（微生物学专业论文）遗传改造zymomonas+mobilis代谢木糖及其木糖醇产生机制的研究.pdf

山东大学博士学位论文 摘要 资源和环境问题是人类当前面临的最主要的挑战。生物资源是地球上最丰富 的可再生性资源。随着矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资 源的微生物技术，生产生物燃料，具有极其重要的意义和光明的发展前景。木质 纤维素原料转化生产燃料酒精是被公认为最有发展前景的可再生清洁能源技术 之一。木糖是继葡萄糖之后自然界中最丰富的糖分，在木质纤维原料水解液中占 3 0 左右。因此，木糖的有效生物转化利用是实现木质纤维素转化生产乙醇的关 键之一。 属于厌氧型细菌的运动发酵单胞菌( z y m o m o n a sm o b i l i s ) 是自然界中迄今 为止唯一已知的将丙酮酸脱羧酶及乙醇脱氢酶与独特的e n t e r - d o u d o r o f f ( e d ) 糖酵解途径相偶联高效产生乙醇的微生物。它具有酒精产率高、酒精耐受力强、 副产物少等优点。但与酿酒酵母相似，运动发酵单胞菌的底物利用范围有限，除 葡萄糖、果糖和蔗糖外，由于自身缺少必要的木糖代谢途径而无法利用木质纤维 素水解产生的木糖等戊糖成分，从而限制了其在酒精发酵生产中的应用。虽然之 前已有成功地遗传改造运动发酵单胞菌使其代谢利用木糖的研究报道，但由于所 构建重组茵大多受专利保护，且在发酵过程中存在着副产物木糖醇抑制、木糖运 输速率低、胞内能量丢失等问题的影响，使其代谢利用木糖产乙醇的效率不是很 高。因此本论文拟通过代谢工程手段改造运动发酵单胞菌以获得能够代谢利用木 糖的重组菌株，并以此为基础，阐明副产物木糖醇的形成机制；初步构建葡萄糖 促扩散蛋白介导木糖运输机制分析及进化改造的平台，为进一步改进菌株的木糖 发酵性能奠定基础。 本论文的主要研究内容如下： 1 遗传改造zm o b i l i s 代谢利用木糖 对自然界中能够利用木糖的微生物代谢途径研究发现，木糖可通过磷酸戊糖 途径而与e d 途径相偶联，其中木酮糖是磷酸戊糖途径的一个重要中间产物。 木酮糖可以进一步通过木酮糖激酶、转酮酶和转醛酶的作用而进入e d 途径生 山东大学博士学俯论文 成酒精。运动发酵单胞菌正是因为缺少相关的磷酸戊糖途径成分而无法代谢利用 木糖。因此，本文通过代谢工程手段，将负责木糖代谢转化的木糖异构酶基因 朋) 和木酮糖激酶基因( 砂舾) 置于强组成型启动子3 - p 甘油醛( p g a p ) 下；同 时将负责木糖转化利用的转醛醇酶( t a l b ) 和转酮醇酶基因( t k t a ) 置于强组成 型启动子烯醇酶( p e n o ) 下，通过电转的方式将上述四个基因转入到z y m o m o n a s m o b i l i sc p 4 中，从而在运动发酵单胞菌中构建起一套完整的木糖代谢途径。实验 结果表明，重组运动发酵单胞菌显示出所有四种酶的活性，由此获得一株能够代 谢利用木糖的重组菌株zm o b i l i sc p 4 ( p b b r x y l ) 。 2 重组菌zm o b i i sc p 4 ( p b b r - x y i ) 木糖发酵测试 对构建的重组菌zm o b i l i s ( p b b r x y l ) 木糖发酵能力进行- j n 试。在3 2 葡萄糖和3 4 木糖( 发酵液中实际糖浓度) 混合碳源条件下发酵，重组菌最终 产生1 9 5 l 乙醇。其中，木糖利用率为3 2 3 ，总糖利用率为6 5 3 6 ，乙醇 产率为理论值( 以总糖计算) 的5 7 6 。本论文构建的重组菌虽然可能受副产物 木糖醇抑制、木糖运输、胞内能量等因素的影响不能高效代谢木糖产乙醇，但是 具有了代谢利用木糖产乙醇的能力，为进一步通过其它手段包括代谢组学分析， 调整改进细胞整体代谢流向及能量与氧化还原状态平衡，从而改进菌株的木糖发 酵性能奠定了一个良好的基础。 3 副产物木糖醇形成机制的研究 我们通过h p l c 分析发酵产物时，在有木糖作为碳源的发酵液中检测到了木 糖醇的生成( 约1 2 9 l ) 。据相关研究报道分析，副产物木糖醇在木酮糖激酶 ( x y z b ) 的作用下会生成5 - p 木糖醇，而5 - p 木糖醇的积累对细胞的生长有很大的 毒害作用。当发酵液中木糖醇的添加浓度达到5g l 时，重组菌的生长就被完全 抑制。因此，木糖醇的形成累积是影响重组菌菌体生长速率、菌体量和乙醇产量 的重要因素之一。但到目前为止，zm o b i l i s 中木糖醇的产生机制尚不清楚。 通过研究发现，zm o b i l i s 中的葡萄糖果糖氧化还原酶( g f o r ，广泛存在于 周质空间中并催化果糖还原生成山梨醇) 介导了木糖还原生成木糖醇的反应 ( 产山梨醇v s 产木糖醇的比酶活为6 8 3 9i t m o lm i n - 1m g 1v s1 1 0 2i t m o lm i n 1 2 山东大学博十学位论文 m g 。1 ) 。g f o r 对木糖的作用机制总体上类似于其将果糖还原生成山梨醇的乒乓反 应机制，但在某些细节上又有所不同：反应过程中，木糖醇的产量随底物浓度的 变化曲线呈现典型的“s 型曲线，并且其协同系数为2 ，遵循正协同反应机制； 进一步研究发现葡萄糖、果糖和木糖竞争同一个底物结合位点；通过对突变体 y 2 6 9 f 和s 11 6 d 的酶活研究发现，其以葡萄糖和木糖为底物反应的变化趋势与 以葡萄糖和果糖为底物反应的变化趋势完全一致，由此说明g f o r 催化木糖还 原的分子机制和催化果糖还原的分子机制是相同的。g f o r 体外催化木糖还原生 成木糖醇的发现，暗示了它是zm o b i l i s 中木糖醇生成的重要途径。美国国家能 源部于2 0 0 8 年1 1 月的相关申请专利( u s p t op a t e n ta p p l i c a t i o n ：2 0 0 8 0 2 8 6 8 7 0 ) 从遗传学角度发现木糖醇主要是由g f o r 所介导产生的，并且报道g f o r 缺失 的重组菌对木糖的利用率明显增加，乙醇的产量也显著提高。通过本论文的体外 研究实验和美国国家能源部的体内实验可以确认，在z m o b i l i s 中，g f o r 是 介导木糖醇产生的主要途径。通过消除副产物木糖醇的影响，应该可以显著提高 重组菌的木糖利用率和乙醇产量。 4 葡萄糖促扩散蛋白介导木糖运输机制分析及进化改造平台初建 研究发现，代谢利用木糖的重组运动发酵单胞菌中木糖和葡萄糖都是在葡萄 糖促扩散蛋白( g l u c o s ef a c i l i t a t o rp r o t e i n ，g l f ) 的协助下，在不需要消耗a t p 的条件下以促进扩散的方式进入胞内的，但由于g l f 对葡萄糖的亲和力嘛= 4 1r a m ) 大于对木糖的亲和力= 4 0m m ) ，所以在葡萄糖和木糖同时存在时， g l f 可能会优先运输葡萄糖，待葡萄糖代谢消耗完毕之后才开始运输木糖，从 而影响木糖的利用速率和乙醇的产率。已知g l f 是运动发酵单胞菌向胞内运输 糖类的唯一载体，推测其在运动发酵单胞菌的木糖运输方面也起着重要作用。 本文通过同源重组将大肠杆菌z s c l1 2a p t s h i - c r r ( 由于缺少p t s 系统相关 酶及葡萄糖激酶而既不能运输也不能磷酸化葡萄糖) 中与木糖转运相关的砂垆、 x y l g 和x y l h 基因敲除，获得了一株既不能转运利用葡萄糖也不能转运利用木糖 的缺陷型菌株z s c l1 2ap t s h i - c r r - x y l f g h ；并进一步将运动发酵单胞菌的 g l f g l k ( 葡萄糖促扩散蛋白葡萄糖激酶) 基因转入上述缺陷菌株中，得到的 重组菌能重新利用葡萄糖和木糖生长，这说明运动发酵单胞菌中的g f 和批可 3 山东大学博十学位论文 在功能上弥补大肠杆菌中的葡萄糖转运( p t s 途径) 的缺陷；此外，在木糖转运 途径( x f l f g h 缺失) 被阻断的情况下，g 矿能够弥补大肠杆菌中木糖转运途径的 缺陷，这直接证明了g g 能够介导木糖的转运。由此我们得到了一株葡萄糖和木 糖代谢缺陷型的z s c l1 2a p t s h i - c r r - x y l f g h 菌株，并通过将运动发酵单胞菌的 g l f g l k ( 葡萄糖促扩散蛋白葡萄糖激酶) 基因转入到缺陷菌株从而构建了一 株便于研究g l f 不同糖转运特性的模式菌株。此菌株为进一步对通过化学诱变 或易错p c r 方法构建的g l f g l k 突变库进行筛选，以获得能同时高效吸收利 用葡萄糖和木糖的g l f 突变蛋白打下了良好的基础。 关键词：z y m o m o n 船m o b i l i s ；木糖；葡萄糖果糖氧化还原酶；木糖醇；葡萄促 扩散蛋白 4 山东大学博七学位论文 a b s t r a c t t h e o i lc r i s i s a n de n v i r o n m e n tp o l l u t i o n b yr a p i de c o n o m ys o c i e t y d e v e l o p m e n t c a u s e dc o n c e r n sa b o u t p r o b l e m s o fr e s o u r c e d e p l e t i o n a n d e n v i r o n m e n t a lg l o b a l l yd e t e r i o r a t i n g f u e le t h a n o li sf o u n dt ob eo n eo ft h er e n e w a b l e a n dc l e a ne n e r g ys o u r c e s t h e r ea r ea b u n d a n tl i g n o c e l l u l o s i cf e e d s t o c k so nt h ee a r t h ， h o w e v e rt h ec h e a pr e s o u r c ei sn o tu t i l i z e de f f e c t i v e l y l i g n o c e l l u l o s i cf e e d s t o c k sa r e c o m p o s e dp r e d o m i n a n t l y o fc e l l u l o s e ，h e m i c e l l u l o s ea n dl i g n i n x y l o s ei st h e p r e d o m i n a n tp e n t o s es u g a rd e r i v e df r o mt h eh e m i c e l l u l o s ea n di sa b o u t3 0 i nt h e l i g n o c e l l u l o s eh y d r o l y s a t e s ，w h i c hi st h es e c o n dp l e n t i f u ls u g a r a f t e rg l u c o s ei nn a t u r e c o n s e q u e n t l y ，t h ee f f i c i e n tb i o c o n v e r s i o no fx y l o s ei so n eo ft h em a j o rk e y sf o r e f f i c i e n tu t i l i z a t i o no fl i g n o c e l l u l o s i ch y d e o l y s a t e st op r o d u c ef u e le t h a n 0 1 t h eg r a m n e g a t i v ez y m o m o n a sm o b i l i si st h eo n l ym i c r o o r g a n i s mk n o w na st h e n a t u r a le t h a n o l o g e n i cb a c t e r i u mc o n v e r t i n gg l u c o s et oe t h a n o la th i g he f f i c i e n c i e sb y t h eu n i q u ee n t n e r - d o u d o r o f fp a r t h w a yw h i c hi sc o u p l e dt op y r u v a t ed e c a r b o x y l a s e a n da l c o h o ld e h y d r o g e n a s e t h i so r g a n i s md e m o n s t r a t e sm a n yo ft h et r a i t ss o u g h ti n a ni d e a lb i o c a t a l y s tf o rf u e le t h a n o lp r o d u c t i o n ，s u c ha sh i g he t h a n o ly i e l da n d t o l e r a n c e ，h i g l l f e r m e n t a t i o n s e l e c t i v i t ya n ds p e c i f i cp r o d u c t i v i t y h o w e v e ri t s s u b s t r a t er a n g ei sr e s t r i c t e dt ot h ef e r m e n t a t i o no fg l u c o s e ，f r u c t o s ea n ds u c r o s e ，a n d 弱s u c h ，w i l d - t y p es t r a i n sa r eu n a b l et of e r m e n tt h ep e n t o s es u g a r sd e r i v e df r o m l i g n o c e l l u l o s i cf e e d s t o c k sb e c a u s et h e yl a c kt h ee s s e n t i a lp e n t o s ea s s i m i l a t i o na n d m e t a b o l i s mp a t h w a y s c o n s e q u e n t l y ，m e t a b o l i ce n g i n e e r i n go fx y l o s ef e r m e n t a t i o no f zm o b i l i si sa ne s s e n t i a ls t e pt o w a r dd e v e l o p m e n ta sab i o c a t a l y s tf o rf u e le t h a n o l p r o d u c t i o nf r o ml i g n o c e l l u l o s i cf e e d s t o c k s a l t h o u g ht h e r eh a sb e e ns u c c e s si n e n g i n e e r i n gzm o b i l i sf o rx y l o s em e t a b o l i s m ，t h es t r a i n sd on o tg r o wa n dp r o d u c e e t h a n o l 勰w e l lo nx y l o s ea so ng l u c o s ef o rt h er e a s o n sl i s t e db e l o w ：t h eg r o w t h i n h i b i t e db yb y - p r o d u c tx y l i t o l ，t h es l o wr a t eo fx y l o s ea s s i m i l a t i o na n dm e t a b o l i s m ， t h el o s so fc a r b o na n de n e r g ya n ds oo n i nt h i ss t u d y ，w ed e v e l o p e da 5 山东大学博士学位论文 x y l o s e - f e r m e n t i n g s t r a i no fzm o b i l i sa n do nt h i sb a s i s ，c l a r i f i e dt h ex y l i t o l m e c h a n i s ma n db u i l dt h ep l a t f o r mf o rg e n e t i ce v o l u t i o no fg l u c o s ef a c i l i t a t o rp r o t e i n ， p r o v i d e dt h ef o u n d a t i o no fi m p r o v i n g t h ep r o p e r t i e so fx y l o s e f e r m e n t i n g t h em a j o r r e s u l t so ft h et h e s i sa r ea sf o l l o w s ： 1 m e t a b o l i ce n g i n e e r i n go f z y m o m o n a sm o b i l i sf o rx y i o s eu t i l i z a t i o n x y l o s ec o u l de n t e rt h ee dp a t h w a yb yp e n t o s ep h o s p h a t e x y l u l o s e 一5 - pi st h e i m p o r t a n ti n t e r m e d i a t ep r o d u c ta n di tc a nb ec a t a l y z e db yx y l u l o k i n a s e ，t r a n s a l d o l a s e a n dt r a n s k e t o l a s e 向n h e r a n dt h e ne n t e re dp a t h w a yf i n a l l y z m o b i l i sl a c k st h e e s s e n t i a lp e n t o s ea s s i m i l a t i o na n dm e t a b o l i s mp a t h w a y s c o n s e q u e n t l y , i nt h i ss t u d y w ei n t r o d u c e dg e n e st h a te n c o d et h ex y l o s ei s o m e r a s e ( x y a ) a n dx y l u l o k i n a s e ( 砂硒 p r e c i s e l yu n d e rt h ec o n t r o lo fas t r o n g , c o n s t i t u t i v eg l y c e r a l d e h y d e s - 3 - 。p h o s p h a t e ( g a p ) p r o m o t e rb yp c r - m e d i a t e do v e r l a pe x t e n s i o n ，w h i c hi si nc h a r g eo fx y l o s e a s s i m i l a t i o n ；a n da l s ow ei n t r o d u c e dg e n e st h a te n c o d et h et r a n s a l d o l a s e ( t a b ) a n d t r a n s k e t o l a s e ( t k t a ) p r e c i s e l yu n d e rt h ec o n t r o lo fe n o l a s e ( e n o ) p r o m o t e r ，w h i c h i s i nc h a r g eo fx y l o s eu t i l i z a t i o n ，t h e nt r a n s f o r m e dp l a s m i dw i t ht h et w oo p e r o n si n t oz m o b i l i s t h u sw ec o m p l e t e dap e n t o s ep h o s p h a t ep a t h w a yi nzm o b i l i s e n z y m a t i c a n a l y s e so fr e c o m b i n a n tz m o b i l i sd e m o n s t r a t e dt h ep r e s e n c eo ft h ef o u re n z y m e s a c t i v i t i e s ，t h e r e b y w ed e v e l o p e dax y l o s e f e r m e n t i n gs t r a i no fzm o b i l i sc p 4 ( p b b r x y l ) 2 f e r m e n t a t i o np e r f o r m a n c eo fr e c o m b i n a n tzm o b i l i sc p 4 ( p b b r - x y l ) w i t h x y l o s e t h er e c o m b i n a n tzm o b i l i sc p 4o b b r x y l ) p r o d u c e d19 5 鲫e t h a n o lf r o m 3 2 o fg l u c o s ea n d3 4 o fx y l o s ew i t h i n6 0 h ，t h ex y l o s eu t i l i z a t i o nr a t ei s3 2 3 ， a n dt h et o t a ls u g a ru t i l i z a t i o nr a t ei s6 5 3 6 ，i ta c h i e v e d5 7 6 o ft h e o r e t i c a le t h a n o l y i e l df r o mg l u c o s ea n dx y l o s e a l t h o u g ht h er e c o m b i n a n ts t r a i nw ed e v e l o p e dc o u l d n o tc o n v e r tx y l o s et oe t h a n o lw i t hh i g h - e f f i c i e n tb e c a u s eo ft h eg r o w t hi n h i b i t e db y b y - p r o d u c tx y l i t o l ，t h es l o wr a t eo fx y l o s ea s s i m i l a t i o na n dm e t a b o l i s m ，t h el o s so f 6 山东大学博+ 学位论文 c a r b o na n de n e r g ya n ds oo n ，i th a st h ea b i l i t yt oc o n v e r tx y l o s et oe t h a n o l ，a n di t p r o v i d e dt h ef o u n d a t i o no fi m p r o v i n gt h ep r o p e r t i e so fx y l o s e f e r m e n t i n gt h r o u g h e v e r ym e a n ss u c ha sm e t a b o n o m i c s 3 m e c h a n i s mo fc a t a l y z e df o r m a t i o no fx y l i t o li nzm o b i l i s x y l i t o lh a sb e e ns h o w n t ob eam a j o rb y - p r o d u c to fx y l o s em e t a b o l i s mc a u s i n g s i g n i f i c a n tg r o w t hi n h i b i t i o no fr e c o m b i n a n ts t r a i n sb yk i me ta 1 t h e yf o u n dt h a t o n l yt h er e c o m b i n a n ts t r a i nw a sg r o w t hi n h i b i t e dw i t ha d d i t i o no fx y l o s e ，a n dt h i s r e s u l t e df r o mt h ea c c u m u l a t i o no fx y l i t o lp h o s p h a t ed u et oas i d er e a c t i o ne f f e c t e db y ac l o n e dx y l u l o k i n a s e f u r t h e r m o r e ，k i me ta 1 f o u n da b o v ec o n c e n t r a t i o n so f5go f x y l i t o lp e rl i t e r ，r e c o m b i n a n ts t r a i n sc o u l dn o tg r o wa ta 1 1 p r o d u c t i o no fx y l i t o la n d t h er e s u l t i n gg r o w t hi n h i b i t i o nb yx y l i t o lp h o s p h a t eh a v eb e e nc o n s i d e r e dt ob eo n eo f t h ei m p o r t a n tf a c t o r sa f f e c t i n gt h er a t e sa n dy i e l d sf r o mx y l o s em e t a b o l i s mb yt h e r e c o m b i n a n tz y m o m o n a sm o b i l 西，b u tt h em e c h a n i s mo fx y l i t o lf o r m a t i o ni sl a r g e l y u n k n o w n i nt h i s s t u d yw ef o u n dt h a tg l u c o s e - f r u c t o s eo x i d o r e d u c t a s e ( g f o r ) ，a p e r i p l a s m i ce n z y m er e s p o n s i b l ef o rs o r b i t o lp r o d u c t i o n ，c a t a l y z e dt h er e d u c t i o no f x y l o s et ox y l i t o li nv i t r oo p e r a t i n gv i aap i n g - p o n gm e c h a n i s ms i m i l a rt ot h a ti nt h e f o r m a t i o no fs o r b i t 0 1 h o w e v e r ，t h ev e l o c i t yo fx y l i t o lf o r m a t i o nw a sm u c hl o w e rt h a n t h a to fs o r b i t o l ( 1 2 7m m o l1 1h - 1v s5 7 4 5m m o l1 。1h 1 ) ；x y l i t o lf o r m a t i o na td i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fx y l o s ed e m o n s t r a t e dat y p i c a ls i g m o i d a lc u r v ew i t hah i l l c o e f f i c i e n to fa b o u t2 ，i m p l y i n gt h a tas u b s t r a t e i n d u c e dc o n f i g u r a t i o nc h a n g e o c c u r r e dw i t hg f o r d u r i n gi t sc a t a l y z e dr e d u c t i o no fx y l o s e ；p i n g p o n gk i n e t i c sw a s o b s e r v e df o rg f o ri nc a t a l y z i n gt h ef o r m a t i o no fx y l i t o lw i t hp a r a l l e ls i g m o i d a l c u r v e sw h e nt h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o n so f x y l o s e v a r i e d a g a i n s t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fg l u c o s e ，s u g g e s t i n gas i m i l a rb i n d i n gc o m p e t i t i o ne x i s tb e t w e e n x y l o s ea n dg l u c o s e ；w h i l ec h a n g eo ft h ep o t e n t i a la c i d b a s ec a t a l y s tt y r 2 6 9t op h e a l m o s tc o m p l e t e l ya b o l i s h e dt h ea c t i v i t yt o w a r dx y l o s ea sw e l la sf r u c t o s e ，m u t a n t s116 d ，w h i c hh a sb e e ns h o w nt ol o s et i g h tc o f a c t o rb i n d i n g , d i s p l a y e da l le v e n 7 山东大学博士学位论文 s l o w e rc a t a l y t i cp r o c e s sa g a i n s tx y l o s e o v e r a l l ，t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a ts i m i l a r c a t a l y t i cm e c h a n i s m sw e r ea d o p t e db yg f o rd u r i n gt h er e d u c t i o no ff r u c t o s ea n d x y l o s e w h i l ew h e nw ep r e p a r e dt os t u d y nv i v of u r t h e ra f t e ro u rp a p e rp u b l i s h e d ，w e f o u n da p a t e n ta p p l i c a n t i o np u b l i s h e db yn r e l o n2 0 0 8n o v a tt h es a m et i m e ，w h i c h r e p o r t e dx y l i t o lp r o d u c t i o n i nx y l o s em e t a b o l i z i n gzm o b i l i si sp r e d o m i n a n t l y m e d i a t e db yt h ee n z y m eg l u c o s e f r u c t o s eo x i d o r e d u c t a s e ( g f o r ) a n dt h eg f o r k n o c k o u tm u t a n tc o n s u m e d m o r e x y l o s e a n dp r o d u c e d s i g n i f i c a n t l yh i g h e r c o n c e n t r a t i o n so fe t h a n 0 1 s ot h e ya p p l i e df o rp a t e n tp r o t e c t i o nf o rt h et e c h n o l o g ya n d c o n t e n t si nl i g h to fp o t e n t i a li n d u s t r i a l i z a t i o n s ow i t ho u rs t u d y nv i t r oa n dn r e l s s t u d y nv i v ow ec o n f i r mt h a ti ti sg f o r t h a tc a t a l y z er e d u c t i o no fx y l o s et ox y l i t o li n zm o b i l i s 4 p l a t f o r mf o r a n a l y s i s o f g l u c o s e f a c i l i t a t o r p r o t e i nm e d i a t e dx y l o s e t r a n s p o r t i n ga n dg e n e t i ce v o l u t i o n t h eg l u c o s ef a c i l i t a t o rp r o t e i n ( g l f ) o fz m o b i l i sw a sf o u n dt op l a yi t sp a r ti n g l u c o s eu p t a k ea n da l s ow i t hx y l o s eu p t a k ei nan o n - 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g l k b yc h e m i c a lm u t a g e n e s i so re r r o r - p r o n ep c r k e yw o r d s ：z y m o m o n a sm o b i l i s ；x y l o s e ；g l u c o s e - f r u c t o s eo x i d o r e d u c t a s e ；x y l i t o l ； g l u c o s ef a c i l i t a t o rp r o t e i n 9 山东大学博士学位论文 缩略词表( a b b r e v i a t i o n ) l o 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研