（无机化学专业论文）新型电流型生物传感器的研制.pdf

两南大学硕+ 学位论文摘要 新型电流型生物传感器的研制 无机化学专业硕士研究生郭晓利 指导教师刘昌华副教授 摘要 由于生物传感器在临床、环境、食品等领域具有广阔的应用前景，近年来发展迅速。本 论文从采用新型的电子媒介体和高分子生物复合膜的安培型过氧化氢传感器进行了研究。主 要内容如下： 1 在玻碳电极上电沉积四( 1 ，4 _ 二噻英) 四氮杂卟啉铁( f e p z ( d t n ) 4 ) ，将其作为电子媒介体与 纳米金结合，利用纳米金的比表面积大，吸附能力强等优点固定辣根过氧化物酶，最后用 聚乙烯缩丁醛包埋修饰好的电极，制备了过氧化氢传感器。采用循环伏安法考察了传感器 的电化学特性，以一0 2 5v 为工作电位，在p h = 6 5 ，温度为2 5 0 c 的最佳条件下，其峰电流值 与h 2 0 2 浓度在3 5 1 0 咱7 3 5 x 1 0 - 3 m o l l 成良好的线性关系，检测下限为1 0 x 1 0 。6 m o l l ( s n = 3 ) 。该传感器有非常好的稳定性，响应较快、灵敏度较高，且具有良好的选择 性。 2 羧甲基聚( 4 一乙烯) 吡啶( q p v p ) 被应用于分散多壁碳纳米管( m w c n t s ) 。采用电沉 积方法将辣根过氧化物酶( h r p ) 与q p v p - m w c n t 的混合物固定在金电极表面，从而 制各了新型的过氧化氢生物传感器。利用紫外可见光谱、扫描电镜和循环伏安法对此进行 表征。探讨了工作电位、温度、p h 对电极响应的影响。在最佳的实验条件下， h r p q p v p m w c n t a u 电极对h 2 0 2 显示出了良好的催化活性，其线性响应范围是 5 0 1 0 一8 o x1 0 m ，检测极限是2 1 l o 。6m ( s n = 3 ) 。此外，该传感器具有良好 的稳定性、重现性和选择性。 3 羧甲基聚( 4 - 乙烯) 吡啶( q p v p ) 的水溶液来分散碳纳米管( m w c n t s ) ，用新颖的电沉积方 法在金电极表面修饰q p v p - m w c n t 导电复合膜了，再通过双层纳米金阎定双层辣根过 氧化酶，制得了新型的第三代过氧化氢生物传感器。实验结果表明传感器在h 2 0 2 的浓度 为9 o 1 0 - - 3 8 1 0 。m o l l 时呈现很好的线形关系，检出下限为3 1 1 0 + 7 m o l l ( s n = 3 ) 。 该传感器具有较高的灵敏度和稳定性，并且有良好的抗干扰能力。 4 采用一步共沉积方法将天然生物高分子海藻酸钠与辣根过氧化酶固定在金电极表面，制成 h r p 一海藻酸钠a u 生物传感器。在循环伏安扫描下，两种带电物质在p b s 缓冲溶液中基 于静电吸附作用沉积于电极上。经实验表征，此方法固定的辣根过氧化酶保持很高的活性， 对h 2 0 2 表现了良好的响应。对影响传感器性能的实验条件如p h 、电位等做了优化，传感 两南大学硕+ 学位论文摘要 器对7 0 1 0 6 4 1 x l o 七m o l l 浓度范围内h 2 0 2 有良好的线性关系，检测下限为1 8 l o 6 m o l l ( s n - 3 ) ，传感器还表现出了良好的灵敏性、重现性、稳定性和选择性。此方法拓 宽了电沉积法应用于固定生物分子实验领域，为下一步继续研究天然高分子直接固定酶奠 定基础。 关键词：生物传感器辣根过氧化物酶电沉积碳纳米管高分子生物复合膜 i i 西南大学硕十学位论文 a b s t r a c t f a b r i c a t i o no fn e wa m p e r o m e t r i cbi o s e n s o r i n o r g a n i cc h e m i s t r ym a s t e rp o s t g r a t u a t e ：x i a o l ig u o s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o r l i uc h a n g h u a a b s t r a c t b i o s e n s o r sb a s e do ne n z y m e - m o d i f i e de l e c t r o d e sa r ev a l u a b l ei nc l i n i c a ld i a g n o s i s ， b r o m a t o l o g y ，e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n ga n db i o c h e m i c a la n a l y s i s t h i st h e s i si n v o l v e s t h ef o l l o w i n gs u b j e c t sr e l a t i n gt oh y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o r 1 ) an o v e la p p l i c a t i o no fi r o n ( i i ) 一t e t r a ( 5 ，6 - d i h y d r o 一1 ，4 - d i t h i j n ) p o r p h y r a z i n e ( f e p z ( d t n ) 4 ) o nt h eh y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o r f e p z ( d t n ) 4 w a sf i x e do nt h eg l a s s c a r b o ne l e c t r o d eb ye l e c t r o d e p o s i t i o nm e t h o d ，a n dt h e nu s i n gc o l l o i d a la ut oa d s o r b h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，p o l y e t h y l e n eb u t y r a lw a su s e dt oe m b e dm o d i f i e de l e c t r o d e c y c l i cv o h a m m e t r yw a se m p l o y e dt od e m o n s t r a t et h ef e a s i b i l i t yo fe l e c t r o nt r a n s f e r b e t w e e n p e r o x i d a s ea n de l e c t r o d e l i n e a rc a l i b r a t i o nf o rh 2 0 2w a so b t a i n e di nt h er a n g e 矗o m3 5 l o 一7 3 5 x 1 0 3 m o 。w i t ht h ec o r r e l a t i o nc o e 伍c i e n t0 9 9 9 4 ，a n dt h el i m i ti s 1 0 xl0 击m o l la tas i g n a l t o n o i s er a t i oo f3 t h es e n s o rh a dg o o ds e n s i t i v i t y ， s e l e c t i v i t ya n ds t a b i l i t y 2 ) p o l y ( 4 一v i n y l - n c a r b o x y m e t h y l p y r i d i n e ) ( q p v p ) w a sw e l la p p l i e dt os o l u b i l i z e m u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e s ( m w c n t s ) av e r ys i m p l ea n de f f e c t i v es t r a t e g yf o r p r e p a r a t i o n an o v e lh y d r o g e n p e r o x i d e b i o s e n s o rb a s e do n e l e c t r o d e p o s i t i o n q p v p m w c n tc o m p o s i t ed o p e d 、而t hh r pi nt h ea q u e o u ss o l u t i o nc o n t a i n i n g m w c n t s ，q p v pa n dh r p w a sr e p o r t e di nt h i sp a p e r t h eq p v p - m w c n tc o m p o s i t e a n dt h ef a b r i c a t e dp r o c e s so fb i o s e n s o rw e r ec h a r a c t e r i z e db yin 乙啊s i b l ea b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p y ，s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ，a n dc y c l i cv o l t a m r n e t r y e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n si n f l u e n c i n gt h eb i o s e n s o rp e r f o r m a n c es u c ha sp h ，p o t e n t i a lw e r eo p t i m i z e d u n d e ro p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，h r p q p v p m w c n t a ue l e c t r o d ee x h i b i t e de x c e l l e n t e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yf o rt h er e d u c t i o no fh e 0 2 t h el i n e a rr a n g ei sf r o m5 0 xl0 。0t o 8 0 x10 一mw i t had e t e c t i o nl i m i to f2 1x10 m ( s n = 3 ) 3 ) p o l y ( 4 一v i n y l - n c a r b o x y m e t h y l p y r i d i n e ) ( q p v p ) w a sw e l la p p l i e dt os o l u b i l i z e m u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e s ( m w c n t s ) ，t h e nav e r yn o v e la n de f f e c t i v es t r a t e g yf o r i m m o b i l i z i n gm w c n t s o nt h eg o l de l e c t r o d eb a s e do ne l e c t r o - d e p o s i t i o nr e p o r t e di n i i i 两南大学硕士学何论文 a b s t r a c t t h i sp a p e r m w c n t ss t r e n g t h e nt h ea b l i t yo ft h ee l e c t r o n s c k c u l a t i o na n df i x e dt h e n a l l o a ub yc h e m i s o r p t i o na tt h es a m et i m e f u r t h e r m o r e ，h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) w a sa b s o r b e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c et h r o u g ht h eg o l dn a n o p a r t i c l e s t h e p e r f o r m a n c ea n df a c t o r si n f l u e n c i n gt h ep e r f o r m a n c eo ft h eb i o s e n s o rw e r es t u d i e d ， u n d e ro p t i m i z e dc o n d i t i o n s 。h r p n a n o a u h r p n a n o 氏嘲q p v p m w c n t a ue l e c t r o d e e x h i b i t e de l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yf o rt h er e d u c t i o no fh 2 0 2 t h el i n e a rr a n g ei sf r o m 9 0 1 0 。7t o3 8 1 0 一mw i t had e t e c t i o nl i m i to f 3 1 x 1 0 m ( s n = 3 ) 4 ) ac o n v e n i e n ta n de f f e c t i v es t r a t e g yf o rf a b r i c a t i o no fh y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o r b a s e do ns o d i u ma l g i n a t e ( s a ) ，a n dp o l y v i n y lb u t y r a l ( p v b ) a sm a t r i c e sw a sr e p o r t e d i nt h i sp a p e r t h eh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) a n ds aw e r ee l e c t r o - - c o - - d e p o s i t e do n t o g o l de l e c t r o d es u r f a c e a n dt h eh r p - s a a ue l e c t r o d ew a sf u r t h e rc o a t e d 谢t hp v b t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h eh r pa n ds aw a sc h a r a c t e r i z e db yu v - v i sa b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p y ， a n dt h e f a b r i c a t e d p r o c e s s o fb i o s e n s o rw a sc h a r a c t e r i z e db y e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) t h ee l e c t r o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f t h eb i o s e n s o rw e r es t u d i e d b yc y c l i cv o l t a m m e t r y a n dc h r o n o a m p e r o m e t r y e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n si n f l u e n c i n gb i o s e n s o rp e r f o r m a n c e ，s u c ha sp h ，a n da p p l i e d p o t e n t i a lw e r ei n v e s t i g a t e d t h eb i o s e n s o rs h o w e dal i n e a rr e s p o n s et oh 2 0 2o v e ra c o n c e n t r a t i o nr a n g e sf r o m7 0 x10 6t o4 1xl0 - 3mw i t had e t e c t i o nl i m i to f1 8 x10 _ 6m b a s e do n as i g n a l t o - n o i s er a t i oo f3u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n s k e y w o r d s ：b i o s e n s o r , h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，e l e c t r o d e p o s i t i o n ，c a r b o nn a n o t u b e s ， b i o c o m p o s i t ep o l y m e r f i l m i v 独创性声明 学位论文题目：堑型皇速型生塑笾蹙墨煎盟剑 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文 中己加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、 朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：新妩铺 签字日期：唧7 年铲月2 8 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 每位论文作者签名：部觑夺丛导师签名：引勿饼 岐i 签字日期：川年午月驾日 签字日期： 舢y 年丫月甥日 西南大学硕十学位论文 第一部分综述 第一部分综述 2 1 世纪席卷全球的现代科技革命是以生物技术与信息技术为主要特征。两种 高新技术的相互融合，派生出一个全新的、异常活跃的研究领域一生物信息技术 体系，生物传感器则是其中最典型的代表，它的出现，是科学家的兴趣和科学技 术发展及社会发展需求多方面驱动的结果，经过4 0 多年的发展，已经成为一个涉 及内容广泛、多学科介入和交叉、充满创新活力的领域。生物传感器由于具有灵 敏度高，选择性好，设备简单，检测迅速和容易实现在线活体检测等特点，已在 生物医学、环境检测、食品医药工业等领域展现出十分广阔的应用前景n 。 1 生物传感器的简介 1 1 生物传感器的定义 生物传感器是将具有分子识i i i i 力的生物活性材料( 如酶、蛋白质、d n a 、抗 体、抗原、生物膜等) 作为敏感元件【2 1 ，与物理化学换能器有机结合的一门交叉学 科，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控方法【3 1 ，也是物质分子 水平的快速、微量分析方法。随着近代电子技术和生物工程的快速发展，生物传 感器的数量和种类迅速增加。 1 2 生物传感器的工作原理 生物传感器由生物识别元件o a i o r e c e p t o r ) 和换f l l 器( t r a n s d u c e r ) 两个部分组成。 生物识别系统能将生物化学领域的信息，通常为分析物的浓度，转换为具有一定 灵敏度的化学或物理输出信号：而传感器的换能器部分则负责把识别系统输出的 信号进行转换，通过检测器进行检l l l t 4 】，其原理如图1 1 所示。传感器的性能主要 包括选择性、灵敏度、响应时间、可逆性和寿命等。 具有分子识别功能的主要生物物质包括酶、抗原、抗体、微生物和动植物组 织等。生物功能物质能够识别相应的生物分子，具有很高的选择性。例如辣根过 氧化物酶能从多种分子的混合溶液中，高选择性地识别过氧化氢，并把它氧化为 水或还原为氧气。例如葡萄糖氧化酶能从多种分子的混合溶液中，高选择性地识 别葡萄糖，并把它氧化为葡萄糖酸内酯。 两南大学硕士学何论文 第一部分综述 1 3 生物传感器的分类 信号 传感器 图1 1 生物传感器的工作原理图 - 测得物的 输出 生物传感器发展至今己有4 0 多年，在基础研究、应用研究、新产品开发和商 品化等各方面都取得了惊人的进展。这些生物传感器有不同的分类法【5 ，其中根 据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感物质分类【8 】，可将生物传感器分为酶生 物传感器、微生物传感器、组织传感器、基因传感器、免疫传感器等。生物传感 器按生物识别元件分类如图1 2 所示。 区固臣困 图1 2 生物传感器按生物识别元件分类 ( 1 ) 酶传感器( e n z y m eb i o s e n s o r ) 酶传感器是应用固定化酶作为分子识别元件的生物传感器。依据信号转换器 的类型，酶传感器大致又可分为酶电极、酶场效应管传感器、酶热敏电阻传感器 等。生物传感器中的酶往往使用固定化技术使其活性保持稳定并能多次重复使用。 酶电极就是常用的生物传感器。 2 两南大学硕士学位论文 第一部分综述 ( 2 ) 微生物传感器( m i o b i a lb i o s e n s o r s ) 微生物传感器是使用微生物活细胞或细胞碎片作为分子识别元件的生物传感 器。许多生物传感器中用全活细胞( w h o l el i v i n gc e l l s ) ，如细菌、酵母和真菌等活 微生物的代谢功能检测污染物。 ( 3 ) 免疫传感器( i m m u n o s e n s o r s ) 免疫传感器是应用免疫物质( 抗原或抗体) 作为分子识别元的生物传感器。免疫 是指肌体对病原生物感染的抵抗能力，抗体通过与外来的异物( 即抗原) 结合， 形成复合体而将抗原清除。利用这种抗原，抗体的识别结合反应可以这得免疫传 感器。 ( 4 ) 组织传感器( t i s s u es e n s o r ) 组织传感器是以活的动植物组织作为分子识别元件，并与相应的信号转换元 件构成生物组织传感器。 ( 5 ) 细胞传感器( o r g a n e l l es e n s o r ) 细胞传感器是由酵母细胞、动物癌细胞、细菌细胞等作为分子识别元件的生 物传感器。 ( 6 ) d n a 传感器( d n as e n s o r ) d n a 传感器是以已知序列的单链d n a 分子作为分子识别元件，该单链d n a 分子称为d n a 探针，按照d n a 碱基配对原理，该探针能够识别样品中的靶d n a 并与之结合，从而达到检测d n a 的目的。 在上述生物传感器中，以电化学为基础的电化学生物传感器始终占有最重要 的地位，这类传感器又称为生物电极，它发展早，普及快，研究内容丰富。电化 学式酶生物传感器把固定化酶和电化学传感器结合在一起，因而具有独特的优点： 1 它既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；2 由于酶的专属 反应性，使其具有高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。因此，酶电极 在生物传感器领域中占有非常重要的地位。 1 4 生物传感器的发展历程 1 9 6 2 年，c l a r k 在纽约自然科学学会的论文集中首次提出了“在化学电极的敏 感膜中加入酶以实现对目标物进行选择性分析”的设想。1 9 6 7 年，u p d i k e 等人把葡 萄 糖氧化酶固定化膜和氧电极组装在一起，制成了第一代生物传感器 9 】。该电极 的问世标志着生物传感器的诞生，这一工作对生物分析来说也具有里程碑的意义。 从此，国际上开始对生物传感器进行广泛的研究。第一个商业化的生物传感器于 西南大学硕十学位论文 第一部分综述 1 9 7 2 年由y e l l o ws p r i n g s 仪器公司制造，之后又由l e e d s ，n o r t h r u p 和b e c k m a n 仪器公司相继推出，这些传感器均是用于血糖和尿糖检测的电化学传感器。1 9 7 5 年，j a n a t a 1 0 】研制出了电化学免疫生物传感器。第一个微生物传感器是1 9 7 5 年由 d i v i e s c 用完整活细胞取代纯酶制成的测定乙醇的传感器【l l 】，而电位型微生物传感 器则出现于1 9 7 7 年【1 2 1 。继酶电极和微生物电极之后，基于各种动植物组织切片的 组织传感器相继被报道【1 3 1 4 】。1 9 7 4 年，瑞典l u n d 大学的m o s b a c h k 和d a n i e l s s o n b 将酶固定在柱填充物上形成酶柱，与保温池和流动管路构成反应系统，发明了酶 热生物传感器【15 1 。1 9 8 0 年c a r a s 和j a n a t a 1 6 1 首先研制成功可测定青霉素的酶场效 应晶体管 f e t 生物传感器，这一成果为离子敏场效应晶体管 i s f e t 开创了新的研 究领域，又为生物传感器的微型化，全固态化，集成化和多功能化开辟了一条新 的途径，实现了生物传感器与微电子技术的结合，为生物传感器应用于医学领域 开辟了新的途径。 八十年代，以抗体为识别元件的免疫传感器开始使用。近些年来，d n a 、r n a 甚至人工识别元件都先后应用于生物传感器中 1 7 - 1 8 】。由于酶分子具有选择性好和 催化效率高等优点，酶是生物传感中研究的最活跃的生物识别元件n9 j ，而换能器 中又以电化学换能器最具优势，其中安培型酶生物传感器是研究和应用最多的生 物传感器，其主要发展目标是实现在医学和临床诊断领域的实际应用 2 0 - 2 7 ，其中安 培型酶生物传感器是研究和应用最多的生物传感器。基于酶或其他生物分子与电 极间电子转移的机理可将生物传感器分为三代啪1 。 ( 1 ) 第一代生物传感器 用酶的天然电子传递体一氧来沟通与电极之间的电子通道，直接检测酶反应 底物的减少或产物的生成的传感器，称为第一代生物传感器。第一代安培酶生物 传感器的响应，检测机理分述如下： a 氧化还原酶类： 以葡萄糖氧化酶为例，用氧化还原酶的天然电子受体一氧来作为酶的氧化还 原活性中心的电子受体，其响应机理如下： 酶层：g o d ( f a d ) + g l u c o s e + h 2 0 2 一g o d ( f a d h 2 ) + g l u c o n i ca c i d g o d ( f a d h 2 ) + 0 2 一g o d ( f a d ) + h 2 0 2 电极：过氧化氢电极 h 2 0 2 2 1 4 + + 0 2 + 2 e 一 反应结果通过检测产物浓度的变化或氧的消耗量来测定底物。这个方法有一 定的缺点：溶解氧的变化可能引起电极响应的波动，由于氧的溶解度有限，当溶 解氧贫乏时，响应电流明显下降，从而影响检出限；另外，h 2 0 2 在金属电极和碳 电极上氧化的过电位均较高，一般在+ o 6 一+ 0 8vv s a g a g c l ，试样中共存的其 4 西南大学硕十学位论文 第一部分综述 它电活性物质，如抗坏血酸、维生素c 和尿酸等，也可以在此电位下氧化而产生氧 化电流，给测定带来干扰。解决这一问题一是采用各种选择性渗透膜去掉干扰物 质；另一方法就是采用化学修饰电极降低过电位，如普鲁士蓝修饰电极，金属卟 啉修饰电极等 2 9 3 1 】，但其灵敏度始终受到体系中溶解氧浓度的限制。 ( 2 ) 第二代生物传感器 为克服第一代传感器受氧分压影响和h 2 0 2 过电位高、干扰多、受氧溶解度限 制等，自7 0 年代起人们开始用小分子的电子传递媒介体来代替氧沟通酶的活性中 心与电极之间的电子通道，通过检测媒介体的电流变化来反映底物浓度的变化， 这就出现了第二代生物传感器。以辣根过氧化物酶为例，检测机理分述如下： 酶层：h 2 0 2 + h r p c o m p o u n di + h 2 0 c o m p o u n di + m e d r c d _ c o m p o u n di i + m e d o x c o m p o u n di i + m e d r e a _ h r p + m e d o x 电极：m e d o x + 矿+ e - _ m e d r e a 由于第二代生物传感采用了电子媒介体，这就要求所选用的优良的电子媒介 体应具备如下性质：可与酶的氧化还原辅基快速反应；能吸附或滞留在电极表面； 呈现可逆的电极反应动力学；具有较低的氧化还原电位，并与p h 无关；氧化还原 形式能稳定存在；对氧惰性或非反应活性；无毒或毒性很低。已见报道的电子媒 介体数量较多，最常见的有铁氰化物【3 2 - 3 3 、有机染料3 4 3 6 1 、二茂铁及其衍生物【3 7 。3 8 1 、 有机导电盐【3 9 】、酞箐【4 0 】等。电子媒介体促进了酶与电极之间的直接电子传输，起 到了酶与电极间的电子开闭器作用，加速了电极反应；另外采用的氧化还原中间 体具有较低的氧化还原电位，工作电极可以在较低的电位下测定，从而减少了其 它电活性物质的干扰，提高了测定的灵敏度和准确度，从而克服了第一代电流型 传感器的一些缺点。 ( 3 ) 第三代生物传感器 媒介体的参与也有一些不可避免的缺点，由于电子媒介体的引入会增加电极 制备难度，可能影响酶的稳定性和生物活性，同时多数介体型酶传感器面临媒介 体泄漏的困扰。第三代生物传感器则实现了酶与电极间的直接电子转移，利用酶 自身与电极间的直接电子转移来完成信号的转换，而与氧或其他电子受体无关， 无需引入外加媒介体，因此固定化相对简单，无外加毒性物质，是最理想的生物 传感器。 以辣根过氧化物酶为例，其响应机理为： 酶层：h r p 他d + h 2 0 2 一冲o x + h 2 0 电极：h 】o x + e 一_ h i 冲硎 有一些分子量相对低的电子载体一如细胞色素c 、细胞色素c 5 、铁氧化还原蛋白、 5 西南大学硕士学位论文 第一部分综述 黄素氧化还原蛋白和一些其它蛋白质，可以在金属酶电极上观测到电子的直接传 递【4 1 也】。高分子量酶的活性中心深埋在多肽结构内部，因而很难发生直接电子传 递。为了实现电子在电极上的直接电子传递，近年来发展了许多固定化的新型材 料如有机导电聚合物膜【4 3 】、有机导电复合材料膜【删金属纳米颗粒或金属和非金属 纳米颗粒 4 5 - 4 8 】。用上面材料所构建传感器性能稳定、工作电压较低、使用寿命较 长、受氧及其底液中电活性物质干扰较小；能较好地保持蛋白质分子的生物活性等 优点，为生物传感器的发展开辟了新的方向。 2 生物传感器的应用及前景 生物传感器的高度自动化、微型化与集成化，减少了对使用者环境和技术的 要求，适合野外现场分析的需求，在生物医学、环境监测、食品、医药及军事医 学等领域有着重要应用价值。 2 1 1 在生物医学上的应用 生物传感器除用于监测多种细菌、病毒及其毒素，还可以用来测量乙酸、葡萄 糖、蛋白质、乳酸、乳糖尿酸、抗生素、谷氨酸等各种氨基酸，以及各种致癌物质。 免疫传感器等生物传感器可用来检测体液中的各种化学成分，为医生的诊断提供 依据。因此运用生物传感器技术实现化合物准备、生物活性测定和数据分析处理 的自动化，建立简便快速的大规模的生物检测方法是未来新药研究开发的关键之 一o 2 1 2 在食品工业中的应用 现在，随着人们生活水平的提高，人们对食品质量和安全性的要求越来越高， 为保证食品质量及对加工过程进行人为的控制，需要比较合适的分析方法【4 9 】。 h o s h i 掣5 0 】用微生物传感器非破坏性地检测鱼肉鲜度。亚硫酸盐通常用作食品工业 的漂白剂和防腐剂，采用亚硫酸盐氧化酶为敏感材料制成的电流型二氧化硫酶电 极可用于测定食品中的亚硫酸含量。曾经有人报道，为了食品安全的免疫传感器， 利用亲和性传感器检测食品添加剂和污染物，进行食品中氨基酸，脂肪酸和糖类 的分析【5 。 2 1 3 在生物工程中的应用 生物传感器在生物工程上应用主要包括在基因工程、发酵工程、细胞工程及 酶工程上的应用。基因工程上应用：众所周知，双链d n a 分子中的碱基是互补的。 若合成出与被测目标物d n a 分子碱基序列互补的单链d n a 分子，并以此作为生 物传感器的探针，结合换能器就能够将所发生的杂化反应的有关信息记录下来。 利用生物工程技术生产药物时，将生物传感器用于生化反应的监视，可以迅速地 获取各种数据，有效地加强生物工程产品的质量管理。又如在发酵过程中，尤其 6 西南大学硕十学位论文第一部分综述 是在发酵过程中的中后期，需要对发酵罐中细菌浓度进行定时检测，以确定停止 发酵的最佳时间。把生物传感器用于发酵工程中，将使工作效率得到极大的提高： 酶工程上应用：酶生物传感器的发展，直接推动了酶工程的进步，在酶工程的研 究中有着举足轻重的作用。 2 1 4 军事上的应用 生物传感器技术在军事领域中具有广阔的应用前景。由于生物传感器具有高 度特异性、灵敏性和能快速地探测化学战剂和生物战剂的特性，将是最重要的一 类化学战剂和生物战剂侦检器材。如检测神经剧毒剂沙淋、梭曼等【5 2 】。单克隆抗 体的出现及其与微电子学的联系，使超敏感、小型生物传感器成为发展可能。因 此，生物传感器在军事上的应用前景将更为广阔。 2 1 5 在环境监测中的应用 随着环境污染问题日益严重，人们对能够连续、快速、在线监测污染物的仪 器的需求也愈来愈迫切。自从8 0 年代初国际上开始了对生物传感器的广泛研究以 来，目前己有很多生物传感器应用于环境监测【5 3 5 4 】。用酶抑制法测有机磷和氨基 甲酸酯农药，用微生物传感器可测生物需氧量，致突变物，n h 3 、n 0 2 和甲烷等， 还有一些免疫传感器可测多氯联苯、甲苯和二甲苯等【5 ”引。 2 2 生物传感器的应用前景 生物传感器是极具有发展潜力的学科领域，作为知识经济的新增长点，作为 知识经济的新增长点，它将促进生物技术产业和常规生物产业的发展，可为许多经 济领域提供不可缺少的信息。国家“十五”计划，传统的生物传感器技术和新型生 物传感器技术都列入其中。生物医用纳米传感器正成为新的研究热点。相信现代 电子学、微电子学、材料科学、及生物技术等相关领域的发展，必将会促进生物 传感器技术发展，进一步提供高效、快速的分析方法代替传统的实验室技术，进 而为生物分析带来技术革命。 3 生物传感器的制备 3 1 生物传感器中生物分子识别物质的固定化 在生物传感器的构建中，其关键技术之一就是如何将生物分子稳定、高活性 地固定到换能器表面。在选择固定化技术时需考虑如下要求：对不同电极表面方 法的可用性；处于固定化状态的酶应呈现最大的生物活性；固定化的酶应可在比 溶液中较宽的p h 范围或不同的p h 下操作；具有较高的稳定性；具有同时固定多 种酶的能力；必须尽量避免或很少有酶的泄漏。为了研制廉价，高灵敏度、高选 择性和长寿命的生物传感器，固定化技术始终是生物传感器研究的重要课题。现 以酶为例对生物分子识别物质的固定化方法作一简单介绍。 7 两南大学硕士学位论文 第一部分综述 3 1 1 共价键合法 共价键合法实际上是一种表面修饰，基质可以是转换器即电极本身或另外一 种能够在其操作中沉积到电极表面的聚合物材料，即通过共价键将酶直接结合到 电极表面。如i a n n i e l l o t 5 9 】等通过等离子体蚀刻并用氰尿酰氯活化，在石墨电极表面 上共价键合可葡萄糖氧化酶。也可先在电极表面上修饰一层合成高分子或生物高 分子，然后将生物分子识别物质键合到高分子膜上。例如采用功能化的聚吡咯表 面可以直接将葡萄糖氧化酶共价键合固定化例。如戊二醛，它是一种双功能试剂， 其分子末端有两个醛基基团，它们能和生物分子的氨基发生反应，形成类似s c h i f f 碱的衍生物。该固定化方法的程序简单，且能形成强的生物分子化学键联，因此 被广泛地使用，如吉林大学用戊二醛作交联剂构造了( a s n p s g o x ) n 多层的葡萄糖 氧化酶生物传感器【6 1 1 。共价键合法的优点是酶结合的牢固，稳定性好。酶固定的 稳定性与其他方法相比是最好的，但如果共价键在生物分子的活性部位键合，或 反应条件苛刻，都会使生物分子的活性降低1 6 2 1 。 3 1 2 吸附法 基于生物分子极性键、氢键、疏水键以及静电等作用将生物分子吸附于不溶 性载体上。此制备过程是通过非化学键力的直接吸附固定生物分子，所以对生物 分子的活性影响较小，传感器响应较好。如y a m a g u c h i 6 3 等通过溶剂挥发，在碳糊 电极表面吸附一层葡萄糖氧化酶，然后用火棉胶乙醇进行处理，火棉胶在电极表 面形成一层薄的硝纤膜，而使酶保持在电极表面。一周后，电极仍保留其起始响 应。邓家祺畔】等利用无机材料如分子筛的强烈的吸附特性，以此作为载体。先将 分子筛用聚乙烯醇调制后固定于电极表面，然后使生物分子识别物质吸附固定于 分子筛膜内，即可构成生物传感器。t u r n e r t 6 5 】等通过滴涂的方式将酶吸附在印制电 极表面而实现了酶的固定化。但吸附法对溶液的p h 变化、温度、离子强度和电极 基底较为敏感，需对实验条件进行优化，且生物组分易从电极表面脱落，生物组 分的寿命较短。 3 1 3 包埋法 包埋法一般是采用聚合物包埋，不需要与生物物质的残基进行结合反应，很 少改变生物活性物质的高级结构，因而生物活性损失很少。常用材料主要有聚丙 烯酰胺、聚氯乙烯( p v c ) 、聚乙烯醇( p v a ) 、聚碳酸酯、尼龙、多肽、醋酸纤维 等合成高聚物及海藻酸、明胶、胶原等溶胶状高聚物。这种方法一般宜于作用于 小分子底物和产物的生物活性物质，而作用于大分子底物和产物的生物活性物质 因传质阻力过大而不宜采用。 3 1 4 溶胶一凝胶( s o l g e l ) 法 溶胶一凝胶( s o l - g e l ) 法是金属醇盐或半金属醇盐在水、互溶剂及催化剂存在 8 两南大学硕士学何论文第一部分综述 下，经水解缩聚等化学反应形成的三维网络结构1 6 剐。该技术应用于生物传感器领 域具有如下突出的优点：制备条件十分温和，通过溶胶一凝胶制备条件的优化，可 控制基质的孔径大小和分布，使酶分子有足够的自由活动空间而又不至于从基质 中流失，从而提高传感器的使用寿命。 3 1 5 自组装( s e l f - a s s e m b l y ，s a ) 法 自组装( s e l f - a s s e m b l y ，s a ) 法，s a m 法是基于分子自组( 分子间化学键) 作用， 在固体表面上自然地形成高度有序的单分子自组膜方法。自组装薄膜与基底之间、 膜层之间的作用力主要包括共价键、配位键、离子一共价键、电荷转移、氢键、 静电吸引等。s a m 是具有高度有序、定向密集、组织完好、热力学稳定和能量最低 的有序体系，其组成结构和功能关系易于调控和表征，而且制备方法简单，是研 究表面和界面现象的理想模型体系7 1 ，研究对象由聚阴离子和聚阳离子电解质扩 展到生物大分子、金属胶体粒子等。该技术将酶或其它生物活性单元固定到自组 装膜电极上，生物活性单元保持接近天然的结构和生物催化活性，被广泛应用于 生物传感器领域。 3 1 6 电化学聚合法 在电聚合过程中将酶作为掺杂阴离子，靠静电吸引作用与带正电荷的聚合物 骨架相作用，把酶掺杂在聚合物膜中而直接固定到电极表面上的固定化方法称之 为电化学聚合法，也是近年来发展的聚合物包埋技术。这种方法具有快速、一步 且全电化学程序的特点，固定的酶分布能立体可控，所形成的聚合物的膜度和膜 致密程度都可通过控制沉积的电荷等来控制，尤其适用于生物传感器的微型化构 造。但是用该固定化方法固定的酶量可能比较小，背景电流较大，且大量的酶被 浪费在电聚合的溶液中。另外，基于该法所构造的生物传感器的稳定性和贮藏寿 命有待于进一步的提高。目前最常用于固定化的聚合物有：导电的聚吡咯( p p 【6 8 】， 聚苯胺( p a n i ) 【6 9 1 ， 聚邻苯二胺【7 0 1 ，非导电的聚苯酚【7 l 】等。对于那些本身具 有选择渗透性的非导电聚合物，在构造性能优秀的安培生物传感器方面具有非常 好的前景。导电聚合物通常用电解法聚合到惰性电极上。一般有两种方法，即“一 步法”和两步法。一步法是指在聚合前将酶与单体、支持电解液混合，在电极上 电解生成导电聚合物膜的同时，将酶包裹于聚合物中。比较其他法，一步共聚合 的方法具有简单、不使用有机溶剂、不进行化学反应、能够更好保持酶的活性、 成膜均匀等优点。 3 2 生物功能物质的固定材料 生物分子的固定材料主要包括纳米材料、碳纳米管、有机导电聚合物以及纳 米复合材料等。 3 2 1 ，纳米材料 9 两南大学硕士学位论文 第一部分综述 纳米材料是指颗粒尺寸在l 1 0 0 n m 的超细材料，其尺寸大于原子簇而小于通 常的微分，处在原子簇和宏观物体交界的过渡区域。纳米材料与其对应的正常态 材料相比，密度降低，强度和硬度提高，塑韧性改善，扩散能力提高，热膨胀系 数提高，导热性降低，弹性模量降低。此外还具有一些独特的物理性能，如超弹 性模量现象、磁致热效应等。纳米粒子的几个主要的特性：( 1 ) 表面效应：固体 表面原子与内部原子所处的环境不同，随着纳米