（微生物学专业论文）巴西固氮螺菌nifa活性调节的分子机制.pdf

摘要 为了研究e p t i l 氮螺菌n i f a 活性调节的分子机制，采用定点突变( s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n s i s ) 技术对神q 基因进行体外突变，分别获得编码n 端1 8 位的酪氨酸突变为苯丙氨酸( y 1 8 f ) 的单 突变 删，以及1 8 和5 3 位酪氨酸都突变为苯丙氨酸( y 1 8 ，5 3 f ) 的双突变h 归4 。将哟爿，、n g a 3 ( y 5 3 f 单突变来自d r e l m e r i c h ) 和却翻4 分别克隆到穿梭质粒p v k l 0 0 上构建重组质粒p v k l 、 p v k 3 千up v k 4 。这三种质粒和p k c l l ( p v k t 0 0 h 倒，来自本实验室，作为突变n 弘基因的对 照) ，通过二亲本结合分别转入以f3 种不同基因型的巴西崮氮螺菌s p 7 ( w t ，野生型) 的突变 株中：( 1 ) s p 7 3 5 8 ( n i f a g l n b , n i f l l - ：l a c z - k m ) 、瞧) s p 7 0 6 7 1 ( h 0 爿? g t n 8 ，n i j h ：l a c z - k m ) 和( 要) s p 7 6 0 6 1 ( 删a ，g l n b - ，g l n b 编码p 蛋白，n i f h ：l a c z - k m ) 中，共得到了1 2 种转化子。通过测定报告基因 l a c z 的活性以检测突变后n i f a 的活性。在固氮条件下分别测定含有不同质粒的1 2 个转化子和3 种受体菌的p 半乳糖苷酶活性。结果表明，s p 7 3 5 8 - p v k 4 的p - 半乳糖苷酶活性分别是 s p 7 3 5 8 p k c l1 ，s p 7 3 5 8 p v k l 和s p 7 3 5 8 p v k 3 的2 9 ，1 5 和1 9 倍；s p 7 6 0 6 1 一p v k 4 的b 半乳糖苷 酶活性分别是s p 7 6 0 6 1 p k c l l ，s p 7 6 0 6 1 - p v k i 和s p 7 6 0 6 1 - p v k 3 的8 5 ，1 8 和2 4 倍：s p 7 0 6 7 1 - p v k 4 的b 半乳糖苷酶活性分别是s p 7 0 6 7 1 一p k c l1 ，s p 7 0 6 7 1 一p v k i 和s p 7 0 6 7 i - p v k 3 的3 6 ，1 6 和2 1 倍。为了验证突变后n i f a 蛋白对固氮酶活性的影响。再将p k c i i , p v k l ，p v k 3 和p v k 4 分别转入s p 7 ( 哟舅，g l n b ) 、s p 7 0 6 7 ( 弘，g l n b ) 、s p 7 6 0 6 ( 哪么g l n b - ) 3 种受体菌中，得到1 2 个转化予。在固氮条件下，用乙炔还原法分别测定1 2 个转化子和上述3 种受体菌的固氮酶活性， 结果表明这些转化子的固氮酶活性与上述b 半乳糖苷酶活性的趋势基本相似。 以上实验说明，在固氮条件下。n i f a y l 8 f 或n i f a y 5 3 f 单突变的活性比野生型n i f a 蛋白的 高，且n i f a y l 8 ，5 3 f 双突变的活性增加的更明显。当p n 蛋白存在时，可进一步提高n i f a y l 8 , 5 3 f 蛋白的活性。但是在有l m m n 凰+ 存在时，所有突变后的n i f a 蛋白都没有活性。说明n i f a n 端 突变只是解除n 端对n i f a 活性的抑制，并没有摆脱铵对n i f a 活性的抑制，因此铵对n i f a 活性 调节机制还有待进一步的研究。 为验证突变后n i f a 蛋白与p 蛋白之间的关系将突变后n 弘分别克隆到酵母表达载体 p g a d 上，得到4 个表达重组质粒，并与p g b d - g l n b ( 来自本实验室) 共转化酵母。同时将正负对 照p g a d - n 弘j ：p g a d - n i f a 3 ：p g a d m 弘：p g a d - n 班a ( 来自本实验室) 分别与p g b d - g l n b 共 转化共得到8 个转化予。检测转化子在选择性平板上的生长和对b - 半乳糖苷酶活性进行测定， 并经载体互换实验验证。根据报告基因表达的情况说明p 蛋白与n i f a n 端1 8 和5 3 位酪氨酸都 发生相互作用，而且1 8 或5 3 位酪氨酸任意一个单独突变后不影响p 与另一个酪氨酸相互作用。 4 3 位酪氨酸是决定n i f a 空间结构的重要位点。p t i 蛋白虽可激活n i f a 的活性，但为什么会提高 n i f a y l 8 ，5 3 f 的活性，尚待研究。 关键词：巴西闽氮螺菌，h 弘基因，p i i 蛋白，定位突变，酵母双杂合技术 a b s t r a c t i no r d e rt os t u d yt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f n i f aa c t i v i t yr e g u l a t i n go f a z o s p i r i l l u mb r a s l i e r i s e ， t h en f ag e n ew a sm u t a t e db ys i t e d i r e c t e dm u t a g e n s i si nv i t r o s i n g l em u t a n tn f f a lt h a te n c o d e s t y r l 8m u t a t e d t op h e ( y 1 8 f ) o nn - t e r m i n a lo fn i f aa n dh 归4t h a te n c o d e sb o t ht y r l 8a n d5 3 m u t a t e dt op h e ( y 1 8 ，5 3 f o nn t e r m i n a lo fn i f aw e r eo b t a i n e dr e s p e c t i v e l y a n dn 弘j ，n g a 3 ( s i n g l em u t a n ty 5 3 f ，f r o md r e l m e r i c h ) a n dn i f a 4 w e r ec l o n e ds e p a r a t i v e l yt ot h eb r o a dh o s tr a n g e v e c t o rp v k l 0 0t oy i e l dp v k l ，p v k 3a n dp v k 4 t h e s ep l a s m i d sa n dp k c l l ( p v k l 0 0 - n 删，t h i s l a b o r a t o r y ，u s e da sc o m p a r i s o nw i t hm u t a t e dn 弘g e n e ) w e r e t r a n s f e r r e df r o me c o l it os p 7 3 5 8 加弘 g l n b ， 髓：l a c z - k m ) ，s p 7 0 6 7 1 伽i f a ，g l n b , n i f h l a c z - k m ) ，s p 7 6 0 6 1m 弘，g l n b 。，h 口阿jl a c z - k m ) o f a z o s p i r i l l u m b r a s d e n s e s p 7 ( w i l dt y p e ) b yu s i n gc o n j u g a t i o n ，r e s p e c t i v e l y ，a n d t w e l v e t r a n s f o t r u a n t sw e r eo b t a i n e d 1 1 ”a c t i v i t i e so fm u t a n tn i f a sw e r ei n v e s t i g a t e db ya s s a y i n gt h e a e t i v i t yo fr e p o r t i n gg e n el a c zu n d e rn i t r o g e n - f i x i n gc o n d i t i o n t h er e s u l 拓s h o w e dt h a tt h e p - g a l a c t o s i d a s ea e t i v i t y o fs p 7 3 5 8 一p v k 4w a s2 9 ，1 5a n d1 9t i m e s h i g h e r t h a nt h a to f s p 7 3 5 8 p k c il ，s p 7 3 5 8 p v k la n ds p 7 3 5 8 - p v k 3 ，r e s p e c t i v e l y ；s p 7 6 0 6 1 - p v k 4 sw a s8 5 。1 8a n d 2 4t i m e sh i g h e rt h a nt h a to f s p 7 6 0 6 1 p k c ll ，s p 7 6 0 6 1 - p v k la n ds p 7 6 0 6 1 - p v k 3 ，r e s p e c t i v e l y ； s p 7 0 6 7 1 - p v k 4 sw 船3 6 ，1 6a n d2 1t i m e sh i g h e rt h a to fs p 7 0 6 7 1 - p k c ll 。s p 7 0 6 7 1 - p v k ia n d s p 7 0 6 7 1 一p v k 3 ，r e s p e c t i v e l y t ov e i l f yt h ee f f e c to f m u t a n tn i f ap r o t e i no nt h en i t r o g e n a s ea c t i v i t y ， p k c ll ，p v k i ，p v k 3a n dp v k 4w e r et r a n s f e r r e da g a i nf r o mg c o it os p 7 ( n i f a g t n 印, s p 7 0 6 7 ( n 弘jg t n a ) a n ds p 7 6 0 6 归，曲刃u s i n gc o n j u g a t i o n , 瑚p e c t i v e l y ，a n da n o t h e rt w e l v e t r a n s f o r m a n t sw e r eo b t a i n e d n 圮n i l r o g e n 越ea c f i v i t yo ft h e s et r a n s f o r m a n t sa n dt h et h r e ea e e e p t o r s w e r e a s s a y e ds e p a r a t i v e l y u n d e rn i t r o g e n - f i x i n gc o n d i t i o n ，a n dt h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h e n i t r o g e n a s ea c t i v i t yo f t h e s et r a n s f o r m a n t sw e r eb a s i c a l l ys i m i l a rt ot h et r e n do f t h ep - g a l a c t o s i d a s e a n t i v i t ya b o v e t h e s ed a t ai n d i c a t o dt h a tt h ea c t i v i t yo f s i n g l em u t a n tn i y i g fo rn i f a y 5 3 fw a sh i g h e rt h a n t h a to fw i l dt y p en i 纨，w k 髓地t l ma c t i v i t yo fd o u b l em u t a n tn i f a y l 8 5 3 fi n c r e a s e sm o r es i g - n i f i c a n t l ya n de w n f u r t h e si n c n m s o di nt h ep l 璐蛳o f p np r o t e i n h o w e - , 盯, t h e a e t i v i t yo f a l lt h e m u t a n tn i f a sw e r el o s tb y a d d i 唱l m mo f n h + w h i c hi n d i c a t e d t h a tm u t a t i o no f t b en - t e r m i n a lo f n i f ao n l yr e l e a s e dt i mi n h i b i t i o no ft h ea = i v i t yo fn i f ab yi t sn - t e r m i n a l , a n dd i d n tr e l e a s et h e i n h i b i t o r ye f f e w , to f t h ea c t i v i t yo f n i b yn h + 1 1 r e g u l a t i n gm e c h a n i s mo f n i - 1 4 + o nt h ea c t i v i t y o f n j 执w i b es t o d i 酣f u r t h e r i no r d e rt ov e r i f yt h er e l a f i o m h i pb e t w e e nt h e s em u t a t e dn i f a sa n d p n ，t h em u t a n t so f n 榭w m c l o n e dt oy e a s t e x p r e s s i o nv e c t o rp g a d r e s p e c t i v e l y f o i l l r e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r eo b t a i n e da n d t h e nc o t r a n s f o r m e d t o y e a s t w i t h p g b d - g l n b ( t h i sl a b o r a t o r y ) m e a n w h i l e , p g a d - n 羽j ： p g a d - n 弘j ：p g a d - n 归m a n dp g a d - n 聊( t h i sl a b o r a t o r y ) w e r ec o t r a n s f o r m e dw i t hd g b d - g l n b r e s p e c t i v e l ya sp o s i t i v e n e g a t i v ec o n t r o l ，a n de i g h tt r a n s f o r m a n t sw e r eo b t a i n e d t h eg r o w t ho f t h e s e t r a n s f o r m a n t si ns e l e c t i v em e d i aa n dt h e i r 1 3 - g a l a c t u s i d a s ea c t i v i t y w e r e i n v e s t i g a t e d v e c t o r e x c h a n g i n ge x p e r i m e n tw a su s e da l s of o rv e r i f y i n gf i g h to ft h e m t h ee x p r e s s i o no ft h er e p o r t e r g e n e ( a d e 2 ，l a c za n dh i s 3 ) s h o w e dt h a tp np r o t e i ni n t e r a c t e dw i t hb o t ht y r l 8a n d5 3o nn i f a n - t e r m i n a l s i n g l em u t a n tt y r l8d i d n ti n f l u e n c et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np i ia n dt y r 5 3 ，a n dv i c e v e r s a t y r 4 3i sa ni m p o r t a n ts i t et h a td e t e r m i n e st h es p a t i a ls t r u c t u r eo f n i f a ，a n di f i tw a sm u t a t e d b yp h e ，t h en i f aw o u l db ei n a c t i v e k e y w o r d s ：a z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s e , ”弘，p np r o t e i n ，m u t a t i o n ，y e a s tt w o h y b r i d s y s t e m 独创性声明 l s 黾b 8 3 2 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名： 壶。l 确 时间： 一2 0 。弓年6 月二。日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 训确 时间：) 。； 年6 月土。日 导师签名： 鑫毵 时间：吃翻缉年月p 日 中周农业人学顺i j 学位论文 i 古i 氮茁问氮删节研究址胜 第一部分固氮菌固氮调节研究进展 1 1 前言 在地球周同的大气中约8 0 是氮气，但在生物界内仅有部分原核生物具有将气态氮还原为 氧、从而掺入到有机分子的能力。据统计，地球上化合态氨总量的6 0 来源于生物劁氮作用，是 地球生物氮素的的主要来源。 现今地球上约有5 3 亿的人口，每年要消耗2 3 0 0 万吨的氮素。在未来的4 0 年里人口将增 长一倍如要维持同样水平的消耗，农作物的产量必须相应增长，而氮是限制农作物产量的主要 因素。现今化学氮肥在农业生产上的大量应用，对自然环境造成了严重的污染：一方面是有毒的 硝酸离子大量进入水圈：另一方面促使合成氨工业不断发展，这不仅消耗巨大的能源，而且使氧 化亚氮排放量e t 益增加( 破坏大气臭氧层及加重温室效应的主要因素之一) 。为避免形成这种局 面，发展可持续农业势在必行。有效的利用生物固氮是减少氮肥使用，缓解环境污染。是发展可 持续农业的一条重要途径。 生物固氮是指某些种类的原核生物可利用体内的固氮酶将空气中的氮气还原为氨的过程。生 物固氮作用不仅是化合态氮素的主要来源。也是自然界氮素循环中不可缺少的重要环节。生物固 氮作用的化学反应计量式为： n 2 + 8 i 十+ 8 c + 1 6 m g a t p 一2 n h 3 + h 2 + 1 6 m g a d p + 1 6 p i 由上式可见，每还原1 分子的n 2 ( 同时放出1 分子h 2 ) 要消耗8 个质子、8 个电子和1 6 分子的 a t p ，是一个非常耗能的过程。对这种耗能反应，固氦菌必然具有一套相应的调节系统，以对各 种环境因素做出反应，从而最大限度地节省自身的能量。 根据固氮生物与植物之间的相互关系通常将自然界中存在的固氮体系分为自生固氮、共生 固氮和联合同氮三种。自生固氮菌由于容易人工培养，对其固氮作用的研究最为深入。迄今为止。 共有5 种自生固氮菌的固氮基因组成已基本研究清楚，包括k l e b s i e l l ap n e w n o n i a e 、a z o t o b a c t e r v i n e l a n d i i 、a z o t b a e t e rc h r o o c o c c u m 、r h o d o b a c t e rc a p s u l a t u s 和e n t e r o b a c t e ra g g l o m e r a n s 。在固氮 分子调节方面，以k p n e u m o n i a e 研究得最清楚成为研究固氮作用的模式菌株。 对共生周氮菌的研究已有1 0 0 多年历史。然而对其固氮遗传学方面的了解远不如自生固氮菌 清楚。目前有三种共生固氮菌的固氮基因组成及相应固氨调节研究得较多( f i s c h e r ，1 9 9 4 ) ： r h i z o b i u mm e l i l o t i ，b r a d y r h t z o b i u m j a p o n i c u m 和a z o r h i z o b i u mc a u l i n o d a n s 。 联合固氮菊与非豆科作物和牧草的根际有密切的关系，它们定植于根表，但不形成特异化结 构，其实他们大多也是属于自生固氮菌的范畴，其中包括a z o s p i r i l l u m 、a c e t o b a c t e r 、a z o a r c u s 、 a z o t o b a c t e r 、e n t e r o b a c t e r 、h e r b a s p i r i l l u m 等( b a l a nd r a u ，1 9 8 3 ；d 6 b e r e i n e r , 1 9 8 9 ；d 6 b e r e i n e r e ta l ， 1 9 8 7 ；r e i n h o l d h u r e k e ta l ，1 9 9 0 ) 。因其分布广泛，可与豆科植物以外的其它单子叶植物和戏子 叶植物，尤其是禾本科粮食作物。进行联合固氮，并能产生促进植物生长的激素，而被重视。其 中a z o s p i r i l l u m 属的细菌，是研究最为广泛的联合同氮菌。本文着重介绍k l e b s i e l l ap n e m o n i a e ， a z o t o b a c t e rv i n e l a n d i i 和a z o s p i r i l u mb r a s i l e n s e 三种有代表性固氮菌固氮作用的调节机制，目的在 于说明不同的同氮菌，因所处的环境不同( 主要是生活环境中的氧分压、化台态氮和可利用的能源 物质等) 它们的同氮调节机制也各异。 t 1 - 牝业人学硕i 学位论义l 茸氮菌问氮训节研究逃胜 1 2k l e b s i e i l ap n e u m o n i a e 优固氮调节的分子机制 cp n e u m o n i a e 是研究白生问氮菌蚓氮调节机制的模式菌。它的主要特性是有化合态氮f 尤其 是n h 。+ 或n o s 。) 硐i 有0 2 时能快速生长，但不l 嗣氮；只在无化合态氨和无0 2 的条件f 才i 司氮生长。 12 1 固氮基因簇( n i lc l u s t e r ) 的结构与功能 芷p n e u m o n i a e 的同氯基因簇( n i f g e n ec l u s t e r ) ，位丁i 染色体上组氨酸合成酶基因h i s g 和莽 草酸合成酶基因s h i a 之间全长2 3 k b ，由2 0 个固氦基因( i f g e n e ) 组成，分属丁- 8 个转录单 位( m e r r i c km j 1 9 8 8 ) 。围氮基因簇的结构和功能分别见图1 1 和表1 1 。 j 堕_ 旦签t v 1hxusvw z ft ab 口 2 圈1 1 肺炎克氏杆菌n i l 基因簇的结构( d e a ne ta 1 ，1 9 9 2 ) f i g u r ei lt h ep h y s i c a lo r g a n i z a t i o no f n i f g e n e sf r o m 置p n e n m o n i a e 表卜1 = p n e l m o n i a e 中各n i l 基因的功能( d e a no t 口，1 9 9 2 ) t a b l ei - 1f u n c t i o no f n g e n e si nk p n e u m o n i a e 基因 编码产物及特征、功能 i f n铁蛋白结构基因 i f d钼铁蛋白结构基因的n 亚基 n i f k 钼铁蛋白结构基因的b 亚基 n f黄素氯还蛋白，为铁蛋白的生理还原剂 一 丙酮酸黄素氧还蛋白- 氧化还原酶把丙酮酸的氧化与黄素氧还蛋白的还 。 原偶联起来 n i g 活化铁蛋白 删v功能未知似乎主要与铁蛋白的稳定有关 删s功能未知，似乎主要与铁蛋白的稳定有关 一沙编码高柠糠酸合成酶 n 霹铁钼辅因子生物台成所必须，与h 基因产物形成n2b2 四聚体 n f 铁钼辅因子生物合成所必须。与”归基因产物形成42b2 四聚体 n f 曰 铁钼辅因子生物合成所必须 i f q与铁铝辅因子生物合成有关，可能作用于早期的步骤 月扩矽功能未知，铁钼蛋白的完整性所必须 一z功能未知，铁钼蛋白的完整性所必须 叻彳 n i f 基因转录激活蛋白 删zn i f a 负调节蛋白 n i x功能未确定，可能为负调节因子 砷甲功能未知，为同氮生物生长的非必须因子 砷甲 功能未知与n i f h d km r n a 稳定性有关 中闺农业人掌硕i 学位论义 1 和虱蔼涮氮训节研究进腱 1 2 2 固氟酶结构基因( n i f h d i o 操纵子的表达 n i f l t d k 基网的转录需要eo ”、激活蛋白n i f a 和i h f 冈子的参与，在转录起始位点上游- 2 7 至1 i 之间具有c t g g n 8 一t t g c a 的保守序列，该区域由r n a 聚合酶因子o ”识别，被称为d p e ( d o w s t r e a mp r o m o t e re l e m e m ) 。转录激活蛋白n i f a 结合在d p e 序列上游1 0 0 b p 处，即u a s ( u p s t r e a m a c t i v a t o r s e q u e n c e ) 。它有一个高度保守的反向重复序列( 5 - t g t - n 1 0 - a c a 一3 ) ，通常 在距转录起始位点上游8 0 1 5 0 核苷酸处。u a s 的作用可能是增高n i f a 在2 4 - 1 2 启动子附近结合 的浓度或使n i f a 以正确的方向结合，以利于n i f a 与o - ”r n a 聚合酶复合体的相互作用。u a s 的 位置并不很严谨，它在d p e 上游2 k b 以上仍有明显的活性( p a u la n dm e r r i c k ，1 9 8 7 ) 。u a s 的1 g t 和a c a 中间1 0 b p 间隔区内任何缺失或插入突变均降低其启动子活性( b u c ke la 1 ，1 9 8 7 ) ，当将 其换成转录激活蛋白n t r c 的结合位点后依赖于n t r c 的启动子活性增加l o 倍，说明启动子激 活蛋白的特异性明显的依赖于相应序列的存在。激活蛋白与o ”相互作用需要i h f 的帮助。i h f 与e c o l i 的一样，在这一转录激活系统中的作用也是使d n a 产生一个折叠，从而促使结合于u a s 上的n i f a 与结合于d p e 上的e a “发生相互作用。已证实其它许多固氨菌的硇汀启动子区都可 结合i h f ，这说明i h f 并非肠杆菌所独有，它可能在革兰氏阴性菌中广泛存在( h o o v e re ta t ， 1 9 9 0 ) 。 转录起始过程描述为：e o ”结合于d p e 上、n i 谯与u a s 结合、n - i f 结合于两者之间的i h f 结合位点上，使得d n a 回折，导致激活蛋白n i f a 与e o ”空间上接近，并发生相互作用，n i f a 水解a t p 使闭合的转录复合物空间构象变化成开放的复合物起始转录。见1 2 。这一转录方式在 固氮菌中普遍存在，但也有不少例外( h o o v e r e t a l ，1 9 9 0 ) 。e 矿4 与d p e 的亲和力、u a s 的有无、 i h f 结合位点的有无及其在d p e 和u a s 之间的相对位置等，均影响启动予的转录活性( m o m t c a n d b u c k , 1 9 8 9 ；s a n t e r oe ta 。1 9 9 0 ) 。在非固氮条件下，负调节蛋白n i f l 与n i f a 蛋白结合使其使去 活性，不能与r a f h d k 基因的u a s 结合因此n i f t i d k 基因不能表达。因此五p n e u m o n i a en i f t t d k 基因的合成受到铵和氧的严格调节。是通过调节转录激活蛋白n i f a 的合成和活性来实现的。 另外，固氮酶结构基因的m r n a 异常稳定，半衰期达2 0 _ q 0 分钟，但在铵或氧存在或温度 较高时均会引起m r n a 迅速降解。其调节机制尚不清楚，可能与h ，y 基因产物有关( s i m o n1 9 9 9 ) 。 d _ 一 芦h 陶l _ 2 n i f a 激活转录模式图( d i x o ne t a l ，1 9 9 5 ) f i g1 2p a t h w a yo f t r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o nb yn i f a 3 一 巾删水业人学坝j 。学位论义 j 均氮蔺j 司氯涮节驯究进腱 1 23 调节基因( n i f l a ) 操纵子的表达调节一n t r b 和n t r c 双元调节系统 在丘p n e u m o n i a e 中n l f l 4 组成一个操纵元，其转录是n t r c - o ”依赖型。在限氨条件f ，n t r c - p i 激活e a “形成开放复合物转录h f 月。n t r c 是与n i f a 在结构上很相似( b u i k e m a e t a l ，1 9 8 5 ； d r u m m o n de l a l 。1 9 8 6 ) 的e o ”依赖型启动子的转荣激活蛋白。 铵对n i f a 的合成是通过n t r 系统起作用的。n t r 系统( g e n e r a ln i t r o g e nr e g u l a t i o ns y s t e m ) 广泛存在丁细菌中，通过感受细胞内n h 。+ 的浓度，控带q 包括固氮过程在内的有关氮代谢的许多 基因的表达。该系统由四种蛋白组成：g t n o 基因编码的双功能蛋白酶g i n d ( 亦称u t a s e u r ，脲 苷酰转移酶水解酶) ，g l n b 基因编码的p 蛋白( 亦称g i n b ) 以及n t r b c 基因编码的双组分调节 蛋白n t r b 和n t r c 。 g i n d 和p 是细胞内n i - 1 4 + 的初级感受蛋白，g i n d 通过感受胞内的谷氨酰胺( 氨信号) ，u 一 酮戊二酸( 碳信号) 的比值来调节自身活性。行使腮苷酰转移酶或脲苷酰水解酶的功能，来调节 p l i 蛋白的活性( j i a n gp ，1 9 9 8 ) p 蛋白可在自身t y p l 位点进行脉苷酰化或脱脲苷酰化，并通 过结合a t p 、u 酮戊二酸、谷氨酸等小分子配体改变自身活性。直接调节n t r b 和腺苷酰转移酶 a t a s e ( 亦称g i n e 由g l n e 基因编码) 的活性。 n 廿b c 是对典型的双组分调节系统，n t r b 为感应蛋白( s e n s o rk i n a s e ) 具有磷酸激酶和磷 酸水解酶双功能可感知环境因子( 如p 蛋白) 的信号，并相应地催化自身以及n t r c 蛋白的磷 酸化、或者n t r c 蛋白的脱磷酸化反应；而n t r c 为效应蛋白( r e s p o n s er e g u l a t o r ) ，其磷酸化形式 具转录激活活性。可以使一系列0 “依赖型启动子起始转录。 正p n e t a n o n i a e 中的h 弘基因转录受铵的调节的规律可以总结为：在细胞内氮素丰富条件下， 浓度相对较高的谷氨酰胺分子可与g i n d 结合。激活g i n d 的脲苷酰水解酶活性进而使p n - u m p 脱取苷酰化i 此时，a 酮戊二酸浓度相对较低，1 分子的n 酮戊二酸与p 结合，这个构象下的 p i i 与n t r b 结合，并激活n t r b 的磷酸水解酶活性，使n t r c - p i 脱磷酸化，n t r c 蛋白失去激活作用， 从而关闭一系列包括n i 皿 在内的n t r c - 0 ”依赖型的基因的表达。当细胞内的氮素消耗到一定程 度o 酮戊二酸浓度提高，p 的3 个亚基均被口酮戊= 酸结合。此时p 肛不能与n l r b 结合，释 放了n a b 的磷酸激酶的活性，n i r b 激活自身磷酸化。并进一步激活n t r c 的活性，n t r c p i 激活 包括h 犯一在内n i r c - o “依犊型的基因的袭达。同时，p 被g l n d 脲苷酰化，p i r u m p 激活a 1 砸e 的腺苷酰水解酶活性，使谷氨酰胺合成酶g s ( 亦称g t n a 由g l n a 基因编码) 脱腺苷酰化，脱 腺苷酰化的g s 恢复活性迅速同化n h 4 + ，补充细胞内的氮素。但细胞内的氮索升到合适水平时， p l l - u m p 被脱腮苷酰化，a 1 趣e 的黥苷酰转移酶活性起作用，使g s 腺苷酰化，失去活性，停止同 化铵反应：p h 又激活n t r b 的磷酸水解酶活性，使n t r c 失活，关闭产生铵的代谢。这样，n t r 系 统调节着细胞c n 代谢的平衡，实现细菌的最优生长。 氧是通过改变启动子区域d n a 超螺旋及r n a 聚合酶全酶的活性来调节砷蚴基因的转录的 ( d i x o n r a e l a l ，1 9 8 8 ) 。 1 2 4n i f a 正调节蛋白与n i f l 负调节蛋白之间的相互作用 正调节蛋白n i f a 有三个结构域。n 端结构域变异较大( 1 6 4 - 2 1 6 个氮基酸) 氨基酸序列保 守性很低，与n i f a 活性调节有关( d r u m m o n de ta l ，1 9 9 0 ) i 中间结构域含2 4 0 个氨基酸在全 4 中闰农业人学坝t - 学位论文 氮菌氨渊节研究进展 跃范同内都有很高的保守性，这是转录激活蛋白家族中的典型特征，这一绱构域是所有具有o ” 依赖型启动子的激活蛋白的特征结构域，如尼p n e u m o n i a e 的n t r c 蛋白、尼m e l i l o t i 的d c t d ( r o n s o n p ，口，1 9 8 7 ) 等，它可能与o “( r n a 聚合酶识别因子) 相互作用，同时这一结构域还能与n i f l 直接相互作_ l i j ( g a v i n ie ta l1 9 9 9 ) 。与n t r c 类似，它有一段高度保守的氨基酸序列g e s g t g k e ， 这在许多a t p 结合蛋白中都存在在起始转录过程中伴随有a t p 的水解( k u s t u “a , ，1 9 8 9 ) 这 种a t p 的结合与水解是所有o “依赖型启动子的激活蛋白起始转录时的共同特征( p o p h a me t a l ， 1 9 8 9 ) ：连接n 端与中间结构域的区域称为q - l i n k e r ( w o o a o na n dd r u m m o n d ，1 9 8 9 ) ， 殳度大约 1 5 2 5 个氨基酸，它富含谷氨酰胺残基和其它亲水氢基酸，是细菌信息传递系统的调节蛋白中普 遍存在的一个区域，但该区域插入或缺失突变并不影响n i f a 的活性，可能它只起连接作用；c 端结构域含有一个典型的h t h 结构其长度在不同的菌中变化较大，这一区域可能是n i f a 与 d n a 结合部位( m o r c t t ，1 9 8 8 ) 。在中间结构域与c 端结构域之间是一个可交区，不同的n i f a 分 别含有3 0 7 5 个氨基酸不等，与氧敏感型有关。k p n e u r a o n i a en i f a 的这一连接部分的氨基酸序列 中不具有c x i i - - c - - x l o - - c - - x 4 一c 结构因此其n i f a 属于氧不敏感的( f i s h e re ta 1 9 8 8 ； k u l l i k e t a l 1 9 8 9 ) 。 n - t e r m i n a ld o m a i n c e n t r a lc - t e r r a i n a l 图1 - 3n i f a 蛋白结构示意圈 f i g l - 3c i r e u i t r yo f n i f a s t r u c t u r e 负调节蛋白n i f l 由两个结构域组成，之阀由亲永氨基酸连接( h y d r o p h i l i ci n t e r d o m a i nl i n k e r , q - l i n k e r ) ( 图1 4 ) 。c - 端结构域与组氨酸激酶有同源性。n 端结构域含有类p a s 区中的保守的s 构型，这种结构通常与环境氧还信号的感应和传导有关s c h m r z 等( 1 9 9 6 ) 发现k p 和a v 的 n i t l 是一个黄素蛋白，n 端结合了f a d ( f l a v i na d e n i ed i n u c l e o t l d e ) 辅因子，说明n i f l l 是氧还敏 感的调节蛋白。n i f a 蛋白的活性是通过n i t l 蛋白直接或间接地感受铵和氧状态来调节的 ( s o d e r b a c k1 9 9 8 ) 。 q - i n k e p sd o m a i n a t pb i n d i n g 图1 - 4 k p n e u m o n i a e 中n i f l 结构( s c h m i t ze t a l 2 0 0 2 ) f i g i - 4c a r t o o no fkp n e u m o n 抽en i f ls t r u c t u r e t h en u m b e r sr e f e rt ot h ep r i m a r ya c i ds e q u e n c eo fk p n e u m o n i a en i f lp r o t e i na n dm a r kt h ea p p r o x i m a t eb o u n d a r i e so fi t sn t e r m i n a la n dc t e r m i n a ld o m a i n st h e l o c a t i o n so f t h eq - l i n k e r , t h ep a sd o m a i n ，a n dt h ea p p a r e n ta t ps i t ea r ei n d i c a t e d 5 【 l 旧农业人学坝卜学位论史i 州氮菌l 村鲺侧节 i j | 究i 上腱 在柯铵或有氧的条件f ，n ；f l 抑制n i f h 的活性但途径不相同( 划l 。5 ) 。有铵耐，n i i l 与 n i f a 相结合通过直接的蛋白作_ i j 使之无活性。已在体外分离到n i f l 与n i f a 的聚合体，并通 过酵母烈杂合系统和免接兆沉淀法体外分析验证了二者的结合作i j 。n i l l 的c - 端与n i f a 的中间 结构域结台抑制n i f a 蛋白与e o ”相互作用，使其失去活性( l e i1 9 9 9 ；m o n e y1 9 9 9 ) 。在固氮 条什f ，n i f l 与n i f a 解离，