（有机化学专业论文）原小檗碱衍生物的合成及其与dna作用的研究.pdf

摘要 摘要 近年来有研究表明，许多原小檗碱类化合物是d n a 结合剂，并表现出抗肿 瘤活性。为了进一步了解原小檗碱类化合物与d n a 作用的机理，发现新的对 d n a 具有高亲和力和高位点选择性的原小檗碱类化合物，本论文的研究选择以 天然原小檗碱类化合物作为母体化合物，经过对母体化合物的化学结构改造，成 功得到了一系列的结构新颖的原小檗碱衍生物，并对这些衍生物与d n a 的相互 作用进行了研究。 论文的主要工作如下： 在论文的第一章中综述了小分子化合物与d n a 作用的研究情况和目前对原 小檗碱类化合物的生物活性及其与d n a 作用的研究进展。 在论文的第二章，首次合成了二聚体原小檗碱化合物j c 2 - j ，j c 3 一j ，j c 4 一j ， j c 2 b ，j c 3 b 和j - c 4 b 。化合物j c 2 一j ，j c 3 一j 和j c 4 j 是通过烷基链从药 根碱分子的3 位将两个相同的药根碱单元连接起来得到，通过采用不同的烷基链 长度改变化合物结构中两个季铵阳离子的正电中心的距离，获得了具有不同电荷 分布的三个同二聚体化合物，如图l 所示。 j a t r q r r h i z i n e c 4n = 2j 一- j ： 圈1 化合物j - c 2 b ，j - c 3 b 和j - c 4 - b 是采用烷基链从药根碱的3 位和小檗红 碱的9 位将药根碱和小檗红碱两个结构单元连接起来得到的三个杂二聚体化合 物( 图2 ) 。与同二聚体一样，连接链长的不同使得化合物中的电荷距离不同， 这对化合物与d n a 相互作用的性质将产生重要影响。利用n m r 和高分辨质谱 ( h r m s ) 分析测试方法对各新化合物进行了结构确证， 中山大学博= 学位论文 b e r b e r r u b i n e 在论文的第三章中，利用光谱方法对六个二聚体化合物与不同的序列d n a 的作用进行了研究。从紫外吸收光谱的滴定实验结果发现，六个二聚体化合物与 d n a 作用后，六个化合物的吸收光谱分别发生1 9 3 5 不同程度的减色现象， 同时最大吸收峰发生红移；从荧光光谱的滴定实验结果发现，这六个二聚体原小 檗碱衍生物在与d n a 作用后荧光发射强度显著增加。通过超分子化学计算理论， 采用非线性拟合方法得到了六个二聚体化合物与d n a 作用的结合常数k a ，结合 常数的大小关系揭示了六个二聚体化合物与d n a 的结合能力要强于原小檗碱单 体化合物。同时还发现，连接链长对二聚体化合物与d n a 作用的性质有重要影 响。在三个同二聚体化合物中，l ，2 一亚乙基链连接的j c 2 一j 表现出与d n a 最好 的结合能力，而在三个杂二聚体化合物中，1 ，3 一亚丙基链连接的化合物j c 3 b 具有与d n a 相对较好的结合力。 在第四章中，对药根碱的3 位和9 位同时进行侧链修饰，通过引进氨丙基和 控制连接不同数目的赖氨酸结构单元，合成了三个双功能多氨基原小檗碱衍生物 l y h - 3 ，l y h 5 和l y h 8 ( 图3 ) 。l y h - 3 ，l y h 5 和l y h 8 的结构经过n m r 和高分辨质谱( h r m s ) 得到确认。 图3 2 i 图 庐胪 4 s 在第五章中，分别采用紫外吸收光谱滴定法和e b 置换荧光光谱法对多氨基 药根碱衍生物l y h 3 ，l y h 一5 ，l y h 一8 与小牛胸腺d n a 的相互作用进行了研究， 结果发现，赖氨酸侧链的引入成百倍的提高了原小檗碱类化合物与小牛胸腺 d n a 的作用能力，是一类良好的d n a 结合剂。 关键词：原小檗碱，药根碱，小檗红碱，d n a 结合剂，多氨基化合物 i i a b s t m c t t h es t u d yo ns y n t h e s i so fp r o t o b e r b e r i n ed e r i v a t i v e s a n dt h e i ri n t e r a c t i o nw i t hd n a m a j o r ：o r g a n i cc h e m i s t r y a u t h o r ：y u - i j al o n g s u p e r v i s o r ：p r o f z u n - l ex u a b s t r a c t m m l yp r o t o b e r t e r i n ea l k a l o i d sh a v eb e e ni d e n t i f i e da sd n a b i n d e r sw i t h m o d e r a t eb i n d i n g8 舔n i t i e sa n ds i t es p e c i f i c i t i e sa n dp o s s e s sa n t i t u m o ra c t i v i t y i n o r d e rt og e tf u r t h e ri n f o r m a t i o no f t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo f p r o t o b e r b e r i n ea s d n ab i n d e r sa n dt od e v e l o pn e wp r o t o b e r b e r i n ed e r i v a t i v e sw i t hh i g hd n a b i n d i n g a f f i n i t i e sa n ds i t es p e c i f i c i t i e s ，as e r i e sp r o t o b e r b e r i n ed e r i v a t i v e sh a v eb e e n s y n t h e s i z e da n dt h e i ra b i l i t i e sb i n d i n gt od n a h a v eb e e ns t u d i e d 善糖sd i s s e r t a t i o nm a i n l yc o m p r i s e st h ef o l l o w i n gf i v ep a r t s ： p r o g r e s so np r o t o b e r b e r i n ea l k a l o i d sb i n d i n gt od n a i ss u m m a r i s e di nc h a p t e r o n e i nc h a p t e rt w o ，s i xd i m e r i cp r o t o b e r b e r i n ea l k a l o i d sj - c 2 - j , j c 3 矗j - c 4 - j , j - c 2 - b ，j c 3 - ba n dj - c 4 一bw e r es y n t h e s i z e d j - c 2 一j ，j - c 3 一j j - c 4 一ja r et h r e e h o m o d i m e r i ca l k a l o i d sd e r i v e df r o ml i n k i n gt w oi d e n t i c a lj a t r o r r h i z i n ep a r t sa tt h e 3 - p o s i t i o no ft h ej a t r o r r h i z i n ew i t hv a r y i n gs p a c e rl e n g t h ( s c h e m e1 ) s c h e m e v 漪 中山大学博士学位论文 j c 2 - b ，j c 3 - ba n dj - c 4 - ba r et h r e eh e t e r o d i m e r i ca l k a l o i d sd e r i v e df r o m l i n k i n gj a t r o r r h i z i n ea t3 - p o s i t i o nw i t hb e r b e r m b i n ea t9 - p o s i t i o n t h r e eh e t e r o d i m e r i c c o m p o u n d sa l s ov a r i e di nd i f f e r e n tl i n k a g es p a c e rl e n g t h ( s c h e m e2 ) t h es i xd i m e r i c c o m p o u n d sw e r ei d e n t i f i e db yn m r a n dh r m s s c h e m e2 i nc h a p t e rt h r e e ，s i xd i m e r i ca l k a l o i d sb i n d i n gt od i f f e r e n td u p l e xd n aw e r e s t u d i e dw i t hs p e c t r o s c o p yt e c h o n o l o g i e s o u rr e s u l t sf r o ms p e c t r o p h o t o m e t r i c e x p e r i m e n t sa n ds p e c t r o f l u o r i m e t r i ce x p e r i m e n t s i n d i c a t et h a tt h es i xd i m e r i c a l k a l o i d sc a nb i n dt od n aw i t hh i g h e rb i n d i n ga f f i n i t i e st h a nb e r b e r i n ea n dp a l m a t i n e t h es p a c e rl e n g t hi nt h es i xd i m e r i cc o m p o u n d sp l a yi m p o r t a n tr o l ei nd n a b i n d i n g a b i l i t y i nc h a p t e rf o u r , t h r e eb i f u n c t i o n a lp o l y a m i n oc o m p o u n d sl y h - 3 ，l y h - 5a n d l y h 一8w e r es y n t h e s i z e d l y h - 3 ，l y h - 5a n dl y h - 8d e r i v e df r o mt h es t r u c t u r a l m o d i f i c a t i o no f j a t r o r r h i z i n ea t3 一a n d9 - p o s i t i o nw i t hl y s i n e l e n g t ho ft h es i d ec h a i n o ft h et h r e ep o l y a m i n oc o m p o u n d sw a sc o n t r o l l e db yl i n k i n gd i f f e r e n tn u m b e ro f l y s i n e ( s c h e m e3 ) a l lt h et h r e ec o m p o u n d sw e r ei d e n t i f i e db yn m r a n dh r m s v q 9 ”2 ”7 、一o c i y 孔 凡 a b s l r a c t i nc h 印t e rf i v e ，t h ed n a b i n d i n ga b i l i t i e so ft h et h r e eb i f u n c t i o n a lp o l y a r n i n o c o p o u n d sl y h 一3 l y h 5a n dl y h 一8w e r es t u d i e dw i t hs p e c t r o s c o p yt e c h n o l o g i e s o u rr e s u l t sf r o m s p e c t r o p h o t o m e t r i ce x p e r i m e n t s a n de b ( e t h i d i u mb r o m i d e ) d i s p l a c e m e n ts p e c t r o f l u o r i m e t r i ce x p e r i m e n t si n d i c a t et h a tt h ei n t r o d u c t i o no fl y s i n e t oj a t r o r r h i z i n ec a no f f e rd n a b i n d i n ga g e n t sw i t hh i g hb i n d i n ga f f i n i t i e s k e yw o r d s ：p r o t o b e r b e r i n e ，j a t r o r r h i z i n e ，b e r b e r r u b i n e ，p o l y a m i n oc o m p o u n d s ， d n a b i n d i n ga g e n t s v i 第1 章原小檗碱化合物与d n a 作用的研究进展 第1 章原小檗碱化合物与d n a 作用的研究进展 1 1 小分子化合物与d n a 作用的研究进展 随着人类对生命现象的不断探索，基因对生命的重要意义已经逐渐被人类所认 识l 。在生命体中基因是生物遗传的功能单位，是载有遗传信息的脱氧核糖核酸 ( d n a ) 片断。基因按照携带的信息表达和产生基因产物核糖核酸( r n a ) 进而 产生蛋白( p r o t e i n ) 。基因结构的异常将导致错误的蛋白的表达，继而表现蛋白功 能的变异，蛋白功能变异是疾病发生的病理生理基础。研究发现许多疾病的发生追 溯其根源都是因为基因结构异常或基因因素与环境因素相互作用的结果。许多常见 病，包括肿瘤，主要是环境因素诱导了基因表达的异常或是引起了基因结构异常的 结果。为了从分子水平上了解导致基因结构变异的原因，进一步寻找出可以治疗基 因结构变异所导致的疾病的药物，科学家开展了小分子化合物与d n a 相互作用的 研究。近年来，大量有关小分子化台物与d n a 作用的研究已在理解生命体中生物 活性物质之间的作用机理，了解疾病产生的分子基础，开发各种治疗疾病的药物等 方面取得了巨大的收获，但同时仍然还有大量的工作需要继续进行，因此这一方面 的相关研究仍然具有重要的意义。 1 1 1d i n a 的结构特点 要很好的开展小分子化合物与d n a 作用的研究，必须首先了解d n a 的结 构特点。对核酸的研究可以回溯到1 8 6 9 年瑞士的青年科学家em i e s c h e r 从脓细 胞中分离得到的一种富含磷的酸性物质，f m i e s c h e r 命名该物质为核质 ( n u c l e i n ) 。事实上，f m i e s c h e r 所得到的是我们今天所说的核蛋白。2 0 年后，r a l t m a n 制备了许多不含蛋白的核酸，并首先使用核酸( n u c l e i ca c i d ) 来命名他的 制品。在后来的研究中，人们根据核酸分子中戊糖的类型将核酸分为核糖核酸 ( r n a ) 和脱氧核糖核酸( d n a ) 。1 9 4 4 年，o ta v e r y 在著名的肺炎球菌转 化实验中首次证明了d n a 是遗传物质。自1 9 5 3 年j d w a t s o n 和f h c r i c k 提 出了d n a 的双螺旋结构模型以来，在现代生物物理技术的发展及其在生物学研 中山大学博士学位论文 究中的广泛应用的基础上，更多的d n a 结构模型已被发现”7 。如与b d n a 模 型几乎同时发现的a d n a ，以及b 和z 型等多种不同构象的d n a 。除此之外 人们还发现了与传统双螺旋截然不同的三链、四链d n a 以及一些非线型结构 的核酸分子( 如三臂、五臂和六臂d n a ) 等。即使是比较常见的双链d n a ，也还 有链状和环状等多种不同形态，并且在一些条件下可形成松弛型、浓缩型、超浓 缩型和花束型等多种拓扑各异的高级结构。这些研究不仅极大地丰富和发展了 d n a 结构学说，而且对于人们了解核酸的功能起到了积极的促进作用。 研究已证明，d n a 是一种由很多核苷酸单体组成的线性大分子聚合物，其 基本单元核苷酸( n u c l e o t i d e ) ( 图1 - 1 ) ，由碱基、戊糖和磷酸三部分组成，四种 含氮碱基为鸟嘌呤( g u a n i n e ) ，腺嘌呤( a d e n i n e ) ，胞嘧啶( c y t o s i n e ) 和胸腺 嘧啶( t h y m i n e ) ，由戊糖和碱基通过糖苷键组合起来的单元叫做核苷。在核酸的 一级结构中，一个核苷的5 一羟基与相邻核苷的3 - 羟基通过磷酸二酯键连接在一 起，因此核酸的共价骨架是由磷酸、戊糖交替排列组成的，而碱基作为侧链连接 在骨架上。核酸中磷酸和戊糖组成的骨架是亲水性的，糖的羟基和溶液中的水分 子形成氢建，在p h7 0 时磷酸基完全离子化，并带负电荷，这些负电荷可与金 属离子、多胺阳离子、蛋白质等带正电荷的物质相互作用。 在水溶液中，d n a 一般是以经典的w a t s o n c r i c k 双螺旋结构存在，即 b d n a ，它是通过两条d n a 单链经过碱基之间以氢建相互作用两两配对结合在 一起( 图1 2 ) 。它的结构参数是每个完整的螺旋约含1 0 4 个碱基对，每两个碱 基对间的距离是3 ，4 a ( 图1 3 ) 。 匹困匝西回 图1 - 1d n a 的核苷酸结构和四个碱基 耐 o 。iiii。 一 文卤 文一 &n、nh鸯回。 第1 章原小檗碱化台物与d n a 作用的研究进展 5 o 0 0 p 二0 c 三兰g b a s ep a i r 图1 2 d n a 双螺旋结构的基本模式 3 5 3 图1 3 b d n a 的结构模型 在d n a 的双螺旋结构中，磷酸二酯键构成的骨架上聚集着丰富的负电荷， 碱基对之间的芳香环部分通过n n 作用堆积在一起，螺旋结构使得两条磷酸骨 架链和碱基对边缘形成了两条相对疏水环境的的凹槽，即宽而浅的大沟槽( m a j o r g r o o v e ) ，和一条相对窄而深的小沟槽( m i n o rg r o o v e ) 。d n a 结构的复杂性特点决 定了小分子化合物与d n a 作用方式的复杂性和多样性。 ，|ij|ilj 诅 中山大学博： 学位论文 1 , 1 2 小分子化合物与d n a 作用的方式 根据小分子化合物与d n a 作用力的不同，总体上可以将作用方式分为两大 类，一类是共价结合作用，另一类是非共价结合作用。 1 1 2 1 共价结合作用 小分子与d n a 的共价结合作用主要是小分子化合物对d n a 的不可逆的化 学修饰作用，通常发生的化学反应有：核苷、核苷酸和核酸的水解作用，氧化作 用，核苷的还原作用以及针对碱基发生的亲核反应和亲电反应。目前临床上使用 的烷化剂类抗癌药物，它们通过共价键作用可以使d n a 的碱基烷基化，从而干 扰d n a 的正常复制和r n a 的合成，阻止癌细胞的增殖，因而表现为抗癌活性。 如临床上重要的抗癌药物丝裂霉素c ( m i t o m y c i nc ) 是乙撑亚胺类抗生素的代 表。丝裂霉素是放线菌( s t r e p t o m y c e sa c h r o m o g e n e s ) 培养液中分离出的一种抗 生素”9 ，它的高细胞毒性和抗癌活性是因为它和d n a 的双共价交联烷基化的结 果。其作用机理过程被认为是丝裂霉素在代谢过程中被还原激活，在d n a 中鸟 嘌呤n 2 处将d n a 烷基化( 图1 4 ) ，过程如下9 ： 图1 4 丝裂霉素与d n a 双烷基化作用的化学机制 烷基化试剂与d n a 作用往往会对d n a 造成非可逆性的损伤，临床上具有 这种作用特点的抗肿瘤抗癌药物对癌细胞的杀伤力大，但同时对增生较快的正常 细胞，如骨髓细胞、肠上皮细胞等的毒副作用也大是这类药物的特点。 第1 章原小檗碱化台物与d n a 作用的研究进展 l i 2 2 非共价结合作用 非共价作用主要包括静电作用，沟槽包结和嵌插作用三种方式( f i g u r el 一5 ) 。 护铲 a b c i n k ：鼬b 矗v e 8 雒 图l 一5 小分子化合物与d n a 非共价作用的三种方式( a ) 静电结合 ( e l e c t r o s t a t i cb i n d i n g ) ，( b ) 沟槽结合( g r o o v eb i n d i n g ) ，( c ) 嵌插作用 ( i n t e r c a l a t i o n ) ( 1 ) 静电作用：带正电荷的阳离子化合物通过静电作用与带负电荷的d n a 非特异性的结合于d n a 双螺旋结构外侧的磷酸骨架。核酸是带有丰富负电荷的 聚合物，在水溶液中往往与阳离子相结合以稳定其结构，因此许多无机阳离子通 常富集在核酸骨架的磷酸根负离子周围，同样带正电荷的有机小分子也可以结合 与d n a 双螺旋的外恻，如多胺小分子。许多芳香环结构的阳离子也可以在核酸 双螺旋结构的外侧堆积形成二聚体或是多聚体，如阳离子卟啉类化合物 ( p o r p h y r i n ) 1 0 叫2 能结合在d n a 双螺旋结构的外侧，并存在多个分子堆叠的情 况，如图1 - 6 和图l 一7 。 p r 。矿c h l i 8 0 p p 鬟；c - o ( c h 幽n * ( c h 3 h 图1 6 卟啉阳离子化合物的化学结构 中山大学博士学位论文 轴b 雌i 州v 9 赫k 融m 。d e h 坤s l a c k 蝴 图1 7 一卟啉结合在d n a 双螺旋结构外侧磷酸根周围的示意图 ( 2 ) 嵌插作用：许多具有平面结构或近平面结构的的小分子化合物可以嵌 入d n a 的碱基对之间，这种作用方式是小分子化合物和碱基之间范德华作用力、 疏水作用、n n 作用的综合结果。嵌插作用又分为经典嵌插( 即完整嵌插) 和 部分嵌插，这两者的区别在热力学效应上有明显差异，经典嵌插反应放热较大， 而部分嵌插反应放热较小。 小分子化合物的嵌入会使碱基对和磷酸骨架发生构形上的扭曲，会使d n a 链增长，柔软性降低，粘度增加。d n a 分子构形的变化可以通过c d 或l d 光 谱加以观察。小分子化合物与碱基之间的n n 作用会使小分子化合物和d n a 分 子的电子效应发生明显的变化，这些电子效应的变化在光谱上通常表现为减色和 红移以及荧光强度的增强或是荧光的淬灭。由于嵌入体的芳环质子受到碱基环电 流的屏蔽作用，在h n m r 中一般可以观察到嵌入体的芳环质子向高场移动。蒽 醌类抗生素”17 是7 0 年代发展起来的抗肿瘤抗生素，主要代表化合物柔红霉素 ( d a u n o m y c i n ) 和阿霉素( a d r i a m y c i n ) ( 图1 8 ) 是典型的d n a 嵌入剂， d a u n o m y c i n 与d n a 作用形成的d a u n o m y c i n - - d n a 复合物的晶体结构证实 d a u n o m y c i n 插入d n a 的碱基对之间。柔红霉索( d a u n o m y e i n ) 和阿霉素 ( a d r i a m y c i n ) 在体内和体外实验均证实具有抑制d n a 复制和r n a 合成的作用， 在临床上用于治疗乳腺癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢痛、肉瘤等实体癌和急性粒细 胞白血病和急性淋巴细胞白血病，这些可能都是因为药物嵌入癌细胞d n a 的碱 基对之间破坏了d n a 的模板作用，进而阻断了d n a 的复制和r n a 的合成，导 致癌细胞最终死亡。 第1 章原小檗碱化合物与d n a 作用的研究进展 图1 8 柔红霉素和阿霉素的化学结构 另一类典型的核酸嵌入剂是溴乙锭类化合物博吨4 ( 图1 9 ) 。溴乙锭具有共平面 的芳环结构，并带有一个正电荷。溴乙锭与d n a 结合后荧光大大增强，基于这 一特性，溴乙锭作为核酸探针已经广泛应用于医药、农药和化工科研和生产体系 中。 图1 - 9 溴乙锭类化合物的化学结构 另外还有吖啶类化合物2 5 3 0 例如原黄素( p r o n a v i n ) ( 图l 一1 0 ) ，吖黄素( a c r m a v i n ) ， 和吖啶黄( a c r i d i n ey e l l o w ) ，他们具有较为扁平的分子平面结构，能够嵌入到d n a 碱基对之间。 骱，鹋n 啦蚪，从矿以n 啦 图1 1 0 原黄素的化学结构 与具有一个芳环平面的嵌插试剂相比，具有两个潜在嵌插部分的双嵌插试剂是科 学家们在寻找具有高亲和力和高序列选择性的d n a 亲和物的产物。双嵌插剂在 d n a 沟槽中与碱基对边缘的作用主要决定于连接两个嵌插部分的链长以及链的 化学性质。地特氯铵( d i t e r c a f i n i u m ) 3 1 q 3 是一个抗肿瘤药物，d i t e r c a l i n i u m 与 蓦 中山大学博士学位论文 d ( c g c g ) 2 序列复合物的n m r 和x 一衍射表明d i t e r c a l i n i u m 嵌插在d n a 的g c 位置，而连接链则位于大沟槽中。这类二聚体化合物中还有溴乙锭二聚体3 6 - 3 7 等( 图l 1 1 ) 。 h 7 一么k 弋 h 图1 1 1 地特氯钱和溴乙锭二聚体的化学结构 嵌插作用是目前许多抗肿瘤抗生素与d n a 相互作用的方式，如：阿霉素、 博莱霉素、道诺霉素、丝裂霉素、放线菌素d 等，它们抗肿瘤活性的实现是通 过与d n a 采用嵌入碱基对的方式，破坏d n a 的模板功能，阻止d n a 的复制、 r n a 的转录以及蛋白质的合成，从而改变癌基因的结构影响癌基因的表达。 ( 3 ) 沟槽结合作用：小分子在d n a 的大沟或小沟的碱基对边缘直接与d n a 结合。这类分予与d n a 结合的共同特点是平面芳香杂环扭转成与d n a 螺旋相 适应的结构，通过一个或多个氢键与d n a 碱基相结合，在范德华作用和疏水作 用下稳定d n a 复合物。 ( i ) 大沟槽包结大沟槽和小沟槽在空间结构、氢建性质、静电势情况以 及水合情况都有不同，因此一般来说，小分子化合物识别小沟槽，大分子( 如： 蛋白质) 识别大沟槽。据报道，有少数的小分子化合物也可以包结在d n a 的大 沟槽，如：甲基绿”。 ( i i ) 小沟槽包结小沟槽具有窄而深的空间结构特性，许多小分子化合物 能与d n a 结合于小沟槽。通过多种方法研究结果3 9 叫8 表明小沟槽结合方式是多 r 第1 章原小檗碱化合物与d n a 作用的研究进展 种非共价结合力的结果，如氢建作用、疏水作用、范德华作用、静电作用。如图 图1 1 2 所示，在小沟槽中富含g c 碱基对的区域由于鸟嘌呤上的氨基的空问位 阻效应使得富含g c 碱基对区域的小沟槽比富含a t 碱基对区域的小沟槽要宽， 并且减弱了g c 段小沟槽的负电势，相反a t 段的小沟槽由于较小的空间位阻和 较强的负电势将更适合许多带正电荷的小沟槽包结化合物的结合。 图l 1 2 d i s t a m y c i n ，n e t r o p s i n 和h o e c h s t3 3 2 5 8 ( 图1 1 3 ) 是研究的比较深入和明确 的d n a 小沟槽包结化合物，许多它们的衍生物也得到广泛的研究4 9 6 9 。 d i s t a m y c i n ，n e t r o p s i n 分别是弯月状的二肽和三肽，它们可通过d n a 小沟结合在 有着4 或5 个连续a t 碱基对的位点，既可以与d n a 以l ：l 结合，也可以以2 ： l 结合，通过对这些肽一d n a 复合物的x 射线晶体结构测定、核磁分析以及热力 学研究表明：氢键、范德华相互作用以及静电作用都对肽与d n a 结合的亲合势 及特异选择性起作用。为了给出互补配位的最适宜形态，这些含两个或三个n 一 甲基吡咯碳酰胺的二肽或三肽以一种适合小沟槽构形的螺旋扭曲方式嵌入d n a 小沟，多酰胺上的n h 在d n a 小沟底部和腺嘌呤a 的n 3 原子及胸腺嘧啶t 的 0 2 原子形成氢键。虽然该n h 基团也可和胞嘧啶c 的0 2 形成氢键，但如果产 生这种结合，n 甲基吡咯环上的芳香氢将因太深地嵌入小沟底部，从而导致无 法提供位置容纳g c 碱基对g 上的n h 基团，这可能是对a t 序列的特异性识别 的根本原因。h o e c h s t3 3 2 5 8 主要是由两个苯并咪唑单元通过单键结合在一起，对 h o e c h s t3 3 2 5 8 与d n a 形成的复合物进行晶体结构分析，表明h o e c h s t3 3 2 5 8 的 苯并咪哗上的n h 基团与t 碱基上的0 2 、n 3 均产生了氢建作用，h o e c h s t3 3 2 5 8 中山大学博士学位论文 分子中苯环与苯环之间单键的连接使得分子易于为了适合小沟槽的螺旋形状而 调整分子的构象。 图1 - 1 3 化合物d i s t a m y c i n ，n e t r o p s i n 和h o e c h s t3 3 2 5 8 的化学结构 由于d n a 结构的复杂性和多态性，小分子化合物与d n a 的作用方式往往 是以上介绍的作用方式中的一种或是几种方式的综合作用。并且一些小分子化合 物对d n a 的作用往往会受到周围环境，如温度、离子强度、p h 值等因素的影 响。要完整获得一个小分子化合物与d n a 作用的详细信息必须依赖先进的测试 方法。目前广泛用于测试的方法有光谱法、粘度法、核磁共振法、微量热法、电 镜法、电化学方法等。每种方法都有特定的局限性，因此多种研究方法的综合应 用是获取小分子化合物与d n a 相互作用的完整信息的必要手段。 1 1 3 研究小分子化合物与d n a 作用的意义 d n a 是生命遗传的物质基础，载有遗传信息的d n a 片断叫做基因，基因的 多样性造就了生物的多样性。研究生物识别体系，开展生物识别的化学模拟研究， 研究生物分子结构和功能之间的关系，探索生物识别的机理和化学本质是当代生 命科学和化学科学的共同课题，开展小分子与d n a 作用的研究不仅对阐明许多 疾病的致病机理有很大帮助，同时是开发新型的抗癌抗病毒药物的有效方法。 。j h n 吖茎| 暾 第1 章原小檗碱化合物与d n a 作用的砷f 究进展 1 2 原小檗碱类化合物与d n a 作用的研究进展 1 2 1 引言 生物碱，一般是指来源于植物的一类含氮有机化合物，大多数具有较复杂的 氮杂环结构，并具有生理活性和碱性。生物碱在植物界分布较广，研究结果显示 在双子叶植物中分布较多，单子叶植物中分布较少。生物碱在植物体的各个组织 都可能存在，但对于某种植物来说，往往是主要集中在某一组织中。例如，麻黄 生物碱在麻黄的髓部含量高，防己生物碱在防己的根部较多。另外，同一种植物 中生物碱的种类和含量一般因产地环境不同、季节不同而有所不同。 自1 8 0 6 年德国科学家f w a s e a m e r 从鸦片中得到吗啡( m o r p h i n e ) 以来， 生物碱类天然产物在全世界受到重视，此后，大量生物碱不断的被发现，如1 8 1 8 年发现的士的宁( s t r y c h n i n e ) 、吐根碱( e m e t i n e ) ；1 8 1 9 年发现的二甲马钱子碱 r b m c i n e ) 、胡椒碱( p i p e r i n e ) 、咖啡碱( c a f e i n e ) 等。1 8 1 9 年ww e i s s n e r 将从植物中 得到的具有碱性的化合物统称之为类碱( a l k a l i l i k e ) 或生物碱( a l k a l o i d ) 。由于生物 碱结构一般较为复杂，虽然1 9 世纪初提取分离了不少生物碱，但当时并未完全 确定结构式。直到1 8 7 0 年才首次测定了较为简单的毒芹碱( c o n i i n e ) 结构式，对 于复杂结构生物碱结构式的确定多数是在2 0 世纪以后，如马钱子碱直到1 9 4 6 年 才得到正确的结构式。现在，由于提取分离技术的不断发展，结合波谱学、晶体 学等系列化学、物理学科和技术的发展及在确定化合物结构上的应用，新的生物 碱被发现和确定的种类和数量大幅增加。同时，由于一些生物碱在生物活性上的 吸引力，生物碱的全合成和半合成工作也己成为重要的研究领域，如，早在1 8 8 9 年就全合成了毒芹碱。此外，通过对生物碱构效关系的研究，进行结构改造，寻 找疗效更高，结构更为简单，并且便于大量生产的新型生物碱药物，也有了很大 的发展，如通过对吗啡的研究，发现了新镇痛药度冷丁( d o l a nt i n e ) ；对可卡因 ( c o c a i n e ) 的研究，发现了局部麻醉药普鲁卡因( p r o c a i n e ) 。 天然生物碱类化合物不仅具有生物来源多样性、化学结构多样性的特点，更 重要的是具有生物活性的多样性特点，这些特点使得生物碱化合物成为今天新药 高通量筛选的天然化合物库，同时也是创新药物研究中发现先导化合物的重要来 源。 中t l l 大学博士学位论文 1 2 2 原小檗碱类化合物的生物活性及构效关系研究 原小檗碱( p r o t o b e r b e r i n e ) 类化合物是生物碱中的一个重要组成部分，广泛存 在于黄连( c o p t i sc h i n e n s i s f r a n c h ) 的根茎、黄柏( p h e l l o d e n d r o n a m u r e n s e r u p r ) 的树皮、| 二| 本小檗( b e r b e r i st h u n b e r g i id c ) 的根茎和木材部分、细叶十大功劳 ( m f o r t u n e il i n d l f e d d e ) 的根、茎、叶等多种植物的各种组织中，主要以叔胺 碱( 即：四氢小檗碱) 和季铵碱两种形式存在”。原小檗碱类化合物都具有共同的 母体结构( 图l 一1 4 ) ，由两个异奎宁环共用一个氮原子稠合而成，许多原小檗碱 类化合物具有广谱的生理、药理活性”“1 ，如抗菌、抗原虫、抗疟、镇痛活性， 抗炎，免疫作用，降糖作用，降胆固醇作用，对神经递质、心脏和循环系统亦有 作用。此外原小檗碱类化合物的抗肿瘤作用更是引起了人们的兴趣。 s t r u c t u r eo fp r o t o b e r b e r i n e j a t r o r r h i z i n e b e r b e r i n e b e r b e r r u b i n e 图1 - 1 4 原小檗碱类化合物：小檗碱( b e r b e r i n e ) ，小檗红碱( b e r b e r r u b i n e ) ， 药根碱( j a t r o r r h i z i n e ) ，巴马亭( p a l m a t i n e ) ，黄连碱( c o p t i s i n e ) 的化学结构。 为了研究原小檗碱类化合物构效关系，研究者将天然原小檗碱化合物进行各种 结构改造得到了许多构效关系方面的信息。 1 2 2 1 抗菌作用的构效研究 原小檗碱类化合物的抗菌作用应用的最为广泛，对这一构效关系的研究也相 对较多。k i m 等人8 2 对小檗红碱9 位进行不同链长的烷基化和酰基化得到了2 5 个化合物，对这些化合物的抗菌活性研究表明，9 位的烷基化和酰基化均能增加 第1 章原小檗碱化合物与d n a 作用的研究进展 对革兰氏阳性菌和真菌的抗菌活性，对革兰氏阴性菌没有活性，随着9 位烷基链 长的增长，抗菌能力增加，c 6 一c 1 2 烷基链具有较好的活性，但当超过1 2 碳链长 则活性降低，并且在总体上，酰基化产物的活性要小于烷基化产物。这说明了化 合物的亲酯性以及空间结构对化合物活性的影响。 1 w a s a 等8 3 为了研究小檗碱类似物的抗菌活性的构效关系设计了四氢原小檗 碱季铵盐、四氢原小檗碱盐及原小檗碱三类共4 0 个化合物，对这些化合物的抗菌 活性的研究发现，这三类化合物抗革兰氏阳性菌金葡萄菌活性大于革兰氏阴性 菌、大肠杆菌和真菌白色念珠菌，并在抗革兰氏阳性菌金葡菌的活性比较中，考 察了原小檗碱c 环中季铵结构、1 3 位的取代基和2 、3 位的亚甲二氧基及9 ，1 0 位的 取代基对活性的影响。结果表明处于芳环c 中的季铵结构及2 ，3 , 6 7 _ 上的亚甲二氧 基、1 3 位上烷基链长度、9 位上烷氧基链长度都能增强原小檗碱类化合物的抗菌 活性。1 9 9 7 年1 w a s a 8 4 研究组在上述研究的基础上继续探讨了1 3 位烷基链的长度对 抗菌活性的影响，无论是1 3 烷基小檗碱衍生物还是1 3 一烷基巴马汀衍生物，其抗 菌活性均随烷基链的增长而增强：2 ，3 亚甲二氧及1 3 一烷基小檗碱衍生物抗菌活性 分别大于相应的2 ，3 一二甲氧基一1 3 一烷基巴马汀衍生物，其中活性较强的1 3 正己基 小檗碱能高选择性地抑制革兰氏阳性菌，其抑制金葡菌s i ( s a u r e u s x ) s o a u r e u s a t c c 3 0 6 1 ) 的活性分别是临床所用小檗碱的6 4 和1 2 8 倍，是卡那霉素硫 酸盐的8 倍和2 倍。另外该研究小组还在保留小檗碱2 ，3 位的亚二甲氧基及c 环中 季铵结构的基础上，研究了于8 矛u 1 2 位分别引入烷基和卤素的抗菌活性，8 一烷基 小檗碱的抗菌沿陛比相应的1 3 一烷基小檗碱强，且随着耿代烷基链的增长，抗菌 活性也增强；1 2 位卤素取代的衍生物比相应的母体化合物强。 2 0 0 3 年v o l l e k o v a 等人8 5 研究了小檗碱、药根碱、巴马亭对表皮真菌的抑制作 用的研究，研究表明，药根碱是这三者中抑制效果最好的一个，药根碱的最小抑制 浓度m i c 为6 2 5 1 2 5 u g m l ，巴马亭和小檗碱的m i c 为5 0 0 1 0 0 0 u g m l 。出现这 种结果，研究人员认为可能是药根碱3 位卜的羟基改变了药物的疏水性的结果。 1 2 2 2 降糖作用的构效关系研究 小檗碱有很好的降糖作用，b i a n 等人8 6 为了研究原小檗碱类化合物降血糖作 用的构效关系，分别从改变小檗碱的2 ，3 ，9 ，1 0 ，1 l 位的基团、及n 原子上的基团 以及c 环的饱和度，合成了1 6 个化合物( 图1 1 5 ) ，从这一系列化合物的构效研究发 中山大学博二l 学位论文 现，2 ，3 位的亚甲二氧基结构对活性有重要意义，c 环的芳环结构不是这一作用 的必须结构，这意味着c 、d 环的非共平面性不一定会使这一活性消失，n 原子上 的取代基对活性影响较大，去除小檗碱9 ，1 0 位的甲基可以增加对小鼠的降糖作用。 图1 1 5b i a n 等人7 5 所设计的化合物 1 2 2 3 抗疟活性的构效关系 1 9 8 8 ；：f - ，v e r m e r s t r o m 等8 7 首次报导了l o + 原d 、檗碱类化合物( 图1 1 6 ) 分别在 体外对恶性疟原虫和体内对伯格氏鼠疟原虫进行了抗疟活性研究。结果发现有些 化合物的体外抗疟活性和奎宁相当，但在体内没有活性。从结构上看，这些化合 物分别是8 位取代的二氢原小檗碱或原小檗碱盐，初步提出了抗疟的活性结构是 二氢原小檗碱和原小檗碱盐。 吨 第l 章积小檗碱化含物与d n a 作用的研究进展 ：肇强强 。麓强强强 融 d ( a a g a a t t c t t ) z c t - d n a d ( a a g c a t g c t t ) 2 ，这说明化合物对a a t t 序列有一定的选择性， 且对长序列的作用强于短序列； ( 3 ) 在三个同二聚体j - c 2 一j ，j - c 3 一j ，j - c 4 - j 中，j - c 2 j 是对d n a 结 合能力最强的一个化合物，这有可能是因为化合物分子中的两个正电荷距离较 近，使得整个分子的正电性密度较大有利于与带负电荷的d n a 进行静电作用。 ( 4 ) j c 2 - j ，j c 3 j ，j c 4 j 对a a t t 的选择性随着链长的增加而减弱。 从表3 - 9 ，表3 1 2 ，表3 1 3 和图3 - 1 3 ；图3 1 5 可以看出： ( 1 ) 杂二聚体原小檗碱衍生物( j c 2 b ，j - c 3 b ，j c 4 b ) 对所研究的 各d n a 都表现出l t d , 檗