（微生物学专业论文）小核盘菌生物除草剂发酵条件的研究.pdf

摘要 小核黼凶( s c l e r o t i n i am i n o rj a g g e r ) 是核盘菌属真菌，可以使多数常见阔叶杂草感病。该 凶除草厂谱，依赖菌丝蔓延传播，在田间极少产生子囊孢子，使用安全性高，在禾本科作物 田间阔叶杂草的防治方面显示出巨大的应用潜力。乙二酸在核盘菌的致病过程中起关键作川， 小核箍菌通过生物合成乙二酸来酸化、削弱寄主杂草组织，同时从寄主细胞壁中吸收钙离子， 形成乙二酸钙晶体，刺破细胞壁，最后在多聚半乳糖醛酸酶作用。r ，使细胞瓦解，提高乙二 酸的合成培就可以提高除草苗的除草效率。 本试验通过单因素试验和正交试验得山最适合该菌液体发酵培养的优化r i c h a r d 培养基 配方是( g l ) ：蔗糖2 5 9 、酵母浸膏3 9 、磷酸二氢钾6 9 、七水硫酸镁2 9 和氯化铁o 0 2 9 。在 各培养条件的单冈素试验的基础上，选择培养p h 值、接种最平发酵温度为二个影响冈素， 采川二次l 交旋转同归试验殴计进行液体发酵试验，筛选到最佳的液体发酵条件是：p h 值为 5 、接种带为3 块( 直径】5 m m 菌丝块) 、温度为2 0 时液体发酵6 天。 筛选出小米培养基为小核盘菌周体发酵培养基。添加琥珀酸钠可增加除草菌的乙二酸含 南 ：井提高其致病力。通过单因素试验和正交试验得出当初始含水量6 0 m l 、液体菌丝接种带 2 m i 、濡度2 0 ，f i - 体发酵6 天时乙二酸含量达到最大值，7 天时除草菌的活力、致病力可 达到最人值。 试验证明在低濡条什f 更有利于保持除草菌的活力。18 条件f 保藏二个月的除草菌的 活力和致病力显著人丁在2 和2 2 的条4 - i ：f 保藏的除草菌，在2 2 条件。r ，除草苗在保藏 3 0 天后火上活性年致病力。 关键词：小核糯凶：发酵条什：乙二酸：保藏 v s t u d yo nc o n d i t i o n sf o rf e r m e n t a t i o no f t h eb i o h e r b i c i d a l s c l e r o t i n i am i n o rj a g g e r a b s t r a c t s c l e r o t i n i am i n o ri sp a t h o g e n i ct om o s tb r o a dl e a fw e e d s i nr e g a r d so fi t sa b i l i t yt op r o d u c e n oorr a r ea p o t h e c i a ，a n dt h e r e f o r ea i r b o r n ea s c o s p o r e si nt h ef i e l dw h i c hc o n t r i b u t e st oi t ss a f e u s ea sab i o h er b i c i d e ，sm i n o ri sas u i t a b c a n d i d a t ef o rb i o a g e n tt oc o n t r o lb r o a dl e a fw e e d s 。 o x a l i ca e i dp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei np a t h o g e n e s i so fan u m b e ro fp a t h o g e n s o x a l i ca c i di s b e l i e v e dt oa c t ：b yd ir e c td i s i n t e g r a t i o no fp e c t i cs u b s t r a t e ；b ys t i m u l a t i n gp o l y g a i a c t u r o n a s e a c t i v i t y ，b o t hb yl o w e r i n gt h ep ho ft h eh o s tt i s s u e s a n db yr e n d e r i n gt h e c a l c i u m - p e c t a t e c o m p l e x e s o ft h ec e l lw a l l sm o r es u s c e t b i l et o h y d r o l y s i s ；b y t h ei n h i b i t i o no f p o l y p h e n 0 1 0 x j d a s e ( p p o ) t h r o u g hi t sb i n d i n gw i t hc o p p e r a tt h ea c t i v ec e n t e rt of o r mas t a b ， i n a c t i v ec o m p l e x l a c ko fp p oa c t i v i t yw o u l dr e s u l ti nas m a ia m o u n to fp h e n o l i co x i d a t i o n p r o d u c t sw h i c h i nt u r n p r o t e c tt h ep e c t i cs u b s t r a t e sf r o md i s i n t e g r a t i o n ；b y i n h i b i t i o no ft h e o x i d a t i v e b ur s to ft h eh o s tp l a n t ，p o s i t i v ec o r r e s p o n d e n c e w a sf o u n db e t w e e no x a l i ca c i d c o n c e n t r a t i o na n dv i r u i e n c e l i q u i d s t a t em e d i u mw a so p t i m i z e dt h r o u g ho n e - f a c t o re x p e r i m e n ta n do r t h o g o n a l e x p er i m e r i t s t h es u i t a b r i c h a r dm e d i u mc o n t a i n e d ( g l ) ：s u c r o s e2 5 9 ，y e a s t3 9 ，k h2 p 0 46 9 ， m g s 0 47 h2 02 9 ，f e e l 3o 0 2 9 w e c h o o s e di n i t i a lp h ，i n o c u l u ms i z ea n dt e m p e r a t u r ea s i n f l u e n c i a lf a c t or st oc a r r i e do u tt h ec u l t i v a t i o no ff r u i t i n gb o d yi nw h i c ho r t h o g o n a l v e g r e s s i o n d e s i g nw a su s e d w i t h t h r e ef a c t o r sa n df i v e l e v e l s a c c o r d i n g l y ，w e f o u n do u tt h e l i q u i d f er m e n t a t i o nc o n d i t i o n sc o n t a i n e d ：i n i t i a lp hw a s5 ， i n o c u l u ms i z ew a s3 a g a rp l u g s ， t e m p e r a t u r ea n dt i m ef o rf e r m e n t a t i o nw e r e2 0 a n d6 d m i i l e tw a sc h o s e nf o rs o l i df e r m e n t a t i o no fs c l e r o t i n i am i n o r ，s o d i u ms u c c i n a t ea c i dr a i s e d t h eo x a l i ca c i dc o n c e n t r a t i o na n dv i r u l e n c eo ft h eh e r b i c i d es i g n i f i c a n t l yt h es o l i df e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sw er eo p t i m i z e dt h r o u g ho n e f a c t o re x p e r i m e n ta n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t st h es u i t a b c o n d i t i o n sc o n t a i n e d ：i n i t i a lm o i s t u r ec o n t e n tw a s6 0 m l ， i n o c u l u ms i z ew a s2 m l ，t e m p e r a t u r e a n dt i m ef o rf e r m e n t a t i o nw e r e2 0 a n d7 d t e m p e r a t u r eh a ds i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo nv i a b i l i t ya n dv i r u l e n c e a tl o w ert e m p e r a t u r e h e r b i c i d ek e p th i g h e rv i a b i l i t y3m o n t ha f t e rs t o r a g e v i a b i l i t ya n dv ir u l e n c e a t i8 w a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s ea tb o t h2 a n d2 2 h e r b i c i d el o s t 10 0 o fi t s v i a b i l i t ya n d a b s t r a c i ! ! ! ! = = ! = ! ! = ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !i!= v ir u l e n c ea t2 2 a f t e r3 0d a y s s t o r a g e k e yw o r d s ：s c l e r o t i n i am i n o rj a g g e r ；c o n d i t i o n sf o rf e r m e n t a t i o n ；o x a l i ca c i d ；s t o r a g e v i c a n d i d a t e ：s u nt i n g s p e c i a l i t y ：m i c r o b i o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f x ux i u h o n g 型塑兰兰些笙苎垫型兰婴塑堡旦堡墼兰 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ! 蕉! 塑遗壹基丝盘蔓挂型直盟的! 奎拦卫窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：劲、吩 慨泖g 年6 月，6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密 后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师 签名： 讽、旃 以够 日期：泐g 年g 月，6 同 日期：d6 年占月，同 引言 1 引言 1 1 研究的目的与意义 由丁人们日茄追求农产品的经济效益，以近年来化学农药的使用餐有增无减。据统计， 全世界每年使_ l j 近2 0 0 万吨农药，我国t 圩334 万吨。化学农药不仅杀死了有益农田微生物， 破坏了农业生态系统，还滞留于土壤、水体、农副产品和畜产品中，对人类健康造成严重的 威胁。另外使_ l i 农药使许多病虫害产生耐药性，导致了农药的使_ l l ! | 频率和剂龄逐年增加的恶 性循环。由此可见，川化学农药存在着较火滞在的生态风险性。因此，在术米的农业中，如 何人力建殴和推“无公害农业，防【t 环境污染和破坏，达到社会、经济和生态的统一，使农 业可持续发展，己成为全社会酱遍关注的焦点。而以发展可持续农业为宗旨的生物防治将在 未米农业中扮演重要的角色。近年来，在微生物方面，细菌、真菌、放线菌年病毒的生物防 治取得了较人成绩。微生物农药是利j 微生物本身或其代谢产物防治病、虫、杂草，或者凋 ：仃植物生| 王= 的制剂，一般分为微生物杀虫剂、微生物杀菌剂、微生物除草剂平微生物植物激 素。以生物防治手段米控制农作物病虫草害的尝试，早在本世纪3 0 年代就已经开始，但在相 当k 一段时间山处丁停滞状态。近年来，生防研究进展速度明显加快世界各国对此项研究 也十分关注。 杂草是危害农作物的劲敌之一，自从人类进行农业生产以来，人们就采取各种方法防除 杂草，井取得了很人成就。其间化学除草剂因其作州迅速，使用方便，易于火面积应川，到 本世纪5 0 年代得剑迅速发展。目前除草剂在世界农药市场的总销售额己超过杀虫剂而跃居首 位( 苏少泉19 9 8 ：薛振祥，l9 9 2 ) 。但化学除草剂的火最开发平使_ 【 j ，并术完全解决杂草的 危害，尤其是耐药性杂草种群的上升。抗除草剂杂草的出现和对环境问题的日菇重视、开发 除草剂新品种难度火，且需巨额经费投资，致使许多研究机构和农药公司纷纷将研究重点转 向微生物除草荆的研制、病原微生物资源的引进和开发利_ l _ ( s t e p h e bo d ，l9 8 7 ：t e b e e s t d o ，l9 9 2 ) 杂草生物防治是谨慎地利_ l ；| 寄主范同较为专一的植食性动物或植物病原微生物，将 影响人类经济活动的杂草种群控制在经济上、生态上或环境美化上可以允许的水平 ( g o e d e n rd ，19 8 8 ) 。 利_ 【_ i 植物病原微生物防除杂草是杂草生物防治的一个重要组成部分。真菌除草剂 ( m y c o h er b i c i d e ) 是一类防治杂草的真菌性植物病原生物制剂，成分是活的真菌繁殖体，加 1 ：成一定的剂型后使州，目标杂草专一性强、选择性高、对环境安全、无残留( 李扬汉等，19 9 4 ) 。 真菌除草剂作为生物农药的一个分杖，将随着现代生物技术的发展及对杂草生物学、真菌除草 剂病原生物学、致病机理、遗传学和病害流行学的进一步研究而得到更快的发展，将会在朱 东北农业_ 人学坝：l ：学位论文 米杂草综合治理中起到愈米愈重要的作_ j 。 本试验选用小核盘菌作为生物除草剂的研究材料，小核盘茵( s c l e r o t i n i am i n o rj a g g e ，) 是 核盘菌属真菌可以使藜( c h e n o p o d i u ma l b u m ) 、蒲公英( t a r a x a c u mo f f i c i n a l e ) 等多数常 见阔叶杂草感病( r i d d e l ，ge ，1 9 9 1 ：s c h n i c k ，2 0 0 2 ) 。防治效果与2 ，4 d 相当( b r i e r e ，sc ，2 0 0 0 ) 。 该菌的一个重要特点是，在生产条件下不能形成子囊赢和子囊孢子，不能通过空气传播，只 能通过菌核传：f l 。而菌核的形成又可以通过( 向生物除草剂中) 添加少封菌核抑制剂( 如环 腺营酸一c y l i ca m p ) 等措施得到有效抑制( d u t t o n ，19 9 6 ) ，这样就可以切断其向其他地块的传 4 途径。另外，该菌的蓝丝体不能越冬( 夏) ( ( d u t t o n ，19 9 6 ) 。对下茬作物没有影响。可见， 该菌对周同作物及f 茬作物安全，在禾本科作物田间阔叫+ 杂草的防治方面显示出巨火的戍州 潜力。本实验在液体发酵和同体发酵的条件下，研究营养因子和环境网子对小核盘菌的生长、 致病力以及乙二酸产量的影响，为开发和生产高效小核盘菌真菌除草剂提供依据。 1 2 国内外研究进展与现状 1 2 1 微生物农药的概念及特点 微生物农药( m i c r o b i a lp e s t i c i d e ) 是指由微生物及其代谢产物和由它加：i ：而成的具有杀 虫、杀菌、除草、杀鼠或调：付植物生长等具有农药活性的物质。微生物农药特点如表1 1 所 一 不 表i 1 微生物农药的特点 t a bi im i c r o b i a lp e s t i c i d e sf e a t u r e s b c d e 对病虫的杀伤特异性强，不杀伤害虫的天敌和有益生物，能保持生态平衡 生产原料和有效成分属于天然产物，可回归自然，能保证可持续发展 能通过现代生物技术对发酵：r 艺和菌种进行改进，不断完善生物农药的性能利提 高【 i ! l 质 多种冈素和成分发挥作州，害虫和病原菌难以产生抗药性 2 引言 12 2 微生物除草剂的研究与应用概况 1221 已商品化的国内外微生物除草剂 表1 2 已商品化的国内外微生物除草剂部分实例 t a bi 2c o m m e r c i a l i z a t i o na n dh a ss o m ee x a m p l e so fm i c r o b i a lh e r b i c i d e s 12 22 微生物除草剂的研究进展 除上述儿种己商品化的微生物除草剂外，内外还有其它多种微生物除草剂正处于研究开 发阶段，部分微生物除草剂己接近商品化。 国际上，在除草菌株的筛选、除草剂生产工艺配方、使川技术以及除草菌的致病机理等 领域开展广泛的研究，微生物除草剂的研究空前活跃。研究l = 作者己对镰格饱属a l t e r n a r i a l 2 个种、壳二抱属、离蠕抱属、尾艳属8 个种、刺盘艳属、旋抱腔菌属、叫黑粉菌属、镰刀菌 属、小球腔菌属、叉丝壳菌属、茎点霉菌属、拟茎点霉菌属、柄锈菌属、核盘菌属、德氏菌 属等i8 属的不同种类真菌作为潜在的病原微生物生防作用物，作了大量的研究。 我国甲在2 0 世纪6 0 、7 0 年代就开始使h = | 生物除草剂“鲁保一号”防治菟丝子，取得很好 3 东北农业大学硕：l 学位论文 效果，其后，在除草菌的筛选、使用技术、生防机理等方面开展了研究。例如，对菟丝子生 防苗的筛选、施j _ i = | 条件的研究：对链格孢菌产孢条件、产孢技术、产毒条件以及致病机制的 研究等。上述r 作的开展，扩大了我国微生物防除杂草的研究范围，为生物除草剂的研制开 辟了新的领域。尽管目前我国杂草生防菌研究颇多，但已经商业化并火面积推广的不多。该 种方法需要较人的开发成本，必须综合考虑菌物生物学、生态：学、发酵汞i 制剂技术( 如锈菌只 能依靠活体繁殖获得菌物产品以及环境保护方面的因素。杀草谱过窄，施用j 亓需要较长的着 露划平特定的温度条 ，| ：，或对目标杂草虽具很高的毒性但缺乏有效的扩散性且对寄主的作川 不能同步，均限制了菌物除草剂的广泛使用。 目前开发的微生物除草剂主要是真菌，不过日本也发现黄单胞菌( x a n t h o m o n a s ) 对一年生 早熟不( p o a a n n u a ) 有生物除草活力。在美国和加拿大，许多研究：l 作正致力于开发致病的根 细菌作除草剂，包括荧光假单胞菌、假单胞茁、草生欧文氏菌、产碱菌等。根细菌不仅具有 寄主专一性，还对某些作物具有促进生长作用。在加拿大西部，从草原十壤上己分离上千株根 细菌作防除一年生杂草的目标菌株。 同顾和总结利用植物病原菌进行杂草生防研究的历程雨i 经验，都预示着生物除草剂的研 究，在人类曰茄芙注由于化学除草剂的使用带米的环境污染干残毒、渴求无污染、安全的新 除草剂的背景。r ，在国际生物除草剂研究活跃和取得重火突破的形势下，将进入一个前所未 有的崭新的发展阶段。相信随着学科整体水平的提高和我国科学技术实力的增强，以及无公 害农业及发展绿色食品的需要，利用植物病原茵生物防除杂草的研究和应用必将会得到进 一步的发展，不久的将来，还会有更多的商品化微生物除草荆品种面世，产生出巨人的经济、 生态利社会效益。 1 2 3 现代技术在微生物除草剂研究中的应用 1 2 31 分子生物学在目标杂草鉴定上的应用 分子生物学技术突飞猛进，儿乎深入到生物科学每个领域。在微生物除草剂的研发过稗 中，研究者也不断地采j = | | 分子生物学技术改良菌株，加快除草剂的商品化进程。目前分子标 记技术在杂草鉴定上已经有了尝试( 赵毓等。l9 9 9 ) 。基丁植物特定化学物质、同功酶( 过氧 化物酶、细胞色素氧化酶) 、d n a 限制性片段长度多肽性( r f l p ) 和( r a p d ) 遗传分析，研究杂 草生物型及演化、确定杂草的分类地位、种群关系、揭示杂草种间的生理生化、生态及遗传 异质性提供了强有力的新： 具( r a c h e l e ，1 9 8 8 ) 其对要求高度专一性的以菌治草至关重要。 b e c k e r 等利；f ip c r 技术来确定生防菌株c h o n d r o s t e r e u mp u r p u r e u m 对杂草裂叶恺木( a l n u s s i n u a t a ) 并i lt r e m b l i n ga s p e n ( p o p u l u st r e m u l o i d e s ) 的侵染与否，同时调夯其寄主范嗣是否专一。 分子生物学技术作为一种强有力的实验手段，必将在真菌除草剂的菌种改良、生测结果分析、 4 引言 环境影响风险评价等方面得到广泛的应用。 1 23 2 生物工程技术的应用研究 生物l 。科技术在杂草科研方面以前常州于作物抗耐除草剂育种，目前在生物除草剂的基 因改良和转基因( 或原生质融合技术) 育种方面多有应用。前者指转移病原菌杂草毒素基因 或它感化合物基因至生物除草剂，即培育优良菌株，将外源优良性状基因d n a 导入受体真菌， 利h j 发酵技术人簧生产天然生物源农约，加大生防菌感染力和致病力。转基因育种一方面是 指转移病原甑杂草毒素基因，另一方面是近些年新兴的转它感基冈育种，即分离转移它感物 质基冈至作物体内诱导其超水平表达。美国“粮食和农业政策全国中心”2 0 0 0 年的一份研究报 告表明，19 9 6 年以米北美由于基因改良的大豆平棉花使除草剂川量减少了1 6 0 0 万次，即减 量2 0 。美国a r c o 植物细胞研究所对此研究有一个长期计划，并取得了一定的进展。我国 在此方面虽有认识，但未见研究报道。 1 ，233 其它相关新技术在杂草生防上的应用 模糊聚类分析、数学模型在杂草科学其它方面应j ：| 已经较酱遍，但在杂草生防上应用不 是很多，偶见报道心丁目标杂草防治经济闽值确定、杂草群落及危害定最分析研究( 强胜等， 1 9 9 6 ) 。数! 学模玳同计算机结合建立的专家系统对生防因子释放后的效果监测也有极大的帮 助。杂草生态! 学的发展，使人们充分认识和利j _ l ；l 作物与杂草本身的一些自我凋：仃机制，最人 限度地趋其利避其害成为可能，且正逐渐成为杂草防治科研的一个新动向( 薛光，l 9 9 5 ) 。系 统论、杂草生物学、生物地理学、种群动力学雨j 群落生态学方面的研究也都促进了杂草生物 防治理论与实践的发展。中国农业科学院生物防治研究所和南京农业人学杂草研究室利_ _ | j 冈 特网技术建立的j 草生防信息系统，也将极火地方便和促进该领域的发展。 1 3 微生物除草剂的开发与前景 1 31 微生物除草剂开发的优势 1 3 1 1 微生物除草剂的复合性 尽管微生物除草剂的效果表面上看起来不如化学除草剂那么明显。但它们的实际效j _ 却 绝不逊色。如果能使化学除草荆和微生物除草剂联合发挥作州的话，其有效性会得到进一步 东北农业大学硕：匕学位论文 地改善，并且二者联合使用可大大减少化学除草剂的使用量，从而减少它们在环境中的残余 埘。 除了化学曲品以外。一种真菌还可以和另一种真菌或某种昆虫控制药 i ! i 共同使川。有专 家发现某些真菌混合作用时所具有的杀伤力比它们单独使用时的杀伤力要强得多。 13 1 2 微生物除草剂选择性 与化学除草剂相比，微生物除草剂具有独特的优点，为了研制一种新的防疫药品，一家 农业化学公司通常要筛选l3 0 0 0 多种化合物，其中一半以上化合物的筛选有极大的偶然性。 相反，微生物除草剂筛选时更具有针对性，研制费用低。此外，如果杂草对化学药品已产生 抵抗作_ _ f j ，则微生物除草剂便可作为化学除草剂的代川品而加以使用。现在至少已有多种除 草剂已经对一度广泛使刚的化学除草剂产生了抵抗力。而且和大多数化学品比较起米，微生 物除草剂更具有选择性。 13 1 3 微生物除草剂的安全性 众所周知，微生物除草剂的使用有助于减少有毒的化学除草剂进人我们的生活环境。但 微生物除草剂是否会造成别的问题呢? 由于除草菌大多是真菌不是动物的病源体，它对人菖 造成危害的可能性是极小的。在任何新的除草剂研究中，安全性和有效性是人们最关心的两 个问题，也是筛选适宜的病原菌的两个重要标准。每一种微生物除草产品的问世都必需经过 严格筛选，以防止造成任何火难。有潜力的生物除草剂的特点如表1 - 3 所示。 表1 3 有潜力的生物除草剂的特征 t a b 1 3c h a r a c t e r i s t i c so fh e r b i c i d e s 序号 特征 在人一：培养基中孢子能够萌发和生长 具备较高的毒性 遗传的稳定性 狭窄的寄主范围 适应性， 能产生丰富的繁殖休 危害寄主植物的能力 不破坏生态环境 6 引言 1 3 2 微生物除草剂开发的限制因素 微生物除草剂一般为活的值物病原真菌制剂，在某种程度上类似于化学除草剂。生物除 草剂的应h 基于植物病理学的流行病学原理，是以病原菌为手段使杂草感染病害而达到控制 杂草或抑制杂草生k 的g t 的。植物病害是寄主、病原菌和环境相互影响的结果，而且病害的 发生可能受剑许多冈素的限制。 对真凶除草荆如何提高除草剂的效率的问题一直被研究( t e m p l e t o ng e ，19 8 6 ) 。提高毒 性、改善产毒条件、改变寄主范围、抵抗植物产生的化学拮抗物质、改变病原菌在土壤中的 残存和持久性、较宽的环境耐受性等都能提高其功效，但是筛选高毒性的菌株是关键。弱鸯 性的病原菌往往导致生物除草剂应用的低效性。目前只有少数生物除草剂被开发成为市场产 品，最主要的原冈之一是生物除草剂与其它控制方法相比效率低。 病原真菌产生的化学物质增强了它们的功效，尤其是许多真菌被推测产生毒素或生长凋 1 y 剂。这些毒素利生长凋：柑剂促进了病害的发展。许多生物除草剂的病原菌产生有除草活性 的有毒代谢物，( d u k e l y d o n ) 强调了天然化合物来源的除草剂的发展和展望。植物毒索作为 一种新的化学除草剂和生物除草剂两者的重要性是难以预言的，但是两者的表现是相似的。 1 3 21 目标杂草的选择 微生物对e l 标杂草的选择性较强，在一个复杂的农业生态系统中却往往是多种杂草井 存，只能防除一种或儿种杂草的微生物除草剂很难达到理想的除草效果，其推广及火规模使 用也相应受到限制( m a k o w s k i ，1 9 9 3 ) 。 13 22 温度和湿度的影晌因素 微生物除草剂发挥作朋的是活菌体。温度和湿度直接影响活菌体对目标杂草的作川效果 这就导致许多这样的菌株往往因为施用技术( 温度、湿度及着露期) 要求太严而难丁商品化 ( c h a r u d a t t a n r ，1 9 9 1 ；m a k o w s k i r m d ，1 9 9 3 ；t e b e e s t d o ，19 9 2 ) 。 13 23 大规模生产的条件 主要包括液体发酵和吲体发酵。液体发酵通常使用的方法( a u l d b a ，1 9 9 5 ) ，不同微生物 对温度、通气量、p h 雨1 培养基等要求不一样，某种条件不合适就会导致火规模生产受阻，影 响产品进入市场。 东北农业大学硕| ：学位论文 132 4 微生物除草剂与化学除草剂、化学农药的相互影响 杂草、虫害和病害常可能在同一生态系统中发生。因此，同时或先后施用除草剂及化学 农曲是经常遇到的情况。微生物除草剂与其它农药同时或先后使用，会抵消一方或双方的作 _ l = | ，使其推广人受限制。若它们之间相互作用对一方或双方有利，则有助于微生物除草剂的 火面积推j 1 。 1 3 3 微生物除草剂的前景展望 从发展商品化了的生物除草剂以及正在实践中使川的品种的经验无疑地岢定了生物除 草剂的研究方向是正确的。人类对环境问题的日益关注，义为该研究的深入开展注入动力。 进入2 1 世纪，很多国家都计划在若干年内将逐渐降低化学除草剂川量一半。能否以生物除草 剂作为替代品，是关系这一计划实现的关键。而生物除草剂研制和开发：c 作的迅速发展，是 业，妥的前提条件。完善液体一罔体结合培养技术，以生产生物除草剂或直接试以发酵培 养生产的菌丝体做生物除草剂，以解决那些不能在液体发酵中生成孢子的生物除草剂种类的 + 业化生产问题。虽然目前还未有细菌除草剂的商品化产品，但对其开发具有很人的吸引力， 某些根际细菌的i 卉| 氮作朋能够减少施用化学肥料的费用，开发同时有i 问氮作_ l f j 的细菌除草剂 将会产生较人的经济效益。利用基因工程对微生物进行改进很可能是未米的发展方向。如果 通过基冈i ：程使微生物能控制那些并非是它们常规寄生主的植物，那么情况就人不相同了。 在我国，随着经济的飞速发展，以及在农业上实施的农业可持续发展战略，给生物除草 剂在我国的研究平l i 发展提供了契机。加强国际间合作和交流，及时向国外介绑我国在这方面 的研究成果。利_ l j 国外的先进科技条什和资金共同开发我国生物除草剂资源。根据生物除草 剂的特点，它将在两个领域发展，其一是用来防除危害严重的特殊杂草及寄生性杂革，在这 种情况r 需要注意制剂的类型及其稳定性，环境条件，特别是湿度与温度对效果的影响；其 二是将生物活性化合物作为先导化合物进行结构修饰与优化，为合成新作用机制的除草剂提 供依据。 微生物除草剂的发展虽然落后于化学除草剂，但化学农药对环境的污染越来越引起人们 重视，人类为自身的安全及整个生物界的平衡，终将把防除污染放在第一位，微生物除草剂 的研究、开发和利州必将大有发展前途。微生物除草剂的出现以及与传统除草剂防除技术的 结合，定能使未来综合防治体系更加丰富多彩，别开生面。 8 引言 1 4 小核盘菌 1 4 1 小核盘菌的特性 14 1 1 小核盘菌的鉴定 小核盘菌( s c l e r o t i n i am i n o r j a g g e r ) 属于真菌门( e u m e c o t a ) 子囊苗弧门( a s c o m y c o t i n a ) 盘苗 纲( d i s c o m y c e t e s ) 柔膜菌目( h e l o t i a l e s ) 核盘菌属( s c l e r o t i n i a ) ，茁核较菌核病菌小，直径0 5 】0 毫米，于囊盘直径约0 5 - 20 毫米左右，子囊圆筒形，12 5 13 5 8 1 1 微米：子囊孢子椭圆形， 12 i6 x 6 8 微米，性孢子串生，球形，直径3 4 5 微米。 此菌以凶核附着在病株上越夏戏越冬，翌春苗核萌发长= 山苗丝，从植物的根或苇基部侵入，病部 向地上部扩展蔓延。病株倒伏后义通过病健株接触传染。在病害扩展过程中，繁茂的苗丝产生大量菌核， 由丁耕翻十地菌核落入十壤中，成为掣年初侵染源。 1 412 寄生范围 本菌的寄生范| | f ；】很火，能侵染6 5 科4 0 1 种植物，可以使藜( c h e n o p o d i u ma l b u m ) 、蒲公英 ( t a r a x a c u mo f f i c i n a l e ) 等多数常见阔1 1 1 _ 杂草感病，对阔叶杂草的生物防治效果较f i r ( s t e p h a nc b r i e r e ，2 0 0 0 ) ，也能侵害莴芦( l a c t u c as a t i v al ) 、菜豆、削萝h 等和多种十字花科蔬菜，引起 软腐病( 魏景超，】9 8 0 ) ；同时小核盘菌还可以侵染芦笋、香蕉、郁金香等植物。 1 4 1 3 特性 传播途径：虽然小核盘菌的寄生范同较，但该凶在生产条什f 不能形成子囊盘和子囊 孢子，不能通过空气传 j ；| ，只能通过菌核传 ； ( s t i p e sj j 等，2 0 0 4 ) 。丽菌核的形成又可以通 过( 向生物除草剂中) 添加少量苗核抑制剂( 如环腺苷酸c y l i ca m p ) 等技术措施得到有效抑 制( l e m a ya v 等，2 0 0 2 ) ，这样就可以切断其向其他地块的传播途径。另外，该菌的菌丝体 不能越冬( 夏) ( w y m o r el p 等，2 0 0 3 ) ，对下茬作物没有影响。因此，该菌作为生物防治 病原真菌的安全性可以得到保障。在加拿大，该菌已被用于草坪除草，用于农田除草的研究：r 作正在进行之中( c u b e t am a 等，2 0 0 1 ) ，在杂草的生物防治方面显示出巨火的开发价值和应 川潜力。 、 致病机理：乙二酸在核盘菌的致病过程中起关键作用( h a oj j 等，2 0 0 3 ；d e b o r a hr f 等，2 0 0 2 ；s t e p h e ngc 等2 0 0 0 ) 。小核盘菌通过生物合成乙二酸来酸化、削弱寄主杂草组织， 9 东北农业大学硕：e 学位论文 同时从寄主细胞壁中吸收钙离子，形成乙二酸钙晶体，刺破细胞壁，最后在多聚半乳糖醛酸 酶作用f ，使细胞瓦解( h o l l o w e l l ，j e 等2 0 0 3 ) 。s t e p h a nc b r i e r e 等r 2 0 0 0 ) 通过增加乙二酸 生物合成量的方法增加了小核盘菌对杂草的致病力，提高了小核盘菌生物除草剂的除草效率。 因此，如何提高小核盘菌乙二酸的生物合成量是增强其致病力，提高除草剂除草效率的关键 问题。 1 4 2 影响致病力的主要因素 1 4 2 1 培养基组分 c 源及n 源对于微生物的生长起到举足轻重的作用，不加c 或n 二者之一，菌丝儿乎不生长，严 格把握c ，n 源的供给是把握微生物生长的关键。适宜培养基的选取对菌丝的生k 具有举足轻重的作州， 一般说米，较常_ i ； j 的是p d a 培养基，而培养效果最佳的为麦麸汁葡萄糖琼脂培养基。此菌对p h 的适 应范围很r “，1 6 8 的范围内均可生长，但以p h 6 1 0 为最适。在培养过程中，由于菌体的生 = = ，培 养液的p h 值会有较大改变，一般会降到3 左右，培养适应注意控制酸碱度。在c 源的筛选上蔗糖的 妖贽最好菌丝干重晟人，在n 源的选择上，酵母浸膏的菌丝干重最大，火豆蛋白其次，配制培养基 时廊注意合理搭配。此外，氯化铁等微量元素也是必不可少的，它们的不足会严重影响菌体的生长。因 此，配制培养基时应保证各影响因素的含量水平均达到合理搭配，从而保证培养液的最优配制。 1 4 2 2 温度和湿度 温度和湿度对小核盘苗生k 都有很大影响。该菌喜低温高湿，一般温度在15 2 0 c 、相对湿度在 8 5 以上，有利丁菌核的萌发平菌丝的生长、侵入。菌丝生长发育要求较高的温度，以1 5 - 2 9 c 最适； 尤其需要极高的温度，苗丝生氏的最适宜温度为2 5 c 。小核盘菌菌核4 。c 经长期低温处理可萌发出子囊 盘。子囊孢子对温度的适应范围较广，在1 3 5 c 范围内部可发芽，以5 - 2 5 c 时发芽最快，侵入适温 为1 5 - 2 0 。c 。子囊孢子耐干燥，在干燥环境f 经2 个月后，只要有8 5 c 以上的大气温度，子囊孢 子发芽率仍可达1 0 0 。子囊孢子在黑暗和散射光f 均能正常萌发，日光直射4 小时厉，儿乎完全不能 发芽。 1 42 3 乙二酸的产量 由于小核盘菌的致病源为乙二酸，而乙二酸的合成又受培养条件的影响。例如培养基成 分、碳氮t t ( c n ) 、培养基初始p h 值、培养时间等因素都影响乙二酸的合成量，尤其当培养 1 0 ( j i a n j u nh 等，2 0 0 3 ) 。s t e p h a nc b r i e r e 等( 2 0 0 0 ) 年p a r r yj s 等( 2 0 0 2 ) 的研究表明，当采 取措施使小核盘菌生物除草剂中乙二酸生物合成量增加后，其对杂草的致病力和除草效率也 随之增加。 1 4 2 4 液体发酵阶段菌丝的产量 凶丝的产簧的可直接影响除草菌致病力的大小，通过优化液体发酵过程中培养基、营养 条件和对环境条件的适当控制可以使菌丝产量显著提高，从而提高小核盘苗生物除草剂的除 草效率。 14 25 固体发酵阶段除草菌的活力 除草菌的活力是其致病力的有力保证，通过优化固体发酵阶段培养条什和保藏条件，可 以提高或保持除草菌活力，从而保障了除草菌大规模生产后产品的货架期使其在长时间正 确储存后仍保持有效的致病力。 材料与方法 2 材料与方法 2 1 菌种活化 2 1 1 材料 小核盘菌菌种由加拿大麦吉尔大学提供， p d a 培养基配方：蒸馏水1 0 0 0 m l 土豆 2 i 2 方法 以菌核形式保存于4 冰箱中。 2 0 0g 蔗糖2 0 9 琼脂2 0g ( 赵斌等，2 0 0 2 ) 将所保存菌核以7 5 的酒精和1 次氯酸钠表面消毒，无菌水冲洗后，接神于p d a 培养 基表面，丁2 0 c 培养箱中活化培养6 - 7 天。 2 2 液体发酵 2 21 液体发酵培养基 1 马铃薯葡萄糖培养基( p d b ) 2 察贝克培养基( c z a p e k ) ( 方中达，19 9 8 ) 3 理商德培养基( r i c h a r d ) ( s t e p h a nc ，2 0 0 0 年) 4 葡萄糖硝酸盐培养基( g n a c ) ( 陈天寿，19 9 5 ) 2 22 液体发酵基础培养基的筛选 分别以p d b 、c z a p e k 、r i c h a r d 平g n a c 液体培养基为基础培养基。将各培养基装入2 5 0 m l 的三角瓶中，每瓶l2 5 m 1 p h 值自然。一个大气压f 12 15 灭菌2 0 分钟。j = i ；| 打孔器( 直径 l5 o m m ) 在活化的菌落边缘连同培养基打下菌丝块，每个三角瓶中放入2 块。2 0 。c 、1 3 0 转 分钟黑暗条件_ 卜恒温振荡培养6 天。测定其p h 值、菌丝干重及乙二酸含量。每个处理3 次重复，选择最优培养基，做进一步的筛选。 1 3 东北农业大学硕士学位论文 苗丝干重的测定：取发酵液1 0 0 m l ，在转速3 0 0 0r m i n 下离心1 5 m i n 后倾去上清液菌丝体于9 0 0 烘干，川分析天平称质量。 乙二酸含量的测定：化学常规法( x h 波钦诺克1 9 8 1 ) 。 2 2 3 碳源试验 将筛选出的基础培养基中的碳源分别选用蔗糖、麦芽糖、果糖、甘露醇、乳糖、可溶性 淀粉利甘油代替葡萄糖( 同质量) 进行试验，以不加碳源为对照试验。装瓶，测p h 值，灭 菌，接种，培养6 天同上。测定其菌丝干重及乙二酸含量。每个处理3 次重复。 2 2 4 氮源试验 将筛选山的基础培养基中的氮源分别选用蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、尿素、酵母浸膏、 大豆蛋白、酪蛋白、麦芽浸膏代替硝酸钾( 同质量) 进行试验，以不加氮源为对照试验。装 瓶，灭菌，接种，培养6 天同上。测定其苗丝干重及乙二酸含量。每个处理3 次重复。 2 25 培养基各组分正交试验 在单因子试验的基础上，选择最适碳源、氮源，加磷酸二氢钾、七水硫酸镁、氯化铁三 种微最元素共五种影响冈素，各设四个水平进行正交试验，以确立培养基中各组分的配比。 设计的混合水平止交表如l i6 ( 4 4 x 2 3 ) ( 表2 - 1 ) 所示。其它培养条件同上。 表2 - 1 l l6 ( 4 4 x 23 ) 正交实验因素水平表