（临床兽医学专业论文）黄曲霉毒素Blt1gt单抗的制备及初步应用.pdf

中文摘要 中文摘要 黄曲霉毒素b l 常会污染植物和动物源性食品，被动物摄入体内后，还可转化 成毒性也较大的黄曲霉毒素m l 等衍生物。黄曲霉毒素b l 具有致癌、致畸、致突 变作用，对人类健康构成巨大的威胁。加强对黄曲霉毒素b l 的检测，对确保食品 安全具有重要意义。 黄曲霉毒素b l 的检测方法主要有薄层层析法、高效液相色谱法及免疫学方法 等。薄层层析法灵敏度不高，特异性不强，易被其它荧光物质干扰，且分析时间 较长；高效液楣色谱法虽然灵敏度高，但检测仪器化程度高、设备昂贵，操作技 术要求高，前处理净化要求高；免疫学方法由于其特异性强、灵敏度商，前处理 简单，操作简便，比较容易推广使用。酶联免疫吸附法可同时检测多个样品，特 异性强、灵敏度高、，速度快，是一个准确性、安全性高，实用性强的检测技术。 玉米是我国较为常用的动物饲料来源，园玉米发霉导致动物黄曲霉毒素急、 。慢性中毒的病例屡见不鲜。本研究运用化学合成方法制备a f b l 完全抗原，采用单 克隆抗体技术制备灵敏度高、特异性强、效价高的抗体，建立了e l i s a 测定方法。 采集玉米样品，进行加标回收试验，优化玉米样品中a f b l 的提取净化方法，最终 建立稳定、可靠的检测玉米中a f b - 的方法。 用a f b l 与羧甲基羟胺半盐酸盐在毗啶中反应生成a f b l o ，再用活性酯法将 a f b l o 与蛋白质偶联合成完全抗原。用t l c 法对a f b l o 的转化进程进行实时监 测，用紫外扫描法鉴定每步反应的合成效果，并根据扫描结果计算载体蛋白与毒 素的结合比。经改进的方法合成过程更为简单，同时a f b l 的肟化率和a f b l o 的 利用率较高，分别达到8 4 3 和5 5 4 。 用a f b l h s a 免疫b a l b c 小鼠，四免后阳性血清效价在1 ：1 0 0 ，0 0 0 以上。经 单克隆抗体技术筛选，获得8 株可持续分泌针对a f b l 抗体的杂交瘤细胞株，分别 命名为1 - 5 g 4 、2 6 a 8 、2 a 5 、2 b l 、2 b 3 、2 b 5 、2 b 6 和2 d 3 。稳定性试验表 明，经体外连续传代培养3 0 代和在液氮中冻存1 8 0 d 复苏后，培养上清中抗体的 效价基本保持不变。 用1 5 g 4 、2 6 a 8 、2 - a 5 、2 - b 6 和2 - d 3 五株细胞制备得5 种腹水，效价全部 在l ：1 , o o o ，0 0 0 以上。用1 - 5 g 4 和2 - 6 a 8 两株单抗建立了间接竞争e l i s a 的检测 方法。包被抗原a f b l b s a 和腹水抗体的工作浓度分别为l ：8 , 0 0 0 和1 ：1 0 0 ，0 0 0 ， 用2 o v a ，3 7 下封闭2 h 。 使用i - 5 g 4 腹水检测时，a f b i 浓度在o i 5 n g m l 时，标准曲线线性良好， 线性方程为y 一0 7 5 0 6 x + 0 6 4 5 6 ( - 产- 0 9 9 6 0 ) ，i c 5 0 为1 0 9 n g m l ，l o d 低于o 1 n g m l ， 中文摘要 n l o q 为0 2 n g r a l 。使用2 - 6 a 8 腹水检测时，a f b l 浓度在o 5 5 0 n g m l 时，标准曲 线线性良好，线性方程为y = - 0 3 9 9 8 x + 0 7 3 9 ( 产- o 9 9 3 7 ) ，i c 5 0 为5 8 3 n g m l 。l o d 低于0 5 n g r a l ，l o q 为0 5 5 n g m l 。 对玉米样品中的a f b l 提取方法进行了优化，使提取液对e l i s a 检测的干扰 降低，当提取液作4 倍以上稀释时，基质干扰基本消失。用1 ，5 ，2 0 ，1 0 0 n g m l a f b 。 做加标回收试验，经检测a f b l 回收率在8 3 7 1 2 7 之间，平行样品之间的重复 性较好。e l i s a 标准曲线的线性方程为y = - 0 7 9 2 9 x + 0 6 6 9 2 ( r - - - 0 9 9 5 2 ) ，线性范围 为0 2 - 1 0 n g n l l ，其l o d 为o 2 p g k g 。 关键词：黄曲霉毒素b i ；单克隆抗体：e l i s a ；玉米；检测 英文摘要 a b s t r a c t a f l a t o x i nb lw i d e s p r c a d l yc o n t a m i n a t e sf o o d sp r e p a r e db ya n i m a l s ，a sw e l la s p l a n t s ，a n do n c ei n g e s t e db ya n i m a l s ，i tw i l lc o n v e r tt os o m eo t h e rt o x i cd e r i v a n t s ， s u c ha sa f l a t o x i nm 1 a f l a t o x i nb 1i sc a n c e r i g e u i c ，t e r a t o g e n i ca n dm u t a g e n i e ，w h i c h i sg r e a tt h r e a tt oh u m a n s h e a l t h s oi ti s v e r yi m p o r t a n tf o re n s u r i n gf o o ds a f e t yt o i l l l l a n c et h ed e t e c t i o no f a f b i t h e r e 黜s e v e r a lm e t h o d st od e t e c tt h ec o n t e n to fa f b l ， i n c l u d i n gt h i nl a y e r c h r o m a t o g r a p h y ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n di m m u n o l o g i c a l m e t h o d t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h yi si n s e n s i t i v e ，i n s p e c i f i c ，t i m e - c o n s u m i n g ，a n d e a s i l yi n t e r f e r e db yf l u o r e s c e n tm a t e r i a l h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yi s s e n s i t i v ea n da c c u r a t e ，h o w e r e v e r ，t h ee q u i p m e n ti s v e r ye x p e n s i v ea n dt h e p r e - p r o c e s s i n gi sc o m p l i c a t e d c o m p a r e dw i t ht h et w om e t h o d si n t r o d u c e db e f o r e ， e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) c a nb eu s e dt os c r e e nal a r g en u m b e ro f s a m p l e s ，m e a n w h i l e ， i ti sas e n s i t i v e ，s p e c i a la n dr a p i dm e t h o d c o mi sf r e q u e n t l ym a d ei n t oa n i m a if e e d si no l u c o u n t r y ， m o u l dd e v e l o p m e n to f c 0 1o f t e nl e a d st oa c t i v ec h r o u i ct o x i c o s i s t oe s t a b l i s ht h ee l l s am e t h o df o r d e t e c t i n ga f b ；，t h i sr e s e a r c hs y n t h e s i z e dc o m p l e t ea n t i g e n ，d e v e l o p e dh i g h - g r a d e a n t i b o d i e su s i n gt h et e c h n o l o g yo f m o n o c l o n a la n t i b o d y a f b is t a n d a r dw a sa d d e dt o g e ms a m p l e s ，t h ep r o c e s so f e x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o nw a so p t i m i z e d ，a n df i n a l l ya s t a b l ea n dr e l i a b l em e t h o dt od e t e c t a f b ii nc o lw a se s t a b l i s h e d o ( c a r b o x y m e t h y l ) h y d r o x y l a m i n eh e m i h y d r o c h l o d d ea n da f b , i np y r i d i n e r e a c t e da n dg e n e r a t e da f b , o x i m a t i o n ，t h e nt h el a t t e rc o n j u g a t e dw i t hp r o t e i nf o r m i n g c o m p l e t ea n t i g e n i nt h ec o u r s eo fr e a c t i o n 。t l cm e t h o dw a su s e dt om o n i t o rt h e e o n v e r t i o no fr u b ii n r e a lt i m e ，u vs c a n n i n gm e t h dt o i d e n t i f yt h ee f f e c to f s y n t h e s i s ，a n dt h er a t i oo f a f b it op r o t e i nw a sc a l c u l a t e do nt h eb a s i so f t h er e s u l to f u v s c a n n i n g a f t e rt h ep r o c e s so f c o m p o s i t i o ni m p r o v e d ，t h eo x i m a t i o nr a t i oo f a f b i a n dt h eu t i l i z a t i o nr a t eo fa f b l 0i n e r e a s e dal o t ， a n dr e a c h e d8 4 3 a n d5 5 4 r e s p e c t i v e l y a f b l h s aw a su s e dt oi m m u n i z eb a l b l cm o u s e ，t h ef i t e ro fb l o o dj e n l m 英文摘要 c o l l e c t e da f m rt h ef o r t hi m m u m 2 a t i o nr e a c h e d1 ：1 0 0 ，0 0 0 a f t e rs c r e e n i n g ) e i g h t h y b r i d o m ac e l l si na l lw h i c hc o u l dp e r s i s t e n l ye x c r e ta n t i b o d i e sa g a i n s ta f b t ，w e 把 a c h i e v e d a n d n a m e d w i t h1 - 5 ( 3 4 ，2 6 a 8 ，2 a 5 ，2 - b l ，2 - b 3 ，2 - b 5 ，2 - b 6a n d 2 - i ) 3 s t a b i l i t ye x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a t ，t h et i t e ro fc u l t i v a t i o ns u p e r n a t a n tr e t a i n e d a f t e rc u l t u r i n gi nv i t r of o rt h i n yg e n e r a t i o n sa n da n a b i o s i s e df r o m q u i dn i t r o g e m f i v ek i n d so f a b d o m i n a ld r o p s yw e r em a d cb yi n j e c t i n g1 5 g 4 、2 6 a 8 、2 a 5 、2 - b 6 a n d2 - i ) 3t u m o rc e l l st oa b d o m i n a lc a v i t yo fm i c e ，a n dt h e i rt i t e r sw e r ea l la b o v e 1 ：1 ，o o o 。o o o 1 5 g 4a n d2 - 6 a 8a n t i b o d i e sw e r eu s e dt 0e s t a b l i s he l i s am e t h o d s u i t a b l ec o n c e n t r a t i o no ft h ec o a t e da n t i g e na n da s c i t e st i t e rw o r ed e t e r m i n e db y c h e s s b o a r dt e s t 1 1 1 e a s c i t e st i t e ra n dc o a t e da n t i g e nr e a c h e dl ：1 0 0 ，0 0 0a n dl ：2 ，0 0 0 r e s p e c t i v e l y c a l i b r a t i o ng r a p h sw e r ep r e p a r e d 1 1 1 el i m i to fd e t e c t i o no ft h i sa s s a yw a s e s t a b l i s h e d t o b e 0 1 n g m l ，a n d t h e c o r r e l a t i o n v a l u e i s h i g h n 埒e u s a m e t h o d c a n b e u s e di np r a c t i c a ld e t e c t i o n t oc u td o w nt h ei n t e r f e r e n c eo fe x t r a c ta n dr a i s ee x t r a c t i o nr a t e ，t h em e t h o do f e x t r a c t i n ga f b tf r o mc 0 1w a so p t i m i z e d i n t e r v e n t i o nd i s a p p e a r e dw h e nt h ee x t r a e e w e l ed i l u t e df o u rt i m e s t h er e c o v e r yr a t i ow f f l eb e t w e e n8 3 7 1 2 7 w h e na d d i n g i ，5 ，2 0 ，a n dl o o n g m l a f b lt o c 0 1 ，t h er e p r o d u c i b i l i t y w a s f i n e k 盯w o r d s ：a f l a t o x i nb 1 ；m o n o c l o n a la n t i b o d y ；e l i s a ；c o r n ；t e s t 煎墨塑里 一翌 缩写 a f t a f b l a f b 2 a f g l a f g 2 a n “l a 卟如 a o a c b s a h s a 0 v a f a i f a e d c d c c n h s c m 0 c m 0 a f b t - o e l l s a i e l i s a 玎) c e l i s a r 队 i a c p b s p b s t i g o - h r p t m b d m s o t l c t f a 符号说明 中文名称 黄曲霉毒素 黄曲霉毒素b 1 黄曲霉毒素b 2 黄曲霉毒素o l 黄曲霉毒素0 2 黄衄霉毒素m l 黄曲霉毒素m 2 官方农业化学家协会【美】 牛血清白蛋白 人血清白蛋白 卵清蛋白 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 乙基二甲氨基碳二亚胺 n ，n 二环己基碳二亚胺 n 羟基琥珀酰亚胺 羧甲基羟胺半盐酸盐 0 一( 羧甲基) 羟胺 黄曲霉毒素b l ( 羧甲基) 肟 酶联免疫吸附测定 间接e l i s a 间接竞争e l i s a 放射免疫分析法 免疫亲和柱法 磷酸盐缓冲液 磷酸盐一吐温缓冲液 英文名称 a f l a t o x i n a f l a t o x i nb 1 a f l a t o x i nb 2 a f l a t o x i n0 l a f l a t o x i ng 2 a f l a t o x i nm 1 a f l a t o x i nm 2 a s s o c i a t i o no f o 伍c i a la g r i c u l t u r a l c h e m i s t s b o v i n es e r u ma l b u m i n ， h u m a ns e r u ma l b u m i n o v a l b u m i n f r e u m sa d j u v a n t ， c o m p l e t e f r e u n d sa d j u v a n t ， i n c o m p l e t e 1 - e t h y l 3 - ( 3 - d i m c t h y l a m i n o p r o p y i ) c a r b o d i l m i d e n ，n - d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e n h y d r o x y s u c c i n i m i d e 0 ( c a r b o x y m e t h y l ) h y d r o x y l a m i n e h e m i h y d r o c h l o r i d e c a r b o x y m e t h o x y l a m i n e a f l a t o x i nb 1o x i m a t i o n e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 1 1 1 d i r e c te l i s a i n d i r e c tc o m p e t i t i o ne l i s a r a d i o i m m u n o a s s a y m m u n o a f f i m t yc o l u m n p h o s d h a t eb u f f e rs o d i u m p h o s p h a t eb u f f e rs o d i u mt w e e n 辣根过氧化物酶标记免疫球i m m u n o g l o b u l i n g h o 陪e r a d i s h 蛋白g p e r o x i d a s ec o n j u g a t e 3 ，3 ，5 ，5 ，四甲基联苯胺t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e 二甲基亚砜d e m e t h y l s u l f o x i d e 薄层层析。t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y 三氟乙酸t r i f l o u r o a c e t i c a c i d 符号说明 h p l c h p t l c g c m s d m g n a g i l g n g l m i m h m m m o i l 眈， n g m l 0 d 4 5 0 s d c v ( r s d ) r n u n h z 高效液相色谱 高效薄层层析 气相色谱 质谱 n ，n 二甲基甲酰胺 克 毫克 微克 纳克 升 毫升 微升 小时 分钟 摩尔每升 微克每千克 纳克每毫升 波长4 5 0 r i m 处的光吸收值 标准差 变异系数 转每分钟 赫兹 啪 h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o g r a p h d i m e t h y l f o r m a m i d e g r a m m i l l i g r a m m i c r o g r a m n a n o g r a m l i t r e m i l l i l i t e r m i c r o l i t r e h o u r m i n u t e m o l ep e rl i t r e m i c r o g r a mp e rk i l o g r a m n a n o g r a mp e rm i l l i l i t e r o p t i c a ld e n s i t ya t4 5 0 h m s t a n d a r dd i f f e r e n c e c o e 施c i e n to f v a r i a t i o n r o u n dp e rm i n u t e h e r t z 蒋广明：黄曲霉毒素b l 单抗的制备及初步应用1 1 黄曲霉毒素概述 前言 黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢产 物。1 9 6 0 年6 月到8 月间，英国英格兰南部和东部地区，黄曲霉毒素污染引起十 万只火鸡迅速死亡i i j 。 黄曲霉毒素对动物性食品的污染较普遍，如奶粉、腌肉、香肠、火腿、干咸 鱼中都有一定的检出率；黄曲霉毒素对植物性食品、饲料如玉米、花生、大米、 稻谷等污染严重。非洲有的国家花生中有1 5 样品污染黄曲霉毒素达l ，0 0 g k g ， 有2 5 样品可达1 0 ，0 0 0 “g k g ：美国玉米样品有1 含有黄曲霉毒素；泰国食用花 生有4 7 污染黄曲霉毒素，玉米3 5 污染黄曲霉毒素，其中有的含量可达1 ，o o o 1 , 5 0 g k g 。甚至高达1 0 0 0 p g l ( g 。从我国大规模食品酱查的资料看，我国南方 高温高湿地区也存在着较严重的污染问题。由于植物性食品及其副产品广泛用于 动物饲料，用霉变饲料饲喂动物，可使其中毒，在肝、肾和肌肉中均能检出a f b i 和a f m l ，还可造成乳的污染。全世界平均每年有数十万家畜和家禽因黄曲霉毒素 中毒而死亡。对于猪来讲，不仅摄入a f b l 引起中毒的黄疽病猪可检出a f b l 和 a f m 。，而且摄入a f b i 并未发生黄疸的猪也有一定的含量l z l 。 黄曲霉毒素b i 、b 2 、g 1 、0 2 是粮油制品中黄曲霉毒素的主要存在形式。1 9 9 3 年，黄曲霉毒素被世界卫生组织的癌症机构定为i 类致癌物，其作用的靶器官主 要为肝脏。 据世界粮农组织( f a o ) 报告，全球每年约有2 5 的农作物遭受真菌及其毒 素污染，约有2 的农作物因污染严重而失去营养和经济价值。另据美国食品和药 物管理局( f d a ) 统计，仅1 9 8 1 年，美国即查获价值2 5 亿美元的食品因黄曲霉 毒素超标而被拒绝进口或被销毁。由此估算，全球每年因真菌毒素污染而造成的 直接及间接损失可能达到数百亿美元。近年，进出口商品中均有发现黄曲霉毒素 超标现象，因此黄曲霉毒素已经成为出入境农产品安全卫生检验的重要项目。 1 1 黄曲霉毒素的种类及理化性质 黄曲霉毒素及其衍生物有2 0 多种，都具有双呋喃环和氧杂萘邻酮的结构【3 】。 根据其在紫外光照射下所发出荧光颜色的不同，可分为b 族( 发蓝色荧光) 和g 族( 发绿色荧光) 两大类。奶牛摄入a f b l 后。分泌的乳汁中有a f m j 和a f m 2 。 扬州大学硕士学位论文 e i 州a t b lo ：l 、_ - _ - 一 2 图1 黄曲霉霉索分子结构图 f i git h ec o n f i g u r a t i o no f a f l a t o x i n 各种黄曲霉毒素的分子量为3 1 2 3 4 6 ，熔点为2 f i 8 2 6 9 ，在熔解时，各种 黄曲霉毒素也随之分解。黄曲霉毒素难溶于水、己烷、石油醚，在水中的最大溶 解度只有l o p g l ，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、二甲基甲酰胺等溶液中。 o 黄曲霉毒素是迄今发现的各种真菌毒素中最稳定的一种。结晶的黄曲霉毒素 非常稳定，高温c 2 0 0 ) 、紫外线照射，都不能使之破坏。黄曲霉毒素在酸性、 中性溶液中非常稳定。在p h1 3 的强酸性溶液中稍有分解“1 。在p h9 l o 的碱 性溶液中，能迅速分解产生钠盐，荧光也随之消失。但此反应是可逆的，在酸性 条件下又能形成带荧光的a f b l 。5 次氯酸钠可使黄曲霉毒素完全破坏，c 1 2 、n h 3 、 h 2 0 2 、s 0 2 也能破坏黄曲霉毒素。高压灭菌较难破坏黄曲霉毒素。黄曲霉毒素的水 溶液对光较敏感，加入3 0 9 6 的甘油。可使其稳定性大为提高。 1 2 黄曲霉毒素毒性 黄曲霉毒素进入机体组织内后，有致癌、致畸、致突变的作用。多种黄曲霉 毒素中以a f b l 最为常见，其次是a f g 卜a f g 2 ，而其它毒素含量相对极微一。j 。 毒素进入动物体内可生成6 种代谢产物，即a f tm l 、m z , p i 、q i 、g m i 、g m 2 ， 它们均具有毒性和致癌性，其中最致癌力最大的是a f m l 。 黄曲霉毒素b l 是目前所发现的致癌力最强的物质之一，被世界卫生组织定为 ，致癌“第一杀手”。据报道黄曲霉毒素的致癌强度比二甲基亚硝胺大7 5 倍，除主 要诱发动物肝癌外，还可诱发肾癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌及卵巢肿瘤等。也可 引起染色体畸变，d n a 损伤和畸胎。 黄曲霉毒素的毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药，其中a f tb i ，b 2 、 g 卜g 2 、m 卜m 2 有很强的毒性，a f b l 的毒性最大，致癌力最强，a f m i 、a f g l 次之，a f b 2 、a f g 2 和a f m 2 相对较弱。a f b l 在动物中的急性毒性如表1 所示”。 a f b t 的毒性医动物的种类、年龄、性别不同两不同。一般说来，年轻的雌性动物 高度易感。 ， 蒋广明：黄曲霉毒素b i 单抗的制备及初步应用 三 表1 黄曲霉毒索的急性毒性 ! 些堡! 竺些竺堑! ! 望! ! 竺! ! 型! ! ! 堕! 动物种类l km g k g 雏鸭 兔 猫 熊猫 绵羊 雄鼠 雌鼠 鸡胚 0 3 3 5 o 3 o 5 5 o 6 2 1 7 2 1 7 9 0 0 2 5 g 胚 1 3 黄曲霉毒素致病机理 黄曲霉毒素主要侵害人和动物的肝脏，属于肝毒类，同时又是细胞毒。中毒 时的病理变化主要发生在肝脏，呈肝细胞变性、出血和坏死。黄曲霉毒素进入胃 肠被吸收后，主要分布于肝脏，血液中分布极少，肌肉中几乎检测不到。毒素在 机体内7 天后，大部分随呼吸、尿液、粪便及乳汁排出，残留的毒素通过乳、肉、 蛋等畜产品危害人类健康。 黄曲霉毒素在体内的主要代谢场所为肝脏，目前研究比较清楚的是a f b 。的代 谢途径。a f b 。随血液进入肝脏，在肝细胞中的n a d h 脱氢酶和其他酶的共同作用下， 发生羟化、脱甲基和环氧化反应，转化成黄曲霉毒素醇和黄曲霉毒素q ，后者又 转化成黄曲霉毒素h 。鸟类肝脏中黄曲霉毒素b 和g 。可转化成2 0 h 一2 ，3 二氢衍 生物或半缩醛，这些物质和蛋白质有很高的亲和力。动物摄入a f b t 经过肝脏转化 后，产生碳正离子，能与核酸或蛋白质等大分子结合，从而导致细胞畸变或癌变， 从流行病学资料来看，凡是黄曲霉毒素污染严重的地区，也是肝癌的高发地区。 黄曲霉毒素对大分子物质有破坏作用，如影响组织细胞d n a 、r n a 的合成和 降解，蛋白质、脂肪的合成和代谢，线粒体、溶酶体、内质网的结构功能。毒素 在肝脏中可引起碱性磷酸酶、转氨酶、异柠檬酸脱氢酶等活性升高，肝脂肪增多， 肝糖原下降，肝细胞变性或坏死。黄曲霉毒素通过对蛋白质合成的影响而降低机 体的免疫力【9 】。 2 黄曲霉毒素限量标准 黄曲霉毒素对人畜健康、畜牧生产危害极大，世界各国及相关组织的高度重 视，并纷纷规定了食品和饲料中的最高残留限量，并作为强制性标准使用。 世界卫生组织、联合国粮农组织及国际儿童福利基金会1 9 6 6 年规定食品中黄 曲霉毒素的最高允许量为3 0 p g k g 。后来发现这一数量太高，仍能引发中毒事故， 扬州大学硕士学位论文 故于1 9 7 0 年将最高允许量降低到2 0 t t g k g ，1 9 7 5 年又降低为1 5 9 9 k g 。欧盟农产品 ( 如花生等) 中黄曲霉毒素的最大允许含量已由早期的5 0 t s k g 降至2 0 p g k g ，1 9 9 8 年又将黄曲霉毒素总量降至4 t t g k g ，a f b t 分量降至2 g k g 。国际上黄曲缳毒素的 最大允许含量不断降低，2 0 0 4 年欧盟再次补充修订对婴儿和儿章食品中的黄曲缳 毒素的限量标准，包括谷类食物在内的婴幼儿食品以及具有特殊医疗目的的婴儿 食品，a f b l 的最大允许限量均为o 1 0 垤, k g ，在婴儿配方食品及改进配方食品( 包 括婴儿牛奶和改进配方牛奶) 以及具有特殊医疗目的的婴儿食品中，a f m l 的最大 允许限量均为0 0 2 5 p g k g ! 】 表2 我国对食品中黄曲霉毒素b l 含晕限晕标准( g b2 7 6 1 - - 2 0 0 5 ) ! 生坦；! ! 巴! ! 业! 竺i 堕垒! 垒i 也鱼! ! 堕g 型塑 食品 限量( m l s ) ( p , g k g ) 玉米7 、花生及其制品 大米、植物油( 除玉米油、花生油) 其它粮食、豆类、发酵食品 婴幼儿配方食品 2 0 1 0 5 5 3 黄曲霉毒素检测方法 黄曲霉毒素的分析过程包括样，铸的采集，黄曲缳毒素的提取、净化和测定三 个步骤。 3 1 样品的采集 待检样品中生长或污染有霉菌颗粒所占比例常较小，分布也不均匀。据报道 少数污染严重的作物颗粒中黄曲霉毒素含量可达1 , 0 0 0 ，0 0 0 g k g t l 2 l ，所以样品中污 染黄曲霉毒素高的一粒霉变样品就会左右整个测定结果。有人认为，黄曲霉毒素 测定过程中几乎9 0 的误差来源于采样和样品的提取净化过程i t 3 。为避免取样带 来的误差，必须大量取样，充分混匀，才有可能得到有代表性的相对可靠的结果。 在官方控制中，已经根据不同物品的特性制定了多种采样方案。 中华人民共和国卫生部、中国国家标准管理委员会于2 0 0 3 年8 月1 1 日发布， 2 0 0 4 年1 月1 日正式实施的o b5 0 0 9 2 2 2 0 0 3 中，对采样过程提出以下建议。 ( 1 ) 根据规定采取有代表性试样。 ( 2 ) 对局部发霉变质的试样，应单独取样。 ( 3 ) 每份分析测定用的试样应从大样经粗碎与连续多次用四分法缩减至 0 5 l k g ，然后全部粉碎。粮食试样全部通过2 0 目筛，混匀。花生试样全部通过 l o 目筛，混匀，或将好、坏样品分别测定，再计算其含量。花生油和花生酱等试 样不需制备，但取样时应搅拌均匀。必要时，每批试样可采取3 份大样作试样制 备及分析测定用，以观察所采试样是否具有一定豹代表性。 蒋广明：黄曲霉毒素b l 单抗的制备及初步应用1 3 2 提取净化与富集 。提取净化就是将黄曲霉毒素从基质中提取出来，减少提取物中干扰物质的过 程：一般来讲，理化检测方法特异性差，应尽量避免样品中各种杂质的干扰，样 品经溶剂提取后还要用固相萃取或免疫亲和柱层析净化样品。免疫学检测法特异 性强，一般杂质，如维生素b 2 、喋呤等荧光物质都不会干扰测定结果，所以一般 经溶剂提取后就可直接用于检测。 黄曲霉毒素的提取过程很大程度上依赖于食品和粮食作物的理化性质，没有 一种方法足以用于所有食品和粮食作物的提取。脂类色素含量高的物质，一般需 要更具选择性的提取方法并需要更完善的净化方法。黄曲霉毒素能溶于中等极性 溶剂，不溶于非极性溶剂，常用的提取溶剂有三氯甲烷水、乙腈水、丙酮水和 二氯甲烷水等i t 4 。其中三氯甲烷水的应用较广，早已通过a o a c ( a s s o c i a t i o no f o f f i c i a la g r i c u l t u r a lc h e m i s t s 官方农业化学家协会 美】) 认证的分析花生的c b 方 法i ”1 就是使用了三氯甲烷一水提取溶液，其提取效率已经在多个研究中得到证实。 但由于三氯甲烷的毒性，很多研究者使用了其它不同的溶剂。甲醇水被广泛应用， 已应用于花生、花生酱以及玉米等多种食品的提取。为了提高提取效率，有效去 除杂质，有时在提取液中加入其它物质? 如硅藻土、氯化钠等。 液液分离是根据黄曲辑毒素在不同溶剂巾的溶解度不同，而达到提取、净化 和富集的作用。该方法效率较低，净化程度不高，现在一般是与其它方法结合使 用。固桐萃取技术的使用f l 益广泛，有多种不同类型的固十丌攀取柱，使用的填料 有硅胶、硅酸镁、c 1 8 键合相、f l o r i s i l 硅土和碱性氧化铝柱等。有些净化柱是在样 品提取液通过柱子时将黄曲得毒素保科住，而干扰物质随沈涤液流出，之后再用 沈脱液将黄曲辑毒素洗脱下来。而多功能m y c o s e p 柱填充有多利，不同物质的混合 物，通过不同的原理阻留脂肪、蛋白类复合物、色素以及糖类，而允许黄曲缳毒 素通过，这种方法已经得到了a o a c 的认证1 1 6 1 。 与液液分离和固相净化柱相比，免疫亲和柱同时克服了前者提取效率低和后 者操作复杂的不足，能简单有效地去除干扰杂质。它是将特异性抗体结合到活化 的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时，特定抗原与抗体结合，其他 杂质则通过水或其它水溶液而洗掉，再通过有机溶剂甲醇或乙腈使抗原与抗体解 离而将抗原即毒素洗脱下来。这种净化方法简单、快速、特异性高，几乎是当前 最受重视、最有发展前景的净化方法。 3 3 测定方法 3 3 1 理化检测方法 3 3 1 1 簿层色谱法 扬州大学硕士学位论文 6 薄层色谱法是最早应用于黄曲霉毒素枪测的方法之一，在黄曲霉毒素鉴定分 离方面具有重要地位。本法既可用于定性分析，也可用于定量测定：既可目测也 可用紫外分光光度计、荧光光度计定量。 薄层色谱法的原理是利用样品q t 的黄曲檬毒素与其它物质在固定帽硅胶和流 动相( 适宜的展开剂，如丙酮三氯甲烷：8 + 9 2 ) 中的分配系数不同，达到分离的 目的，再用3 6 5 n m 波跃的紫外线激发黄曲霉毒素产生荧光，根据荧光的强弱与标 准品比较测定其含量。 在t l c 的基础上又发展了高效薄层色谱法( h p t l c ) ，该法可根据待测样品 的不同，改变各种分析条件，如展丌剂，进样技术，展丌槽，检测方式等，以得 到最佳检测效果。张鹏等采用多功能净化柱与h p t l c 法结合检测花生中的黄曲霉 毒素，检出限达o 5 p g k g ，以空白样品为基底，样品中加入0 5 1 0 n g g a f b l 标准 品，平均回收率为8 6 5 9 9 0 t ”j 。 此法检测黄曲霉毒素b f 操作简单，成本低，对实验室仪器设备要求低，一般 实验室均可进行；但其灵敏度不高、特异性不强，样品处理烦琐( 要进行样品提 取和净化) ，分析所需时间长，进行目测定量分析时主观性影响较大。这种方法 仍然是目前使用较多的方法。我国国标中此方法的最低检出量为o 0 0 0 4 p g ，检出 限为5 p g 俺。 3 3 1 2 离效液相色谱法 黄曲霉毒素的高效液相检测方法包括j 下相液帽色谱方法( n p h p l c ) 和反向 液相色谱方法( r p h p l c ) ；检测器可用紫外榆测器和荧光检测器，由于h p l c 荧光检测器的检测灵敏度比h p l c 紫外检测器高3 0 4 0 倍，所以目前多使用 h p l c 荧光检测器检测。黄曲霉毒素液相色谱测定中最大的问题之一是主要黄曲檬 毒素( b i 、b 2 、g i 、g 2 ) 的荧光发射依赖于溶剂的组成：黄曲霉毒素b i 和g i 的 荧光强度较强但在含水的溶剂中容易发生淬灭，因此，一般需对黄曲霉毒素进行 柱前或柱后衍生化以提高它们的检测灵敏度。 n p h p l c 一般使用硅胶柱，流动相含有三氯甲烷或二氯甲烷，在这种条件下， a f b i 和a f b 2 的荧光显著猝灭。为了解决这个问题，有时同时使用荧光检测器和 紫外检测器。 尽管使用n p h p l c 方法，4 种主要黄曲霉毒素能很容易分- 丌，r p h p l c 法由 于其更容易操作以及所使用水性流动相的低毒性使其比n p h p l c 更为常用。黄曲 霉毒素的r p 。h p l c 方法通常使用甲醇水、乙腈水、甲醇乙腈水做流动相，但 在这些水溶液中，a f b i 和a f o i 的荧光释放相当弱，要通过一定的方法使其转变 为其它的物质进行检测。 目前已试验了不同的衍生方法。三氟乙酸能将a f b l 、a f o t 以及a f b i 在体内 的代谢产物黄曲霉毒素a f m i 、a f p i 等转变为a f b 2 。、a f g 孙、a f m 2 。和a g p 2 a ， 较大的提高了检测灵敏度t f a 柱前衍生方法被广泛应用，黄曲霉毒素提取物于 蒋广明：黄曲霉毒索b - 单抗的制备及初步应用! 水三氟乙酸乙酸( 7 + 2 州) 混合物中6 5 加热8 5 r a i n ，水相用于h p l c 分析，a f b i 的检出限低于o 5 p g k g 这种方法已用于多种谷物、坚果的测定。a o a c 推荐的认 证液相方法也使用t f a 衍生，将正己烷和t f a 加入到吹干的提取物中，混合3 0 s ， 不需加热。t f a 也经常用于 f m l 的衍生，s t u b b t e f i d d 研究了不同衍生条件的影响， 认为在非极性溶剂正己烷和异辛烷中， 刚i 和t f 反应效果较好，衍生反应需要 加热“”。t f a 衍生操作简单不需特殊设嵛，其缺点是_ 坤 加了反应步骤，衍生产物不 稳定，并且酸性环境会对管道系统产生腐蚀作用。与柱前衍生相比，柱后衍生完 全在线进行，不需要增加操作步骤。柱后衍生方法所用衍生化试剂有溴、碘以及 环糊精等。 衍生法灵敏度高，检测所需时间短，分辨率高，可对样品进行定性、定量检 测。但仪器设备较昂贵，还要对样品进行提取、净化处理，技术要求较高。 3 3 1 3 微柱层析法 微柱层析法可用于大量样品的过筛，亦可进行半定量测定各种食品中黄曲霉 毒素b l 、b 2 、g 卜g 2 总量。该法主要利用硅镁型吸附剂吸附黄曲辑毒素后，在3 6 5 n m 波长紫外光灯下里蓝紫色荧光带，再与系列定量标准液的微杜管比较进行半定量， 其灵敏度为5 l o p g l ( g ，回收率在9 0 以上，但需要用其它的分析方法进一步测 定确认。微柱层析法特别适用于大批量样品的快速筛选测定，能迅速可靠地筛去 大量阴性样品，以便只对极少数超标样品进行测定 3 3 2 免疫学方法 免疫学方法是以抗黄曲霉毒素的单克隆抗体或多克隆抗体为基础