（微生物学专业论文）改性壳聚糖交联微球的合成及其蛋白吸附性能的研究.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 目的：开发新的高分子微球材料，用作蛋白分离纯化的层析固定相。 方法：以壳聚糖( c t s ) 为原料，分别与氯乙酸和环氧丙基三甲基氯化铵 ( g t a ) 反应，制备n ，o 一羧甲基壳聚糖( c m c t s ) 和氯化三甲基壳聚糖季铵 盐( h a c c ) ，然后通过乳化戊二醛交联得到c m c t s 和h a c c 微球，优化了 反应条件并对合成的微球性能做了表征。 主要研究内容及结论如下： 1 以c m c t s 为原料悬浮交联合成c m c t s 微球，阐述了各种不同的交联 条件对微球形态和性能的影响，主要从形态方面确立了最佳反应体系：2g c m c t s ，5 0m lh 2 0 ，5 0m l 石蜡( 含2 5 s p a n 8 0 ) ，1 0m l 戊二醛。我们以 b s a 和c y t o c 作为研究对象，考察了c m c t s 微球吸附蛋白的性能。测定的蛋 白最大吸附量为6 9 1 0m g g 。此外为了验证微球吸附蛋白是否可逆，我们还做了 微球脱吸附蛋白的测定。此外，加入c a c 0 3 和p e g 并未达到良好的致孔效果。 2 我们利用c t s 直接合成c m c t s ，试图通过测定产物羧甲基取代度( d s ) 来确定羧甲基化合成的反应条件。在这过程中研究了在c m c t s 合成过程中反 应温度、反应时间、氯乙酸用量、n a o h 用量、碱化温度、等因素对反应产物 d s 的影响，并确定了最佳反应条件。研究表明，氯乙酸、碱以及原料的用量是 影响d s 大小的重要因素。反应最佳条件为：3gc t s ，2 0gn a o h ，2 0 0m l 异丙醇，在5 5 下碱化1 2h ，4g 氯乙酸，2 5m l 异丙醇，在6 0 下反应5h ， 此时，d s 最高为0 7 2 9 5 。 3 、上面我们通过测定d s 来确定反应条件并不是很准确，接下来我们采用两 步反应合成c m c t s 微球，用微球的蛋白的吸附性能确定c m c t s 合成条件。 第_ 步是c t s 合成c m c t s ，第二步是c m c t s 交联成c m c t s 微球，我们以 b s a 作为研究对象，考察c m c t s 微球吸附蛋白的性能。实验结果证明最佳合 成c m c t s 的条件是：2 9c t s ，2 5m l5 0 n a o h 溶液，碱化1 2h ，5g 氯乙酸， 2 5 m l 异丙醇，反应5h ，碱化温度和反应温度均为6 0 ，产物微球最大 b s a 吸 附量为4 7 0 3m g g ，仍没有达到理想的蛋白吸附效果。 4 由于羧甲基化产物的多样性及存在的副反应，使反应很难得到我们预想的 结果，所以我们接下来改变策略，在c t s 上加活性基团季铵基，然后交联得到 山东大学硕士学位论文 h a c c 微球，进行b s a 吸附的测定和红外光谱的表征。确立了最佳反应条件为 5g c t s ，1 0 0m l 溶剂( 异丙醇：水= 9 ：1 ) ，2 0gg t a ，反应时间8h 。交联时，加 入5m l 戊二醛。其中，微球最大b s a 吸附量达到1 3 2 2m g 。此外还做了h a c c 微球b s a 等温吸附曲线和h a c c 及h a c c 微球的红外表征。 关键词：羧甲基壳聚糖，壳聚糖季铵盐，交联微球，吸附蛋白 i i 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t h ea i mo f t h i sp a p e rw a st oi n v e s t i g a t en e wp o l y m e rm i c r o s p h e r e m a t e r i a l sa st h ep o t e n t i a lc h r o m a t o g r a p h ys t a t i o n a r yp h a s e sf o rp r o t e i ns e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o n m e t h o d s ：c m - c t sa n dc h l o r i d et r i m e t h y lc h i t o s a n q u a t e r n a r y a n a m o n i u m ( h a c c ) ，w e r es e p a r a t e l yp r e p a r e db yr e a c t i n gc t sw i t l lc h l o r o a c e t i ca c i da n d e p o x y p r o p y lt r i m e t h y la m m o n i u mc h l o r i d e ( g t a ) ，a n dt h e nw e r ec r o s s - l i n k e di n t o m i c r o s p h e r e sb ye m u l s i o n - g l u t a r a l d e h y d e t h er e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e d a n do p t i m i z e da n dt h ep e r f o r m a n c e so fs y n t h e t i cm i c r o s p h e r e sw e r es t u d i e d t h ef o l l o w i n ga r et h em a i nc o n t e n t sa n dc o n c l u s i o n s ： 1b y u s i n gc m - c t sa st h eo r i g i n a lm a t e r i a lt os y n t h e s i z ec m c t s m i c r o s p h e r e s ，w es e tu pt h eb e s tr e a c t i o ns y s t e mi nt h el i g h to ft h em i c r o s p h e r i c m o r p h o l o g y ：2gc m c t s ，5 0m lh 2 0 ，5 0m lp a r a f f i n ( c o n t a i n s2 5 s p a n 8 0 ) ，10 m l g i u t a r a l d e h y d e , m a i n l yf r o mt h ef o r mo f t h em i c r o s p h e r e s w eu s e dt h e c a n d i d a t i n gb s a a n dc y t o cf o rt h es t u d yo np r o t e i na d s o r p t i o no fs y n t h e s i z e d c m - c t sm i c r o s p h e r e s t h em a x i m u ma d s o r p t i o no fb s ar e a c h e d6 9 10m e g g i n a d d i t i o n ，i no r d e rt ov a l i d a t ew h e t h e rt h ea d s o r p t i o ni sr e v e r s i b l eo rn o t , w ea l s ot e s t e d t h em i c r o s p h e r e sf o rt h ep r o t e i nd e s o r p t i o n b e s i d e s ，t h ep o r o g e n s ，p e ga n dc a c 0 3 ， i sn o ta b l e t ow o r k 2w eu s e dc t st os y n t h e s i z et h ec m c t s ，a n dt r i e dt oc a l c u l a t et h ed so f c m - c t st o o p t i m i z er e a c t i o np a r a m e t e r s p a r a m e t e r si n c l u d i n gt h e r e a c t i o n t e m p e r a t u r e ，r e a c t i o nt i m e ，t h ea m o u n to fc h l o r o a c e t i c a c i da n ds o d i u mh y d r o x i d e ， a n da l k a l i z a t i o nt e m p e r a t u r e ，w e r ef i x e do nt os e tu pb e s tr e a c t i o ns y s t e m s t u d i e s h a v es h o w nm a tc h l o r o a c e t i ca c i d ，s o d i u mh y d r o x i d ea n dt h ea m o u n to fo r i g i n a l m a t e r i a l sa r et h em o s ti m p o r t a n tf a c t o r sa f f e c t i n gt h es y n t h e s i so fc m - c t s t h eb e s t r e a c t i o ns y s t e mi s ：3 9c t s ，2 0gn a o h ，2 0 0 m li s o p r o p a n o l ，5 5 f o r1 2h ，4g c h l o r o a c e t a t e ，6 0 f o r5h ，a n dt h em a x i m u mo f d s i s0 7 2 9 5 3t h r o u g hm e a s u r i n gt h ed s ，t h es e tu pr e a c t i o ns y s t e mi sn o tv e r ya c c u r a t e s o w ea d o p t e da t w o s t e pr e a c t i o np r o c e s st os y n t h e s i z ec m c t sm i c r o s p h e r e s ，a n db y d e t e c t i n gt h ep r o t e i na d s o r p t i o nc a p a c i t yo fc m c t sm i c r o s p h e r e s ，w ef i n a l i z et h e b e s tp a r a m e t e r sf o rs y n t h e s i s s y n t h e s i z e dc t si so no n eh a n d a n dt h es e c o n di s c r o s s l i n k e dc m c t si n t oc m c t sm i c r o s p h e r e s w eu s e db s at of i g u r eo u tt h e p r o t e i na d s o r p t i o nc a p a c i t yo fc m - c t sm i c r o s p h e r e s e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e d i i i 山东大学硕士学位论文 t h eo p t i m u ms y n t h e s i sp a r a m e t e r sf o rc m - c t s ：2gc t s ，2 5m l5 0 n a o h s o l u t i o n ，5gc h l o r o a c e t a t e ，2 5m li s o p r o p y l a l c o h o l ，6 0 t h eh i g h e s ta d s o r p t i o n a m o u n to fb s aw a s4 7 0 3m g g d i s s a t i s f a c t o r i l y , w es t i l lc o u l dn o to b t a i nt h ed e s i r e d m i c r o s p h e r e sw i t hag o o dp r o t e i na d s o r p t i o nc a p a c i t y 4b e c a u s eo ft h ec o m p l e x i t yo ft h ec a r b o x y m e t h y l a t i o nr e a c t i o na n de x i s t i n g b y - p r o d u c t s ，i tw a sd i f f i c u l tt oa c h i e v eag o o dr e s u l ta sw ei n i t i a l l yd e v i s e d s ow e a d d e dq u a t e m a r ya m m o n i u mg r o u p st oc t sa n dt h e nc r o s s - l i n k e dt h ep r o d u c t si n t o h a c cm i c r o s p h e r e sf o rf u n c t i o n a lb s aa d s o r p t i o na n di n f i ：a r e ds p e c t r o s c o p y t h e o p t i m u mr e a c t i o ns y s t e mf o rh a c cs y n t h e s i sw a s ：5gc t s ，10 0m ls o l v e n t ( i s o p r o p a n o l ：w a t e r = 9 ：1 ) ，2 0gg t a ，r e a c t i o nf o r8h f o rt h ec r o s s - l i n k i n g ，5m l g l u t a r a l d e h y d ew a sf u r t h e ra d d e di n t o t h eh i g h e s tb s aa d s o r p t i o nw a s13 2 2m g g m e a n w h i l e ，w et e s t e dt ob u i l dt h eb s aa d s o r p t i o ni s o t h e r mc u r v ef o rt h eh a c c m i c r o s p h e r e sa n di t si n f r a r e dc h a r a c t e r i z a t i o n k e yw o r d s ：c a r b o x y m e t h y l c h i t o s a n ；t r i m e t h y l c h i t o s a nc h l o r i d eq u a t e r n a r y a m m o n i u m ；m i c r o s p h e r e s ；p r o t e i na b s o r p t i o n i v 山东大学硕士学位论文 论文中的缩写词表 缩写英文全名中文全名 i e ci o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y 离子交换层析 c tc h i t i n甲壳素 c t sc h i t o s a n 壳聚糖 c m c t s c a r b o x y m e t h y lc 1 1 i t o s a n羧甲基壳聚糖 d s d e g r e eo fs u b s t i t u t i o n 羧甲基取代度 c h l o r i d et r i m e t h y lc h i t o s a nq u a t e r n a r y氯化三甲基壳聚糖季铵 h a c c a m m o n i u m 盐 s p a n 8 0 s o r b i t a nm o n o o l e a t e山梨糖醇酐单油酸酯 b s a b o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白 c y t o - c c v t o c h r o m ec细胞色素c aa b s o r b a n c e吸光度 h a c n a a ca c e t i ca c i d s o d i u ma c e醋酸醋酸钠 g t a e p o x y p r o p y lt r i m e t h y la m m o n i u mc h l o r i d e 环氧丙基三甲基氯化铵 v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：逻圜数 e l期： 幽：至：垫 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：三尾围酶师签名： 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 层析固定相研究的意义 在蛋白质分离纯化技术中，层析是一门关键技术，其中离子交换层析( i e c ) 操作简单、适用范围广、选择性高、易再生，被广泛应用。i e c 是分析性和制备 性的分离、纯化混合物的液固相层析方法，它基于所研究或所分离物质的阳或 阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，通过离子间的吸附和脱吸附而将电 解质溶液各组分分开。其分离的对象多为小分子物质，当i e c 和凝胶过滤相结 合时，它的应用范围就可扩大到生物大分子( 如蛋白质、多肽、核酸等) 的分离 纯化，是目前国内外最广泛使用的一种分离分析手段【i 】。 层析技术的核心是层析固定相。大多数层析固定相是官能化的载体，所以， 层析固定相又直接决定于层析载体。早期使用的各种强酸、强碱型离子交换树脂 等固定相不适用于蛋白质的分离。适用于蛋白质分离纯化的固定相必须具有高度 的亲水性，并具有一定的三维空间结构和疏散度，以便于生物物质的扩散进出， 通过表面作用或体积排阻实现蛋白质的分离。到6 0 年代，交联葡聚糖、琼脂糖 凝胶等高分子材料的使用，使各种蛋白质层析技术的应用得以实现。由于原料成 本高，功能化技术难于掌握，现在，国内使用的这类层析载体基本为国外公司所 垄断，价格昂贵，严重影响我国生物下游工程技术的发展，开发新的层析固定相 迫在眉睫。目前最常用的官能团配基有羧甲基和季铵基等，最常用的载体有淀粉、 葡聚糖、壳聚糖等高分子材料【2 】。 壳聚糖与其他人工类高分子材料相比具有生物相容性好、可降解、原料来源 广泛、成本低等优点，其微球可作为层析载体和吸附剂材料用于蛋白的分离纯化 研究，因此壳聚糖微球的合成和功能化研究成为人们关注的热点。普通的中性壳 聚糖微球以物理吸附为主，因此吸附或选择性吸附能力较弱，对壳聚糖进行离子 化改性然后合成微球可以提高吸附或选择性吸附能力。因此制备离子化壳聚糖微 球，并将其用于药物载体或吸附剂，在现代制药和分离技术领域有着重要意义。 离子化壳聚糖微球，分为两类：阴离子化和阳离子化。 1 2c t s 1 2 1c t s 的结构及性质 甲壳素( c h i t i n ) 学名为p 1 ，4 - 聚n 乙酰d 氨基葡萄糖，分子式( c s h l 3 n o s ) n ， 山东大学硕士学位论文 又名甲壳质、几丁质等，在自然界中广泛存在于蟹、虾以及藻类、真菌等低等动 植物及它也在某些微生物和酵母菌中天然存在【3 】，是地球上仅次于纤维素的含氮 天然高分子化合物【4 】。由于它是由葡萄糖结构单元组成的直链多糖，此多糖中含 有数千个乙酰己糖胺残基，因此在分子间形成很强的氢键，导致其不溶于水和普 通有机溶剂，这就大大限制了其应用范围。将甲壳素在碱性条件下加热，脱去 n 乙酰基后可生成壳聚糖。与前者相比，后者溶解性能有很大程度的改善。 壳聚糖( c t s ) 学名为p 1 ，4 聚d 氨基葡萄糖，分子式( c 6 h l l n 0 4 ) n ，又名几丁 聚糖、甲壳胺、脱乙酰甲壳素等，是甲壳素脱乙酰基后的产物，是一种自然界少 见的聚阳离子生物高分子化合物t s l ( 图1 1 ) 。不溶于水和碱溶液，可溶于稀盐酸、 硝酸等无机酸以及醋酸等大多数有机酸。在稀酸溶液中，c t s 的主链会缓慢水解。 作为一种天然碱性多糖，c t s 具有复杂的双螺旋结构，其大分子链上分布着许多 羟基、氨基，还有一些n 乙酰氨基，它们会形成各种分子内和分子间氢键，从 而导致c t s 的结晶性较高，水溶性能较差，仅溶于一部分酸性介质中，这使c t s 在应用方面受到限制，因而有必要对c t s 的水溶性进行改善，以扩大其应用范 围。 2 睁悟。喻懵 a _ 幽11 甲壳素及c t s 的结构单体和结构式 1 2 2c t s 的应用 1 2 2 1 医药领域的应用 c t s 分子链上的游离氨基在弱酸溶液中结合一个质子，生成阳离子聚合体， 有很强的吸附能力，是一种良好的絮凝齐俨。此外c t s 在靶向给药系统中有广 阔前景【- 8 一。 1 2 2 2 环保中的应用 c t s 对金属离子络合吸附，使其在废水处理中作为金属离子的螯舍剂和活性 污泥絮凝剂而得到广泛应用【i o , 1 1 , 1 2 。 1 3c m c t s 1 3 1c m c t s 的结构匣性质 由于c t s 分子结构中含有氢基、羟基、乙酰氨基、氧桥、以及富含电子的 吡喃环等活性基团，能进行多种化学反应，例如羧甲基化、季铵化、酯化、酰化、 席夫碱反应、接枝共聚反应等。 在众多的化学改性中，羧甲基化反应是研究丌发的重要内容之一。羧甲基壳 聚糖( c m c t s ) 是c t s 经羧甲基化反应后得到的产物，它具有水溶性、抗菌性、 蛰合性、成膜性、保湿性和安全无毒性等很多优良的件质。与c t s 相比，c m c t s 火分了链l 。含有大量可离解的羧牿，闻而其水溶性较c t s 有很大改善，可在较 宽的口h 值范山内溶解，有更广泛的应用价值，表现出更加良好的如下性能：水 溶性、抗茼性、螫合性、0 物学特性及高分子性能。 1 3 2c m c t s 的制备 在壳聚糖的分子结构中，与羧甲基化学性质有关的官能团是氨基葡萄糖单元 上的6 位们羟基、3 位仲羟基、2 位氨基以及糖苷键。援甲壁取代反应可发生 在壳聚糖的c r o h 、c 6 o h 和c 2 一n h 2 卜。c 3 - o h 空问位阻大，不能自由旋转， 山东大学硕七学位论文 故c 6 o h 比c 3 o h 的反应活性强。另一方面，c 2 - n h 2 又比c 6 o h 反应活性大 些，相应的产物有o c m - c t s 、n c m c t s 和n ，o c m c t s ( 图1 2 ) 。壳聚糖的 羧甲基化反应究竟先在哪个位置上发生，还与反应溶剂、羧甲基化试剂、催化剂、 反应温度等因素有关。此外，壳聚糖的羧甲基取代位置与其生物活性和功能作用 有密切关系。 奠城绺羧擎纂巍瓣耩 a 嘲a 驯 洳羧攀蒸壳蘩羹，。幺 图1 2 c m c t s 种类 避冀 翼 哺警墓尧聚糍鬟 c t s 与氯乙酸反应，得到的大部分是n ，o c m c t s 1 4 】( 图1 3 ) 。本文主要 是采用的此种方法合成n ，o c m c t s 。 图1 3n o c m c t s 的制备流程 要得到o c m c t s ，则需用乙酰基保护n h 2 上的氢，羧甲基反应完成后， 再将乙酰基脱除( 图1 4 ) 。 4 山东大学硕士学位论文 图1 4o c m c t s 的制备流程 采用乙醛酸作为羧甲基化试剂，可使反应只发生在- n h 2 上，经还原可得到 n c m c t s 1 6 】( 图1 5 ) 。 图1 5n c m 。c t s 的制备流程 1 3 3c m c t s 的应用 与c t s 相比，c m c t s 的水溶性提高，且具有无毒、无味、生物相容性、 可降解，抑菌、成膜、保湿、增稠、絮凝、螯合等特性，得到了广泛的应用 1 7 , 1 8 , 1 9 。 1 3 3 1 医学领域的应用 c m c t s 具有抑菌杀菌功能。n ，o 羧甲基壳聚糖与金属离子有络合作用，和 亚铁离子络合可以用于治疗缺铁性贫血。羧甲基壳聚糖膜具有良好的细胞相容 5 山东大学硕十学位论文 性，为其作为细胞生长支持物和医学应用提供了实验基础【2 0 1 。 1 3 3 2 化妆品工业中的应用 c m c t s 优良的水溶性、乳化性、成膜性能适于制备水质性化妆品的功能性 成分。它在水中的粘度比其它的保湿剂要高，持续保湿性能优于透明质酸，可代 替昂贵的透明质酸用于高级护肤品 2 1 1 。 1 3 3 3 水处理中的应用 c m c t s 做污水处理的絮凝剂效果远好于常用的聚丙烯酰胺，o c m c t s 是 它不仅表现在可通过电荷中和而使悬浮胶体离子絮凝，而且还可以与带负电荷的 溶解物进行反应，生成不溶性盐 2 2 , 2 3 】。c m c t s 还可做为稀有金属吸附剂，金属 涂锌添加剂，阻垢剂 2 4 2 5 1 。 此外在农业领域，c m c t s 可作植物生长调节剂，n ，o c m c t s 对水稻氮 代谢有一定的调控作用。在食品工业中，。n ，o c m c h i t o s a n 膜对气体有选择性的 通透作用，特别适合于作为水果保鲜剂使用 2 6 1 。n c m c t s 可制成肉食防腐剂， 效果良好。 1 3 4c m c t s 微球 c t s 微球对阴离子物质吸附作用多在酸性条件下才能较好的发挥，因为酸性 条件下氨基质子化，才能有效吸附阴离子。而c t s 羧甲基化后，引入了羧甲基 基团，在溶液中电离后表现出较强的电负性，能有效地吸附阳离子。周孙英等用 戊二醛将c m c t s 进行交联得到粉球状c m c t s 树脂，并研究其对p b 2 + 的吸附 性能，结果证明交联c m c t s 微球在溶液中具有相当好的刚性，不流失，主要 是通过羧基与p b 2 + 配位，与未改性的c t s 微球相比，对p b 2 + 有更强的吸附能力， 并且经洗脱剂脱附后，可再生利用，避免了二次污染 2 7 1 。有文献以c t s 为原料， 用微波辐射法制成了c m c t s ，再通过戊二醛交联，制成了交联c m c t s 微球。 研究了交联c m c t s 微球对尿素的吸附性能。结果证明交联c m c t s 微球对尿 素具有较高的吸附容量和较高的选择性，是一种具有发展前景的尿素吸附剂材料 2 8 1 。这些研究结果表明，羧甲基化后的壳聚糖具有更宽的适用p h 范围和更好的 吸附效果，壳聚糖羧甲基化微球在吸附阳离子类物质方面具有良好效果。 1 4 壳聚糖季铵盐 1 4 1 壳聚糖季铵盐的性质 为了改善c t s 的水溶性，保持分子的阳离子性能，在c t s 分子中引入季铵 6 山东大学硕士学位论文 盐基团成为c t s 衍生物研究的热点领域之一。壳聚糖季铵盐是c t s 经季铵化反 应后得到的产物。c t s 分子的每个糖残基上都有一个游离氨基，很容易发生亲核 取代，被制成季铵盐。由于位阻大、水合能力强的季铵盐基团的引入，c t s 分子 间的氢键作用被大大削弱，取而代之的是c t s 与水之间的水合作用，从而使其 水溶性增大，可在较宽的p n 值范围内溶解。 1 4 2 壳聚糖季铵盐的制备 壳聚糖季铵化主要有在醋酸中用盐式链季铵盐化、与甲基碘等烷基卤反应和 使已经季铵化的化合物与壳聚糖反应等三种方法。 1 4 2 1 环氧衍生物开环法 国外较早报道环氧衍生物开环法，采用水作溶剂，副反应较多，产率较低【2 9 】。 国内最早报道的是采用异丙醇作溶剂，副反应少，产率高，是目前壳聚糖季铵化 改性采用较多的方法。该法制备原理是利用壳聚糖氨基的活性，与三元环氧衍生 物发生亲核取代反应，所用环氧衍生物为环氧丙基三甲基氯化铵( g t a ) 或羟丙基 三甲基氯化铵( c t a ) ，后者是g t a 的开环产物，由于c t a 反应活性低于g t a ， 目前普遍采用g t a e 3 0 ，3 1 1 。g t a 分子式c 6 h 1 4 c 1 n o ，分子量1 5 1 6 4 ，结构式为： ， 、：c i 。 0 7 。本文采用此法制备得到的壳聚糖季铵盐为氯化三甲基壳聚糖季铵 盐，( h a c c ) 。 1 4 2 2n 2 烷基化法 n 2 烷基化法是季铵化改性较早采用的方法，该法原理是先用卤烃碘化物与 壳聚糖氨基反应，生成壳聚糖季铵化碘化物，再进行碘交换获得稳定的产物该法 为两步反应，且所需壳聚糖的分子量很低，市售壳聚糖分子量在几十万至上百万， 需要对其降解处理才能获得壳聚糖低聚物，增加了步骤，影响产率3 2 1 。 1 4 2 3 酯交换法 目前用酯交换法制备壳聚糖季铵盐的报道远少于采用环氧衍生物开环法和 n 2 烷基化法，该法原理是先制备季铵盐的酯化物，再与壳聚糖的氨基进行酯交 换获得终产物。该法具有副反应少，产物易提纯的优点，但需合成中间产物三乙 胺氯乙酸乙酯，步骤较繁琐 3 3 1 。 1 4 3 壳聚糖季铵盐的应用 1 4 3 1 水处理中的应用 7 山东人学硕上学位论文 水处理是解决环境污染中的重大问题，天然高分子絮凝齐i f , i 是一类颇受重视 的新的水处理剂。壳聚糖改性后的壳聚糖季铵盐，其正电性和阳离子强度得到了 很大的提高，p h 适用范围增大，是一类优于壳聚糖的高分子絮凝剂3 4 , 3 5 】。 1 4 3 2 化妆品工业中的应用 壳聚糖季铵盐的保湿性能和吸湿性能相对于c t s 来说都大大地提高了，且 氨基取代度越大，保湿吸湿性能就越出色f 3 6 】。 1 4 3 3 医学领域的应用 壳聚糖季铵盐因其更出色的黏膜吸附性和渗透性而成为潜在的蛋白质及多 肽等水溶性药物的吸收增强剂3 7 1 。 此外，壳聚糖季铵盐的生物活性，抗氧化活性，抗菌活性以及作为催化剂都 得到非常广泛的应用 3 8 。 1 4 4 壳聚糖季铵盐微球 c t s 季铵化后，引入了季铵盐基团，在溶液中电离后表现出较强的电正性， 能更有效地吸附阴离子。杜予民等用离子交联法制得羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖 ( h a c c ) 纳米微球，并研究了其对蛋白质药物模型牛血清蛋白的载药及缓释性 能，结果表明，h a c c 纳米微球对牛血清蛋白具有良好的载药性及缓释效果【3 9 1 。 覃彩芹等用反相乳液聚合法制得季铵化壳聚糖微球，并比较了季铵化前后微球对 水中c r ( v i ) 的吸附性能，结果表明，季铵化后的c t s 具有更宽的适用p h 范围和 更好的吸附效果4 0 1 。这些研究表明，壳聚糖季铵盐微球在吸附阴离子类物质方 面具有良好效果。 1 5 反相悬浮交联 c m c t s 和h a c c 作为一种线形聚合物，在酸性条件下易软化流失，不能直接 作蛋白分离纯化用，而必须把它交联，才具有一定的稳定性。在反相悬浮交联的过 程中，需要用到乳化剂和交联剂。 1 5 1 乳化剂 1 5 1 1 乳化剂性质 乳化剂是乳浊液的稳定剂，是一类表面活性剂，有亲水和亲油两个部分。其 作用是：当它分散在分散质的表面时，形成薄膜或双电层，可使分散相带有电荷， 这样就能阻止分散相的小液滴互相凝结，使形成的乳浊液比较稳定。常用的乳化 剂有肥皂、阿拉伯胶、烷基苯磺酸钠等【4 1 1 。 山东大学硕士学位论文 1 5 1 2 乳化剂种类 按其在两相中所形成乳化体系性质又可分为水包油( o a v ) 型和油包水 ( w o ) 型两类。衡量乳化性能最常用的指标是亲水亲油平衡值( h l b 值) 。h l b 值低表示乳化剂的亲油性强，易形成油包水( w o ) 型体系；h l b 值高则表示 亲水性强，易形成水包油( o 脚) 型体系。 根据它们亲水部分的特征，分为三种类型：负离子型乳化剂、正离子型乳化 剂、非离子型乳化剂。负离子型乳化剂在水中电离生成带有烷基或芳基的负离子 亲水基团的乳化剂，如羧酸盐、硫酸盐和磺酸盐等，这类乳化剂最常用；正离子 型乳化剂在水中电离生成带有烷基或芳基的正离子亲水基团，这类乳化剂的品种 较少，都是胺的衍生物，可用于聚合反应；非离子型乳化剂为一类新型的乳化剂， 其特点是在水中不电离，它的亲水部分是各种极性基团，亲油部分( 烷基或芳基) 直接与氧乙烯醚键结合 4 2 , 4 3 】。 1 5 1 3s p a n 8 0 我们试验中用到的s p a n 8 0 为单油酸酯，别名为山梨醇脂肪酸酯，是一种非 离子型乳化剂，其h l b 为4 3 ，亲油性强，可形成w o 型体系。它既可在酸性 条件下使用，也可在碱性条件下使用，而且乳化效果很好，广泛用于化工、纺织、 农药、石油和乳胶等的生产，4 5 1 。 1 5 2 交联剂 1 5 2 1 交联剂性质 交联剂是一类小分子化合物，分子量一般在2 0 0 6 0 0 之间，具有2 个或者更 多的针对特殊基团( 氨基、巯基等) 的反应性末端，可以和2 个或者更多的分子 分别偶联从而使这些分子结合在一起。换言之，它是一种能在线型分子间起架桥 作用从而使多个线型分子相互键合交联成网络结构的物质，其能促进或调节聚合 物分子链间共价键或离子键形成。作用时待线型分子单体缩聚( 或聚合) 到一定程 度发生交联，使产物变为不溶的交联聚合物。其有以下优点：种类多，可满足各 种偶联需要；生理条件下即可共价交联，反应快速简便；多种反应性基团可供选 择，反应指向既可以有专一性也可以无专一性：含有不同长度的间臂，有效地降 低空间位阻效应【4 6 4 刀。 1 5 2 2 戊二醛 二醛类由于其特殊的化学结构被广为用作交联剂，其分子中有两个羰基( 图 9 山东大学硕士学位论文 1 7 ) 。羰基碳带有部分正电荷；羰基氧带有部分负电荷。醛类非常典型的特征反 应是碳氧双键的亲核加成反应。羰基碳上的正电荷使得它对亲核试剂的攻击特别 敏感；而羰基氧上的负电荷意味着亲核加成反应对酸性催化很敏感。羰基的极化 结构使得它容易与某些极性基团发生亲核反应。另一方面，壳聚糖的c 3 和c 6 羟 基由于电荷的极化使氧原子带有负电，与羰基发生缩醛化反应( 图1 8 ) ，而壳聚 糖的c 2 氨基由于其氮原子中的未共用电子对也具有亲核性，与羰基发生s c h i f f 碱反应( 图1 9 ) ，这些羟基和氨基很容易与带有正电荷的羰基碳发生反应，这正 是二醛类能作为交联剂对壳聚糖进行交联处理的原理所在【4 8 1 。我们在试验中用 到的戊二醛是一种典型的二醛类交联剂，其分子式：c 5 h 8 0 2 ，是一种带有刺激 性气味的无色透明油状液体，溶于热水、乙醇等。其含有双功能团，通过其醛基 与交联前样品各单位上的氨基共价结合，通过它联结起来，形成如c m c t s 戊 二醛c m c t s 结合物。 _ i e 一 ：一。 铲 二+ 。 “ 鑫一鑫十 嚣o 珏 童 ， ，一 d j 一 嚣? 一器基一冀 ，” ! 一鞭誓器净蔓 i - ，矿j 巨l - c 譬q 一裂一0 i i 鬈一墨一霹赢h c i 国酗薹t 之十霉 ；， 、琏 殷h。hl “一 嚣善 ；枷+ h 搿一；竺一江+ 孤； e = 幻+ h 搿一o 一江+ 现 。l 。j l 钕毡瞪媳 j ； 1 5 3 致孔剂p e g 和c a c 0 3 反应后，得到实心小球，吸附性并不好，试着在水溶液中加入聚乙二醇p e g ， 其和c m c t s 相容性好，乳化产生的水球中就会有大分子物质p e g ，而且在小 球中高分子的p e g 不与交联剂戊二醛反应，交联后用碱洗去，即可以得到带孔 1 0 山东大学硕士学位论文 的网状c m c t s 微球，起到致孔剂的作用，从而增加c m c t s 微球吸附蛋白质 的性能，提高分离纯化蛋白质的效率。同样的道理，我们也用c a c 0 3 做了初步 的实验，不同的是交联后用酸洗与c a c 0 3 反应除去c a c 0 3 ，从而达到致孔的效 果。 1 6 论文设计 c m c t s 和h a c c 分子上都带有可电离基团，比c t s 更适合作为离子交换 柱的交换介质，用于分离纯化蛋白质。但两者均是水溶性多糖，用作分离胶的载 体，需要对其进行疏水交联改性【4 9 】。 本文对壳聚糖进行两种改性，一是羧甲基化，二是季铵化，合成两种水溶性 更好的壳聚糖衍生物即c m c t s 和h a c c ，然后这两种衍生物经溶胀、乳化、 交联，得到不溶性的c m c t s 阳离子微球和h a c c 阴离子微球。分别研究了两 步反应的主要因素对产物性能的影响。包括用光学显微镜观察成球形态，测定产 物的吸水率，测定对蛋白的吸附量，此外我们还对h a c c 微球进行了红外表征。 山东大学硕士学位论文 第二章以c m c t s 为原料合成微球及其性能表征 在本章中我们将c m c t s 通过反相悬浮交联得c m c t s 微球，并且讨论了 水油相比、乳化剂、戊二醛、p e g 和c a c 0 3 对微球形态的影响，以及戊二醛、 p e g 和c a c 0 3 对微球吸水和吸附蛋白性能的影响。 交联反应式如下： 2 c m - c t s l ，2 - n h 2 + o h c 一( c h 2 ) 3 - c h o - - - c m - c t s l - n = c h ( c h 2 ) 3 c h 爿n c m c t s 2 c y t o c 由于有铁卟啉环，在波长4 0 0n m 附近有吸收峰；b s a 在波长2 7 8n m 附近有吸收峰。根据这两个蛋白的特性，用制各的微球分别对其进行静念吸附， 比较吸附前后吸收峰处吸光值的变化，并根据蛋白浓度计算出平均吸附蛋白量， 以此来推断微球的吸附性能。其中，舢为原蛋白在吸收峰处的吸光度值，a s 为 微球吸附后上清在吸收峰处的吸光度值，a = a o a s 。 1 2 如图2 1 ，2 2 所示 图2 1b s a 的紫外吸收曲线 山东大学硕士学位论文 图2 2c y t o - c 的紫外吸收曲线 2 1 材料与方法 2 1 1 仪器与试剂 d 8 4 0 1 w 型多功能电动搅拌器( 天津市华兴科学仪器厂) 、k d m 型连续可 调电子控温电热套( 巩义市英峪予华仪器厂) 、j a l 0 0 2 电子天平( 上海精天电子 仪器) 、j a 5 0 0 3 上皿电子天平( 上海天平仪器厂) 、u v 3 1 0 0 紫外分光光度计( 日 本岛津公司) 、h c 3 0 1 8 r 台式高速冷冻离一t l , 机( 科创中新) 、移液枪、o r i o n 8 2 8 型p h 计( 奥立龙公司玻璃仪器) 、o l y m p u sb x 5 1 光学显微镜、电热恒温干燥箱 ( 上海实验仪器厂) 。 c m c t s ( 青岛利中甲壳质公司) 、氢氧化钠( 天津市凯通) 、氯乙酸( 天津 大茂) 、异丙醇( 国药集团) 、丙酮( 康德化工) 、无水乙醇( 凯通化学) 、石蜡、 s p a n 8 0 ( 天津市广成化学试剂有限公司) 、戊二醛( 含量t 5 0 ，武汉市鸿兴化 学试剂厂) 、p e g ( 聚7 , - - 醇，平均分子量为1 9 0 0 0 ，国药集团化学试剂有限公 司) 、b s a ( 上海君创生物) 、牛心c y t o c 初提液( 本实验室提供) 、h a c n a a c 缓冲液( p h 3 5 ) 、柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液( p h2 2 ) 。 2 1 2c m c t s 微球的合成 ( 1 ) 溶胀：称取2g 左右的干燥c m c t s 置于装有搅拌器及温度计的5 0 0m l 三口圆底烧瓶中，加水搅拌3 0 m i n 使其充分溶胀； ( 2 ) 乳化：加入液体石蜡溶液( 含s p a n 8 0 ) ，启动搅拌器，常温下充分搅 拌乳化1 5h ，形成油包水溶液( 乳化是此反应重要的一步，一定要保证乳化时 1 3 山东大学硕士学位论文 间) ； ( 3 ) 交联：加戊二醛溶液，反应2h ，得到c m c t s 微球； ( 4 ) 洗涤：分别用水，酒精，丙酮