（无机化学专业论文）癌胚抗原及癌抗原153电化学免疫传感器的研究.pdf

西南大学硕士学位论文摘 要 癌胚抗原及癌抗原1 5 3 电化学免疫 传感器的研究 无机化学专业硕士研究生安海珍 指导教师袁若教授 摘要 癌胚抗原( c e a ) 和癌抗原1 5 3 ( c a1 5 - 3 ) 是国际公认的肿瘤标志物。目前被普遍应用于恶 性肿瘤的辅助诊断、疗效评价和检测复发，如果血液中c e a 或c a1 5 3 呈现较高浓度时，往 往与肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝硬化及肝炎等疾病有很大的关系，因此，快速、准 确地检测血清中c e a 或c a1 5 3 的含量具有非常重要的临床价值。目前检测方法主要包括酶 联免疫吸附分析法( e u s a ) 、放射性免疫法( r i a ) 和化学发光免疫法( c l i a ) 等，但这些方法操 作复杂、检测时间长、有放射性污染等缺点。电化学免疫传感器在临床医学、环境监测、食 品和发酵工业以及农业和国防替方面都有重要应用并以其制备简单、灵敏度高、价格低廉、 检测快速方便和容易实现实时在线活体检测等优点，成为当前研究的热点之一。近年来，国 内外一些学者采用不同的固定方法将抗体固定在传感器上来检测肿瘤标志物，并取得了较好 的进展，但其检测方法和灵敏度仍不能满足实际的需要，因此，开发高灵敏、简便、快速的 检测方法对免疫传感器中抗原或抗体的检测具有重要的理论意义和实际应用价值。 在电化学免疫传感器的构建中，如何有效地利用生物分子固定化技术及固定化材料决定 着生物传感器的稳定性、灵敏度和选择性等主要性能。本文运用电沉积、静电吸附、共价键 合等技术，利用具有强吸附作用的纳米颗粒( 纳米金) 和纳米复合材料( d n a 纳米银复合物) 将 不同的抗体固定在电极表面，实现抗原抗体实时、在线检测；同时利用生物相容性良好的双 链d n a ( d s d n a ) 分子扩大电极的表面积，增加抗体的固定量，解决了传统免疫传感器灵敏度 低、寿命短的缺点。 本论文主要从以下几方面开展研究工作： 1 利用纳米金和( 3 - 巯基丙基) - 三甲氧基硅烷( m p t s ) 作为双重放大基质研制成一种高灵 敏电位型癌胚抗原( c e a ) 免疫传感器。m p t s 通过s h 固定在金电极表面，并通过三个一o c h 3 为后续分子的固定提供更多的键合位点实现第一重放人。纳米金通过其人的比表面积和良好 的生物相容性吸附更多抗体实现第二重放大。比较研究了戊二醛( g a ) 和 y r s 共修饰的免疫 i 西南大学硕士学位论文摘要 传感器、纳米金和巯基乙胺( a e t ) 共修饰的免疫传感器、纳米金和m p t s 共修饰的免疫传感 器的电位响应，证实了纳米金利m p t s 的般重放大作用。另外研究了电极修饰过程中m p t s 和羟胺( n h ) 的反应时间、抗原和抗体的孵育时间、孵育温度等实验条件和参数对传感器性能 的影响。在最优实验条件下，该免疫传感器的线性范围是4 4 8 5 7n g m l - l 。检出限为1 2 r l g - m l - 1 。 2 将硫堇聚合到玻碳电极( g c e ) 表面形成带正电的多孔聚硫堇( p t h ) 复合膜，通过静电吸 附固定d n a 纳米银复合物，利用复合物中纳米银人的比表面积和强的吸附能力将癌胚抗体 ( a m i _ c e a ) 嘲定到电极表面，从而制得高灵敏的电流型癌胚抗原( c e a ) 免疫传感器。通过循环 伏安法考察了电极表面的电化学行为，并对免疫传感器的性能进行了详细研究。在最优的实 验条件下用示差脉冲伏安法( d p v ) 对癌胚抗原进行检测，其线性范同为1 o 1 0 o n g ml - j 和 l o 0 8 0 on g m l 1 ，线性相关系数分别为o 9 9 8 3 和o 9 9 7 0 ，检测限为o 2 4n g m l ，并将该 免疫传感器用于血清样品中c e a 的检测。 3 利用电化学还原氯金酸( h a u c l 。) 的方法将第一层纳米金固定在普鲁士蓝( p b ) 修饰 的金电极( a u ) 表面，再通过共价键合固定玻链d n a ( d s d n a ) ，最后电化学还原氯金酸将第 二层纳米金固定在双链d n a 的表面，利用纳米金大的比表面积和强的吸附能力将癌抗原 1 5 3 抗体( a n t i c a1 5 3 ) 固定到电极表面，从而制得高灵敏的电流型癌抗原1 5 3 ( c a1 5 3 ) 免 疫传感器。通过扫描电子显微镜( s e m ) 和循环伏安法( c v ) 考察了电极的修饰过程，并对 免疫传感器的性能和影响因素进行了详细研究。在最优的实验条件f ，用循环伏安法对癌抗 原1 5 3 进行检测，其线性范围为1 0 1 5 0n g m l 。和1 5 o 2 4 0 0n g m l ，检测限为0 6 n g ml 1 。该免疫传感器呈现较高的灵敏度、良好的选择性和较强的稳定性，并将该免疫传感 器用于血清样品中c a1 5 3 的检测。 关键词：免疫传感器癌胚抗原癌抗原15 3 双层纳米金d n a 纳米银复合物 l i 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t s t u d i e so nn o v e le l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r sf b r c a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e na n dc a n c e ra n t i g e n1 5 3 i n o 唱a n i cc h e m i s t r ym a s t e rp o s t g r a d u a t e ：h a i z l l e na n s u p e r v i s o r ： p r o f e s s o rr u oy u a i l a b s t r a c t c a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e n ( c e a ) o rc a n c e ra n 石g e n1 5 3 ( c a1 5 3 ) i sm a i n i yu s e d 髂at 啪o r m a l ( e rf o rd i a g n o s i n gad i s e 船e ，e v a l u a t i n gc u r a t i v ee 仃e c to rj u d g i n gr e c n j d e s c e n c e t h ec e ao r c a1 5 - 3l e v e li ns e n l mi sr e l a t e dt o l u n gc a n c e r ， b r e a s tc a n c e r ，o v a r i a nc a r c i n o m a c y s t a d e n o c a r c i n o m a ， l i v e rc a r c i n o m a ，h e p a t o c e l l u l a r ”do t h e r s t h u s ，m ef 如t 锄da c c u r a t c d e t e m l i n a t i o no fc e ao rc a15 3i s v e r yh e l p f u lt oc n i c a lt u m o rd i a g n o s e s an u m b e ro f j m m u n o a s s a ym e t h o d sf o rt h ed e t e n n i na t l o no fc e ao rc a15 - 3l e v e i i ns e mh a v eb e e nr e p o n e d s u c h船 e n 巧m e i i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y( e l i s a ) ，r a d i o i m m u n o a s s a y( r j a )锄d c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o s a y ( c l i a ) ，y e tt h e s em e t h o d ss u f f e rf 吣md i s a d v a n t a g e ss u c h 雒 u s i r l gc o m p l e xt i m e - c o n s u m i n gp r o c e d u r e sa n 怕rr e q u i r n gp o t e m i a l l yd a n g e r o u so re x p e n s i v e m a t e r i a l s d u et 0t 1 1 e a d v a n 切g e so fs i m p l ep r e p a r a t i o n ，l o wc o s s h o nr e s p o n s et i m ea 1 1 dy e t a c c u r a t e 锄ds e n s i t i v ep i a t f o n l l ，e l e c t c h e m i c a li m m u n o s e n s o r sh a v eb e e nw i d e l ya p p l i e di 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es t a b i i i t y ，s e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t yo fb i o s e n s o ri nt h i st h e s i s ，w eh a v ec o n s t r u c t e d s e v e r a li m m u n o s e n s o r sb a s e do ne l e c t r o p o i y m e r j z a t i o n ，e l e c t r o s ci n t e r a c t i o n ，c o v a l e m b o n d i n ga n dn a n o p a n i c l e ( n a n o - a u ) n a n oc o m p o s i t em a t e r i a l ( d n a n a n o a gc o m p o s i t e ) a t t 1 1 es 扪e 廿m e ，w eu s ed s d n a ，ab i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l ew i t l lat t l r e ed i m e n s i o n a j s t r i l c t i l r cn o to n l yc a i le n l a r g em e 叫f 如ea r e ao f 也ee l e c t r o d ef o rm o r el o a d i n gt l l e i 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t a n t m o d i e sb u ta l s oc a np r o v i d eg o o db i o c o m p a t i b i l i t y 、i t ht h ee n v i r o 咖e n tf o r a v o i d i n gt h ep m t e i n sd e n a t u r a l i z a t i o n ，t oi m p r o v et h es e n s i t i v i t ya n dl i f es p a no f 血e i m m u n o s e n s o r s t l em a i nw o r k sa n dc o n c i u s i o n sa r ei n c i u d e da sf b l l o w s ： i an e wd u a l - a m p i i 疗c a t i o ns t r a t e g yo fe l e c t r o c h e m i c a ls i 印a l i n g 舶ma n t 培朗。柚t i b o d y i n t e r a c t i o n sw a s p r o p o s e d v i a b a c b 行1 l i n gg o l d n a n o p a r t i c l e s o n ( 3 一m e r c a p t o p r o p y l ) 订i m e t h o x y s i l a n es o i - g c l ( m p t s ) n m c t i o n a l 拓他di n t e r f 如e t h em p t sw a se m p l o y e dn o to n l ya sa b u 蛆d i n g b l o c kf b r t h ee l e c t r o d es u r f k em o d m c a t i o nb u ta l s o a sam a c r i xf o r 1 培柚d f h n c t i o n a l i z a n o nw i t hf i r s ta m p i i f i c a t i o n t h es e c o n ds i 驴a la m p n 疗c a t i o ns 缸锄踞yi n 仃0 d u c e di n t h i ss t u d yw a sb a s e do nt h eb a c k 一疗l l i n gi m m o b i l j z a t i o no fn a n o g o l dp 舭i c l e st om ei m m u n o s e n s o r s u r f a c e s e v e m lc o u p l i n gt e c h n i q u e s ，s u c ha sw i t l ln a n o g o l db u tn o t i p t so rw i t h 【p t sb u tn o t n a l l o g o l d ，w e r ei n v e s t i g a t e df o rt h ed e t e r m n a t i o no fc a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e n ( c e a ) 髂am o d e l ， 卸dav e r y9 0 0 dr e s u i tw a so b t a i n e dw i t hn a n 0 9 0 l da n dm p t sc o u p i j n gi m m u n o s e n s o r w 讹t h e n o n - c o m p e t i t i v ef o r r n a t ，t h ef o m l a t i o no ft h ea n t i g e n - a n t i b o d yc o m p l e xb yas i m p i eo n e s t e p i m m u n o r e a c t i o nb e t 、v e e nt h ei m m o b i l i z e da 1 1 t i - c e aa i l dc e ai ns a i l l p l es o l u t i o ni n t r o d u c e d m e m b r a n ep o t e n t i a lc h a n g eb e f o r ea n da f t e rt 1 1 e 绷t i g e n - a l l t l b o d yi n t e r a c t i o n u n d e r0 p t i m a i c o n d i t j o n s ，t h ep r o p o s e di m m u n o s e n s o re x h i b i t e dag o o de l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o rt oc e ai na d y n a m i cc o n c e n t r a t o nr a n g eo f4 4t o8 5 7n g m l w i t had e t e c t i o ni i m to f1 2n g m l 1 ( a t3 6 ) m o r e o v e r ，t h ep r e c i s i o n ，r e p r o d u c i b i l i t ya 1 1 ds t a b 订i t yo ft 1 ea s - p r e p a r c di m m u n o s e n s o r 、v e a c c e p 协b l e i m p o n a n t l y ，l h ep r o p o s e dm c l h o d o l o 科w 叫l d b ev a l u a b l ef o rd i a g i l o s j s 卸d m o n t or i n go f c a r c i n o m aa n di t sm e t a s t a s i s 2 an o v e la m p e r o m e t ci m m u n o s e n s o rf o rt h ed e t c n n i n a t i o no fc a r c i n o e m b r y o n i c 柚t i g e n ( c e a ) b a s e do nd n a ，n a n o - a gc o m p o s i t ea r l dp o l y t h i o n eh a sb e e nf a b r i c a t e d t h ec o m p o s i t e ， w h i c hc o n t a i l l sd n a ( n e g a t i v e l yc h a r g e d ) a 1 1 dn a i l o - a g ，c a nn o t0 n l yb ei m m o b i l i z e dt ot h eg l 嬲s c a r b o ne l e c t r o d cs u r f 缸em o d m e dw 油p o l y t h i o n e ( p o s i t i v e l yc h a r g e d ) t h r o u g hn e g a t i v e i yc h a r g e d d n a ，b u ta i s oa d s o r bc a r c i n o e m b r y o n i ca n t b o d i e st h r o u g hn a n o - a gp a n i c l e sw i t hl a r g es p e c i f i c s u 瞻c ea r e a sa n dg o o db j o c o m p a t i b i l i t y t h em o d i f i c a t i o np m c e d u r ew a se l e c n _ 0 c h e m i c a i l y m o n i t o r e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y t h cp e r f b r m a n c ea n di n n u e n c i n gf k t o r so ft h er e s u l t i n g i m m u n o s e n s o rw e r es t u d i e di nd e t a mu n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ed e v e l o p e di m m u n o s e n s o r e x h j b i t e d 船tr c s p o n s et oc e aa n dt h e l i n e a rr a n g e sw e r e1 0 1 0 0n 9 4 m l l 锄dl o o 一8 0 0 n g m l w i t l lad e t e c t j o nl j m i t0 f o 2 4n g 。m l 3 an o v e la m p e m m e t r i ci m m u n o s e n s o rf o rt h ed e t e m l i n a t i o no f c a n c e ra n t 培e n1 5 3 ( c a1 5 - 3 ) w 船p r e p a r e db yi m m o b i l i z i n ga i l t i c a1 5 3o nd o u b l e l a y e rg o l dn a i l o p a r t i c l e s 锄dd o u b l e s t r a n d d n a ( d s d n a ) m o d m e dg o l de l e c t r o d e s p r u s s j a r ib l u e ( p b ) ，a sa9 0 0 dm e d i a l o r ，w a sf i 嘣l y 西南大学硕上学位论文a b s l r a c t e l e c 仃。一d e p o s j t e d0 na ue l e c 仃o d es u 如c et of b 兀i las t a b l ea n d h o m o g e n e o u si n t e r f k e ，w h i c hc o u l d b ee n c a p s u l a t e dv i ae l e c t r o c h e m i c a jr e d u c t i o no f h a u c l 4s o l u t i o n ，t h e nd s d n aw 雏a n a c h e dt ot l l e n 锄0 9 0 l dp a m c l e s ，a n dt h e nm es e c o r l d l a y e r9 0 1 dn 柚o p a r t i c l e sw e r ed e p o s i t e do nt h ed s d n a s u 吨l c et oa m p l i 母t l l es u r f k ec o v e r a g eo fb i o m o l e c u l e s ，矗n a l i ya m i - c a1 5 - 3a n t b o d i e sw e r e a b s o r b e do n t o 出es u r f a c eo fr i a n o s t r u c t u r e dg o i dp a r t i c l e s ，t h ef a b r i c a t i o np r o c e s so ft 1 1 e i m m u n o s e m o rw a sc h a r a c t e r i z e db ys c 糊i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) a 1 1 dc y c l i cv o i 伽n m e t r y ( c v ) u n d e rt h e o p t i m i z e dc o n d i t i o n s ， 廿l e p r o p o s e d i m m u n o s e n s o re x h i b j t e da g o o d e i e c t r o c h e m i c a l b e h a v i o rt 0c a1 5 3j nt h er a n g e so f1 ot o1 5 on g m a 1 1 d1 5 ot o2 4 0 on g m l - 。 w i t had e t e c t i o nl i m i to fo 6n g m l t h ei m m u n o s e n s o rs h o w e dh i 曲s e n s i t i v i t y ，s e i e c t i v 时锄d s t a b i l i t y t m p o r t a n t ly ，t h i s f 曲r i c “o n m e t l o d o l o g y c o u l db ef u r t h e r d e v e l o p e d f o rm e i m m o b i l i z a t i o no f0 t h e rp r o t e j n s 锄db i o c o m p o u n d s k e ) w o r d s ：i m m u n o s e n s o lc a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e n ，c a n c e ra n t i g e n1 5 - 3 ， d o u b l e - i a y e rg o l d - n a n o p a r t i c i e s ，d n a ，n a n o - a gc o m p o s i t e v 独创性声明 学位论文题目：疸延埴厘区瘦荭厘! 多鱼也堂鱼瘥篮盛矍趁班塞 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论义中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者：结i 各 会 签字日期： 伽g 年争月；o 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定。有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 搿翥，鬻糍气蘑龆：场年圳。日签字日期：g 年乒月；口自签字日期：励年厶月，o 日 通讯地址： 邮编： 西南大学硕士学位论文第1 章绪言电化学免疫传感器概述 第1 章绪言电化学免疫传感器概述 生物传感器是将生物技术、材料技术、纳米技术、微电子技术等结合起来形成的新兴高 科技产品，它是在化学传感器基础上发展起来的一类特殊的化学传感器，可在医学及工农业 等其他领域广泛地应剧于检测分析。电化学生物传感器以生物材料作为敏感元件，电极作为 转化元件，屯位或电流等作为特征检测信号。其中的生物材料包括了酶、抗原、抗体、激素 等生物体成分和细胞、细胞器、组织等生物体本身。由于生物材料作为敏感元件使其具有高 选择性，当待测物质经过具有分子识别功能的感受器时传感器所感受的生物量由信号转换 器将其转化成为与分析物浓度有关的电信号输出，通过电子系统进行处理和显示这种传感 器已成为一种最直接的生命反应过程检测方法，且控制速度快、灵敏度高和使用简便并且不 破坏样品等特点则又使其特别适用于生物溶液和活体组织中各组分的连续监测。 按敏感元件的不同生物传感器可以分为五类：免疫传感器( i m m u n o s e l l s o r ) 、酶传感器 ( e n 巧m e s e n s o r ) 、细胞传感器( o 唱a 1 1 a l l s e n s o r ) 、微生物传感器( m i c r o b j a i s e n s o r ) 。作为一种新的检 测手段，生物传感器正迅猛发展，有的已在生物j 二程、医学与临床、环境监测等领域展现出 十分广阔的前景口】。免疫传感器是生物传感器中非常重要的一类，由于抗原和抗体的特异性反 应，免疫传感器较其他生物和化学传感器有更高的专一性和选择性p ，”。随着“人类基因组工 作草图”的完成、纳米技术和纳米加工技术的出现，无论在原理上还是加工技术上都将为免 疫传感器的发展带来巨大变革。电化学免疫传感器是免疫传感器中研究最早，种类最多，发 展较为成熟的一个分支，它耦连各种电分析技术在短短几十年时间内，相继开辟了种类繁 多的研究和应用领域，目前，世界各国都投入巨资对电化学免疫传感器进行技术研究和产品 开发。 1 1 免疫传感器的定义 1 9 9 0 年h e n r y 等提出了免疫传感器的概念：将高灵敏的传感技术与特异性免疫反应结合 起来，用以监测抗原一抗体反应的生物传感器称作免疫传感器。免疫传感器的工作原理和传 统的免疫测试法相似，都属丁崮相免疫测试法，即把抗原或抗体固定在固相支持物表面，来 检测样品中的抗原或抗体。不同的是，传统免疫测试法的输出结果只能定性或半定量地判断， 且一般不能对整个免疫反应过程的动态变化进行实时监测。而免疫传感器具有能将输出结果 数字化的精密换能器，不但能达到定量检测的效果，而且由于传感与换能同步进行，能实时 监测到传感器表面的抗原抗体反应，因此，它可促使免疫诊断方法向定量化、操作自动化方 向发展。抗原抗体的反应被公认是一种专一性极强的化学反应，利用抗原抗体专一性反应的 原理并与及时、快速、简便、灵敏、自动的传感技术相结合，形成了医学诊断中具有良好发 展势头的检测方法免疫传感器技术，用于在体或离体的超灵敏高特异的相关分子的检测 两南大学硕士学位沦文第1 章绪言电化学免疫传感器概述 目。 1 2 免疫传感器的测定原理 免疫传感器具有三元复合物的结构，即感受器、转换器和电子放大器。在感受器单元中 与抗体和抗原选择性结合产生的信号敏感地传送给感受器，抗体与抗原的结合具有高度的特 异性，检测抗体的结合有两种基本方法1 6 】： ( 1 ) 标记法标记法采用酶、荧光物质、电活性化合物等进行标记，抗体与抗原反应过程 通过电化学、光学等手段进行检测，同时对浓度信息加以化学放大( 酶标记) ，从而实现高灵 敏检测目标物。该类传感器的原理主要有夹心法和竞争法，前者是在样品中的抗原与传感界 面上的抗体结合后，再加标记的抗体与样品中的抗原结台，形成夹心结构；后者则是用标记 的抗原与样品中的抗原竞争结合传感界面的抗体。 ( 2 ) 非标记法在抗体与其相应抗原识别结合时直接转变成可测信号。这类传感器在结构 上可进一步分为结合型和分离型两种。前者是将抗体或抗原直接同定在传感器表面上，传感 器与相应的抗体或抗原发生结合的同时产生可测信号；后者是用抗体或抗原制作抗体或抗原 膜，当其与相应的配基反应时，膜电位( 或其他物理参数) 发生变化，测定膜电位的电极与膜 是分开的。 1 3 免疫传感器的分类 免疫传感器中抗原抗体结合前后可导致多种信号的变化，如在重量、光学、热学、声学、 电化学等方面。由于免疫传感器的检测结果晟终还需换能器转换成输出信号，其检测效果因 此也往往取决于所用换能器的精确度与稳定性，故换能器的种类对传感系统来说显得尤为重 要。根据换能器不同可将免疫传感器划分为：光学免疫传感器、压电晶体免疫传感器、热传 导免疫传感器和电化学免疫传感器。 ( 1 ) 光学免疫传感器光学免疫传感器是测量免疫反应后引起光学信号变化量的一类 传感器。在光学免疫传感器中，光学信号的获得既可通过标记法也可以不用。不需要标记的 光学传感器( 直接光学传感器) 占目前使用的化学免疫传感器中相当人一部分，包括表面等离 子体、紫外、荧光、化学发光、拉曼散射、光卢等免疫传感器。光学免疫传感器具有很高的 传输信息容量、检测安全、信号稳定等特点，但使用的仪器和药品价格昂贵。 ( 2 ) 压电晶体免疫传感器压电晶体免疫传感器是最常见的一种质量测量式免疫传感 器，它的原理是石英晶片在振荡时有个基础频率，当样品中的抗原或抗体与包被在晶片上的 抗体或抗原结合时，由丁负载的增加，晶片的振荡频率会相应减少，其减少值与吸附上去的 质量有相关性。1 9 7 2 年，s h o n s 等【7 1 首次将压电石英谐振器用作免疫测定，他们在有塑料涂 层的石英晶体表面固定牛血清白蛋白( b s a ) 用丁相应抗体测定。此后对培g 、i g e 、甲状腺素、 病毒等也用类似方法进行了测定“。俞汝勤小组采用自组装单层膜技术在压电石英晶振 2 西南大学硕士学位论文第1 章绪言电化学免疫传感器概述 金表面自组装巯基丙酸，以e d c 和n h s 为偶连剂共价固定补体c 3 抗体，研制了一种检测人 血清中补体c 3 成分的压电免疫传感器。 ( 3 ) 热传导免疫传感器热传导免疫传感器是基于测量化学和生物反应中热量变化的 量热计原理而制成的热电堆( t h e h n i s t o r ) 传感器”j ，具有结构简单、价格低廉等特点，但检 测灵敏度低，这类传感器的研究丁作较少。 ( 4 ) 电化学免疫传感器电化学免疫传感器是测量免疫反应前后引起电化学信号变化 的一类传感器。与其他免疫传感器相比，电化学免疫传感器具有仪器设备相对简单，构制敏 感电极方法灵活，体系容易集成化、微型化，测定不受样品颜色、浊度的影响( 即样品可以不 经处理，不需分离) ，可以在线检测等优势，因此，电化学免疫传感器的前景较好。 1 4 电化学免疫传感器的种类极其原理 根据检测的信号不同，电化学免疫传感器可分为电位型、电流型、电导型和电容型免疫 传感器。 电位型免疫传感器是基于离子选择电极原理发展起来的1 1 4 ”】，通过测量电极表面 电位变化来进行免疫分析的生物传感器。抗原或抗体在敏感膜上的结合或继后的反应引起电 极电位或膜电位发生改变，而 i 这种电位的变化与待测物浓度之间存在对数关系。电位型免 疫传感器已成功地用丁j 人血清中的梅毒抗体、人绒毛膜促性腺激素( h c g ) 、人血清蛋白 ( h a s ) 等的检测【l 。电位型免疫传感器又分为直接型电位传感器、非酶标记电位型免疫传 感器、酶标记型电位免疫传感器。 电流型免疫传感器是将电化学反应与抗原抗体免疫反应相结合的一种分析方 法，主要基于探测生物识别或化学反应中的电活性物质，通过同定工作电极的电位给电活性 的电子转移反应提供驱动力，探测电流随时间的变化，该电流直接测量了电子转移反应的速 度，反映了生物分子识别的速度，即该电流正比于待测物的浓度。由于抗原抗体生物分 子本身不具备电活性，电流型免疫传感器一般需要标记的抗原抗体，标记物一般用酶。最 常用的标记酶有碱性磷酸酶、辣根过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、尿素水解酶等。酶标物中的 酶催化其底物反应生成电活性物质，在电极上通过氧化或还原加以检测。电流型免疫传感器 目前已用于多种物质的检测 2 ”，但仍然在探索更优越的固定技术和更优良的固定材料，以 期能达到更灵敏、更稳定、更完美的检测。 电导型免疫传感器是利用免疫反应引起溶液或薄膜的电导发生变化来进行分析 的传感器。酶催化底物的反应，导致反应体系中离子种类及浓度的变化，从而改变溶液的导 电率。i u d a i “1 等用电导法测定了尿中吗啡解决了原来吗啡测量设备昂贵、费时、麻烦 的问题。但电导型免疫传感器受待测样品中离子强度和缓冲液容积等非特异因素影响较大。 电容型免疫传感器是基丁将识别分子同定在电极表面，在电极溶液界面存在双 电层，当抗原抗体在电极表面复合时，相关复合物及液体移动引起双电层介电常数的改变， 西南大学硕士学位论文第l 章绪言电化学免疫传感器概述 导致电容变化而进行检测。电容型免疫传感器是一种高灵敏非标记型免疫传感技术其测定 通常基于电化学交流阻抗谱进行，有关这类传感器的报道较少。 1 5 免疫传感器的构建 构建免疫传感器的关键是生物分子的嘲定化，因为其直接影响传感器的稳定性、灵敏度 和选择性等主要性能。生物分子的固定化可以分为生物分子的周定化技术和生物分子的固定 化材料，固定化技术和同定化材料既要保持生物活性单元的固有特性和生物活性，又要避免 生物自由活性单元应用上的缺陷，因此它们是生物传感器制备过程中的关键性因素。 1 5 1 生物分子的固定化方法 由于传感器表面构造不一，有金属( 如金、银、铜、铂、铅、锂、钛、镍或铬) 、碳、 玻璃、石英等，它们与抗原或抗体的结合特性都不同，这就需要不同的固定方法，使得吸附 好了的抗原或抗体在反应中既能保持生物活性又不从电极表面脱落。常用的固定方法有：物 理吸附固定法、共价键合固定法、包埋固定法、定向固定法、层层组装固定法。 物理吸附固定法；物理吸附嘲定法大多基于特定换能器界面( 如金、银等金属) 对蛋白质 的直接吸附作用，通过涂覆或浸泡方式固定免疫物质的一种方法。物理吸附具有无需化学试 剂、活化和清洗步骤少、生物组分不易降解、对生物活性影响小等优点。此法多以无机材料 为载体t 主要包括多孔玻璃、活性炭、氧化铞等。由于吸附法具有生物体活性不易被破坏和 高级结构变化少的优点，因而生物体活性损失少，但吸附法对溶液的p h 值变化、温度、离 子强度和电极基底较为敏感，需对实验条件进行优化，若能找到适当的载体，这是一种良好 的固定方法。 共价键台固定法：共价键合法是利用抗体( 或抗原) 表面特定功能基团与电极表面修饰的 化学基团之间直接形成共价键，或通过修饰生物吸附剂( 如生物素、亲合素) 间接进行化学键 合，实现免疫物质| 划定化的一种方法鲫。共价键合法是将电极表面进行化学处理和修饰引 入活性反应基团，如- n h 2 、一0 h 、c o o h 等，然后用偶联剂将生物材料与换能器表面的活性 基团共价连接，从而将生物材料固定丁：电极表面，此法通常可在低温、低离子强度和生理p h 值条件下进行。共价键合法的优点是它通过特殊键的形成而将生物分子固化于固体表面，因 而不易发生分子的泄露，并且改善了分子在表面的定向、均匀的分布状况，使生物分子与载 体结合牢固，但该同定化方法程序复杂、耗时长，会引起生物体高级结构变化，破坏部分活 性中心，从而影响固定的生物敏感膜的性能。 包埋固定法： 包埋囿定法是将生物分子直接包埋在高分子聚合物或复合电极中，从而 将生物分子固定在转换器上的一种同定方法。该技术的特点是：可采用较温和的同定条件 包埋的生物括性分子较牢固及聚合膜的孔径和几何形状可以调控，并且可以固定较高浓度的 生物人分子。硅烷基溶胶一凝胶、固体石蜡、环氧树脂、烯酸酯聚合物、电聚吡咯等都可以 4 西南大学硕上学位跄文第1 章绪言电化学免疫传感器概述 作为固定免疫组份的基底材料。包埋法一般不改变生物分子的高级结构，但是在包堋时发生 化学聚合反应，生物分子容易失活，必须巧妙设计反应条件。由于只有小分子可以通过高分 子凝胶的网格扩散，并且这种扩散阻力还会导致固定化生物分子动力学行为改变，降低生物 分子活性，因此，包埋法只适合于小分子底物和产物的生物分子。 定向固定法：蛋白a ( 蛋白g ) 同定抗体方法称为定向固定，蛋白a ( 蛋白g ) 能和i g g 的f c 段特异性结合，这种结合能使抗体上与抗原决定簇发生键台的活动中心所在的f a b 段 远离载体而伸向溶液，避免了普通固定方法i 古| 定生物组分取向的杂乱无章。因而所固定的生 物材料具有较高的生物活性，有利丁提高分析检测的灵敏度。而且蛋白a ( 蛋白g ) 在金电极 表面可强烈吸附，形成的膜较稳定，因此可以用米定向崮定抗体口。定向同定法一般将免疫 组分定向同定厉，被蒯定的抗体分子其抗原识别