（微生物学专业论文）多拷贝策略构建瑞氏木霉外源基因系列表达载体.pdf

山东大学硕士学位论文 多拷贝策略构建瑞氏木霉外源基因系列表达载体 摘要 瑞氏木霉是自然界中广泛分布的腐生性丝状真菌，具有良好的分泌多种 大分子物质降解酶类的能力，用瑞氏木霉作为工业菌株生产分解不同植物材 料的酶类包括纤维素酶、半纤维素酶等，已有多年历史瑞氏木霉具有极好 的合成蛋白和分泌蛋白的能力，某些高产菌株其胞外纤维素酶的主要成分一 外切葡聚糖纤维二糖水解酶i 的产量可达5 0 m g l ，其中此启动子为强启动子。 近年来，瑞氏木霉已作为基因工程宿主菌用于生产外源真核蛋白。瑞氏 木霉所具有的优良性能促进了对该菌的分子生物学研究和遗传改造。国内对 瑞氏木霉的分子生物学研究报导不多，建立性能优良、强表达的遗传转化系 统是目前深入开展瑞氏木霉分子生物学和遗传育种研究中迫切需要解决的关 键问题。其中利用外切葡聚糖纤维二糖水解酶i 基因的启动子在瑞氏木霉中 构建高效表达载体被广泛的运用。 在基因工程研究中，影响外源蛋白表达的因素包括基因拷贝数、启动子 强度以及多拷贝、蛋白质稳定性、宿主蛋白酶活性等。为了解除葡萄糖阻遏、 提高外源蛋白的表达量，本文利用重组p c r 缺失瑞氏木霉外切葡聚糖纤维二 糖水解酶i 基因启动子上的葡萄糖阻遏位点，并对含有c c a a t 盒、a c e 2 结合 位点、x l n r 结合位点等转录激活因子结合基序的功能区域采用多拷贝策略进 行了改造。 用c b h l 全长启动子( 1 2 9 1 b p ) 构建了以g u s 基因作为报告基因的表达质 粒p l p t g ，并在p l p t g 基础上对c b h l 启动子一1 3 0 6 - 8 6 9 b p 区域进行缺失 突变，构建得到质粒p c p t g 。在p c p t g 基础上对含有c r e l 结合位点的- 7 0 9 6 6 1 b p 区域进行缺失突变，得到缺失质粒a p c p t g 。通过分子操作，在重组 质粒a p c p t g 基础上插入a p c p t gc b h l 启动子中的一8 0 5 - 6 0 6 b p 区不同数 目拷贝序列，构建了含该功能区2 、4 、6 拷贝序列的质粒a p 2 c p t g 、 a p 4 c p t g 、a p 6 c p t g 山东大学硕士学位论文 将上述6 种质粒分别与潮霉素抗性质粒p a n 7 1 一起转化瑞氏木霉蛋白 酶缺陷株zr e e s e ir u tc 3 0u 4 ，挑选单个菌落并培养，p c r 验证g u s 基因是 否整合到转化子的染色体上通过对1 2 0 0 多株转化子进行p c r 反应，获得 了5 0 株g u s 基因可能整合到染色体上的转化子。对p c r 产物测序结果证实 确实扩增得到为g u s 报告基因d n a 序列。对其中的6 株转化子进行r t - p c r ， 试验结果与预计结果相吻合。对6 株转化子进行g u s 比活测定，结果显示 zr e e s e ip 1 2 ( p c p t g 质粒的tr e e s e ir u tc 3 0u 4 转化子) 的g u s 比活是l 1 3 3 ( p l p t g 质粒的tr e e s e ir u tc 3 0u 4 转化子) 的1 3 4 倍，zr e e s e i z 1 - 2 ( a p c p t g 质粒的zr e e s e i r u t c 3 0 u 4 转化子) g u s 比活是l 1 3 3 的1 8 倍。 在此基础上的多拷贝启动子转化结果表明，在8 0 5 6 0 6 b p 区4 拷贝以内， 随着c b h l 启动予拷贝数的升高，报告基因的表达水平呈上升趋势，即zr e e s e i 2 - 4 ( a p 2 c p t g 质粒的tr e e s e ir u tc 3 0u 4 转化子) g u s 比活是l 1 3 3 的 2 1 倍，zr e e s e i z x 4 3 ( p 2 c p t g 质粒的tr e e s e ir u tc 3 0u 4 转化子) g u s 比活是l 1 3 3 的2 4 4 倍；但拷贝数达到6 ( zr e e s e i a 6 - 1 ) 时，报告基因表达水 平与4 拷贝转化子a 4 3 基本持平。 在乳糖培养基上分别补加乳糖与葡萄糖培养zr e e s e ip 1 2 与zr e e s e i a i - 2 ，测定报告基因g u s 酶活。测定结果显示在补加葡萄糖的培养基上培养 的tr e e s e ip 1 2g u s 酶活大幅度下降，仅为补加乳糖培养基所测酶活的4 0 左右，证实在c b h l 启动子7 0 9 6 6 1 b p 区域确实存在着引起葡萄糖阻遏作用 的位点，而zr e e s e ia 1 - 2 在补加乳糖与葡萄糖培养基中产生的g u s 酶活性 基本相近，证实葡萄糖阻遏作用已被消除。 本文构建的系列表达载体，作为外源蛋自在瑞氏木霉中的高效表达以及 功能研究的很好的工具，为瑞氏木霉在工业技术中的应用提供了良好的技术 基础，也为瑞氏木霉的遗传改造和分子育种提供了一条新的行之有效的途径。 关键词：瑞氏木霉，外切葡聚糖纤维二糖水解酶i ，c 肋，启动子，缺失突变， 多拷贝 2 山东大学硕士学位论文 c o n s t r u c t i o no fe x p r e s s i o nv e c t o r si nt r e e s e i w i t hm u l t i c o p i e ss t r a t e g y a b s t r a c t s a p r o p h y t i cf u n g u st r i c h o d e r m ar e e s e ih a sal o n gh i s t o r yo fi m p o r t a n t i n d u s t r i a lp r o d u c t i o no fd i f f e r e n tp l a n tm a t e r i a lh y d r o l y z i n ge n z y m e s ，e s p e c i a l l y c e l l u l a s e sa n dh e m i c e l l u l a s e ，d u et oi t se x c e p t i o n a la b i l i t yt os e c r e t ee r l z y m e sf o r s u b s t r a t ed e g r a d a t i o nt or e a d i l ym e t a b o l i z a b l eb r e a k d o w np r o d u c t s t r i c h o d e r m ar e e s e ih a st h ea d v a n t a g eo fp o s s e s s i n gae u k a r y o t i cs e c r e t o r y m a c h i n e r ya n d , m o s tl i k e l y , s i m i l a rp r o t e i nm o d i f i c a t i o np r o p e r t i e s ( e g h i g h m a n n o s et y p en g l y c o s y l a t i o n ) t om a m m a l i a ns y s t e m s a l lt h ee x c e l l e n t c h a r a c t e r si m p r o v e dt h em o l e c u l a rb i o l o g i c a lr e s e a r c ha n dg e n e t i cm o d i f i c a t i o no f t r i c h o d e r m ar e e s e i t h e r eh a sf e wr e p o r t so nc o n s t r u c t i o no fs t r o n ge x p r e s s i o n a l t r a n s f o r m a t i o ns y s t e ma n de n g i n e e r i n gs t r a i n sr e p o r t e d i nl o c a ll i t e r a t u r e t h e r e f o r e ，c o n s t r u c t i o no f h i g ht r a n s f o r m a t i o na n de x p r e s s i o ns y s t e mi si m p o r t a n t f o rc a r r y i n go u tm o l e c u l a rb i o l o g i c a lr e s e a r c ho nt r i c h o d e r m ar e e s e i t h ec b h lg e n ei nzr e e s e ii sas i n g l e - c o p yg e n ei nzr e e s e i t h ep r o m o t e r w a sc o n s i d e r e da ss t r o n gp r o m o t e r t h e r e f o r e ，i ti ss i g n i f i c a n tt oc h o o s es t r o n g p r o m o t e rp c b h lt oc o n s t r u c te x p r e s s i o n a l v e c t o rt oc o n t r o lf o r e i g n p r o t e i n e x p r e s s i o ni nz r e e s e l a c c o r d i n gt ot h er e p o r t sb yl i t e r a t u r e ，t h ea m o u n to fh c t e r o g o n o u sp r o t e i n s c a ni n c r e a s eb ym a n yf a c t o r s ：g e n e sc o p i e s 、t h ei n t e n s i t yo fp r o m o t e r 、 m u l t i - c o p i e s 、p r o t e i ns t a b i l i z a t i o n s ow ed e l e t et h eg l u c o s er e p r e s s o r - b i n d i n g s i t e si nt h eu p s t r e a mr e g i o no fz r e e s e ie e l l o b i l h y d r o l a s ei ( c 6 矗j ) u s i n g r e c o m b i n a r ap c ra n dt h e nm u l t i - c o p yt h eu p s t e a mr e g i o no fc b h lp r o m o t e r c o n t a i n i n gc c a a tr e g i o n 、a c e 2b i n d i n g s i t e sa n dx i n rb i n d i gs i t e s f u s i n gt h er e p o r t e rg e n eec o l iu i d ag e n ew i t h 1 3 0 6 1 6 b pr e g i o na n d - 8 6 8 1 6 b pr e g i o no ft h ec b h lp r o m o t e ra n dt e r r n i n a t o rr e s u l t e di nt h ep l a s m i d p l p t ga n dp c p t gr e s p e c t i v e l y t h e d e l e t i o no ft h e 7 0 9 - 6 6 1 b pr e g i o n 3 山东大学硕士学位论文 c o n t a i n i n gt h r e eg l u c o s er e p r e s s o rc r e a - b i n d i n gs i t e si nt h ep r o m o t e ro fc b h lo n t h eb a s i so f p c p t gw a sp e r f o r r n e r e db yp c r , t h r o u g hw h i c ht h ep l a s m i d a p c p t gw a sc o n s m m t e x l 8 0 5 6 0 6 b pu p s t r e a mo ft h et r a n s l a t i o ni n f l a t i o n c o d o n ，a2 0 0 一b pd n af r a g m e n tc o n t a i n i n ga c e 2b i n d i n gs i t e s 、x l n rb i n d i g s i t e s 、c c a a ta n h a n c e rs e q u e n c e sl o c a t e di nt h ep c b h lo f t h ep l a s m i d a p c p t ow a sa m p l i e db yp c rw h o s ep r o d u c tw a si n s e r t e di n t oa p c p t gt o c r e a t ep l a s m i d p 2 c p t g s i m i l a r l y , p l a s m i d p 4 c p t gc a r r y i n gf o u rc o p i e s o f 一8 0 5t o - 6 0 6 b pr e g i o na n dp l a s m i dz l p 6 c p t gc a r r y i n g6c o p i e so f 一8 0 5t o - 6 0 6 b pr e g i o n 、) i 眦o b t a i n e d f i n a l l y , t h er e s u l t i n gp 】a s r n i d sw e r ec o - t r a n s f o r m e dw i t hp l a s m i dp a n 7 - 1 c a r r y i n gah y g r o m y c i nr e s i s t a n c ec a s s e t t ei n t ozr e e s e ir u tc 3 0u 4 ap r o t e a s e d e f i c i e n ts t r a i n 1 2 0 0 h y g r o m y c i n - r e s i s t a n tw a n s f o r m a n t sw e r eo b t a i n e d 5 0 t r a n s f o r m a n t sw e r ei s o l a t e d b yp c a n dp c ra m p l i f i c a t i o np r o d u c tw a s s e q u e n c e d ，d e m o n s t r a t i n gt h e u i d de x p r e s s i o nc a s s e t eh a si n s e r t e di n t ot h e c h r o m o s o m a ld n a 6o ft h e s et r a n s f o r m a n t sw e r ev e r i f i e df u l l e rb yr t - p c r t h e np r o m o t e ra c t i v i t yw a sj u d g e db yu s i n ga na s s a yf o r8 - g l u c u r o n i d a s e ，w h i c h w a s e x p r e s s e d u n d e rt h ec o n t r o lo ft h e s e p r o m o t e r s a n i n c r e a s ei n p - g l u c u r o n i d a s ea c t i v i t y , c o r r e s p o n d i n gt ot h en u m b e ro fi n s e r t e d 8 0 5t o 6 0 6 b p r e g i o n sc o p i e s ，w a so b s e r v e d i nt r a n s f o r m a n tz r e e s e ia 4 - 3 ，c a r r y i n g4c o p i e s ， t h ep - g l u c u r o n i d a s ea c t i v i t yw e l es h o w nt ob e2 4f o l do fw a n s f o t r u a n tt r e e s e i l 1 3 ，2f o l do ft r a n s f o r m a n tz r e e s e ip 1 2 i nt r a n s f o r m a n tz r e e s e i 1 - 2 ，t h e p r o m o t e ra c t i v i t yw a ss h o w nt ob e1 8f o l do ft r e e s e il 1 3 b u ti nt r a n s f o r m a n t t r e e s e ia 6 l ，t h ea c t i v i t yw a st h es a m ea st h a to ft r e e s e ia 4 3 a tt h es a m e t i m e t h ep - g l u c u r o n i d a s ea c t i v i t yo fzr e e s e ip 1 2g r o w ni ng l u c o s em e d i u mi s o n l y4 0 o f t h a ti nt h el a c t o s em e d i u m , h o w e v e ri ti ss i m i l a rf o rz r e e s e ia 1 - 2 ， d e m o n s t r a t i n gt h a tt h ec r e ib i n d i n gs i t e sh a v eb e e nd e l e t e d t h em u l t i c o p i e g p l a s m i d sc o n s t r u c t e dp r o v i d e dat o o lf o rh i g h l y - e x p r e s s i n gh e t e r o l o g o u sp r o t e i n a n df u n c t i o nr e s e a r c hi nrr e e s e ia n dt h eb a s i so nf u r i h e ra p p l i c a t i o ni ni n d u s t y 。 k e yw o r d s ：t r e e s e i ，c b h l ，c b h ip r o m o t e r ，d e l e t i o nm u t a t i o n ，m u l t i c o p i e s 4 山东大学硕士学位论文 缩略词表 b p e m s a c b h p c r l b k d k b i p t g h p h g u s g l a a t s p u a s l 塔 g a l a t | i p n a a c v a b a s ep a i r ( s ) e l e c t r o p h o r e t i em o b i l i t ys h i f ta s s a y e e l l o b i o h y d r o l a s e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n l u r i a - b e r t a n i ( m e d i u m ) k i l o d a l t o n k i l o b a s e ( s ) i s o p r o p y l d d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e h y g r o m y c i nbp h o s p h o t r a n s f e r a s e p i g l u c u r o n i d a s e g l u c o a m y l a s e t r a n s c r i p t i o n a ls t a r tp o i n t u p e a r na c t i v a t i o n r e p r e s s i n gs e q u e n c e g a l a c t o s i d a s e a n d a c y l e o e n z y m ea ：6 - a m i n o p e n i c i l l a n i ea c i d a c y l t r a n s f e r a s e i s o p e n e i l l i nns y n t h a s ea s - 0 - - a m i n o a d i p y l ) 一l - c y s t e i n y l - d - v a - l i n e s y n t h e t a s e 5 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 丝状真菌是重要的工业菌株，如黑曲霉( d s p e r g i l l u $ n i g e r ) ，米曲霉 ( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 、瑞氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 和产黄青霉( p e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m ) 等广泛应用于酶制剂、抗生素、有机酸的生产，已有数十年的 历史。当今的发酵工业利用丝状真菌生产大量产品，年产值己达几十亿美元。 丝状真菌大规模工业应用的同时，人们也开始对其进行基因表达调控方面的 研究。分子生物学的发展为以丝状真菌为宿主生产同源、异源( 尤其是哺乳 动物) 蛋白开辟了广阔的天地。由于丝状真菌与工、农业生产关系密切，极 大地刺激了研究人员对丝状真菌的兴趣。丝状真菌中的构巢曲霉( a s p e r g i l l u s n i d u l a n s ) 、粗糙脉孢菌( n e u r o s p o r ac r a $ s a ) 等长期以来一直作用生物学基础 研究的模式菌株和常用材料。 丝状真菌作为低等真核生物，既具有结构简单，繁殖迅速、易于操作的 优点，又具有真核特征性的细胞结构和基因结构，以及与高等真核生物类似 的复杂的基因表达调控机制，其中很多为重要的工业生产菌株。瑞氏木霉是 自然界中广泛分布的腐生性丝状真菌，能利用多种碳源和氮源生长。这种代 谢多样性所必须具有的多条生物合成与降解途径，使得瑞氏木霉具有产生多 种初级和次级代谢产物的能力。由于瑞氏木霉具有良好的分泌多种大分子物 质降解酶类的能力，用瑞氏木霉作为工业菌株生产分解不同植物材料的酶类， 包括纤维素酶、半纤维素酶以及蛋白酶、淀粉酶等，已有多年历史( 汪天虹 等，2 0 0 0 ) ，瑞氏木霉具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，同时还具有 真核的分泌机制和与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能，如：高甘露糖型和 n 糖基化。瑞氏木霉被公认为是安全的生产菌株，对其发酵生产已具有成熟 的技术 瑞氏木霉所产生的纤维素酶系组分中，外切葡聚糖纤维二糖水解酶i ( c b h i ) 产量可达瑞氏木霉胞外分泌蛋白总量的5 0 ，其最高产量可以达到 5 0 m e , 几。c b h i 启动子在瑞氏木霉中是最强的启动子，并且被用于多种异源 蛋白的表达，如生产外源漆酶等。瑞氏木霉不仅具有适于蛋白生产的诸多优 点，且对人没有毒性，在产酶条件下也不产生真菌毒素和抗生素但是相对 于构巢曲霉和粗糙脉孢霉等模式菌株而言，瑞氏木霉的分子生物学研究起步 6 山东大学硕士学位论文 较晚。由于瑞氏木霉具有以上优良性能，加之比较成熟的工业化规模发酵工 艺，瑞氏木霉在基因工程中已被作为宿主菌生产多种外源蛋白。这些都促进 了对瑞氏木霉分子生物学的研究和遗传改造。近几十年来，对于丝状真菌的 研究国际上进展迅速，而国内尚处于起步阶段，但发展前景十分广阔。 纤维素和半纤维素是自然界中由光合作用所产生的最丰富的结构多糖， 这些植物大分子物质的降解机理在基础生物学和生物技术中都占有很重要的 地位。在过去二十年中，对很多纤维素与半纤维素水解酶的生化性质、三维 结构、及相应基因的分离与鉴定，都已进行了深入的研究，但只有少数基因 ( 如c b h l ，c b h 2 ) 的表达与调控得到了详细的研究。还有很多基因表达调控 的规律是未知的，特别是从分子水平对基因表达机制的论证更为欠缺。对基 因启动子结构与功能的研究，以及与启动子特定d n a 序列起作用的基因调 节蛋白的研究，一直是分子生物学和分子遗传学研究的热点，它既属于具有 重要意义的基础理论研究范畴，其研究成果同时也为现代生物技术的发展与 应用奠定了基础。这种基因调控方面的研究在营养策略和生物过程设计方面 对酶工程的发展有很大推动作用，同时也促进了在水解酶强启动子控制下高 效表达重组酶或异源蛋白的研究进展。了解丝状真菌不同的基因表达调控机 制有助于构建更高效、更经济的外源基因表达系统，促进具有特定开关功能 的人工启动子的设计合成，从而使外源蛋白在瑞氏木霉中的高效表达并应用 于大规模工业生产成为可能。 1 1丝状真菌启动子结构特点 1 1 1 丝状真菌基因的启动子结构特点 对克隆到的丝状真菌的基因进行序列分析和功能结构分析表明，丝状真菌 基因的基本结构与高等真核生物基因相似。丝状真菌基因的基本结构如图 1 1 。 1 a g 卸i a 1 ：g 外星子凳盘 u a s i i n l $ 唑盯t a t a b o x l t - r i c h z e g x o n 外显子内台子 内台子外显子 图1 1丝状真菌基因的基本结构 起始密码子( a t o ) 上游的区域即为基因的5 非编码区，其中转录起始位点 7 山东大学硕士学位论文 ( 印) 上游的区域为基因的转录调控区，负责基因转录的起始及转录活性的调 控，t s p 和a t g 之间的区域对应于m r n a 上的5 非编码区，与翻译起始有关 丝状真菌基因转录调控包括以下两种类型的功能序列： 一种是由真核生物普遍存在的t a t a - b o x 、c c a a t - b o x ，和真菌特有的 c t - r i c h 区组成的靠近t s p 的所谓“核心”启动子成分( c o r ep r o m o t e re l e m e n t s ) ， 负责决定转录起始位点和最基本转录的效率，即负责组成型表达。它多集中 在t s p 上游2 0 0 3 0 0 b p 以内的转录调控区内，对该区域进行功能分析研究的 报道还较少。 另一种是位于更上游的负责基因转录活性调控的序列，称为u a s u r s ( u p s t r e a m a c t i v a t i n g r e p r e s s i n gs e q u e n c e s ) 。其调控蛋白一般是诱导型的，有 促进基因表达的转录激活因子，也有抑制基因表达的阻遏蛋白，它们与 u a s u r s 组成的调控网络对内外环境做出应答，调控基因的表达。目前对丝 状真菌转录调控的研究，主要针对这类序列及其调控蛋白。 1 1 2 丝状真菌基因的顺式调控研究 7 1 1 2 1u a s u r s 对丝状真菌基因表达调控的研究，主要针对u a s u r s 序列及其调控 蛋白。 1 1 2 2 核心启动子成分 c c a a t 盒：c c a a t 序列经常存在于真核生物启动子区域，一般定位于 转录起始位点的2 0 0 - 5 0 b p 之间，真核生物c c a a t 盒一般是转录因子的结 合位点，丽这种结合不仅存在于低等真菌中而且还存在于人中这些转录因 子对c c a a t 盒有优先选择性，同时c c a a t 盒在低等与高等的真菌中存在很 高的相似性。这些转录因子在不同的生物中具不同的名字：在人、小鼠以及 x e n o p u sl a e v i s 中为n f - y 蛋白，在s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e 、 s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e 、k l u y v e r o m y c e sl a c t i s 和a r a b i d o p s i st h a l i a n a 中为 h a p 蛋白，a s p e r g i l l u a n i d u l a n s 中为a n c f 蛋白( s t e i d ls 等，2 0 0 1 ) t a n gg 等发现，黑曲霉葡萄糖淀粉酶g a l 基因上游的- 4 8 9 4 1 4 b p 和 3 9 0 - 3 4 5 b p 区域中的c c a a t 盒定点突变为c g t a t ，转录因子不能与之结 8 山东大学硕士学位论文 合，g a t 启动子的转录活性降到较低的水平。对- 4 8 9 - 4 1 4 b p 区域采取多拷 贝策略改造g 可启动子来表达u i d a 外源基因，同样的降低了g a l 的表达水平 而报告基因u i d a 却没有受到影响。通过e m s a 试验揭示了细胞中转录因子 维持在一定的水平而- 4 8 9 , 一- 4 1 4 b p 多拷贝的引入产生了滴定效应，证实了g a l 基因上游的- 4 8 9 - 4 1 4 b p 和3 9 0 3 4 5 b p 区域的c c a a t 盒在g a l 基因的转录 中是必需的( z h u x 等2 0 0 4 ) 。l i l i u 等对g a l a 基因上游顺式作用元件c c a a t 盒采取多拷贝策略引入到表达载体的启动子中，增加了外源蛋白的表达量， 进一步表明c c a a t 盒是一个转录激活因子结合位点( l l i u 等2 0 0 3 ) 。 t a t a 框：在高等真核生物中，t a t a 框被认为与基因转录起始位点的决 定有关，并为转录因子t f i id 所识别。t a t a 框也普遍存在于丝状真菌中， 位于t s p 上游4 0 1 0 0 b p 处，目前对t a t a 框在丝状真菌基因转录中所起的作 用仍说法不一，但有迹象表明，丝状真菌中的t a t a 框所起的作用可能并不 象在高等真核生物中的那样重要，有的丝状真菌中根本没有t a t a 框序列， 如a n i g e r n i a d 和t r p c 基因等。p u n t 等用缺失分析证明，在a n i d u l a n s g p d a 基因中，t a t a 框与转录的起始无关( p u n t 等1 9 8 7 ) 。 c t - r i c h 区c t - r i e h 区是广泛存在酵母和丝状真菌中的启动子重要成 分。研究表明，c t - r i e h 区在丝状真菌中较t a t a 框和c a a t 框更有可能是决 定卸的序列。p u n t 等用缺失分析证明a n i d u l a n s g p d a 基因和t r p c 基因中的 c t - r i e h 区负责决定t s p 位置( p u n t ，e ta l ，1 9 9 0 ) 。c t - f i e h 区一般长l o - 6 0 b p ， 平均约2 0 b p ，紧靠主要的t s p ，一般位于t s p 上游，但在少数基因中，c t - r i c h 区位于主要的t s p 和a t o 之间，如a n i g e r 和a o r y z a e 的a m y b 基因等 1 1 2 3 t s p 的确定 与其它真核生物一样，丝状真菌基因转录产物常常具有多态性，原因之 一是r n a 从d n a 模板上的不同位点起始转录。特定基因在不同类型细胞或 同类型细胞的不同生长状态下选择性地从某一特定位点开始转录，必然涉及 到不同的转录调控机制。而且t s p 不同，转录效率也不同，往往有一个主要 的t 币，转录效率最高。因此，t s p 的检测不仅是对转录产物进行的一般定性 分析，而且也是基因表达调控研究的手段之一。基因的t s p 可以通过对m r n a 的s 1 核酸作图及引物延伸分析来确定。目前只有少数丝状真菌基因的t s p 得 9 山东大学硕士学位论文 到了测定，这些结果表明，不少丝状真菌基因具有两个以上的t 印，但只有一 个是主要的脚没有明显的碱基倾向性，在其前后也没有明显的序列特征， 不如在酵母基因中存在着保守的t s p 序列p y a a g ( p u n t ，e ta l ，1 9 9 2 ) 。 p e r e z - e s t e b a n 等利用引物延伸法确定了a n i d u l a n s 异青霉素n 合成酶 i p n a 有6 个t s p ，其中最主要的一个在翻译起始点上游一1 0 6 b p 位点处 ( p e r e z - e s t e b a n 等，1 9 9 3 ) h o 等用此方法确定了a n i d u l a n s 果胶质溶解酶 基因p e l a 有5 个t s p 集中在翻译起始点上游- 7 9 一6 5 b p 之间( h o 等，1 9 9 5 ) 在a n i g e r 中与氨基酸饥饿有关的基因c p c a ，有3 个t s p ( w a r k e 等，1 9 9 7 ) s e l e e b a 等用核酸酶s 1 图谱分析确定了a n i d u l a n sa c i a 基因有两个t s p ( s a l c e b a 等，1 9 9 2 ) 1 1 2 4 其他的顺式作用元件以及相应的反式作用因子 x l n r 结合位点： 一种转录激活因子结合位点，通过与相应转录因子结合，能够激活纤维 素酶基因以及半纤维素酶基因的表达，它们的序列具有一致性：g g c t a a a 。 如果第2 个g 缺失或突变则导致结合蛋白不能与之结合。n o i n m e 等在 黑曲霉中把x i n r 结合位点中的第2 个g 置换为t ，x l n r 蛋白不能与之结合， 降低了相应基因的转录水平( n o e ln m e 等1 9 9 8 ) 。 a n g e r 的转录激活因子x i n r 是一个双核锌簇转录因子，含有8 7 5 个氨基酸，分子量为9 5 k d a ，属于g a l 4 家族。此蛋白c 端的螺旋螺旋区域 能够指导x l n r 蛋白进入细胞核如果缺失c 端基因，包括编码螺旋一螺旋区 域的核苷酸，蛋白则被滞留在细胞质中。x i n r 的c 端与其它转录因子都含有 a r g 、l y s 两个基本氨基酸，它们与核酸的定位有很大的关系：g a l 4 和p p r 的c 端与同源二聚体的形成有关。c 端的第二个高相似性区域是邻近a 唱一 a r g - a r g - l e u - 1 印1 印区的氨基酸序列，此区域与g a l a 家族成员具有高度 的保守性。x i n r 蛋白的n 端部分与真菌的双核锌簇合物有很高的序列同源 性，如g a i m ，酿酒酵母的p p r i 、a n i d u l a n s 的u a y 和c r a $ $ a 的q a l f ， 与d n a 结合区域是c y s - x 2 _ c y s - x 6 - c y s 5 - c y s - x 2 y s - x 6 y s 。 x i n r 激活因子与转录因子c y s 6 家族中的其他蛋白都含有个高度保守的 a l a 和l y s 区域，第二个环中的p r o 也高度保守，而这环在g a l 4 家族的双核 1 0 山东大学硕士学位论文 锌簇的形成中扮演重要的角色。 a t u b i n g e n s i s 和a n i g e r 中的x l n r 激活因子能分别与a t u b i n g e n s i s x l n a 和a n i g e r x l n d 启动子区域结合。a n i g e r x l n d 启动子t a t a 框上游的 1 2 6 b p 区域和2 5 6 b p 区域能与x i n r 结合，结合位点仅相差7 b p 。在x l n a 上游 区域存在4 个这样的结合位点，它们之间的差距为1 2 b p 如果x l n d 启动子 中的g g c t a a a 突变为g t c t a a a ，x l n r 激活因子则不能与之结合 a 疗i 秽r 的木聚糖酶转录因子x i n r 既调节内切葡聚糖酶基因的转录， 又调节外切葡聚糖酶基因的转录。zr e e s e i 和a t e g r e u $ 的纤维素酶基因能被 纤维素以及槐糖诱导进行高效表达，两种木聚糖酶基因x y n l 和x y n 2 、b x l l 基因在纤维素培养基中能被激活。但a n i g e r 却不同，两种e g l a 、e g l b 基因 以及c b h a 、c b h b 基因能被d 木糖诱导而不能被槐糖诱导，与木霉相比，爿 n i g e r 纤维素酶基因的转录水平比较低。四种纤维素酶基因在x l n r 多拷贝菌 株中能进行高效转录，在缺失情况下则不转录。对a t u b i n g e n s i s x l n a 基因采 用多拷贝策略，导致x l n b 基因和所有纤维素酶基因的转录水平下降，主要原 因在于此基因上游含有3 个x i n r 结合位点，产生滴定反应，更进一步验证 了x i n r 可以调节纤维素酶基因的表达。在zr e e s e ic b h 2 启动子中，存在一 个与x l n r 结合位点相似位点，在与a n i g e r x l n d 启动子寡核苷酸竞争性试验 中发现连接到此区域的蛋白在木霉中不具有x i n r 的同源性，说明a n i g e r 与 tr e e s e i 的纤维素酶基因的转录调节系统不同( m a r c om c 等1 9 9 9 ) 。 c r e a c r e l 结合位点： 碳代谢抑制机制在许多真核生物中进行研究，包括遗传模式生物，如构 巢曲霉、酿酒酵母和工业生产菌株如黑曲霉、木霉等。在构巢曲霉和黑曲霉 等丝状真菌中，c r e a 为主要碳源抑制蛋白，它通过与相应基因启动子序列结 合从而抑制基因的转录，达到抑制效果。通过d n a s e i 足迹法确定了c r e a c r e l 结合位点为5 - s y g g r g - 3 ( s - - c g 、y - - c t 、r = a g ) ，但并不是所有启动子 中的结合位点都具有相应的功能，如在某些生物体中c r e a c r e l 与结合位点 结合依靠6 核苷酸外面的区域。如a n i d u l a n si p n a 基因的启动子( g e o r g ej g 等1 9 9 7 ) 。同时体外结合试验也证实了有些保守序列并不与c r e a c r e i 结合， 而一些其它的相关序列如5 - g a g g g g 3 序列能与它结合。 山东大学硕士学位论文 c r e a c r e i 参与了脯氨酸代谢、乙醇代谢、多糖水解等基因的代谢抑制 转录，它含有两个c y s 2 h i s 2 锌指结构域，这与酵母的代谢抑制蛋白m i g 具 有很高的同源性此结构同样的存在于a s p e r g i l l u sc r e a s ，zr e e s e ic r e i 以及 h u m i c o l ag r i s e ac r e a 中。 tr e e s e ic r e i 含有4 0 2 个氨基酸，分子量为4 3 6k d a ，氨基酸序列与 a n i d u l a n s 和a n i g e r 的相关蛋白相似性分别为5 5 6 、5 4 7 ，相似性主要 集中在两个区域：一个为c 2 h 2 锌指结构域，与曲霉和木霉的氨基酸序列几乎 完全相同，结合的d n a 序列具有高度保守性。c 2 h 2 锌指结构域与酵母的葡 萄糖抑制蛋白m i g l 锌指结构域、哺乳细胞调节早期生长反应的锌指蛋白、 以及酵母中与细胞生长相关的r g m l 蛋白和酵母中与碳利用相关的m s n 2 、 m s n 4 蛋白具有相似性。另一个区域就是脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸富集区。 此区域与酵母的碳代谢抑制蛋白r g r i 蛋白具