的活性位点，突变酶( y 3 1 8 f ) 完全丧失了负超螺旋松弛活性和寡核 苷酸切割能力。s s ot o p oi 不能松弛正超螺旋d n a ，其负超螺旋d n a 松弛活性 不依赖a t p 的存在，但依赖于二价阳离子( m 9 2 + 或c a 2 + ) 。该酶的最适p h 为 7 5 9 0 ，最适反应温度为7 5 ，该酶具有较高的热稳定性，8 5 。c 保温3 小时 后，酶活只是略有降低。该酶的作用模式受盐浓度的影响，在低盐浓度下( 5 0 r a m ) 为行进式，而在高盐浓度下( 2 0 0 n i m ) 为分布式。在标准的实验条件下，该酶表 现出很高的负超螺旋松弛活性，4 0 f m o l 的酶在3 0 分钟内就可以完全松弛3 0 0 n g 负超螺旋p u c l 8 质粒。对大肠杆菌t o p oi 有抑制作用的化学物质一亚精胺，可 明显促进该酶的活性。 s s o t o p oi 具有对含有特异切割序列的单链寡核苷酸的切割活性，该酶的特 异性切割序列为g ( a t ) c a ( t ) a g ( t ) g ( a ) xlx x 。切割模板的长度对该酶的切割 活性有很大影响，切割模板在切割位点的5 端至少要有8 个碱基，3 端至少要 有2 个碱基。s s d t o p oi 的切割活性依赖于二价阳离子的存在，在试过的阳离子 中，m g ”，c a + ，c u ”，c o ”，m n 2 + 和n i 2 + 等均可支持切割，该酶的切割活性受 温度影响，当温度低于3 7 c 时，活性明显减弱。 本文首次对古菌的拓扑异构酶i 进行了较为详细的研究a a b s t r a c t s u l f o l o b u ss h i b a t a e ，ah y p e r t h e r m o p h i ca r c h a e o n ，l i v e so p t i m a l l ya t8 0 c t h e g e n o m i cd n a i sb e l i e v e dt ob er e l a x e do rs l i 曲t l yp o s i t i v e l ys u p e r c o i l e d am a j o r r e v e r s e g y r a s ew a sp u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yf r o ms u l f o l o b u ss h i b a t a eb yu s i n ga n o v e lp u r i f i c a t i o np r o t o c o li n v o l v i n gc h r o m a t o g r a p h yo nq s e p h a r o s ea n dh e p a r i n s e p h a r o s ec o l u n m sa n de l e c t r o p h o r e s i si ns d s - p o l y a c r y l a r n i d eg e l t h ea c t i v i t yo f t h e g e l p u r i f i e de n z y m ew a sr e c o v e r e db yd e n a t u r a t i o n a n dr e n a t u r a t i o n t h e p r o t o c o la l l o w e de f f e c t i v ea n dr e p r o d u c i b l es e p a r a t i o no fl v e r s eg y r a s ef r o mt h e r e s to ft h ec e l l u l a rp r o t e i n s t h ep u r i f i e dr e v e r s eg y r a s ei sa p p r o x i m a t e l y12 6k d a i nm o l e c u l a rm a s s ，a n di t sa b i l i t yt oi n t r o d u c ep o s i t i v es u p e r c o i l si n t ot o p o l o g i c a l l y c o n s t r a i n e dd n a d e p e n d s o nt h ep r e s e n c eo f a t p , l o ws a l tc o n c e n t r a t i o na n dam e t a l c o f a c t o r ( m 9 2 + o rc a 2 + 1 n t e r m i n a la m i n o a c i ds e q u e n c ea n a l y s i ss h o w st h a tt h e p r o t e i ni se n c o d e db yat o p r - 1h o m o l o g u ea n d n o tt h et o p r g e n ep r e v i o u s l yc l o n e d f r o mss h i b a t a e t o p o i s o m e r a s e ii sw i d e l y p r e s e n t i nb a c t e r i a ，a r c h a e aa n d e u k a r y a ap u t a t i v e t o p oi ae n c o d i n gg e n ew a si d e n t i f i e di nt h eg e n o m eo f ss o l f a t a r i c u s ，w h i c hh a s b e e ns e q u e n c e dr e c e n t l y t h eg e n ew a so v e r e x p r e s s e di ne c o l ia n dp u r i f i e dt o h o m o g e n e i t yu s i n g a s i m p l ep r o c e d u r ei n c l u d i n g ah e a tt r e a t m e n t s t e p m u t a g e n e s i se x p e r i m e n t ss u g g e s tt h a tt h et y r o s i n er e s i d u ea tp o s i t i o n3 18w a st h e a c t i v es i t eo f t h e e n z y m e t h er e c o m b i n a n tp r o t e i ni sh i 曲l ye f f i c i e n ti nr e l a x i n gs u p e r c o i l e dd n ai nt h e p r e s e n c e o fam e t a l c o f a c t o r ( m ，+ o rc a 2 + ) t h ea c t i v i t y o ft h e e n z y m ei s 3 i n d e p e n d e n to f t h ep r e s e n c eo f a t e t h e a c t i v i t yo f t h ee n z y m e i sm o s ta c t i v eo v e r a p hr a n g ef r o m 7 , 5t o9 0 t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ef o rt h ea c t i v i t yo f t h ee n z y m e i s7 5 c s s ot o p oii sr e l a t i v e l yt h e r m o s t a b l e ，i n c u b a t i o na t8 5 cf o r3h o u r s ，t h e p r o t e i nr e t a i n sm u c h o fi t so r i g i n a la c t i v i t y t h ee n z y m er e l a x e st h et e m p l a t ei na p r o c e s s i v em o d ei nl o w s a l ta n dad i s t r i b u t i v em o d ei nh i 曲s a l t s p e r m i d i n e ，a n e c o ，ft o p oii n h i b i t o r , s t i m u l a t et h ea c t i v i t yo f s s o t o p o ia tl o wc o n c e n t r a t i o n s s ot o p oih a so l i g o n u c l e o t i d ec l e a v a g ea c t i v i t yi nt h ep r e s e n c eo f am e t a l c o f a c t o r ( m g ”，c a z + ，c u 2 + ，c d + ，m n 2 + o rn i 2 + ) t h ec l e a v a g ea c t i v i t yd e p e n d s o n t h el e n g t ho f o l i g o n u c l e o t i d e a n ds e q u e n c e ，t h em i n i m a ls u b s t r a t er e q u i r e m e n tf o r c l e a v a g eh a sb e e n d e t e r m i n e dt oc o n s i s to f8b a s e s5 t ot h ec l e a v a g es i t ea n d2b a s e s 3 t ot h e c l e a v a g e s i t e t h e s p e c i f i cc l e a v a g es e q u e n c e i s g ( a t ) c a ( t ) a g ( t ) g ( a ) xix x t h i si st h ef i r s tb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o no f a na r c h a e a lt o p o i s o m e r a s ei 4 缩写表 二硫苏糖醇( d i t h i o t h r e i t 0 1 ) 三羟甲基氨基甲烷( t r i s h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e ) 已二酸四乙酸钠( e t h y l e n e d i a m i n e t e t r aa c e t i ca c i d ) 十二烷基硫酸钠( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 拓扑异构酶( t o p o i s o m e r a s e ) 反旋转酶( r e v e r s eg y r a s e ) 硫磺矿硫化叶菌( s u l f o l o b u ss h i b a t e ) 芝田硫化叶菌( s u t f o l o b u ss u l f o t a r i c u s ) s u l f o l o b u st o k o d a i i 泉古菌( c r e n a r c h a e o t a ) 广古菌( e u r y a r c h a e o t a ) 8 叩羞一誊|一雄(曼油耋 氨基酸缩写表 丙氨酸 精氨酸 天冬酰胺 天冬氨酸 半胱氨酸 谷氨酰胺 谷氨酸 甘氨酸 组氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 赖氨酸 甲硫氨酸 苯丙氨酸 脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 酪氨酸 缬氨酸 珧船衄卸哪弛叭田-羞耻协伽：薹断m砷兰 a r n d c q e g h l k m f p s t w y v 古菌概述 文献综述 长期以来，生命一直被分为两界，即真核生物和原核生物，其区别在于真 核生物有由核膜包裹的典型的细胞核，而原核生物则无细胞核。古菌一直被当 作细菌的一部分。1 9 7 7 年，w o e s e 等人( f o x e la 1 ，1 9 7 7 ，w o e s ee ta 1 ，1 9 7 7 ) 用比 较s s u r r n a ( s m a l ls u b u n i tr i b o s o m a lr n a 。) 序列相似性的方法对细菌进行分类 研究时，发现了一组不同于细菌，后来被称为古细菌( a r e h a e b a e t e r i a ) 的微生物。 此后，更多的系统分类学家用同样的方法比较了更多的生物之间的进化关系， 并构建了系统进化树。分析发现，在数亿年前，由一个共同的祖先产生了两个 分支，其中的一支演化为细菌，而另一支则演化为古菌和真核生物。第二次分 支发生在古菌和真核生物之问，也就是说在进化上，古细菌比真细菌更接近真 核生物。作为第三种生命形式，古细菌与真细菌( e u b a c t e r i a ) 和真核生物共同 构成生物的三大类群。1 9 9 0 年w o e s e ( 1 9 9 0 ) 提出了三域学说，即生物分为真 核生物、细菌、古菌三个域。域( d o m a i n ) 是比界( k i n g d o m ) 更高的分类单位， 为了突出古细菌与真细菌的区别，w o e s e 等将古细菌改称古菌( a r c h a e a ) ，将 真细菌改称细菌( b a c t e r i a ) 。古菌又分为两界一广古菌( e u r y a r c h a e o t a ) 和 泉古茵( c r e n a r c h a e o t a ) ，广古菌包括甲烷菌和表型与之相近的古菌，泉古菌 由一组亲缘关系很近的极端嗜热古菌组成。三域学说使古菌获得了与细菌同等 的分类地位。 自提出之日起，w o e s e 的三域学说在很长一段时间内，一直遭到反对。直到 v e n t e r 领导的小组测定完第一个古菌一詹氏甲烷球菌( m e t h a n o c o c c u s j a n n a s c h i i ) 的基因组全序列并在s c i e n c e 上发表( b u l t e ta 1 ，1 9 9 6 ) 后， 反对之声才有所减弱。在詹氏甲烷球菌的1 7 3 8 个基因中只有3 8 可在数据库 中找到已确定功能的同源基因，有6 与假定的蛋白基因同源。与之相比，流 感嗜血杆菌( h a e m o p h i l i u si n f l u e n z a e ) 的1 7 3 4 个蛋白基因中的7 8 能在公 共数据库中找到同源序列，其中5 8 为已知功能的基因，2 0 为未知功能的基 因。流感嗜血杆菌和生殖道支原体( m y o o p a s m ag e n i t a l i u m ) 分别只有l l 和1 7 的基因可在詹氏甲烷球菌中找到同源序列。而8 3 的生殖道支原体基因 可在流感嗜血杆菌的基因组中找到同源基因( f l e i s c h m a n n ，1 9 9 5 ，f r a s e r ， 1 9 9 5 ) ，基因组学强有力的证据证明了w o e s e 三域学说的正确性。詹氏甲烷球菌 基因序列初步反映出了古菌与另外两个生物类群之间的亲缘关系。即在产能、 纽胞分裂、代谢等方面，古菌与细菌相似；而在转录、翻译、和复制等方面则 与真核生物更相似。 古菌的生长环境大多比较特殊，如深海海底热溢口、地热泉、盐碱湖、寒 冷的极地水域等。按其生活习性古菌大致可分为；嗜高压菌( 存在于深海火山 口) 、嗜盐菌( 存在于盐湖) 、嗜热菌和极端嗜热菌( 分别存在于 5 0c i c 和 7 0 的生境中) 、嗜冷菌( 极地海水中) 、嗜酸菌( 酸性含硫温泉中) 、嗜碱菌( 碱湖 中) 。目前可在实验室培养的古菌主要有产甲烷菌、极端嗜热菌和极端嗜盐菌。 其中，产甲烷菌生活于富含有机质且严格无氧的环境中，如沼泽地、水稻田、 反刍动物的反刍胃等，参与地球上的碳素循环，负责甲烷的生物合成。极端嗜 热菌主要存在于含硫或硫化物的陆相或水相地质热点，如含硫的热泉、泥潭、 海底热溢曰等，绝大多数极端嗜热菌严格厌氧，在获得能量时完成硫的转化。 极端嗜盐菌生活于盐湖、盐田及腌制品表明，可在盐饱和的环境中生长。事实 上，各类古菌的生长环境基本上界定了生物圈的范围。近年来人们还发现，古 菌并非只生活在极端环境，而是广泛分布于自然界的各种环境中，在普通的土 壤、海水、沼泽地等都能分离到古菌。 古菌虽然生长环境差异很大，但在细胞学、生物化学及遗传学上有一些共 有的特征。如，在形态上类似细菌，但细胞壁不含肽聚糖，而是由蛋白、糖蛋 白、多糖等构成( k a n d l e r ，1 9 9 8 ) ；古菌细胞膜含有由分枝脂肪酸与d 一型磷 酸甘油以醚键相连而成的脂类，而细菌及真核生物的细胞膜的脂类则由不分枝 脂肪酸与l 型磷酸甘油以酯键相连而成；与细菌相似，古菌染色体d n a 呈闭 合环状( 8 a u m a n ne ta j ，1 9 9 8 ) ，基因也组织成操纵子，但在d n a 复制、转录、 翻译等方面，古菌与真核生物类似，如采用非甲酰化的甲硫氨酸t r n a 作为起始 t r n a ，启动子、转录因子、d n a 聚合酶、r n a 聚合酶等均与真核生物类似( 1 w a b e 日fa z ，1 9 8 9 ，g o g a r t e ne ta 1 ，1 9 8 9 ，z i l l i ge ta 1 ，1 9 8 9 ，b r o w ne ta ， 1 9 9 5 ) 。 古菌的研究工作相对困难，主要受以下两方面因素的影响。首先。大多数 古菌为极端微生物，要求有很特殊的生长条件，必须先解决培养古菌的困难， 其次，由于古菌和细菌在细胞结构上的差别，很多为细菌研究而发展起来的有 效方法和工具不适合于古菌的研究。尽管如此，古菌的研究工作还是取得了一 些重要进展，在嗜盐菌中，已经构建了几种带有嗜盐菌复制起点以及抗性基因 的穿梭载体。古菌的遗传机制如复制、转录等过程也有一定程度的了解。到目 前为止，共完成了1 4 个古菌全基因组序列的测定工作( b u l te ta l ，1 9 9 6 ： s m i t ho ta 1 ，1 9 9 7 ：k l e n ke ta 1 ，1 9 9 7 ； k a w a r a b a y a s ie ta 1 ，1 9 9 8 ，1 9 9 9 ， 2 0 0 1 ：h e i l i g1 9 9 9 ；r u e p p ，2 0 0 0 ；n g ，e ta 1 ，2 0 0 0 ) s l e s a r e v , e ta j ，2 0 0 2 ； d e p p e n m e i e re ta 1 ，2 0 0 2 ；f i t z g i b b o ne ta z ，2 0 0 2 ：s h ee ta 1 。2 0 0 1 ： k a w a s h i m ae ta 1 ，2 0 0 0 ) ，与本研究的对象芝田硫化叶菌( s u l f o l o b u ss m b a t a e b 1 2 ) 亲缘关系非常近的硫磺矿硫化叶菌( s u l f o l o b u ss o l f a t a r y c u sp 2 ) 的全 序列测定也已经完成( c r i s t o p he ta j ，1 9 9 8 ) 。古菌的基因组学已经并且还 将继续为进化学家、遗传学家、生化学家等提供大量的信息。 二硫化叶菌概述 硫化叶菌是一类极端嗜热嗜酸古菌，最佳生长温度7 0 - - 8 5 ，最佳生长p h 为2 3 ，可耐受p h0 ，9 - 5 8 。形态上为球形，并有许多叶状分裂，切面为树叶形。 细胞壁缺乏肽聚糖。兼性自养，可以硫磺或其它简单有机物为养分。由于硫化 叶菌的独特生物学特性，1 9 7 2 年被定为一个新属一硫化叶菌属( b r o c kp 谊j ， 1 9 7 2 ) 。硫化叶菌属现有7 种，分别为嗜酸热硫化叶菌( s u l f o l o b u s a c i d o c a l d a m u s ) ，硫磺矿硫化叶菌( s u l f o l o b u ss o f a t 甜i c u s ) ，芝田硫化 叶菌( s u l f o l o b u ss h i b a t a e ) ，金属硫化叶菌( s u l f o l o b u s m e t a l l i c u s ) ，布 氏硫化叶菌( s u l f o l o b u sb r i e r l e y i ) ，阴阳硫化叶菌( s u j f o l o b u s a m b i v a l e n s ) 和s u l f o l o b u st o k o d a i i 。硫化叶菌多存在于地热泉，如硫磺矿 硫化叶菌分离于意大利那不勒斯的一个硫磺矿热泉；嗜酸热硫化叶菌分离于美 国黄石公园的热泉；而芝田硫化叶菌则是从日本的b e p p u 的一个热泉分离。1 9 9 0 年，硫化叶菌b 1 2 菌株被定为一个新种，即芝田硫化叶菌( g r o g a ne t a l ，1 9 9 0 ) ， d n a d n a 杂交及1 6 sr r n a 序列比较表明芝田硫化叶菌与硫磺矿硫化叶菌的亲 缘关系( 9 8 i n d e n t i t y ) 比与嗜酸热硫化叶菌的亲缘关系( 9 0 i n d e n t i t y ) 更近，芝田硫化叶菌的依赖于d n f i 的r n a 聚合酶的电泳图与硫磺矿硫化叶菌类 似而与嗜酸热硫化叶菌不同。芝田硫化叶菌中含有可通过紫外诱导的病毒 s s v l ( y e a t se ta 1 ，1 9 8 2 ) ，该病毒编码位点特异性重组系统( m u s k h e l i s h v i l i p a 1 ，1 9 9 3 ) ，可整合至宿主基因组中，尤其特别的是，病毒d n a 为正超螺旋， 在硫化叶菌中首先发现的一种拓扑异构酶一反旋转酶可能在维持其正超螺旋方 面起作用( n a d a le ta 1 ，1 9 8 0 ) 。硫化时菌已成为研究古菌，特别是极端嗜热 古菌的重要模式生物。 三拓扑异构酶研究进展 1d n a 超螺旋 自从1 9 6 5 年v i n o g r a d 等人发现多瘤病毒的环形d n a 分子以来，现已知道 绝大多数原核生物d n a 都是共价封闭环( c o v a l e n t l y c l o s e dc i r c l e ) 简称c c c 分 子。这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构( s u p e r c o i l ) 。有些单链环 形染色体( 如中x1 7 4 ) 或双链线性染色体( 如噬菌体 ) ，在其生活周期的某 一阶段，将其染色体也为超螺旋形式。真核生物其染色体多为线形分子，但其 d n a 均与蛋白质相结合，两个结合点之间的d n a 形成一个环状( 1 0 0 p ) 结构， 类似于c c c 分子，同样具有超螺旋形式。超螺旋具有方向性，有正超螺旋和负 超螺旋两种。双螺旋d n a 的松缠导致形成负超螺旋，而d n a 的紧缠则导致形 成正超螺旋。可以用下面的方程式来表述d n a 的拓扑学状态的变化：l 一丁- - 三称为d n a 的链环数( 1 i n k i n gn u m b e r ) ，它是d n a 的一条链绕另一条链盘绕 的次数，它代表环状双螺旋d n a 分子的拓扑学特性。在不发生链的断裂时， 共价闭环d n a 的链环数是一常数。在右手双螺旋中，上规定为正，丁为盘绕数 ( t w i s t i n gn u m b e r ) ，它代表d n a 的一股链绕双螺旋轴所做的完整的旋转数。 对于b d n a 而言，它等于d n a 的碱基数除以1 0 ( 晶体中) 。w 为超盘绕数 ( w r i t h i n g n u m b e r ) ，代表双螺旋轴在空间的转动数，r 和矿是可变的。 对于一特定的d n a 言，是一定值，但细胞内存在着一些可使d n a 分子 断裂和重新连接的酶，故会在一定的范围内变化，d n a 的超螺旋结构常处于 动态变化中，在这2 过程中，我们实际上关心的是链环数的改变及其对丁和酽 的影响，即a = 4 t - - 4 矿。为了表达一定的超螺旋( 形) 对不同d n a 分子的 影响，引入超螺旋密度( s u p e r c o l id e n s i t y ) 百= 4 耽，4 三为链环数的变化值， 当两个不同长度的d n a 作比较时，它与分子的长度和其拓扑学状态两者都有 关系，情况比较复杂。如采用石，由于它仅与分子的拓扑张力有关，故而可直 1 4 接加以比较。现在，已测得从细胞和病毒粒子中分离到的d n a 超螺旋密度介 于0 0 5 0 0 7 之间，一般为0 。0 5 ( s a n g e r ，1 9 8 4 ) 。 在细胞中，d n a 的各种拓扑异构体之间是互变的，是动态的。d n a 的这种 结构变化对它的功能具有重要意义。d n a 的各种拓扑异构体是如何转变的昵? 细胞内存在着一类能催化d n a 拓扑异构体之间相互转化的酶，称为拓扑异 构酶( t o p oi s o m e r a s e ) 它们通过与d n a 形成共价结合的蛋白质一d n a 中间体， 从而在其骨架的磷酸二酯键处造成暂时性的缺口，使d n a 单链或者双链得以 穿越，从而改变d n a 的拓扑学状态。在这一过程中，d n a 的链环数虽然改变 了，但其核苷酸序列并无任何变化。最初认为拓扑异构酶只可以松弛负超螺旋， 随着研究工作的深入，发现不同的拓扑异构酶在细胞内可行使许多功能，例如， 松弛正、负超螺旋，向d n a 分子中引入负超螺旋或者正超螺旋，除了能改变 闭环d n a 分子的超螺旋状态，拓扑异构酶还可以促进环状d n a 分子的连环化 和脱连环化，或者解开互相缠绕的线状染色体分子。拓扑异构酶几乎涉及了所 有与d n a 拓扑学状态变化有关的活动和进程，如复制，转录，重组，染色体 的聚合、分配以及d n a 修复等重要环节。在转录和重组中，双螺旋链必须暂 时性的分开，而在复制中双螺旋链要永久性的分离，这些过程都会导致d n a 拓扑学状态的变化。另外，d n a 的许多活动都可以形成超螺旋，如转录过程中 r n a 合成酶的结合，d n a 与组蛋白或其它蛋白的结合。在原核细胞中，许多 启动子的转录需要一定水平负超螺旋的d n a ，而在细胞复制中，复制完成的染 色体必须依靠d n a 拓扑异构酶松弛后才能分开，细胞分裂中姊妹染色体的分 离也是通过d n a 拓扑异构酶的作用来完成。以上这些例子说明，由于d n a 的 自身结构或者细胞内代谢活动的要求。d n a 的拓扑学状态需要被拓扑异构酶调 整到晟佳状态才能完成复杂的遗传活动( k a g u n ia n dk o m b e r g ，19 8 4 ；m a s s ea n d d m l e t ，1 9 9 9 ；w a n g e ta 1 ，1 9 9 0 ；w a l l i se ta 1 ，1 9 8 9 ) 。 近年来，拓扑异构酶研究的热点已经转移到它在抗癌药的应用上。许多d n a 拓扑异构酶靶药被分离出来，包括一些抗癌药和抗菌药，这些药物通过与d n a 拓扑异构酶形成共价复合物对细胞造成损坏，其中许多药已用于临床，如新生 霉素、喹啉类药物等( r o t h e n b e r g ，1 9 9 7 ；p o m m i e r , t 9 9 8 ；w a n g ，1 9 9 7 ；m a x w e l l ， 1 9 9 9 ；m a x w e l l ，1 9 9 7 ) 。 2 拓扑异构酶的分类 根据作用方式不同，拓扑异构酶被分为i 型和i i 型两类。i 型拓扑异构酶在 d n a 双链中的一条链上产生一切口，使另一条链得以穿越。面i i 型拓扑异构酶 在两条链上各产生一切口，使d n a 双链得以穿越。根据拓扑异构酶与d n a 结 合时连结于5 端还是3 端，i 型拓扑异构酶又分为n 型和i b 型。由于最近发 现的一种i i 型拓扑异构酶一芝田硫化叶菌v i 与其它i i 型拓扑异构酶有较大差 别( b u h l e r e t a l ，1 9 9 4 ；b e r g e r a t e t a l ，1 9 9 8 ) 。i i 型拓扑异构酶又分为i i a 和i i b 型， i i b 拓扑异构酶只包括芝田硫化叶菌拓扑异构酶v i 。i 型拓扑异构酶使d n a 的 链环数每作用一次改变l ，而i i 型拓扑异构酶则使链环数每次改变2 。表1 1 列 出了原核生物和真核生物中拓扑异构酶各家族中的代表酶。其中细菌t o p o i 和 t o p o l i i 以及哺乳动物t o p o l i 、t o p o l i i 中的、b 形式是同源基因( p a r a l o g u e s ) 的重复而形成的两种酶( s n g e t a t ，1 9 9 9 ) 。 1 9 7 9 年以来，在许多病毒和质粒中发现有拓扑异构酶存在。痘病毒拓扑异 构酶i 是研究最早，也是研究最多的病毒拓扑异构酶。在病毒中还发现有许多 i i 型拓扑异构酶，包括t 4 噬菌体( l i u ，t 9 7 9 ) ，a f r i c a ns w i n ef e v e r ( a s f ) ( g a r c i a - b e a t o ，1 9 9 2 ) ，p a r a m e c i w n b u r a s r i ac h l a r e l l av i r u s ( p b c v - 1 ) 编码的拓扑异 构酶( l a v r u k h i ne a 1 ，2 0 0 0 ) 。其中p b c v - - l 拓扑异构酶是目前已知的最小的i i 型拓扑异构酶，分子量约为1 2 0 ，0 0 0 。质粒编码的拓扑异构酶在许多革兰氏阴性 和阳性细菌中都有发现，但是它们的功能还很不清楚( b i d a e n k oe a ，1 9 9 8 ) 。 1 6 表1 1 拓扑异构酶的分类 t a b l e1 i c l a s s i f i c a t i o no f t o p e s o m e r a s e e c e l ld n a t o p o i s o m e r a s ei i i ( b a c t e r i a ) s c e r e v i s i a ed n a t o p e i s o m e r a s em ( e u k a r y a ) h u m a nd n a t o p e i s o m e r a s ei i i a ( e u k a r y a ) h u m a nd n a t o p oi s o m e r a s et l i f l ( e u k a r y a ) 血t f o l o b u sa c i d o c a l d a r i r e v e r s eg y r a s e ( a r c h a e a ) m e t h a n o t r y r u s k a n d l e r it e v e i s e 舒性s e ( a r c h a e a ) h u m a nd n a t o p ei s o m e r a s ei ( e u k a r y a ) v a c c i n i ad n a t o p e s o m e r a s ei ( v i r u s ) m e t h a n o p y r u s k a n d l e r it o p ei s o m e r a s e v ( a r c h a e a ) e c o i l d n a g y r a s e ( b a c t e r i a ) ec o l id n a t o p el s o m e r a s e l v ( b a c t e r i a ) s c e r e v i s i a ed n a t o p oi s o m e r a s e i f ( e u k a r y a ) h u m a nd n at o i s o m e r a s ei ia ( e u k a r y a ) h u m a nd n a t o p o s o m e r a s e b ( e u k a r y a ) m o n o m e r m o n o m e r m o n o m e r m o n o m c r m o n o m e r h e t e r o d i m e r m o n o m e r m o n o f f l e r m o n o l t t e r a 2 8 2 h e t e r o - t e t r a m e r c 2 f 2 h e r e t o t e t r a m e r h o m o d i m e r h o m o d i m e r h o m o d i m e r 6 5 3 6 5 6 1 0 0 i 8 6 2 1 2 4 7 a ，3 5 8 b 1 2 2 1 7 6 5 3 1 4 g y r a ，8 7 5 g y r b ，8 0 4 p a r c ，7 5 2 p a r e ，6 3 0 1 4 2 8 1 5 3 1 1 6 2 6 3 拓扑异构酶的细胞内功能 ( 1 ) 细菌 大肠杆菌 在大肠杆菌中发现了四种拓扑异构酶，即t o p ei 、t o p o i i i 、旋转酶和t o p e 。其中t o p e i 和t o p e i i i 属于i a 型，而旋转酶和t o p e i v 属于i i a 型 1 7 n 认n 胰n 队 m m m 淞 队 舱姒姒 旋转酶是目前唯一已知能引入负超螺旋的拓扑异构酶。负超螺旋与m l l k 蛋 自的结合对染色体的凝聚和细胞分裂中染色体的正确分离起着很重要的作用， 而m u k 蛋白与染色体凝聚和分离有关( h o l m e se ta l ，2 0 0 0 ；s a w i t z k e ，2 0 0 0 ) 。最 近发现t o p oi v 在复制中起着脱连环作用，它还可以松弛负超螺旋( t s e d i n h ， 1 9 9 8 ) ，这表明t o p oi 和t o p oi v 共同作用来松弛负超螺旋。总的说来，t o p o i ， t o p oi v 和旋转酶共同作用维持着细胞内一定的负超螺旋水平( z e c h i e d r i c he t a l ， 2 0 0 0 ) 。 。 在环状d n a 的复制过程中。复制叉的移动会导致在复制叉前方的未复制区 和复制叉后方的已复制区都产生一些拓扑学变化。复制刚刚起始时，在复制叉 前方的未复制区会形成部分正超螺旋，这种正超螺旋会很快被旋转酶所松弛 ( l e v i n ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 。然而当复制继续进行时，复制叉前方的正超螺旋会扩散 回复制叉后方，结果导致姊妹染色体的交缠( c a t e n a t i o n ) ( c h a m p o u xe t a l ，1 9 8 0 ) ， 如果这种交缠不去除，将会导致两条姊妹染色体的连环化，最近的研究结果也 证实了过度的双螺旋缠绕可分布于复制叉的前方，也可分布于复制叉的后方 ( p e t e r e t a l ，1 9 9 8 ) 。所以复制叉移动的保持不仅要通过d n a 旋转酶来松弛复制 叉前方的正超螺旋，而且还依赖复制叉后方姊妹链的脱连环化。在两种i i 型拓 扑异构酶中，t o p oi v 主要行使脱连环化作用而旋转酶的主要作用是松弛正超螺 旋f f n s a e a ，1 9 9 6 ；u l l a p e r g e r , 1 9 9 6 ) 。这种功能上的差别也表明了t o p o i v 的主 要功能是脱连环化或者松弛部分正超螺旋( z e c h i e d r i c he t a l 1 9 9 5 ) 。 体外实验表明t o p oi i i 可单独支持复制叉的移动( h i s ae ta t ，1 9 9 4 ) ，因此 t o p oi i i 在细胞内可能主要负责复制叉后方连环体的解除( h i s ah e ta 1 ，1 9 9 4 ； d i g a t ee ta t ，1 9 8 8 ；h i s ae ta 1 ，1 9 9 4 ) 。这样t o p oi i i 和t o p oi v 在功能上似乎有部 分重叠，在体内，t o p oi i i 似乎只能解除复制叉正后方的连环体，而t o p oi v 作 1 用于复制叉后方远端区域的连环体( d i g a t e e ta 1 ，1 9 8 8 ) 。在正常生理状况下，细 胞内负超螺旋的松弛主要靠t o p oi 来行使，而t o p oi i i 在细胞内也许不行使负 超螺旋松弛活性，因为它需要一种过度的负超螺旋底物( d i g a t e e ta 1 ，1 9 8 8 ) 。 最近发现大肠杆菌t o p oi i i 和r e c q 解旋酶有相互作用，对染色体的正确分 离起作用( h a i m o ne t a l ，1 9 9 9 ) 。与此相应，发现人t o p o1 1 1 和r e c q 同源蛋白也 有相互作用( h a i m o n e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 其它细菌 在已测序的1 7 种中温细菌中，发现有三种细菌( h a e m o p h i l u si n f l u e n z a e , b a c i l l u ss u b t i l 趣和x y l e l l a f a s t i d i o s a ) 与大肠杆菌有相同的拓扑异构酶组成，这 些酶在胞内的功能与大肠杆菌可能也有相似的地方，由于t o p o l l l 和t o p o l v 在功 能上的重叠，所以在许多中温细菌中似乎没有t o p o i 两只具有其它三种拓扑异 构酶，这一些细菌包括b o r r e l i ab u r g d o r f e 瞳c h l a m y d o p h i l a p n e u m o n i a e , c h l a m y d i at r a c h o m a t i 磋p n e u m o n i a e ,m y c o p l a s m a g e n i t a l i u m , n e i s s e r i a m e n i n g i t t d i d r i c k e t t s i ap r o w a z e & i , s y n e c h o c y s t i s p c c 6 8 0a n d u r e a p l a s m a u r e a l y t i c u m ，在这些细菌中，t 0 p o 很可能行使着脱连环化和姊妹染色体分离 的功能。根据目前基因组注释的情况，还有一些中温细菌( c a m p y l o b a c t e r e j u n ， d e i n o c o c c u s r a d i o d u r a n s ，m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s , a n dt r e p