（微生物学专业论文）草原湿地土壤细菌和氨氧化细菌群落结构分析.pdf

原创性声明 删嬲 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除本文已经 注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得内蒙古大学及其 他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：童l 夔 日期：列，j ! 衫 指导教师签名 日 期：趁： 。兰厶 在学期间研究成果使用承诺书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将学位论文的全 都内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索， 也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在学期 间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古 大学就读期间导师的同意；若用于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。 学位论文作者签名： 喇艿 指导教师签名： 内蒙古大学硕士学位论文 草原湿地土壤细菌和氨氧化细菌群落结构分析 摘要 湿地是自然界中人类重要的环境资源，具有巨大的环境调节功能 及生态效益。内蒙古高原湿地资源丰富，但也是最受威胁的生态系统。 湿地作为氮素的源、汇或转化器的功能在生态学和环境科学领域日渐 受到重视。内蒙古高原湿地资源丰富，也是最受威胁的生态系统，但 这个区域中氮素循环微生物群落结构变化分析的研究还是空白。 本文以内蒙古高原区域内陆河湿地土壤氨氧化微生物动态变化 为切入点，通过1 6 sr d n a p c r d g g e 技术研究了内蒙古高原锡林河 湿地不同土壤的细菌和氨氧化细菌( a o b ) 的群落结构和遗传多样性， 并对a o b 中的优势菌群进行测序研究，构建了n j 系统发育树。主 要结果如下： 从河心底泥( h x ) 一河边底泥( 船) 一低河漫滩( d q ) 一高 河漫滩( e q ) 一典型草原( t n ) 河流陆向分布的5 个样点中， s h a n l l o n w i e n e ri n d e x ( h ) 、 砌c h n e s s ( s ) 、e v e n n e s s ( e ) 都呈先增后减 的单峰趋势，土壤细菌和a o b 群落结构及其多样性呈现明显的湿地 过渡带分布特征，表明湿地高度的土壤微生物多样性为该区域巨大的 植物生产力提供了基础条件。 塔头湿地土壤细菌以及a o b 的这些指数均表现为塔头高于塔头 间，说明塔头土壤更适合细菌以及a o b 的生长 内蒙古大学硕士学位论文 通过对9 个湿地土壤样品d g g e 图谱进行聚类分析，发现河心 底泥( h x ) 、河边底泥( h b ) 、低河漫滩( d q ) 样点土壤中细菌群 落的多样性相似；河心底泥( h x ) 、河边底泥( h b ) 样点和围封塔头 间湿地( 、m ) 、放牧塔头间湿地( f j ) 长期积水的塔间样地的a o b 群落结构图谱可以分别聚为一类，说明水生环境是影响细菌群落结构 的重要因素。 对a o b 的d g g e 优势条带切胶测序及系统发育分析发现， 中场反阳6 口c 切记占主导地位，大部分为亚硝化单胞菌( m 加s d 聊册黜) 和类亚硝化螺旋菌( n i t r o s o s p i r a - r e l a t e d ) 。据此推断，河流湿地土壤 中，朋加s d m d 刀础为a o b 群落中的优势菌。研究结果可以为内蒙古 高原湿地土壤微生物研究提供基础数据，并为氮素循环研究提供理论 依据。 关键词：草原湿地；土壤细菌；a o b ；d g g e ；群落结构；系统发育 树 内蒙古大学硕士学位论文 c o m 【i 价t ys 1 琢u c t u rea n a i y s i so fb a c t e r i aa n d a m m o n i a o d i z i n gb a c t e r i ai ns t e p p ea n d 硼，a n d s o i l a b s t r a c t w | e t l a n d sa r ei m p o r t a n t 硼胁r a l 锄v i r o n m e n to fh l l m a nr e s o u r c e s ，i t h a sg r e a t 锄访r o 姗e n t a lr e g u l a t i o nf e a t i l r e sa n de c o l o g i c a lb e n e f i t s t h o u 曲t h e r ea r er i c hr c s 伽r c e si ni n n e rm o n g o l i ap l a t e a uw e t l 觚ds o i l ，i t i sa l s ot h em o s tt h 】e a t e n e de c o s y s t e m sw h i c hi s m 】r e l ys t u d i e da i l d r 印o n e d m 如n c t i o no f w r e t l 锄d s 嬲an i 仃o g e ns o u r c e ，s i n l 【o rc o n v e r t e r i nt h eg l o b a lb i o g e o c h 砌c a lc y c l e sh 嬲i n c r e a s i n 9 1 ya t t r a c t e dp e o p l e s a t t e n t i o n t h o u 曲t 1 1 e r ca r cr i c hw e t l a n dr e s o u r c 骼i i lm o n g o l i a np 1 a t e a u ， i ti sa l s ot h em o s tt h l 鼢t e i l e de c o s y s t e m sw 1 1 i c hi s 瑚e l ys t l l d i e da 1 1 d r 印o r t e d t h es t u d yd b o u tt h ec o m m u n i 够s t n j c t u r ec h a n g 懿o fn c y c l e b a c t e r i ai nt h ea m ai sa l m o s tb l a n k i nm i s p a p e r ，、e s t u d i e dt h ec o m m u n i 锣蚰m c t u r ea n dg e n e t i c d i v e r s 时o fw e t l a n ds o i lb a c t 耐a 鲫d 锄m o n j a0 x i d i z i n gb a c t 耐a ( a o b ) i n ) ( i l i n 黜v e ro fi n l 撒m o n g o l i ap l a t e a ub yl6 sr d l n a p c r - d g g e ， a n ds e q u e n c e dc e r t a i nt y p i c a ld o m i n a n ta o b 印u p s ，c o n s m l c t e d 也e 内蒙古大学硕士学位论文 p h y l o g e n e t i c 仃e e t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： s h a i l n o n - w i e n e ri i l d e x ( h ) 、m c l m e s s ( s ) a 1 1 de v e 衄e s s ( e ) b o t hi n b a c t e r i aa n da o bi n c r i e a s e da n dt 1 1 e nd e c i e a s e df 而mt h e5t e n e s t d a l d i s t r i b u t i o n 鼢m p l e s ：s a m p l e so fs e d i m e n tc o l l e c t e di nt h eb o t t o ma tt h e c e m r er i v e r ( h x ) 专s a m p l e so fs o d i i n e n tc o l l e c t e di nt h er i v e r s i d e ( 邶) _ s a n l p l e sc o l l e c t e di nt h el o wf l o o d p l a i n ( d q ) 一s a m p l e sc o l l e c t e di i l t h eh i g hn o o d p l a i n ( e q ) 一s a n l p l e sc o l l e c t e di nt 1 1 et y p i c a ls t e p p e ( n d ， s h o w e dt h a tt h ec o m m u n i t ys 仃u c t u r ea n dd i v e r s i t yo fb a c t e r i aa n da o b h a do b v i o u s l yl a n dd i s t r i b u t i o nf e a t u 陀s w r e t l a n dt 姗s i t i o na r e a so f h i g l l s o i lm i c r o o r g ：洫s m sd i v e r s i 呗c a np r o v i d eam i c r o b i a le c o l o g yb a s i sf o l t h eh i g hb i o l o g i c a lp r o d u c t i v i t yi nt l l i sa r e a s h a m l o n w i e n e ri n d e ) 【( h ) 、硒c l m e s s ( s ) i nt h et o w e n i p w 弱h i g h e r t h a nt h ei n d e x 懿i nt h es a n l p l ea 玎n gt o w e r sw h e m e ri ne n c l o s e do r g a e 乙i n gp l o t s i n d i c a t i n gm a tt h et o w 咖w 舔m o r es u t i a b l ef o rt h e a e r o b i cb a 矧at os u i v e c l u s t e ra n a l y s i so ft h ed g g ep a t t e m sd e m o n s t l 劬。dm a tm e d i v e r s i t yo fb a e r i a li n3r i v e rs 卸1 p l e sh ) ( ，h b ，d qw 嬲s i m p l ew i t h e a c ho t h e et h ea o bi n2r i v e rs a n l p l e sh x ，h ba n dw j ，f js a l p l e s b e t w e c nt o w e r s 也a tp e r e n n i a lf l o o d e dc a nb ec l u s t e r e d t o g e t h e r ， c o n c l u d e dt h a tw a t e re n v i r o m n e n ti sav e 哕i m p o r t a i l tf - a c t o ri n f e c tt h e b a c t 嘶a sc 0 衄u n i 够s 仇l c t u r e s f r o mt h es e ( 1 u e n c i n go ft h ea o b p a r t i a ll6 s d 斟ag e n e s 触肿e n t s 内蒙古大学硕士学位论文 a n ds t u d yo fp h 姐o g e n e t i c 仃| e e ，w ef i n dt h a tm ec o 眦u n i t yw a s d o n l i n a n t e d b y b e t a 尸) 怕纪d 6 口c 玉盯缸， m o s to fm e mw e r e n i t r o s o s p i r a - r e l a t e d 锄dn i 仰s o m o n a s r e l a t e ds e q u e n c e s ，w ei n f e r e dt h a t i nt h er i v e re i i r o 衄e n t ，渤铘d 研d ”傩驴m a yb et h ed o m i n a i l ts p e c i e s 0 u rr e s e a r c hc a np r o v i d eb a s i cd a t af o rt h ei m l e rm o n g o l i ap 1 a t e a u w e t l a n d si l i 佃o g e nc y c l e ，c o n t r i b u t et og l o b a lc l i m a t ec h 乏m g ea n dp r o v i d e at h e o r e t i c a lb a s i sf o re c o l o g i c a la i l de n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n k e y w o r d s ：s t 印p ea n dw e t l a n d ；s o i lb a c t e r i a ；a o b ；d g g e ； c o m m u n i t ys t m c t u r e ；p b 姐o g e n e t i ct r e e v 内蒙古大学硕士学位论文 目录 一引言1 1 1 湿地的生态功能与效益1 1 1 1 湿地的生态功能1 1 1 1 1 湿地的水文功能1 1 1 1 2 湿地的生物地球化学功能i 1 1 1 3 湿地有丰富的生物多样性2 1 1 2 湿地的生态效益和经济效益3 1 1 2 1 湿地的生态效益3 1 1 2 2 湿地的经济效益3 1 2 湿地氮素循环及氮素微生物研究现状3 1 2 1 湿地氮素循环3 1 2 2 氮素微生物研究现状。4 1 3 锡林郭勒草原湿地的特点5 1 4 土壤微生物多态性的研究手段6 1 4 1 磷脂脂肪酸分析方法7 1 4 2 变性梯度凝胶电泳技术( d g g e ) 8 1 4 3 末端限制性片段长度多态性( i 搏l p ) 9 1 4 4 扩增性r d n a 限制性酶切片段9 1 4 5 限制性片段长度多态性一1 0 1 4 6 随机引物扩增多态性l o 1 4 7 单链构象多态性1 0 1 4 8p h y l o c ! l l i p m 毫；片1l 1 4 - 9g c h i p 棚芯片ll 二研究材料及研究方法1 3 2 1 研究材料。1 3 2 1 1 供试样品及其理化性质1 3 2 1 2 主要药品和试剂。1 4 2 1 2 1d n a 提取所需试剂1 4 2 i 2 2 琼脂糖凝胶电泳所需试剂1 5 2 1 3 培养基1 6 2 1 4 试剂盒1 6 2 1 5 主要实验仪器1 6 2 2 研究方法。1 7 2 2 1 湿地土壤d n a 提取1 7 2 2 2d o g e 测定方法。l8 2 2 2 1 准备试剂18 2 2 2 2 准备胶板l8 2 2 2 3 灌胶1 9 2 2 2 4 装配电泳槽架1 9 内蒙古大学硕士学位论文 2 2 2 5 电泳。2 0 2 2 2 6 染色以及照胶2 0 2 2 3q i 脚m 哆0 恤软件使用2 0 2 2 4 克隆测序2 0 2 2 4 1p c r 扩增目的片段2 0 2 2 4 2 琼脂糖凝胶电泳中回收目的片段 2 2 4 3 目的片段与载体连接2 1 2 2 4 4 转化2 l 2 2 4 5 测序2 l 三湿地土壤细菌群落结构分析2 3 3 1 细菌菌群的1 6 sr 鼬崾a 基因的p c r 扩增2 3 3 1 1p c r 反应体系2 3 3 1 2p c r 反应条件2 3 3 2 湿地细菌1 6 sr d n a d g g e 2 4 3 2 1d g g e 。2 4 3 2 2d g g e 图谱分析2 4 3 3 主要结果2 5 3 3 1d g g e 图谱2 5 3 3 2d g g e 多样性指数一2 5 3 3 3 d g g e 条带的聚类分析2 6 3 4 讨论。2 7 四湿地土壤a 群落结构分析2 9 4 1 对湿地a o b 的1 6 sr l u 叮a 基因的p c r 扩增。2 9 4 1 1p c r 反应体系2 9 4 1 2p c r 反应条件。2 9 4 2 湿地a o b 的1 6 sr 【 n a - d ( 粥e 3 0 4 2 1d g g e 3 0 4 2 2d g g e 图谱分析。3 0 4 3 主要结果3 l 4 3 1 d o g e 图谱3 l 4 3 2 d g g e 多样性指数3l 4 3 3 d g g e 条带的聚类分析3 2 4 4 讨论3 3 五湿地土壤a 的系统发育分析3 5 5 1 切胶、构建系统发育树3 5 5 2 核苷酸n c b i 登录号3 5 5 3 主要结果。3 6 5 3 1 测序结果3 6 5 3 2 构建的a o b 系统发育树图谱3 7 5 4 讨论3 8 六结论与展望3 9 内蒙古大学硕士学位论文 6 1 结论：1 9 6 2 展望4 0 参考文献4 1 攻读硕士期间发表的学术论文4 8 致谢4 9 内蒙古大学硕士学位论文 一引言 1 1 湿地的生态功能与效益 湿地和陆地以及水域的界限难以限定，目前尚无确切的湿地定义。但我国学 者常用的湿地定义为：陆地上常年或季节性积水( 水深2m 以内，积水4 个月以 上) 和过湿的土地，并与其上生长、栖息的生物种群构成的生态系统【。 湿地是人类最重要的环境资本之一，它不仅可以为人类提供各种各样的水力 资源、生物资源、景观资源及各种能源等，同时有巨大的环境调节功能及生态效 益，被称为“自然之肾 【2 】。 1 1 1 湿地的生态功能 1 1 1 1 湿地的水文功能 湿地的水文功能主要有供给水分、调蓄洪水、补给地下水、改善水质净化水 质等功能。人们的生活生产用水以及工业用水大都从湿地中获得，湿地储存了大 量的水分，是天然的蓄水容器。由于湿地沼泽土壤含量很大，有很大的蓄水弹性， 可以短时间内蓄积洪水。湿地的地表水可以成为地下水的补给源，地表水从湿地 渗透入地下蓄水系统时，使蓄水层得到了水量补充。这部分流到蓄水层的水溶入 到浅层的地下水中，可以为周围地区提供水源，也可能最终汇入到深层地下水， 在抬高地下水位的同时，成为长期地下水源。由于湿地水流缓慢，对沉积物的沉 降有利，土壤中含有大量有机质，因此湿地系统往往有丰富的动物植物以及微生 物资源。香蒲和芦苇经常被作为湿地生态系统典型修复植物来研究。工业以及生 活废水排入湿地后，经过生物地化循环，被微生物分解转化，使污染程度降低， 改善水质。 1 1 1 2 湿地的生物地球化学功能 1 9 8 1 年，g 棚e l s 和i 栅雒提出了地球表面大气圈、海洋圈、岩石圈和生物 圈之间相互作用的一个简单生物地化模型【”。该模型把大气和海洋中发生的化学 内蒙古大学硕士学位论文 反应同代表地壳主要矿物的7 个分室结合在一起。在湿地生态系统中存在着水循 环、碳循环、氮循环和硫循环等等各种循环。大气圈是陆地生态系统的c 、n 和 s 的主要来源。随着全球环境问题日趋严峻，人类活动和生产对地球造成的伤害 已经快要达到地球承载力的极限。c 0 2 、n 2 0 及其它温室气体的大量排放导致全 球变暖，人类生产生活制造的各种污染物大量流入环境，大肆开采地球非可再生 资源，我们的家园已经千疮百孔12 0 0 9 年的哥本哈根气候大会呼吁“低碳生活 ， 保护环境。 湿地以其结构、分布、组成和构成的特点成为地球上应对气候变化的重要生 态系统之一。湿地生态系统是c 0 2 的“源 和“汇，是c h 4 的“源”，是n 2 0 的“源”。湿地对于大气中c 0 2 的吸收有着重要意义，植物通过光合作用将c 0 2 吸收转化为有机碳，湿地有泥炭湿地和沼泽湿地等，其中积累了大量有机质，不 能快速完全降解，使c 0 2 循环释放，因此湿地作为储存c 0 2 的容器，成为了“碳 汇 ；若湿地被破坏，湿地积累有机质加速分解，那么湿地就会成为“碳源 。甲 烷在厌氧条件下如沼泽等地被甲烷菌分解产生，到好氧环境被甲烷氧化菌氧化。 n 2 0 的排放源主要是土壤【4 】。因此，不同湿地土壤类型以及各种微生物的类型对 全球气候变化有重大作用，保护湿地生态系统已经不容置疑。 1 1 1 - 3 湿地有丰富的生物多样性 湿地生态系统是介于水、陆生态系统之间的一类生态单元。其生物群落由水 生和陆生种类组成，物质循环、能量流动和物种迁移与演变活跃，具有较高的生 态多样性、物种多样性和生物生产力。我国有湿地的面积约2 5 0 0 万公顷，仅次 于加拿大和俄罗斯，居世界第三位【5 】，但人均利用资源量极低。与陆地生态系统 相比，湿地的生物多样性较为丰富，它为多种无脊椎动物、冷血和热血的脊椎动 物提供栖息和繁衍的场所【6 7 】。另外，湿地中有很多不同种类的水生植物，例如 前面提到的香蒲等。这些植物本身可以富集金属元素，将污染物吸收转化，经过 一系列生化过程将其降解，可以改善水质，保护自然。作为多个生化循环途径的 重要参加者，微生物在湿地中的生态作用不可忽视。许多生化、物理等重要的反 应途径中都是借助微生物来完成的，植物根系分泌物成分不同，土壤中气体含量 也有高低，土壤中丰富的肥料以及有机质组分都构成了湿地不同区域的微生物有 2 内蒙古大学硕士学位论文 不同的群落分布，硝化反硝化细菌、甲烷氧化菌以及各种好氧厌氧菌的自然分布 成为湿地调节气候变化的主要组分。 1 1 2 湿地的生态效益和经济效益 1 1 2 1 湿地的生态效益 湿地是地球上具有多种独特功能的生态系统，它可以为人类提供食物、原料 和水资源，同时在维持生态的平衡、保持生物多样性以及保护珍稀物种资源方面， 在涵养水源、蓄洪防旱、调节大气、降解污染物、补充水源、控制土壤侵蚀等方 面均起到重要作用。湿地面积仅占地球表面的6 ，却为地球上2 0 的已知物种 提供生存环境，湿地的生态功能以及作用是不可替代的。 1 1 2 2 湿地的经济效益 湿地可以提供丰富的动植物资源以及农业工业用水以及生活用水，湿地可以 为人类提供各种生产和生活资料，例如木材、食用野菜、药材、特有的动物、禽 蛋、鱼虾、水生植物等，还可以提供水电、沼气等多种生物能源。 同时可以因地制宜，开发湿地作为旅游景区，向公众开发，做为旅游资源， 例如湿地公园等。 湿地同时具有巨大的教育科研意义，丰富的湿地类型，复杂的湿地物种资源 以及湿地自身的生态学意义，可以为科研工作者提供更多的科技课题。 1 2 湿地氮素循环及氮素微生物研究现状 1 2 1 湿地氮素循环 n 是大气圈中含量最丰富的元素，n 与c ，s ，p 等元素的循环是相互耦合的， 对其中一种元素的研究有助于了解其他元素的作用。同时，人类干扰生态环境的 许多方面都牵涉到了n 素，例如光化学烟雾、酸雨，以及地下水中n 0 3 造成的污 染，而n h 3 在早期大气圈中还有可能是一个重要的温室气体。 湿地土壤中的n 素以有机氮的形式存在，占湿地氮总量的9 5 以上。矿质态 3 内蒙古大学硕士学位论文 氮是湿地生态系统中总氮库过渡库，包括n o - n ，n 0 3 。n 。氮进入湿地系统后， 含氮有机化合物在微生物矿化作用下分解为可溶性无机氮；植物吸收可溶性无机 氮并同化为有机氮；植物体内有机氮被动物摄取转移；植物动物残体沉积到湿地 中，含的有机氮又被微生物分解为无机氮，重新开始新一轮循环，具体见下图1 1 。 图1 1 湿地土壤氮素循环 f i g u 1 1 也en i 仃0 9 即- c y d ei nw e d a n d n 湿地在全球生物地球化学循环中的作用已越发引起人们的重视，而氮素作为 一种湿地营养水平的指示剂，常常是天然湿地或人工湿地土壤中的限制性成分 【引。研究成果表明，整个温室效应的5 哆扣1 0 都是由n 2 0 所引起的，n 2 0 对臭氧空 洞的形成和影响至关重要，并且n 2 0 在大气中的含量以年平均o 2 5 的速度在增 加，其主要来源是陆地土壤【9 】。湿地作为氮源、氮汇以及转化器的功能显得至关 重要。湿地土壤中氮素含量及其迁移转化过程也显著影响着湿地生态系统的结构 和功能以及湿地生产力【1 0 1 。 1 2 2 氮素微生物研究现状 目前，世界关于湿地多样性研究大都集中在对人工构建湿地处理后的研究， 而对于天然湿地中参与氮素循环中微生物群落结构的了解却相对贫乏。高原天然 湿地是特殊的湿地生态系统，具有相对高的土壤有机碳，土壤水分和地上植被都 4 内蒙古大学硕士学位论文 具有条带分布性。尽管内蒙古高原湿地生物资源丰富，但随着人们肆无忌惮放牧 和破坏的增加，它也是目前最受威胁的环境系统之一。又由于过去2 0 年的研究 表明，环境样品中多于9 9 的细菌不能在实验室条件下培养出来【1 1 1 ，利用传统 微生物培养方法研究微生物多样性必会造成大量生物信息的遗漏和丢失。因此， 现在人们多用非培养的方法来进行研究。最近，一些研究报道了由过度放牧所引 起的内蒙古湿地退化问题导致的地带性植被和植物群落的变化【1 2 1 ，而针对内蒙古 高原湿地在退化问题导致的土壤微生物群落结构及功能群变化以及随地带性分 布的变化的研究几乎空白。 氨氧化作用是硝化作用的第一个反应步骤，也是限速步骤，是全球氮循环的 中心环节【1 3 ，1 4 1 。而氨氧化细菌可以将氨转化为硝酸盐进行氨氧化且广泛分布于土 壤，海洋等各环境中。鉴于上述，氨氧化细菌作为理想的微生物生态学研究的模 式微生物受到广泛的关注【1 5 1 。 目前，对氮素循环微生物的多态性研究大多在生物反应器【1 6 】和土壤【1 7 】部分， 而关于湿地微生物群落结构及功能群的研究主要集中在人工湿地进行重金属或 各种废水处理或种植某种植物后植物根际效应对微生物影响的研列1 3 】。只有很少 的文献报道了在自然湿地系统中由于不同自然条件的变化导致的氮素循环中 a o b 的变化研究，而在内蒙古高原湿地中这方面还没有相关报道。 l - 3 锡林郭勒草原湿地的特点 我国有4 0 1 0 6 姘草地，约占国土面积的4 0 ，主要有三大类型：温带草原、 高寒草地与热带亚热带草地，分布在我国北方的温带草原是天然草地的主体， 它是地球表面欧亚大陆草原的重要组成部分。锡林郭勒大草原是温带草原最有代 表性的类型。 锡林郭勒生物圈保护区位于锡林郭勒草原的中心，总面积1 0 7 8 6 姘。主要 包括沙地森林生态系统、草原生态系统、农田生态系统、湿地生态系统等不同类 型生态系统。 锡林郭勒草原是重要的草原畜牧业经济区，随着该区域人口的增加，牲畜数 量的增多，放牧强度不断增加，而特定时间和空间的草原承载能力是有限的，因 5 内蒙古大学硕士学位论文 此不合理的割草制度、过度放牧、开垦和粗放耕作使得这一生态系统失衡，导致 退化。家畜在原有的放牧场难以获得足够的牧草，从而放牧的重点从草原转移到 湿地。 内蒙古自治区是我国湿地资源大区之一，面积达4 2 4 5 0 1 0 4k m 2 ，占全国湿 地总面积的1 1 0 3 ，位居全国第三位。受气候、地形、母岩、生物及成土时间等 自然因素影响，全区湿地类型众多。锡林郭勒湿地生态系统主要是自然保护区内 锡林河、扎根斯坦诺尔等河流湖泊，溪水水体及其周边地区的沼泽湿地。这一类 型生态系统所占面积不大，如扎根斯坦诺尔，仅1 6 8 姘，平均水深1 3 m ，锡林 河及其支流如来吐河等，长十千米到几十千米，锡林河平均水深o 2 9 3 m ，年径流 量2 8 5 4 1 0 6 姘。上述湿地生态系统虽然面积不大，但其地位十分重要。由于过 度利用以及天气气候变化，这一生态系统也在退化。 近年来，以塔头为代表的湿地由于放牧强度( 牲畜践踏、啃食程度) 增加， 土壤生产力下降( 地上及地下生物量) 。该区域的湿地退化问题实质是由人为过 度放牧引起的湿地受损问题。湿地作为畜牧业生产的最后支柱，建立湿地受损的 早期预警对维持经济可持续发展至关重要。 1 4 土壤微生物多态性的研究手段 过去2 0 年的研究表明，很多环境样品中多于9 9 的细菌不能在实验室条件 下培养出来【1 1 】，利用传统微生物培养方法研究微生物多样性势必会造成大量生物 信息的遗漏和丢失。因此，现在人们多用非培养的方法进行研究。 目前用于湿地微生物群落结构分析的技术主要有平板计数法、荧光染色法、 b i o l o g 微平板分析、微生物醌指纹法、磷脂脂肪酸( p l f a ) 谱图、荧光原位杂交 ( f i s h ) 技术【1 9 】以及对于微生物多态性的分子研究手段等等。 研究环境微生物群落结构及功能群多样性的分子生物学方法很多，基于磷脂 脂肪酸( p h o s p h o l i p i df a t ：t y 撕d ，p m ) 和核糖体核糖核酸r 】d _ n a 的序列分析，均可 检测土壤中整个微生物群落结构和功能群的多样性【2 0 2 1 1 。研究发现，p u a 图谱 包含了磷脂结构的详细信息，可同时研究微生物群落结构和代谢功能。但分子水 平上主要基于r d i n a 的序列分析。其中，不依赖于p c r 的荧光原位杂交( f i s h ) 技 术【1 9 】可获得形态学数量、空间分布与细胞环境方面的信息，使人们可以对自然 6 内蒙古大学硕士学位论文 生境中的微生物群落及功能群动态进行观察和鉴定。 依赖于p c r 的r d n a 序列分析又是r d l n a 序列分析的主要部分，如扩增性 r d i n a 限制性酶切片段分析( 加n p l i 6 e d 曲o m a ld n ar 懿t r i c t i o n 趾a l y s i s ， a ) 黜q ，肠杆菌基因间保守重复序列( e n t 蹦) b a c t 耐a lr e p 嘶t i v ei l l t e r g 饥i c c o i l s e i l 吼娼，e r i c ) ，单链构象多态性技术( s i n 酉e s 仃刁m dc 0 玎而m 撕o n p o l y m o r l 蛳s m ，s s c p ) ，限制性酶切片段长度多态性分析皿e s t r i 甜五a 鲫e n t l 饥g mp 0 1 ) ，i i 贼p l l i 锄，r f l p ) ，变性梯度凝胶电泳( d 肌a t 证n gg r a d i e n tg e l e l e c h o p s ，d g g e ) 和末端限制性酶切片段长度多态性分析( t 锄【i l i n a l r e s t r i 砸0 n 脚e n tl 锄g c l lp o l y m o 印l l i s m ，t - i 江l p ) 等。 由于自然界中可培养的微生物种类仅占微生物总数的0 1 1 0 蚶2 2 矧。依赖 于p c r 的核酸分析技术可检测某一基因的整个微生物群落结构和功能群的多样 性信息，便于发现新的物种资源，在微生物群落结构变化与环境变化相互作用等 诸多领域取得突破进展，发挥了传统方法无可替代的作用。 下面介绍几种现在常用的研究微生物多态性的分子生物学技术： 1 4 1 磷脂脂肪酸分析方法 p l f a ( p h 供p h o h p mf a t 锣a c i d ) 是磷脂脂肪酸的英文缩写，磷脂是所有生物 活细胞重要的的膜组分，在真核生物和细菌的膜中磷脂分别占约5 0 和9 8 f 2 4 】。 微生物细胞膜的重要成分之一就是p u a 。不同的微生物类群含有不同的 p l f a 。它在土壤中的存在及其丰度可以揭示特定生物或生物种群的存在及其丰 度2 5 1 。由于磷脂在微生物死亡后释放到外面，快速降解，因此这种方法只适用于 研究活体微生物的群落结构。 目前是根据特定的需要使用特定的提取方法如简单提取、扩展提取或m d i 法将p l f a 提取出来后，采用g c 。m s 的方法进行分析测定p l f a 的各种特征以及结 构。 根据不同微生物有不同p l f a 的特点，可以利用这种技术对微生物进行定性 研究，同时根据测得的p l f a 的含量也可以进行定量分析。这种方法不仅只检测 土壤，可以检测腐殖质等其他环境微生物，同时适合大批量检测。但这种方法同 样具有局限性：鉴于目前人们并没有了解所有生物的脂肪酸类型，因此针对某些 7 内蒙古大学硕士学位论文 p l f a 可能无法得出与之相对应的微生物种类。同时，这种方法还有一个缺点就 是不能对古菌进行分析。 现在这种技术已经被人们广泛应用于检测各种土壤微生物的多态性，来监测 各种不同的因素变化对土壤微生物的影响【2 6 1 。 1 4 2 变性梯度凝胶电泳技术( d g g e ) 变性梯度凝胶电泳技术( d 吼a n l r i n gg r a d i e n tg e le l e c 胁p h o r e s i s ，d g g e ) 是目 前应用最为广泛的技术之一。它是指在含有由低到高变性剂浓度的聚丙烯胺 凝胶电泳中，由于相同片段长度的d n a 碱基组成不同，随着电泳的进行， 在d n a 片段向高浓度变性剂方向迁移的过程中，当达到d n a 变性所需要 的最适宜变性温度和变性梯度时，双链d n a 形成部分解链状态，导致其迁 移速率变慢，由于这种变性具有序列特异性，因此d g g e 可以更将不同来源 的d n a 片段进行很好的区分，甚至可以区分到1 个碱基的不同。 d g g e 技术是由f i s c h e r 和l e 姗跚于1 9 7 9 年最先提出的用于检测 d n a 突变的一种电泳技术3 7 1 。自1 9 9 3 年m u y z e r 【3 8 1 首次用d g g e 技术分 析1 6 sr r n a 基因的p c r 产物，研究自然环境微生物群落结构与多样性之 后，这种技术就越来越广泛地应用于各种环境微生物群落结构的组成，功 能群的动态变化分析以及功能细菌的跟踪【3 9 4 3 1 ，人们将它广泛用于研究和比 较不同体系下的微生物群体的结构，通过p c r - d g g 甩可以对土壤微生物群体的 结构进行分析，农业土壤、植物根际、森林、草地、丘陵、稻田、油田、果园、 沙漠等等几乎每一种土壤环境下的细菌群体都已通过p c r d g g e 而被检测。 从理论上讲，d g g e 指纹图上的一个条带就代表一个微生物类群( 分类 水平可达种) 。因而，指纹图谱直观反映了微生物群落的结构和多样性，还 方便判断出优势功能群。回收特征性条带，序列克隆测序后与g e n e b a i l k 中的 已知序列比较，可完成优势物种的分类鉴定。还可以进一步应用于荧光原 位杂交、d n a 芯片和实时定量p c r 等技术，为特异功能群的快速监测做出 贡献。由于d g g e 技术对于引物的大小要求比较苛刻，对超过5 0 0 b p 以上的 d n a 片段不能高效地分离，必需借助“g c 夹 技术才能提高其检出率l 。 d g g e 非常简便，不用培养就可以直接对相同长度的样品目的基因片段 8 内蒙古大学硕士学位论文 进行分析，而且可以检验出整个群落中占总体细菌数量1 以上的优势菌群。 1 4 3 末端限制性片段长度多态性( t - r f l p ) t i 江l p 是对现有的i 江l p 技术的深化延伸，与其它指纹图谱技术相比，它具