（微生物学专业论文）菲高效降解菌株agrobacterium+vitis+phx1的分离、鉴定及其代谢途径研究.pdf

摘要 多环芳烃( p a l - i s ) 是指两个或两个以上的芳环化合物，具有很强的致癌性，给人类健康和环 境造成严重危害，因此开展对多环芳烃污染的生物修复具有重要的理论意义和实践价值。本研究 采用平板升华法对采自大庆油田的油井油水混合物，油田驱油水及石油污染水体的4 个样品进行 了对多环芳烃一菲具有高效降解活性菌株的分离筛选根据形成透明圈的速率和透明圈直径大 小从3 个样品中分离得到1 8 株对菲具有降解活性的细菌其中编号为p h x l 的菌株在牛肉青蛋白 胨培养基( b f ) 中3 6 h 内形成直径大约为7 m m 的透明圈，其透明圈大小及形成速率均为分离菌 株中最显著的进一步对p h x l 在牛肉膏蛋白胨培养基( b f ) 和无机盐( m s ) 培养基中降解菲的 能力进行定量分析，结果发现p h x l 在2 4 h 内将b f 、m s 培养基中1 0 0 p g m l 的菲几乎降解殆尽， 其降解效率明显高于以往报道，最终确定p h x l 为本实验的目的菌株 p h x l 的1 6 sr d n a 的全序列测序结果表明，其与a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n su p - 3 的相似性最 高，为9 9 4 与a g r o b a c t e r i u ma l b e r t i m a g n i 次之，相似性为9 9 1 根据1 6 sr d n a 相似性及 p h x l 生理生化特性，确定p h x l 为a g r o b a c t e r i u ms p 。对p h x l 进行g + c 含量测定及与a g r o b a c t e r i w n 筇属内标准菌株的d n a 同源性分析，发现p h x l 的g + c m 0 1 为5 9 4 ，在a g r o b a c t e r i u ms p 的 c r l c m 0 1 范围内( 5 7 6 3 ) ；与参比菌株a v t s i a m l 4 1 4 0 t 同源性最高达到8 9 4 但p h x l 不能使向日葵结瘤、且3 一酮基乳糖实验为阴性结合其表型特征、生理生化特性、系统发育、 总基因组d n a 杂交分析，将p h x l 定为a g r o b a c t e r i u mv i t i s 的一个变种( 一v i t i sv a t ) p h x l 生长的最适温度为3 7 1 2 ；生长的p h 范围为7 0 9 0 ，其中p h 范围为8 o 8 5 时生长 最好；最适盐浓度为1 5 n a c i ；最佳碳源为麦芽糖和蔗糖；最佳氮源为蛋白胨。p h x i 在牛肉 膏蛋白胨( b f ) 、无机盐( m s ) 和l b 三种培养基中均可以在2 4 h 内将1 0 0 p g m l 的菲降解完全。 b f 和l b 培养基对菌体的生长以及菲的降解是有益的在无机盐培养基中，p h x l 降解菲的适宜 条件为：菲初始浓度为2 0 0 p g m l ，培养温度3 7 ( 2 ，p h 在7 5 9 0 之间，接种量为1 ，以2 5 0 m l 三角瓶中装入5 0 m l 培养基的传氧速率可达到最佳降解效果 对p h x l 在m s 培养基中降解菲的途径进行了研究。首先对p h x l 降解菲的1 、3 、7 d 的产物分别进 行g c - k s 分析，结果从第l d 的降解产物中检测到了卜羟基一2 一萘甲酸( 1 h 2 n ) 和1 一萘酚( n o l ) ，到 第3 d 时只发现n o l ，第7 d 时n o l 消失s o l 是菲的细菌经典代谢途中所没有的，而且发现p h x l 降解 菲的过程中此物质在产物中大量积累；对其不同时间降解产物进行h p l c 分析，结果验证了6 c - g s 的结果，并首次发现菲降解中由邻苯二甲酸( o p a ) 产生邻苯二酚( c a t ) 的现象；进一步以0 p a 为底物接种p h x l ，结果在其降解产物中也检测到c a t ，从而推断p h x l 降解菲的途径不完全相同于 目前已有的报道，是一条新途径 利用质粒消除法证明p h x l 降解菲的主要基因位于质粒上s d s 法对p h x l 的质粒消除效果最好， 利用胶内裂解法证明p h x l 含有两个大型质粒，降解质粒为其中较大的一个，大小约为2 8 0 k b 左右 在以往报道中几乎没有发现如此大的降解质粒接合实验结果表g q p h x l 质粒具有一定移动性但 其接合效率较低；经过摸索9 种不同质粒提取方法，最后确定经过优化的s d s 碱裂解法是提取p i l 】【1 大质粒的最佳方法。 通过六对引物对p h x l 菲降解关键酶一双氧加合酶的a 亚基基因进行p c r 扩增，晟后从来 源于r h o d o c o c c u ss p 的引物1 2 4 的p c r 扩增产物中得到大小为6 6 3 b p 的片段，将其输入g e n b a n k 进行b l a s t 比对，发现与之相似性最高的片段仅为5 5 ，但在2 9 个b l a s th i t s 中有9 个基因序列 同多环芳烃降解有关，且其来源菌属均为砌o d o c o c c $ s p ，与引物1 2 4 来源相符。这些说明p h x l 虽与r h o d o c o c c u ss p 属内相应基因具有一定亲缘关系，但又具有较大的差异，因此p h x l 的双氧 加合酶的编码基因可能具有一定的遗传独特性，该基因可能与双氧加合酶基因相关，但需要进一 步实验证明。 关键词：菲、a g r o b a c t e r i u mv i t j s , p h x l ，代谢途径、降解质粒、双氧加合酶 i i a b s t r a c t p o l y e y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) a r cc o m p o u n d su b i q u i t o u s l yd i s t r i b u t e di na i r , s o i la n d a q u a t i ce n v i r o n m e n t sa sc o n t a m i n a n t s t h ep a h sc o n t a m i n a n t sm a i n l yg e n e r a t e df r o mt h ep r o c e d u r e s o f p r o d u c t i o na n dt r a n s p o r t a t i o no f p e t r o l e u m m o s tp a h sa 托t o x i ct ol i v j | f l gm 即n i s i 璐s 锄co f t h e m a n dt h e i rm e t a b o l i t e sa r em n t a g e n i ca n dc a r c i n o g e n i ct oh u m a n s s ot h es t u d yo nb i o r e m e d i a t i o no f p a h si so f t h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e s c r e e n i n go f ap h e n a n t h r e - d e g r a d i n gs t r a i nf r o mt h e s a m p l e so f o i lw e l la n dt h ew a t e rp o l l u t e db yo i li nd a q i n go nf i e l db yt h em e t h o do f s u b l i m a t i o nw a s d e s c r i b e dm a i n l yi nt h i sp a p e r t h e r ew e 1 85 t r a i n bs h o w i n gp h e n a n t h r e n e - d e g r a d i n ga c t i v i t yi s o l a t e d a f t e rs c r e e n i n g p h x lw a si s o l a t e da st h em o s te f f e c t i v es t r a i no fp h e n a n t h r e n e - d e g r a d i n g , f o r m i n g c l e a r i n gz o n co f 7 r a md i a m e t e ri n3 6 h , b yt h ev e l o c i t yo f t h ef o r m i n gc l e a r i n gz o n ea n dw a n s f o r m a t i o n o fi n d o l e t h ef u r t h e rq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fp h e n a n t h r e n e - d e g r a d i n ge f f i c i e n c yw a sc a r r i e do u t i ti s a b l et ot r a n s f o r mp h e n a n t h r e n e ( 1 0 0 i j t g m l ) c o m p l e t e l yw i t h i n2 4h ri nb e e fe x t r a c t - p e p t o n e0 3 na n d m i n e r a ls a l to “s ) m e d i a t h ed e g r a d i n g - r a 把w a so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h es t r a i n sp r e v i o u sr e p o r t s d u et o t h er e s u l t sa b o v e p h x iw a ss e l e c t e d t a r g e ts t r a i ni nt h i sp a p e r o n m1 6 sr d n as e q u e n c eo fp h x lw a sm o s ts i m i l a rt ot h o s eo f a g r o b a c t e r i u mt w n e f a c i e m ( 9 9 4 ) a n d a a l b e r t i m a g n i ( 9 9 1 9 瓴a n d t h e n t o a v i t i $ 认m 1 4 1 4 0 ( 9 5 7 ) a c c o r d i n g t o t h es i m i l a r i t y o f l 6 s r d n aa n di t sb i o e h e r n i c a lc h a r a c t e f i z a t i o n , p h x lw a si d e n f i f i e da sa g r o b a c t e r i u ms p t h e g u a n i n e - p l u s - c y t o s i n e ( g + c ) c o n t e n to fp 1 1 ) 【ld n a ，w a s5 9 4 l o c a t e dw i t h i nt h er a n g e o f a g r o b a c t e r i u ms p 1 1 d n a d n r e l a t e d n e s sb e t w 1p h x la n da v i a si a m l 4 1 4 0 w 8 9 4 f u r t h e r m o r e , p h x lw a sa b s e n to f3 - k e t o l a e t o s ep r o d u c t i o nw h i c h i sad i s t i n c t i v ef e a t u r ef o r a g r o b a c t e r u ms p e c i e sa n dd i dn o t i l s e1 1 1 1 1 1 0 1 5i nt h eh e l i o t r o p ep l a n t s , i n d i c a t i n gt h a ti tm i g h tn o tb e ap h y t o p a t h o g e n , w h i l et h ea v a ss t r a i l bw e r en o r m a l l yt u m o ri n d u c e r so ng r a p ep l a n t s f r o mt h e s e r e s u l t s , p h x lw a si d e n t i f i e da s a v a s 眦 t h e o p t i m u m g r o w t h t e m p e r a t u r e o f p h x l w a s3 7 c ，a n d g r e w i n g o o d c o n d i t i o n w i t h i n t h er a n g eo f p h 8 0t o8 5 a n d1 5 w a so p t i m u ms a l t yc o n c e n t r a t i o n , i tc o u l dg r o wb e t t e rw h e nc a r b s o u r e a gw a s m a l t o s eo fs u c r o s e a n dg r o wb e t t e rw h e nn i t r o g e ns o t l r e ew a sp e p t o n e p h x la l m o s t a b l et o t r a n s f o r m1 0 0 p g m lo fp h e n a n t h r e n ec o m p l e t e l yi n2 4 hi nb r o t hm e d i ao fb e e fe x t r a c t - p e p t o n e p ) ， l u r i a - b e r t a n i 皿b ) a n dm i n e r a ls a l t sm e d i ao “s ) a n dl ba n db pc o u l dp r o m o t et h eg r o w t ha n d d e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yo fp h x i t h ef o l l o w i n gi so p t i m u mc o n d i t i o no fp h e n a n t h r e n ed e g r a d a t i o no f p h x li nm sm e d i u m ：2 0 0 i t g m lo f p h e n a n t h r e n eo f o r i g i n a lc o n c e n t r a t i o n , 3 7 1 2o f g r o w t ht e m p e r a t u r e ， r a n g eo fp h 7 5t op h 9 ，1 ( v n ) c o i l t e mo fi n o c u l a t i o n , t h ea e r a t i o nr a t eo f2 5 0 m l f l a s kp l u s5 0m l m e d i u m t h eg c - m sw a se m p l o y e dt oa n a l y z et h em e t a b o l i t e so ft h e1 1 , 3 吐a n d 严d a yo fp h e n a n t l u m * d e g r a d a t i o ni nm sm e d i a a sar e s u l t , t h e1 - h y d r o x y - 2 - n a p h t h o i ca c i d ( 1 h 2 n ) a n d1 - n a p h t h o l ( n o l ) w e r ed e t e c t e di nt h em e t a b e l i t e so ft h e1 d a y o n l yn o lw a so b s e r v e do nt h e3 “d a ya n di t ! i i d i s a p p e a r e do nt h e 尹d a y t h ea c c u m u l a t i o no f n o ld i dn o tp e r t a i nt ot h ed e f i n e db a c t e r i a lp m h w a yo f p h e n a n t h r e n ed e g r a d a t i o n f u a h e rh p l cs t u d yc o n f i r m e dt h ef i n d i n gi ng c m sa n a l y s i sa n df o u n dt h e p r o d u c t i o no fc a t e c h o l ( c a t ) f r o mo - p h t h a l i ca c i d ( o p a ) i nt h ep h e n a n t h r e n em e t a b o l i z a t i o n , w h i c h h a sn e v e rb e e nr e p o r t e di no t h e rb a c t e r i a t h i sf i n d i n gw a sc o n f i r m e db yt h ep r o d u c t i o no fc a tu s i n g o p a s u b s t r a t e a c c o r d i n gt ot h ea n a l y t i c a lr e s u l t s w ec o n c l u d et h a tan o v e lp a t h w a ym a y b ee x i s t d u r i n g t h e p r o c e s so f p h e n a n t h r e n e - d e g r a d i n g b y a v i t i s p h x l t h ee f f e c to f s d sf o rp l a s m i de l i m i n a t i o nw a sf o u n dt ob eo b v i o u si nt h ec o u r s eo f t h ec h a r a c t e r i s t i c r e s e a r c hf o rp h x lc a t a b o l i cp l a s m i d t w ol a r g ep l u s m i d sw e l gd e t e c t e da m o n gt h ew i l dt y p ep h x ls t r a i n t h el a r g e ro n e a b o u t2 8 0 k b , i sc a t a b o l i cp l a s m i d t h ep l a s m i d sp h x lc o n t a i n e dw e r es ob i gt h a th a v e n e v e rb e e nr e p o r t e dp r e v i o u s l y t h ec a t a b o l i cp l a s m i do fp h x lw a sp r o v e dt ob eo fm o b i l i t yw i t hl o w f r e q u e n c yb yt h ec o n j u g a t i o ne x p e r i m e n t a tl a s t , 9m e t h o d so ft h e i s o l a t i o no fl a r g ep l a s m i dw e r e a p p l i e di nt h i ss t u d y t h em e t h o do fs d sl y s i sw a sa f f i r m e dt h a ti ti st h em o s te f f e c t i v em e t h o df o r i s o l a t i o no f t h ep h x l sp l a s m i d p c rw a sc a r r i e do u tt oc l o n et h ep h e n a n t h r e n ed i o x y g e n a s eg e n ew i t hs i xp a i r so f p r i m e r af r a g m e n t o f6 6 3 b pw a so b t a i n e du s i n gt h ep r i m e r1 2 4d e s i g n e df r o mr h o d o e o c u ss p t h es e q u e n c ew a sb l a s ti n g e n b a n ka n dm a x i m a ls i m i l a r i t yo f5 5 w a sf o u n d b u t9o f2 9b l a s th i t s ，a l lf r o mr h o d o c o c u ss p ， h a dr e l a t i o n s h i pw i t hp a h - d e g r a d i n g s ot h ef r a g m e n to b t a i n e dm i g h tb ean o v e lg e n eo f p h e n a n t h r e n e d i o x y g e n a s e k e y w o r d s ：p h e n a n t h r e n e ，a g r o b a c t e r i m n v i t i s ，p h x l ，m e t a b 0 1 c p a t h a y , c a t a b o l i c p t a s m i d ，d i o x y g e n a s e 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：彳以缸 时间：2 呓年月2 p 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印，缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：彳厶磊，时间：旗月2 p 日 僦名：嗽放懒帆州钏 中国农业大学博士毕业论文 第一章文献综述 1 1 引言 第一章文献综述 随着人口的迅速增长、工业生产的迅速发展和人民生活水平的不断提高，人类对化学品的依 赖程度越来越高，化学品构成的潜在危险越来越大至今全世界已知的化学品有1 0 0 0 万种，据 u n e p ( u n i t e dn a t i o n se n v i r o n m e n tp r o g r a m m e 。h t t p ：w w w u n e p o r g ) 2 0 0 2 年报告，目前在市场 上流通的化学品超过7 0 0 0 0 种，而每年又有近1 5 0 0 种新的化学品流进市场，这些化学品广泛应 用于农业、工业、医疗及家居，其中有相当一部分很可能导致人类癌症和其它疾病，还有一些则 能破坏臭氧层此外，自然灾害、石油泄漏、火灾等灾害的发生也会导致大量的污染物产生现 在每年约有3 - 4 亿吨有毒有害废物进入环境，它们中绝大多数在环境中蓄积，在生物体内可以 积累并参与生物转化或化学反应等，从而给环境和人类健康造成严重的危害。 在这些污染物中多环芳烃( p o l y c y c l e sa r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a i l s ) 占有相当大比例，它们 大多难以通过物理、化学或生物途径分解而具有环境持久性，在环境中长期存在并保留下来，并可 以通过大气、土壤、水等介质进行全球性迁移，如图i 1 另外。由于这类化学品容易生物蓄积， 使得它们可能浓缩在处于生物链上层的生物活组织中，对人体和野生生物的生命和健康造成威 胁，如导致内分泌、生殖和免疫机能失调、神经行为和发育紊乱、甚至引发癌症( w h i t e ，1 9 8 6 ； p a l h m a n na n dp e l k o n e n , 1 9 8 7 ；u se p a ，1 9 9 8 ) 。因i 绥j p a h s 污染的治理势在必行。 图1 1 有机污染物的全球循环( e p a , 2 0 0 2 ) f i g i | lt h ee j o b a ld i s t r i b u t i o no f o r g a n i cc o n u m i n e n t 中国农业大学博十毕业论文第一章文献综述 1 2 研究背景及研究意义 1 2 1 多环芳烃的定义 多环芳烃( p a h s ) 是指两个或两个以上的芳环稠合在一起的一类化合物，它普遍存在于环境 中。这类物质由于水溶性差、蒸汽压低、辛醇水分配系数高、对微生物生长有抑制作用，再加上 其特殊而稳定的环状结构等特点，使其难以被生物利用并具有强烈的吸附性，因而它们在环境中 呈不断累积的趋势 ( j a e o be ta 1 9 8 6 ) 。 二十世纪初各种多环芳烃的分子结构逐一被确定，许多研究表明( s i m sa n dg r o v e l1 9 7 4 ； h e i d e l b e r g e r , 1 9 7 5 ) ，一些多环芳烃进入动物体后，对哺乳类动物及人类有致癌，致畸、致突变的 作用。1 9 9 0 年，美国环境保护总署将1 6 种多环芳烃化合物列入优先控制污染物的名单中f v a ne t a 2 0 0 4 ) ，如图1 2 。随着科学的发展，人们已经在微生物降解p a h s 的领域做出了较多的研究和有意 义的尝试( w e i s s e n f e l se ta ，1 9 9 0 ；w a l t e re ta ，1 9 9 1 ；m u e l l e re ta 1 9 9 l ；k a n a l ya n dh a r a y a m a , 2 0 0 0 ；k a n g , 2 0 0 2 ) ，实验已经证明微生物能将很多具有遗传毒性的p a h s 降解为二氧化碳和水等无 毒物质( s i m sa n do v e r c a s h ，1 9 8 3 ) ，因此微生物修复是环境多环芳烃污染治理中最具潜力的方式， 并具有成本低、效率高、环境副作用小的优点。萘、菲是目前研究最为广泛的多环芳烃化合物， 尤其是菲在特定的情况下是细菌的诱变剂而且是人类某些超敏反应的外部抗原( f a w e l la n dh t m t , 1 9 8 8 ) ，有些报道称菲可以诱导染色体的交换，同时是阻断细胞间信号转导的潜在抑制物( w e i se t a ，1 9 9 8 ) 许多高致癌性的p a h s 都具有“弯区”( b a y - r e g i o n ) ，如图1 3 ，这个弯区是角苯并环 与分子其余部分之间的区域( j e r i n ae t 以，1 9 7 7 ) 据量子力学计算，预测在这个区域具有环氧基团 的二氢二酚环氧化物有高度的化学和生物学活性。在这个区域形成的二氢二酚环氧化物是强诱变 剂和致癌剂，并被认为是最终致癌物。 1 2 2 多环芳烃来源及其我国污染现状 一般认为多环芳烃主要是由有机物质的不完全燃烧以及石油自然形成的过程中产生的，环境 p a h s 的自然源包括：火山爆发，森林植被和灌木丛燃烧，以及细菌对动物、植物的生化作用等， 但是人为活动特别是化石燃料的燃烧也是环境p a h s 的主要来源( s i m sa n do v c r c a s h , 1 9 8 3 ； b e n n e r e t a l ，1 9 9 0 ；f r e e m a n a n d c a t t e l l ，1 9 9 0 ) 。烟草燃烧也能产生大量的多环芳烃，因为香烟的化 学成分比较复杂，大约有1 2 0 0 种，香烟烟雾中有害物质的种类很多，对人体健康明显有害的就有 3 0 多种，而有致癌危险的多环芳烃化合物也有十几种。以苯并【a 】芘为例，每1 0 0 0 支香烟中的含量 可以高达1 2 2 微克，国产香烟也不例外。一个人如果每天吸无过滤嘴香烟2 0 支以上，每年可以吸 入苯并芘7 0 0 微克以上。这个数字比每人每年从城市污染的空气中吸入的苯并芘量有时还高此 外汽车尾气中也含有半挥发性多环芳烃化合物，其中汽车尾气中还含有苯、甲苯、二甲苯、苯并 【a 】芘等，苯是致癌物质，近年来儿童白血病( 血癌) 高发，就与此有关。 在严重污染区，p a h s 的存在还与下列工业行为有关：化石燃料的汽化和液化、利用化石燃 料生产热和电、焦炭生产、催化裂解、碳黑的生产和应用、煤焦油的生产和应用、原油及其衍生 物的精炼和分馏、木材的保护性处理和防腐剂生产、石油贮存转运处理与应用、废物倾倒和垃圾 填埋、露天燃烧( 垃圾、轮胎、塑料等) 和焚化过程等( b o s e t a l ，1 9 8 4 ；b u m p u s , 1 9 8 9 ；g u n s t e r e t a 。 2 中囝农业大学博士毕业论文 第一章文献综述 删国 国顶d 圆 固幽b e n z o ( b ) f l u o r a n t h e n e 8 击b benzoghiperylene秽dibenza,hianthracene 图1 2 e p a 发布的1 6 种优先控制的p a l i s f i g 1 2 p r i o r i t y c o n t r o l o f l 6 p a h s r e l e a s e d b y e p a 中国农业大学博十毕业论文 第一章文献综述 b e n z o a p y r e n e s e n z a a n t h r a c e n e f l u o r e n t h e n e 图1 3 高致癌性多环芳烃中所含的“弯区” f i g 1 3t h eb a y - r e g i o ni nc a r c i n o g e n e s i sp a h s 1 9 9 3 ；h u n t l e ye t 础，1 9 9 3 ；m u e l l e re ta 1 ，1 9 8 9 ) 我国的p a h s 污染主要体现在土壤、大气、江河沉积物等方面。土地的污水灌溉是造成土壤 污染的主要方式。沈抚灌区位于沈阳东南部，是我国最大的石油类污水灌区之一全区污灌面积 达0 8 7 万m 2 ，由于长期采用抚顺市排放的富含石油烃、挥发酚、硫化物等污染物的工业、生活污 水进行灌溉，已使该区域农田土壤遭受严重污染，土壤中毒物积累严重这其中芳烃类占有相当 比例，致癌物质苯并【a 】芘严重超标，农产品质量低下，尤其是水稻的感官指标极差，已有浓重的 油和芳香族化合物气味该区域的土壤和农作物污染已给区域生态环境和人群健康造成严重危 害。据有关部门的调查，该地区人群几种慢性和恶性疾病的发病率明显增高，特别是由于污灌区 农作物( 稻米、蔬菜等) 基本销往沈阳市城区，造成固定人群长年食用，这已给市区居民身体健康 带来很大的潜在威胁。刘期松等( 1 9 8 4 ) 报道沈抚灌区的抚顺三宝屯四队水稻田，因在3 0 多年的 石油污水灌溉而成为重污染农田，1 9 8 2 年测得p a h s 表层土总量高达6 3 1 9 m g k g 2 0 c m ) ，底层 土总量达6 0 2 9 5 m g k g ( 2 0 3 5 c m ) 。广泛分布于大气中颗粒物( 气溶胶) 中的p a h s 含量也逐 渐增加，例如在p a h s 污染最严重的冬春季节，1 9 9 9 年珠江三角洲经济区大气气溶胶中p a h s 的含 量为( n e d m 3 ) ：南海3 6 1 8 ，广州5 5 4 9 ，珠海2 5 6 3 ，香港1 4 8 8 ，澳f 4 1 7 0 ( 祁士华等，2 0 0 0 ) 。由 于长期水资源污染，江河沉积物中p a h s 的含量也在增加，据1 9 9 8 年的测定结果( 许士奋等，2 0 0 0 ) 长江南京段沉积物p a h s 总量2 1 3 8 5 5 0 3 2 n g g 辽河新民段沉积物p a l - i s 总量在2 7 4 5 1 9 8 2 6 n g g 综上所述，p a h s 污染已对人类和自然界构成了巨大威胁，对其进行环境修复成为人们研究 重点。传统的修复方法是经过土壤挖出、卫生填埋或旖用土壤改良剂等步骤，利用添加氧化物、 过氧化物，使用光解、紫外一氧化或溶剂萃取、表面活性剂洗涤等化学、物理方法进行修复，这 一过程成本较高，且会伴生二次污染( 沈德中，2 0 0 2 ) 。而生物修复恰恰能够避免传统修复的缺陷： 人们已经在微生物降解p a h s 的领域做出了较多的研究和有意义的尝试，实验已经证明微生物能 4 中国农业大学博士毕业论文 第一章文献综述 将很多具有遗传毒性的p a i l s 降解为二氧化碳和水等无毒物质，因此微生物修复具有成本低( 只 有化学、物理等传统修复方法的3 0 4 5 0 ) 、效率高、降解彻底而环境副作用小的优点目前 p a l - i s 高效降解菌株的筛选、降解途径的研究、关键酶及其基因克隆等作为生物修复中涉及到的 重要元素均已成为目前国内外的研究热点 1 3 国内外的研究现状 1 3 1p a h s 高效降解菌株的筛选和培育 微生物修复是环境多环芳烃污染治理中最具潜力的方式，高效降解菌株的筛选是生物修复的 前提和基础，菌种筛选所涉及的因素非常复杂，例如筛选条件、实验室分离的高效降解菌株是否 是环境中优势种群、生物修复中不同微生物的配伍、以及分离得到的高效菌株的稳定性以及其可 靠的保存方法等，这些都是影响生物修复最终成败的关键因素 目前，多环芳烃高效降解菌株的选育主要分为三个步骤：采样、富集和选择培养基筛选采 样是微生物筛选的第一步，所以采样地点、采样方式是后续工作的重要保障。采样地点一般比较 多样化，如士壤、河流、空气、海洋、油田等存在多环芳烃污染的地方，但重要的是取样的同时 要对其取样地点的环境因素做一个充分的调查，如土壤类型、取样深度、酸碱、盐度、含水量、 化学组分、周围环境气候特点等，这些都是菌种筛选过程中模拟自然条件的重要参数采样方式 是保证样品与取样点一致性的重要步骤，通常情况下首先选好取样地点，用事先灭好菌的取样工 具取出一定量的样品放入事先灭菌的器皿中，并将其迅速放入冰浴中，将样品带回实验室后可以 根据情况将其放入超低温或4 c 冰箱保存 分离多环芳烃降解菌第一步是用含有一定量的p a i l s 或原油的无机盐培养基( m i n e r a ls a l t y m e d i a , m s ) 进行富集培养，使降解菌株得到富集而易于分离。由于人造培养基很可能缺乏样品 中所含的一些生长因子而无法分离到环境中真正对污染物降解起作用的菌群，所以目前富集培养 时所用的培养基很多都是样品土壤的浸出液，这样可以尽可能的保持样品中微生物的原生状态 用选择培养基进行分离筛选是最为关键的步骤，筛选方法的不同所得到的微生物也有很大的 差异，适当的方法可以大大提高筛选效率1 9 8 2 年日本的h o h z o h 将萘溶于乙醚，后将此有机溶液 喷洒在事先接种的m s 固体培养基，培养2 3 天，能降解萘的细菌周围就会出现透明圈，然后将 其挑出、纯化。虽然这种方法简单快捷，但是有机溶剂对有些细菌有抑制作用，并很容易污染其 他的杂菌。j e n n y 等在2 0 0 0 年提出了一个更为巧妙的方法，他利用了大多数p a h s 在加热到一定温 度时会发生升华的现象，将萘直接升华到事先接种的m s 培养基表面这样就避免了溶剂喷洒法的 缺点( 图1 4 ) b a s t i a e n s 等人利用锆一聚砜复合膜这一可吸附p a l l s 的载体来筛选具有p a h s 粘着 性的降解菌株，以期提高环境中那些被土壤或淤泥吸附的p a i l s 的降解效率随着分子生物学的 迅猛发展，基于特定d n a 片段或核糖体r n a 的检测筛选技术已经逐渐成为一种新的选择 ( l o y d j o n e se t 以1 9 9 9 ) ，其关键是对p a h s 降解途径中重要降解酶的基因序列进行测定，并将这 些基因片段作为环境中p a h s 降解菌的筛选探针( h e r r i c ke ta 1 ，1 9 9 3 ；l a m i n ge ta 1 ，1 9 9 8 ；h a m a n n “a 1 ，1 9 9 9 ；m e y e r e t a l ，1 9 9 9 ；w i l s o n 甜a ，1 9 9 9 ) 5 中国农业大学博十毕业论文第一章文献综述 图1 4 菲平板升华法选择培养基( j c r c m ya n dl e w i s ，2 0 0 0 ) f i g 1 4s e l e c t i v em e d i a w i t hp h e n a n t h r e n es u b l i m a t i o n 随着分子生物技术的发展，研究者通过分子生态学方法( 如d g g e ) 发现微生物群落中很多 情况下真正起作用的往往不是我们所分离得到的菌株，而是那些不可培养的微生物这种现象实 际上是非常普遍的，有人估计自然界存在的微生物种群大约为l 旷1 0 6 ( t i e d j e 1 9 9 4 ；a l l s o p pe t a 1 9 9 5 ) ，但是我们能够通过实验室条件分离到纯培养微生物也只有几千种，其主要有以下的原因： 1 ) 人类对微生物生长条件、生长规律及相关因素了解的远远不够；2 ) 根据对微生物的估计，人 为“主观”地、武断地设计微生物的培养基、培养条件，使很多在自然环境中生活的微生物在人类的 实验室中“水土不服”，无法存活；3 ) 人类无法“唤醒”在自然环境中“休眠”的微生物；4 ) 通常情 况下人们采用富营养培养条件，认为这样可以使尽可能多的微生物分离出来，但实际上多的并不 是种类而是数量，按照b l o o m f i e l d 理论，将实际对营养物质需求为“寡营养”的微生物迅速置于富 营养状态，微生物初期的快速生长会同时产生大量的、微生物自身难以调节的过氧化物、超氧化 物和羟基自由基等“毒性氧物质”( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) ( b l o o m f i e l de ta ，1 9 9 8 ) ，该类物质 快速、过量的积累会破坏细胞内膜结构，导致细胞死亡，从而表现为微生物的不可培养性：5 ) 忽视微生物问的联系，微生物间的信息交流通过信号分子来完成( 刘小锦等，2 0 0 4 ；付艳芳等， 2 0 0 4 ) ，如酰化高丝氨酸内酯；6 ) 细菌聚集生长，生长最快的菌种占优势、其他菌不能生长；7 ) 细菌尺寸的影响，细菌生长较慢，以普通的培养时间( 一般为2 3 天) 难以培养出肉眼可辨的 菌落。 根据以上的原因，在分离筛选降解菌株时可以改变一些相应的条件来分离尽可能多的微生 物，如降低营养物质、加入新的电子受体和电子供体、加入诱导剂、将样品进行超声处理、延长 培养周期等，但是这也给分离筛选增加了相当的工作量。2 0 0 2 年k a e b e d e i n 等依据膜过滤交换原 理和固定化技术，设计了一种新型的培养方法。此法由一个环状的不锈钢垫圈和两侧胶连的0 1 l a n 滤膜组成一个小扩散盒，滤膜只能允许培养环境中的化学物质通过而不能让细胞通过。将底泥样品 置于扩散盒内的半固体培养基中，扩散盒置于容器底部的天然海洋底泥上。往容器内加入天然海水 并保证扩散盒内存有一定空气供微生物生长( 图1 5 ) 培养时，使天然