（植物学专业论文）comamonastestosteroni降解植物雌激素异黄酮的研究.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：卢之柞 日期：刎 厂厂7 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：户丈暂、日期：矽萝、厂厂7 指导教师亲笔签名：厂 日期： 诚。6 j 绣 福建农林大学硕士学位论文 中文摘要 环境雌激素具有类似雌激素的作用，进入生物体内，通过干扰生物体自身激 素的合成、分泌、转运、结合、活性反应、代谢和消解，对生物有机体维护正常 的动态平衡、繁殖、生长及行为有不利的影响。这些化学物质主要随人类的活动 排放到环境中，破坏机体稳定性和调控作用，即使数量很少，也可能影响到各种 生物的性行为、生殖功能、免疫系统和神经系统等。 植物雌激素是一类具有类似动物雌激素生物活性的植物化学成分，主要有3 类：异黄酮类、木酚素类和香豆素类。植物雌激素在体内外表现出雌激素和抗雌 激素活性，而这种双相作用主要取决于植物雌激素在细胞培养液中的浓度。 目前，局部环境中异黄酮的含量随着相关企业的废水污水排放而增加；异黄 酮在饲料添加剂中的含量普遍较高；且人类的异黄酮平均消费量也日趋增加。环 境中和生物机体内的高异黄酮含量将对人类本身和其它生物产生巨大副作用。然 而，植物雌激素的抗雌激素活性和雌激素活性还没得到足够的重视。 c o m a m o n a st e s t o s t e r o n i 具有关键酶3a 一羟类固醇脱氢酶碳酰基还原酶， 因此能够以睾丸酮、孕酮和胆汁酸等类固醇类及黄酮类物质为唯一碳源和能源， 通过包含许多酶的氧化代谢途径，完全消化这类底物，因此该菌在这些危害大的 稳定化合物的生物修复中起重要作用。 本试验首先确定了大豆异黄酮的提取和检测方法，再根据温度、时间、接种 量、静止与振荡各处理，来研究几种菌株对大豆粉和大豆制品中异黄酮降解的最 佳条件，主要的研究结果如下： 1 以不同的有机溶剂为提取液，在不同的温度下超声波提取大豆异黄酮，高效 液相色谱法法测定异黄酮浓度变化。结果表明，7 0 甲醇、7 0 下超声波提 取两次，第一次2 5m i n ，第二次2 0m i n ，提取量相对最高；色谱条件，色谱 柱：c 。柱；检测器：2 9 9 6 - - 极管阵列检测器；流动相：甲醇( a ) ；0 2 5 乙 酸水溶液( b ) ，在0m i n ，a 为2 5 ，梯度洗脱，终点为5 5 ，增加曲线为6 ； 检测时间：3 0m i n ：柱温：3 0 ；流速：1 0m l m i n ，能很好的分离出大豆 异黄酮成分。 2 在温度与时间因素对大豆粉中异黄酮的降解处理中，各菌株的降解率都随着 温度从4 、1 5 、2 5 到3 0 的升高而增大，当温度为3 0 时，各菌 福建农林大学硕士学位论文 株的降解率最高；各菌株的降解率随着时间在5d 、l od 、1 5d 、2 0d 的增加 而提高。当温度为3 0 ，时间为2 0d 时，c a 3 的降解率达到最大，为9 3 9 。方 差分析表明：温度因素四水平和时间因素四水平都达到了极显著差异。 3 在不同大豆品种的降解处理中，结果表明：各菌株对大豆品种威莱姆斯中异 黄酮的降解率最大，其次是东农4 1 0 。从异黄酮的总降解量分析，异黄酮含 量越高的大豆品种，菌株对其的降解率也较高。方差分析说明了菌株因素与 品种因素的差异达到了极显著水平。 4 细菌浓度与降解率有很大关系，试验分析得出j 接种量8 0 0pl 时的降解率 与5 0 0pl ，5 0 0l il 与2 0 0l il 的降解率之间差异达到了极显著水平；而 接种量1 0 0 0pl 与8 0 0ul 的降解率之间显著性差异不明显，所以8 0 0pl 的接种量较合适。 5 在两种无机盐培养基中，m s 。比m s 。更有利于各菌株对异黄酮的降解。当异黄 酮浓度在0 0 5m g m l 、o 1 5m g m l 、0 6 5m g m l 和0 9 0m g i n l 范围内升高 时，各菌对异黄酮的降解率也随着提高，但浓度为o 6 5m g m l 和0 9 0m g m l 时两者间对降解率的影响无明显差异；从菌株因素分析，c a 3 的降解能力表 现出最强。 6 c t 和c a 3 可以在p h 环境为5 - 9 的酸碱范围内生长，在p h7 的中性条件下降 解能力最强；不同菌株在p h6 - 与p h8 、p h5 与p h9 间的降解率差异无明显差 异。 7 对豆制品的降解试验里，3 0 下的降解率大于4 0 、1 5 和4 下的降解 率，且与其它温度达到极显著差异，说明过高的温度不利于降解率的提高； 与静止相比，振荡能提高菌株对异黄酮的降解率。 关键词：植物雌激素；大豆异黄酮；c o m a m o n a st e s t o s t e r o n i ，生物修复。 2 福建农林大学硕士学位论文 a b s t r a c t e n v i r o n m e n t a le s t r o g e n ，h a v i n gt h es i m il a re f f e c tw i t he s t r o g e n ，c a n i n t e r f e r ew i t ht h es y n t h e s i so fo r g a n i s m sh o r m o n e 、s e c r e t i o n 、t r a n s p o r t 、 i n t e g r a t i o n 、a c t i v er e a c t i o n 、m e t a b 0 1 i s ma n dd i g e s t i o n ，a n dh a v en e g a t i v e i m p a c t o nb i o l o g i c a l o r g a n i s m sf o rm a i n t a i n i n gan o r m a ld y n a m i c 、 r e p r o d u c t i o n 、g r o w t ha n db e h a v i o r t h e s ec h e m i c a l s ，d i s c h a r g e dt ot h e e n v i r o n m e n tm a i n l yb yt h ea c t i v i t i e so fh u m a n ，u n d e r m i n et h es t a b i l i t y a n dr e g u l a t i o no ft h eb o d y ，a n dm a ya f f e c tav a r i e t yo f s e x u a la c t 、 r e p r o d u c t i v ef u n c t i o n 、i m m u n es y s t e m 、n e u r a ls y s t e m sa n ds oo n ，e v e ni f w i t ha1 i t t e rn u m b e r p h y t o e s t r o g e n si sak i n do fp l a n tc h e m i c a lc o n s t i t u e n t sh a v i n gs i m il a r b i o l o g i c a la c t i v i t yw i t ha n i m a l se s t r o g e n ，t h e r ea r et h r e ec a t e g o r i e s m a i n l y ：i s o f l a v o n e s ，l i g n a n s a n dc o u m e s t a n s p l a n t e s t r o g e n s h o wt h e a c t i v i t yo fe s t r o g e na n da n t i e s t r o g e ni nv i t r oa n di nv i v o ，a n di td e p e n d s m a i n l yo nt h ep h y t o e s t r o g e n sc o n c e n t r a t i o ni nt h ec e l lc u l t u r em e d i u m p r e s e n t l y ，t h e c o n t e n to fi s o f l a v o n ei nl o c a le n v i r o n m e n tw a s i n c r e a s i n gw i t ht h ed i s c h a r g e dw a s t e w a t e ra n ds e w a g eo fr e l a t e d e n t e r p r i s e ：i s o f l a v o n e sc o n t e n ti nt h ef e e d a d d i t i v ei sr e l a t i v e l y h i g h ：a n d t h eh u m a n a v e r a g ec o n s u m p t i o no fi s o f l a v o n e sa l s o i s i n c r e a s i n g a n dt h eh i g hi s o f l a v o n ec o n t e n ti nt h ee n v i r o n m e n ta n di nv i v o h a v eat r e m e n d o u ss i d ee f f e c t st oh u m a n i t ya n do t h e ro r g a n i s m s h o w e v e r ， t h ea n t i 。e s t r o g e n i ca n de s t r o g e n i ca c t i v i t yo fp l a n te s t r o g e nh a v en o t b e e ng i v e na d e q u a t ea t t e n t i o n 3q h y d r o x y s t e r o i dd e h y d r o g e n a s e c a r b o n y lr e d u c t a s e ( 3a - h s d c r ) f r o m c o m a m o n a st e s t o s t e r o n ii sak e ye n z y m ei n v o l v e di nt h ed e g r a d a t i o no f s t e r o i d sa n dx e n o b i o t i c c o m a m o n a st e s t o s t e r o n ya r ea b l et ou s es t e r o i d s ( t e s t o s t e r o n e ，p r o g e s t e r o n e ，b i l ea c i d ) a n do t i g r s u b g t a n c 甘sa s s o l e c a r b o na n de n e r g ys o u r c e s c o m p l e t ea s s i m i l a t i o no fs t e r o i d si sa c h i e v e d t h r o u g hac o m p l e xp a t h w a yi n v o l v i n gm a n ye n z y m a t i cs t e p so fo x i d a t i o n 3 福建农林大学硕士学位论文 r e s p o n s i b l e f o rt h eb r e a k d o w no ft h e s t e r o i dn u c l e u s 。c o m a i m o n a s t e s t o s t e r o n it h e r e f o r ep l a yas i g n i f i c a n tr o l ei nt h eb i o r e m e d i a t i o no f t h e s es t a b l e l yh o r m o n a l l ya c t i v ec o m p o u n d si nt h ee n v i r o n m e n t f i r s t l y w ed e t e r m i n et h em e t h o d so fe x t r a c t i o na n dd e t e c t i o no f s o y b e a ni s o f l a v o n e s ，a c c o r d i n gt oe x p e r i m e n t so ft e m p e r a t u r e 、t i m e 、 i n o c u l u mc o n c e n t r a t i o n 、s t a t i ca n d o s c i l l a t i n g ，w es t u d yt h eb e s t c o n d i t i o n so fd e g r a d a t i o ns o y b e a np o w e ra n ds o y b e a np r o d u c t sb ys e v e r a l s t r a i n s t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 w i t hd i f f e r e n to r g a n i cs o l v e n t sa se x t r a c t i n gs o l u t i o n s ，u l t r a s o n i c e x t r a c t i o no fs o y b e a ni s o f l a v o n e sa td i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s ，d e t e c t i s o f l a v o n ec o n c e n t r a t i o nw i t hh p l c t h er e s u l t ss h o w e dt h a tu i t r a s o n i c e x t r a c t i o nt w i c ew i t h7 0 m e t h a n o la t7 0 ，2 5m i ni nf r i s tt i m e ：2 0 m i ni ns e c o n dt i m e ，c h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s ，c o l u m n ：c 1 8 c o l u m n ； d e t e c t o r ：w a t e r s2 9 9 6p d a ：m o b i l ep h a s e ：m e t h a n o l ( a ) ，0 2 5 a c e t i c a c i dw a t e r ( b ) ，0m i nai n c r e a s ef r o m2 5 g r a d i e n t ，i n c r e a s i n gc u r v e 6 ：d e t e c t i o nt i m e ：3 0m i n ；t e m p e r a t u r e ：3 0 ：v e l o c i t y ：1m l m i n ，s o y i s o f l a v o n e sc a nb ei s o l a t e dw e l l 2 i nt h ep r o c e s s i n go f t e m p e r a t u r e a n dt i m e i n f l u e n c e i n go n t h e d e g r a d a t i o no fi s o f l a v o n e si ns o y b e a np o w d e r ，t h ed e g r a d a t i o nr a t eo f c f ，c a 3 ，c p 4 ，c p 7 ，p 8a n dp b b pi n c r e a s ew i t ht h et e m p e r a t u r er a i s e f o r m4 ，1 5 ，2 5 t o3 0 r e s p e c t i v e l y ，t h ed e g r a d a t i o nr a t e o fs t r a i n sa r em a x i m u ma t3 0 t h ed e g r a d a t i o nr a t ei n c r e a s e f r o m t h et h e5 t hd a y ，t h el o t hd a y ，t h e1 5 t hd a yt ot h e2 0 t hd a y ，a tt h e 2 0 t hd a yr e a c h sm a x i m u n 【lt h ed e g r a d a ti o nr a t eo fc a 3w a s9 3 9 a tt h e 2 0 t hd a y 、3 0 v a r i a n c ea n a l y s i s s h o wt h a t ：f o u rl e v e l s o ft h e t e m p e r a t u r ea n dt h et i m er e a c has i g n i f i c a n td i f f e r e n c e 3 i nt h ee x p e r i m e n to fd e g r a d a t i o nr a t ef o rd i f f e r e n ts o y b e a n v a r i e t i e s ， t h er e s u l t ss h o wt h a t ：t h ed e g r a d a t i o nr a t eo fw e i l a i m u s h ii st h e l a r g e s t ，f o l l o w e db yt h ed o n g n o n g4 1 0 a st h ed e g r a d a t i o nw e i g h t ，t h e 4 福建农林大学硕士学位论文 h i g h e ro ft h ei s o f l a v o n ec o n t e n ti s ，t h eh i g h e rr a t eo fd e g r a d a t i o n r a t e v a r i a n c ea n a l y s i ss h o wt h a tt h et i m ea n ds t r a i n si ss i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e ：s t r a i n sa n dv a r i e t i e si sv e r ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e 4 t h ed e g r a d a t i o nr a t ei sv e r ym u c hr e l a t e dt ob a c t e r i a lc o n c e n t r a t i o n ，i t s h o wt h a tt h ed e g r a d a ti o nr a t eo fv a c c i n a ti o no f8 0 0ula n d5 0 0ul 、 5 0 0pl2 0 0ula n dt h er e a c hav e r ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ，b u tt h e d e g r a d a t i o nr a t eo fv a c c i n a t i o no f1 0 0 0i lla n d8 0 0l lli sn o t s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s ，s ov a c c i n a t i o no f8 0 0uli st h em o s t s u i t a b l e 5 w i t ht h et w os a l t m e d i u m s ，t h em s 2h a sb e t t e re f f e c tt h a nm s l w h e nt h e c o n c e n t r a tio no fis o f la v o n ein c r e a s ef r o m0 0 5m g m l ，0 15m g m l ，0 6 5 m g l lt o0 9 0m g m l ，t h ed e g r a d a ti o nr a t eo fb a c t e r i a sa ls or is e ，b u t b e t w e e n0 6 5m g m la n d0 9 0m g m l s h o wn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s ， a m o n g d i f f e r e n ts t r a i n s ，c a 3 d e m o n s t r a t et h eb e s ta b i l i t yo f d e g r a d a t io n 6 c ta n dc a 3c a ng r o wf r o mt h er a n g ep h5t op h9 ，a n dh a v et h eb e s t d e g r a d a t i o na b i l i t yi nt h en e u t r a lc o n d i t i o no fp h7 ：t h ed e g r a d a t i o n r a t eb e t w e e np h6 a n dp h8 ，p h5a n dp h9w a sn o ts i g n if ic a n td if f e r e n t 7 t h ed e g r a d a t i o no fs o y b e a np r o d u c t s ，t h ed e g r a d a t i o nr a t eo f3 0 i s h i g h e rt h a n4 0 ，1 5 a n d4 ，a n dr e a c h sv e r ys i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s ，i ts h o w e st h eh i g h e rt e m p e r a t u r ei sn o tg o o dt oe n h a n c e t h ed e g r a d a t i o nr a t e ；c o m p a r e dw i t ht h es t i l l n e s s ，o s c i l l a t i o nc a n i n c r e a s et h ed e g r a d a t i o nr a t eo fs t r a i n s k e y w o r d s ：p l a n te s t r o g e n ：s o yi s o f l a v o n e s ：c o m a m o n a st e s t o s t e r o n i b i o r e m e d i a t i o n 5 福建农林大学硕士学位论文 1 前言 1 1 雌激素 环境雌激素( e n v i r o n m e n t a le s t r o g e n s ，e e s ) ，又称为环境荷尔蒙、或环境内 分泌干扰物。目前较一致性的描述认为是：进入生物体内，可通过干扰生物体自身 激素的合成、分泌、转运、结合、活性反应、代谢、消解或产生类似生物体自身 激素的作用，对生物有机体维护正常的动态平衡、繁殖、生长及行为有不利影响 的环境化学物质( 生物体外源物质) 。这些化学物质都有激素样的作用，即使数量 很少，也可能导致各种生物的性激素分泌量下降、活性减弱、精子数量减少、生 殖器官异常、癌症等发病率增加，并影响到各种生物的性行为、生殖功能、免疫 系统和神经系统等等n 一。 环境雌激素具有苯环结构的居多，分子量在1 5 0 一- , 4 0 0 d a 之间。到目前为止。 列入e e s 的化学物质大约有7 0 余种h 3 ，分子结构和分子大小与生物体内的激素 相似。大多分子中不含有强的水溶性基团而呈现难溶于水而易溶于脂类化合物的 性质。化学性质稳定，难分解，不易被生物降解，生物半衰期较长，在环境中高蓄 积性，可通过食物链进入体内并富集，不易排出体外。有机氯化物占环境雌激素 的比例较大，且具有可吸附性眵一7 1 。毒性强，它们进入靶细胞后，与体内激素竞争 性地结合甾类受体，形成激素一受体复合物，然后进入细胞核与d n a 结合，发挥生 物学作用，改变细胞功能，扰乱身体内分泌系统的正常代谢阳一1 。含量低，在环境中 一般是以p p m 浓度甚至p p b 浓度存在的，但污染范围广，在大气、水、土壤、沉积 物、植物、人体和动物组织中均检出此类物质，还具有致癌性、致突变和致畸作 用，微量e e s 就能产生显著的效果，因此其对人体健康和生态环境形成潜在的威 胁n 仉n 一船。 根据来源，一般把雌激素分为以下几类n 朝： 1 1 1 天然雌激素一般指雌二醇、雌酮和雌三醇，在通常情况下主要由卵巢合成 分泌，其中以雌二醇的活性最高n 劓。 雌二醇雌酮 图1 - 1 雌二醇和雌酮的结构 6 福建农林大学硕士学位论文 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo fe s t r a d i o la n de s t r o n e 1 1 2 环境化学污染物农药：有机氯农药及其代谢产物，拟除虫菊酯类农药： 氯化芳烃和环烃：二恶英( t c d d ) 、氯代酚类、多氯联苯( p c b s ) ；去污剂洗 涤剂中的表面活性物质：烷基酚、壬基酚、辛基酚等酚类；某些金属：铅，有机 锡，镉；邻苯二甲酸酯类( p a e s ) ；二苯烷烃双酚类化合物( b p s ) ：双酚a 、 双酚f 等。 1 1 3 真菌性雌激素是由环境中的霉菌毒素产生，如玉米赤霉烯酮，其合成的 衍生物一玉米赤霉醇常被用作家畜促进生长激素。它进入体内，与雌激素受体结 合，使雌激素依赖的基因活化发生转录，从而产生雌激素效应n 射。 1 1 4 人工合成的雌激素包括与雌二醇结构相似的类固醇衍生物，也有些是结 构简单的同型物，即非甾体雌激素，如己烯雌酚、炔雌醇等口服避孕药或用于促进 家畜生长的同化激素n 们。 1 1 5植物性雌激素它是一类存在于植物中，本身或其代谢产物具有与雌激素 结构相似并具有雌激素效能的天然化合物。目前至少有4 0 0 多种植物含有具有生 物活性的雌激素样物质如异黄酮、香豆雌酚和木酚素。适量的植物性雌激素有利 于人体的健康，但对于孕妇和婴幼儿，若大量食用，其安全性值得深入研究n 7 1 。 1 2 异黄酮的生理效应 黄酮类化合物属植物次生代谢产物，广泛分布于蔬菜、水果及药用植物中， 是一类具有共同母核的苯丙吡哺酮衍生物，按其结构可分为黄酮、黄酮醇、黄烷 酮、黄烷酮醇、异黄酮、双黄酮、花青素、查耳酮及其苷等。 大豆异黄酮( s o y b e a ni s o f l a v o n e s ，s i f ) 是一种天然的植物类雌激素，其包 括染料木黄酮( g e n i s t e i n ，g e n ) 、黄豆苷元( d a i d z e i n ，d a i ) 、黄豆黄素 ( g l y c i t e i n ，g l y ) 及其糖苷型共1 2 种，主要以糖苷型存在。它广泛存在于豆科 类植物中，在大豆中的含量尤为丰富n 射。由于其结构与内源雌二醇( e 2 ) 相似，故表 现出雌激素作用和抗雌激素作用，其具有防治更年期综合症，抑制肿瘤增生，抑制 血管生成，抗骨质疏松等作用。目前，国内研究较多的是其提取、测定的方法，及 其抗肿瘤、抗骨质疏松以及防治更年期综合症等方面，对于大豆异黄酮的潜在毒 性的研究很少n 吼巩2 k 翻。随着对环境中内分泌干扰物研究的深入，s i f 作为一种大 剂量的环境激素，其潜在毒性作用开始引起了人们极大的关注。早在1 9 4 6 年澳 大利亚西南部牧场的绵羊因长期采食三叶草而引发“三叶草病”( 表现为子宫内 7 福建农林大学硕士学位论文 膜囊肿、产羔率降低、难产乃至不孕) ，导致动物生殖紊乱，目前的研究表明三叶 草含有异黄酮类化合物芒柄花黄素阻3 卫劓。后来陆续发现，动物食用富含植物雌激 素的植物会出现如子宫下垂、阴囊肥大等病症。近年来，随着s i f 在食品工业中 的广泛开发应用，其毒性尤其是对妇女和婴幼儿的可能不良影响已为国际学术界 所普遍关注。目前，对大豆异黄酮潜在毒性的研究主要集中在其致癌、对生殖系 统的影响、免疫毒性等方面。 1 2 1致癌作用 临床和流行病学研究已经证实e 2 是一种促细胞分裂剂，可引发和促进生殖 系统肿瘤，而s i f 的结构与e 2 的相似。张俊文等伪3 体外研究等研究发现，g e n 浓 度1 0n m o l l 时能促进m c f 2 2 7 细胞增殖，1pm o l l 的g e n 可诱导m c f 2 2 7 细胞 中的雌激素依赖性p s 2 基因表达，而 2 0l zm o l l 则抑制m c f 2 2 7 细胞增殖。林 成招等啪3 研究表明，g e n 对人乳腺癌细胞m c f 2 7 的增殖影响具有双向效应。余 增丽等咖的研究也表明，异黄酮类化合物具有低增高抑的作用，当g e n 2 5m g k g 剂量组子鼠的乳腺组 织增生、肥大，与雌激素效应一致，且随剂量增加而加重，子鼠出生体重较轻，雄 性子鼠前列腺重量下降，睾丸发育延迟，精子发育迟缓、畸型：雌性子鼠卵巢滤泡 异常，间质部分细胞稀疏、萎缩、水肿。另据许建宁等口们的研究，孕鼠在围产期和 哺乳期给予高剂量( 4 8 0m g k g ) 的g e n ，会明显增高子代死亡率，生理发育滞后， 但对子代行为、生殖功能无明显影响：并且其认为对母鼠生殖和子代生长发育的 8 福建农林大学硕士学位论文 无作用剂量为1 6 0m g k g 。g e n 也可对雄性大鼠的生殖系统造成不可逆性的改变。 成年大鼠通过饲料暴露于g e n ( 9 0 0m g k g ) 6 周后大鼠睾丸和附睾明显变小，乳腺 显著增生：给成年大鼠灌胃4 8 0m g k g 的g e n ，持续2 个月，可使大鼠精子活度下 降。崔洪斌等口毛蚓研究认为，在高剂量( 9 0 0m g k g ) 的情况下，大鼠睾丸、附睾的 脏体比值，睾丸的病理学组织检查及雌、雄激素水平均出现异常，与基础组比较 有显著差异，认为s i f 对雄性生殖系统产生副作用的阈剂量可能在3 0 0 - - 9 0 0m g k g 。有学者认为s i f 作为一种大剂量的环境激素与男性精子质量及数量下降密 切相关。孕妇摄入异黄酮可致宫内胎儿造血细胞d n a 损伤，这种损伤在婴儿或生 命后期可能导致白血病。另外，由于动物试验表明新出生动物对g e n 较为敏感， 从而引起了人们对含s i f 的婴儿食品的极大关注和担忧。有调查研究表明，在含 s i f 的大豆婴儿食品中，异黄酮平均含量为3 2 4 71 tg m l ，按4 个月婴儿饮食 量计，其平均暴露量为4 5 - 一8 0m g ( k g d ) 。婴儿血浆样中g e n 和d a i 平均浓 度水平为6 8 4 和2 9 5ug l ，是食用母乳或牛奶的婴儿浓度的2 0 0 倍1 。另据报 道妇女血浆内s i f 的浓度为雌二醇浓度的1 3 0 0 0 - 2 2 0 0 0 倍，因而有研究者担心 即使异黄酮的拟抗雌激素作用较弱( 为e 2 的i 0 3 - - 1 0 5 ) ，如此高的摄入量和 血浆水平也不能排除其在婴儿体内发挥生物作用的可能，其对婴儿的潜在影响可 能将在青春期或生命后期甚至其子代中体现出来嘲。 1 2 3免疫毒性 s i f 对免疫系统也有毒性。体外研究发现，g e n 作为一种特异的酪氨酸蛋白 激酶抑制因子抑制t 淋巴细胞增殖、白细胞介素2 2 ( i l 2 2 ) 生成及i l 2 2 受体表 达。y e l l a y i 等啪1 研究发现，g e n 对p m a + 抗c d 2 8 刺激t 淋巴细胞增殖有抑制作； s i f 对甲状腺也有一定的影响。研究表明，g e n 可抑制甲状腺过氧化物酶( t p o ) ， 从而导致甲状腺功能低下；另有研究显示，s d 大鼠从受孕至断乳通过母鼠暴露及 断乳至出生后第5 0 天，通过饲料暴露于不同剂量的g e n ( 含2 5 - - 1 2 5 0m g k g ) ， 动物甲状腺过氧化酶的活性呈剂量依赖性降低；流行病学研究表明，食用大豆食 品会使人体免疫球蛋白减少，t 淋巴细胞功能障碍及补体水平下降3 钉。用大豆食 品喂养的婴儿，其免疫球蛋白比牛乳喂养的婴儿低，而用合成的s i f 类衍生物治 疗绝经后妇女骨质疏松症则产生了淋巴细胞减少症；有研究发现，食用富含s i f 饲料的雄性大鼠，其认知功能较食用不含s i f 饲料的雄鼠弱，表明s i f 可减少额 9 福建农林大学硕士学位论文 叶皮质钙结合蛋白水平，从而影响雄性大鼠的认知功能1 。 1 2 4 联合暴露效应 包括s i f 在内的植物雌激素只是膳食中多种环境雌激素之一，它与其它环境 雌激素( 如双酚a ) 和雌激素类药物之间是否存在联合作用，其它化合物( 如重金 属和有机氯污染物) 是否会影响植物雌激素的效应和作用方式，目前尚未最终定 论。但现有的少量资料表明，s i f 与其它化合物联合暴露时可能会表现出协同作 用或拮抗作用，这取决于化合物的雌激素相对活性及作用机制。k u m i - d i a k a 等 “l 创在研究g e n 对体外睾丸细胞t m 3 、t m 4 、g c l s p g 的影响时发现，g e n 与地塞米 松联合暴露时，在诱导睾丸细胞凋亡方面具有协同效应：与叠氮钠联合暴露 时，g e n 加剧叠氮钠诱导睾丸细胞坏死，表明两者之间具有协同作用。许多研究表 明，g e n 和甲氧氯的联合雌激素作用比单一暴露时大，两物质对大鼠生殖系统存 在协同效应。h u g h e s 等h 3 朋3 根据已有研究的结果认为，当g e n 与活性更强的雌激 素物质共同暴露时可能起雌激素拮抗作用。 1 2 5 其它毒性 c u r r a n 等m 娜1 给慢性感染小鼠分别喂饲含g e n ( 3 0 0m g p k g ) 的无大豆饲料和 全豆基饲料6 0d ，发现两种饲料均可抑制小鼠脾脏y 一千扰素( y2 i f n ) 的生成， 表明g e n 和大豆成分可调节细胞免疫和i 型炎症反应，进而可能会降低机体对疾 病的抵抗力；s i f 可能具有神经毒性，大鼠从妊娠第7d 至断乳通过母鼠暴露及 断乳至出生后第7 7 天通过饲料暴露于g e n ( 每k g 饲料含1 2 5 0 m g ) ，其对盐溶液的 摄食量明显高于对照组( 雄性超出6 8 ，雌性超出9 0 ) ，血管加压素( 由下丘脑合 成) 浓度显著升高，表明g e n 可明显干扰大鼠的盐溶液摄入模式，这种作用是 由s i f 干扰中枢神经系统发育而引起的；另有研究发现，雄性大鼠食用富含s i f 的饲料，其认知功能会出现一定程度的减退，与食用不含s i f 饲料的雄鼠相比， 前者大脑额叶皮质的钙结合蛋白明显减少，而环氧合酶- 2 ( c o x 一2 ，一种炎症因子) 的表达明显升高h l 砚例。这表明大豆异黄酮可通过增加c o x - 2 的表达以及减少额 叶皮质钙结合蛋白水平来影响雄性大鼠的认知功能；g e n 可能具有细胞毒性。经 口给予s d 大g e n ( 2 0 m g p d ) ，持续4 周，可显著增加大鼠大脑的乳酸脱氢酶( l d h ) 活性、诱发d n a 断裂，降低前体c a s p a s e - 3 ( 3 2 k d ) 表达但增加切割后活性亚单 c a s p a s e - 3p 1 8 的表达，说明长期摄入高剂量g e n 能诱导大鼠大脑细胞毒性和大 1 0 福建农林大学硕士学位论文 脑皮质神经元细胞凋亡的发生；s i f 还可能具有潜在的遗传毒性，小鼠淋巴细胞 体外微核实验发现，3 01 tm o l p l 的g e n 所诱导的微核发生率为8 1 2 ，表明 g e n 在体外具有遗传毒性。虽然另一种大豆异黄酮d a i 不能诱导微核的发生，但 其4 种代谢产物( 雌马酚、邻去甲基安哥拉紫檀素、47 ，67 ，77 一三羟基异黄酮、 37 ，47 ，7 一三羟基异黄酮) 均能诱导微核发生，且呈浓度依赖性，说明d a i 的氧 化和还原产物均可在体外表现出遗传毒性咖届。 1 3 异黄酮的提取分离与检测 1 3 1 异黄酮的提取 甲醇和乙醇是提取大豆异黄酮的最有效的有机提取溶剂喳2 ，唧；曾祥群泓3 在 2 0 0 0 年石研究葛根中黄酮的提取时分别采用了甲醇、9 5 乙醇、6 5 l 醇和直接 用水进行提取，结果表明甲醇是提取异黄酮较好的溶剂，9 5 乙醇次之，水直接 提取的异黄酮得率较低。 超声波辅萃取是利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应、机械振动、扰动 效应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运 动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行。 潘廖明等啼朝利用超声辅助提取大豆异黄酮，正交试验结果显示，当超声频率为2 5 k h z 、超声功率为1 6 0 w ，乙醇浓度为5 0 ，料液比为l ：6 ，6 0 超声处理6 0 m i n 时，大豆异黄酮得率可达4 2 3m g g ，较之醇提法提高了3 9 3 ：谢明杰等 脚1 利用超声波从脱脂豆粕中提取大豆异黄酮，并与乙醇加热回流法进行了比较， 证明了此方法具有一定的优越性。 微波萃取的本质是微波对萃取溶剂和物料的加热作用。微波加热的机理有别 于常规加热，它能够穿透萃取溶剂和物料使整个系统均匀加热，这样省去常规加 热由表及里的热传导所需的时间，使萃取体系快速升温，萃取速率明显高于常规 的加热方法。张永忠等凹7 3 用微波法预处理提取大豆异黄酮，通过二因素三水平的 正交试验确定微波处理后的最佳浸取物料比为l ：1 5 ，浸取时间为9h ，浸提率 为9 7 4 2 。 异黄酮的提取方法还有高压湿法呻，观矧、酸水解及酶水解法池1 。 福建农林大学硕士学位论文 1 3 2 大豆异黄酮分离 大豆异黄酮单体分离的方法主要有硅胶柱层析法、聚酰胺柱层析法、葡聚糖 凝胶柱层析法、高效液相色谱法、高速逆流色谱法等。 硅胶柱层是以有吸附能力的固体为固定相，以液体为流动相，利用不同溶质 分子在吸附剂( 固定相) 和洗脱剂( 流动相) 之间的同吸附和解吸能力而彼此分离。 徐德平等哺钔利用硅胶柱层析法从大豆中提取分离到大豆苷元糖苷、染料木素糖 苷、大豆苷元、染料木素4 个异黄酮单体。姚开等瞄1 采用3 0 0 - 4 0 0 目硅胶、洗 脱体系为氯仿一甲醇( 5 ：1 ，v v ) 、流速为1 0m l m i n ，可以使染料木苷、大豆 苷、染料木素和大豆苷元4 种主要单体组分得到分离。 聚酰胺对酚类物质具有较强吸附力的原理是基于其酰胺羰基与酚羟基之间 可形成氢键，它适用于不同类型黄酮化合物的分离。姚开等司采用聚酰胺柱层析 法，流速为1 oi i l l m i n ，用2 0 ( v v ) 甲醇作为洗脱液可以分离出含量为8 5 3 ( w w ) 的大豆苷，再用4 0 ( v v ) 甲醇洗脱可以分离出含量为8 7 o ( w w ) 的染 料木苷聚酰胺柱层析对大豆异黄酮糖苷的分离效果好。 葡聚糖凝胶是根据分子大小而将混合物进行分离，一般是以分子量递减的次 序被洗脱，适用于纸色谱、薄层色谱、硅胶及聚酰胺色谱中分离得到的异黄酮类 化合物中糖苷配基或糖苷的进一步分离。姚开等睇1 采用l h - 2 0 葡聚糖凝胶柱， 以9 0 ( v v ) 甲醇作为洗脱剂、流速为2 0m l m i n ，可以将染料木苷和大豆分离 出来，其含量分别达到5 7 ( w w ) 和9 5 1 ( w w ) 。葡聚糖凝胶柱层析可以使大 豆异黄酮中的染木苷和大豆苷得到最好的分离。 高效液相色谱法( h p l c ) 是目前普遍采用的分离方法，用于大豆异黄酮分离的 c 。柱反相高效液相色谱法( r p _