（无机化学专业论文）钌Ⅱ配合物的dna键合及拓扑异构酶抑制研究.pdf

摘要 钌( ) 配合物的d n a 键合及拓扑异构酶抑制研究 专业：无机化学 硕士生：王贻灿 指导教师：计亮年院士，巢晖教授 摘要 本文共分三章。 第一章，绪论，主要介绍了d n a 、拓扑异构酶的基本知识，介绍了钌( i i ) 多 吡啶配合物与d n a 相互作用以及其作为拓扑酶抑制剂的研究方法和进展。 第二章，设计和合成了含有不对称p a i d h 的手性钌配合物， r u ( b p y ) 2 p a i d h “，a r u ( b p y ) 2 p a i d h 2 + 。通过e a ，m s ，1 h n m r 、c d 表征 了这两个化合物。用循环伏安法研究了它们的电化学性质。用紫外吸收光谱、荧 光光谱、琼脂糖凝胶电泳等实验方法研究了配合物与d n a 的作用。利用凝胶电 泳方法研究了它们的拓扑酶抑制效果。结果显示，这两个化合物对拓扑异构酶没 有效果。 第三章，设计和合成了含氟取代的六个手性钌多吡啶配合物 a a r u ( b p y ) e l “。( l = p 兀p ( 4 一氟苯基咪唑并 5 ，6 - f 邻菲咯啉) ，o d f i p ( 3 ，4 一二氟苯基咪唑并 5 ，6 一f 邻菲咯啉) ，o t f i p ( 3 ，4 ，5 一三氟苯基咪唑并 5 ，6 - f l 邻菲咯啉) 。通过e a 、m s 、1 h n m r 、c d 表征了这六个配合物。通过其与d n a 的作用，表明这六个化合物均能够与d n a 相互作用，且人构型略好于构型。 从配合物与拓扑酶的抑制效果上看，我们发现，对于a - r u ( b p y ) 2 p f i p 2 + 与 a - r u ( b p y ) 2 p f i p “，不论是t o p o i ，还是t o p oi i ，人构型总是强于构型。对 于a - r u ( b p y ) e o d f i p l 2 + 和a - r u ( b p y ) 2 0 d f i p 2 + ，抑制t o p o i 时，构型表现较 好，而抑制t o p o i i 时，a 构型表现较好。对于a - r u ( b p y ) e o t f i p 2 + 和 2 0 0 9 中山大学硕十学位论文王贻灿 a - r u ( b p y ) 2 0 t f i p “，抑制t o p o i 时，a 构型表现较好，而抑制t o p oi i 时，a 构 型表现较好。在这六个配合物中，抑制t o p o i 效果最好的是a - r u ( b p y ) 2 0 d f i p “， 而抑制t o p oi i 效果最好的是人一 r u ( b p y ) 2 0 d f i p “。 关键词：钌( i i ) 多吡啶配合物，拓扑异构酶，d n a ，键合，抑制 摘要 d n a b i n d i n ga n dt o p o i s o m e r a s ei n h i b i t i o nb y r u t h e n i u m ( i i ) p o l y p y r i d y lc o m p l e x e s m a j o r ：i n o r g a n i cc h e m i s t r y n a m e ：y i - c a nw a n g s u p e r v i s o r ：p r o f l i a n g - n i a nj i p r o f h u ic h a o a b s t r a c t t h i st h e s i sc o n s i s t so ft h r e ec h a p t e r sa sf o l l o w i n g t h ef i r s tc h a p t e r ：a se x o r d i u m , i tf n s ti n t r o d u c et h eb a s i ck n o w l e d g eo fd n aa n d t o p o i s o m e r a s e ，a n dt h e nh i g h l i g h t s s o m er e c e n tp r o g r e s s e si nt h ed n a b i n d i n ga n d t o p o i s o m e r a s ei n h i b i t i o ns t u d i n go fr u t h e n i u m ( i i ) c o m p l e x e s t h es e c o n dc h a p t e r ：t w oc h i r a lr u t h e n i u mr u t h e n i u m ( i i ) c o m p l e x e s a r u ( b p y ) 2 p a i d h “，a - r u ( b p y ) 2 p a i d h “( b p y = 2 , 2 b i p y r i d i n e ，p a i d h = 2 - p y r i d y l - 1 h - a n t h r a 1 ，2 - d i m i d a z o l e - 6 ，1 1 - d i o n e ) w e r ed e s i g n e d a n d s y n t h e s i z e d t h e yw e r ec h a r a c t e r i z e db ye a , 1 hn m r ，m s ，c d t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so f t w oc o m p l e x e sw e r es t u d i e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y t h ed n ab i n d i n gb yt h et w o c o m p l e x e sw e r es t u d i e db yu v - v i ss p e c t r a , f l u o r e s c e n c es p e c t r a , d n at h e r m a l d e n a t u r a t i o na n dg e le l e c t r o p h o r e s i s t o p o i s o m e r a s ei n h i b i t i o nb yr u t h e n i u m ( i i ) p o l y p y r i d y lc o m p l e x e sh a sb e e ns t u d i e db yr e l a x a t i o na s s a ya n ds t r a n dp a s s a g ea s s a y t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h et w oc o m p l e x e sh a v en oi n h i b i t i o na c t i v i t i e so nt o p 0ia n d t 0 p o i i t h et h i r dc h a p t e r ：as e r i e so ff i g a n d sc o n t a i n i n gs u b s t i t u e n tfa n dt h e i rc h i r a l r u ( i i ) c o m p l e x e s ，【r u ( b p y 2 l 2 + b p y = 2 ，2 b i p y r i d i n e ，u = p f i p ( 4 一f l u o r o p h e n y l i m i - d a z o 4 ，5 胡一1 ，1 0 - p h e n a n t h r o l i n e ) ，o d f i p ( 3 ，4 - d i f l u o r o p h e n y l i m i d a z o 4 ，5 - f l - 1 ，1 0 - p h e n a n t h r o l i n e ) ，o t f i p ( 3 ，4 ，5 一t r i f l u o r o p h e n y l i m i d a z o 4 ，5 - f l 1 ，1 0 - p h e n a n t h r o l i n e ) w e r e i i i 2 0 0 9 中山大学硕士学位论文 王贻灿 s y n t h e s i z e d t h e yw e r ec h a r a c t e r i z e db ye a , 1 h n m r ，m s ，c d t h ed n a - b i n g d i n g e x p e r i m e n t ss u g g e s tt h a tac o n f i g u r a t i o ni sb e t t e rt h a nac o n f i g u r a t i o n t h et o p 0 i n h i b i t i o ne x p e r i m e n t ss u g g e s tt h es a m er e s u l tb e t w e e na - r u ( b p y ) e p f i p z + a n d 人 r u ( b p y ) 2 p f i p 2 + h o w e v e r , f o ra r u ( b p y ) 2 0 d f i p 2 + a n da r u ( b p y ) e o d f i p “， a - r u ( b p y ) 2 0 d f i p 2 + i sb e t t e ri ni n h i b i t i n gt o p o i ，w h i l ea 一 r u ( b p y ) 2 0 d f i p i z + i s b e t t e ro nt 0 p oi i s i m i l a rr e s u l t sw e r eo b s e r v e df o ra - r u ( b p y ) 2 0 t f i p i 抖a n d 人一 r u ( b p y ) 2 0 t f i p 抖 k e y w o r d s ：r u ( i i ) p o l y p o r i d y lc o m p l e x e s ，d n a ，t o p o i s o m e r a s e ，b i n d ，i n h i b i t i o n 原创性说明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：三月参义1 1 1 日期：2 0 0 9 年4 月2 0 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定 机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢 利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室 被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：王月磊j 7 t 日期：盘幻1 年箩月2 。日 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导 师指导下完成的成果，该成果属于中山大学化学与化学工程 学院，受国家知识产权法保护。在学期间与毕业后以任何形 式公开发表论文或申请专利，均需由导师作为通讯联系人， 未经导师的书面许可，本人不得以任何方式，以任何其它单 位作全部和局部署名公布学位论文成果。本人完全意识到本 声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：互夕忽旭 日期：2 0 0 9 年4 月2 0 日 第章绪论 1 1 引言 第一章绪论 随着人们对生命过程认识的深刻，无机元素在生命体系中物质传输、生命催 化、能量转移等至关重要的作用，激起了生物化学与无机化学工作者的兴趣。生 物无机化学家将无机化学原理和研究方法应用于生物体系中无机元素，尤其是过 渡金属元素及其化合物的结构与生理功能的研究中，从宏观和微观的角度，研究 无机元素在生物体内的循环、吸收、代谢，研究金属离子及其配合物与生物大分 子之间的相互作用等【1 ，引。无机化学与生物学学科的交叉渗透，使生物无机化学 成为了交叉前沿研究领域。 2 0 世纪6 0 年代，r o s c n b e r g 等发现c i s p l a t i n 具有抗肿瘤活性。随后，h e r m a n n e g a u b ，r u p e r tk r a u t b a u c r 和h a u k cc l a u s e n s c h a u m a n n 研究了c i s p l a t i n 的抗肿 瘤机制，发现c i s p l a t i n 能机械地稳定d n a ，使之不能被阅读，从而导致细胞不 能分裂，阻断了肿瘤的生长。1 9 7 8 年，c i s p l a t i n 作为抗肿瘤药物应用于了临床。 c i s p l a t i n 的发现以及迅速的应用于临床，大大促进了生物无机化学的快速发展1 3 l 。 研究金属配合物在抗肿瘤药物、分子生物学、生物工程及其它有关领域的应用， 已成为近十年来生物无机化学领域国际上十分活跃的研究课题。由于核酸的在生 命体系中的重要作用，核酸往往作为研究的重要靶点即】。 核酸是由许多核苷酸聚合而成的生物大分子化合物。根据化学组成不同，核 酸可分为核糖核酸( r n a ) 和脱氧核糖核酸( d n a ) 。d n a 是储存、复制和传 递遗传信息的主要物质基础。d n a 碱基对的排列中包含了遗传信息，储存在细 胞d n a 分子中的生物信息，通过复制、转录和翻译进行遗传和性状表达，这些 信息指导着细胞的生长，代谢和变异。因此，研究d n a 的结构与功能，筛选具 有调控d n a 功能的化合物具有更现实的意义。目前，已设计了许多具有能识别 d n a 构型的结构探针的小分子金属配合物，来探索d n a 结构与其功能。另外， 利用八面体金属配合物的构型选择，使其特定插入d n a 的某一沟区，然后再通 过辅助配体与d n a 沟壁上碱基间的氢键作用和范德华力，可望实现对d n a 的 定点位置的识别，从而能模拟某些d n a 结合蛋白的特异性识别功能，达到对某 些结合蛋白反应性的定点抑制【孔1 1 1 。 自从b a r t o n 发现 r u ( p h e n ) 3 】2 + 能够立体选择性的结合d n a 以来1 1 2 】，钌( i i ) 2 0 0 9 中山大学硕士学位论文 千贻灿 多吡啶配合物已得到了广泛而深入的研究。由于它们的化学稳定性、电子传递能 力、强的发光能力和寿命相对较长的激发态，这类金属配合物已被应用于d n a 结 构探针、d n a 分子光开关、抗肿瘤药物、d n a 特异性位置识别及d n a 的断裂等 多领域【1 3 2 4 1 。 1 2 钌( i i ) 多吡啶配合物与d n a 的作用 1 2 1d n a 的组成与结构 作为生命的遗传物质核酸，是由核苷酸组成，而核苷酸又由碱基、戊糖 与磷酸组成。其中，碱基包括两种嘌呤，即腺嘌呤( a ) 和鸟嘌呤( g ) ；三种嘧 啶碱，即胞嘧啶( c ) 、尿嘧啶( u ) 和胸腺嘧啶( t ) 。而戊糖有两种：d 一核糖 和d 2 一脱氧核糖。根据核糖的不同，核酸被分为两大类。一类是核糖核酸 ( r n a ) ，主要由a 、u 、c 、g 四种碱基的核苷酸组成，它的主要功能是将d n a 的遗传信息翻译和表达成具有各种功能的蛋白质，另一类是脱氧核糖核酸 ( d n a ) ，主要由a 、t 、c 、g 四种碱基的核苷酸组成。它是遗传信息的真正携 带者。 o 胸腺嘧啶胞嘧啶( c ) 图卜1嘌呤碱和嘧啶碱结构 每个人体细胞d n a 约含有1 0 0 亿个碱基，分子量很大，并且d n a 具有丰 富的结构形态，因此d n a 能包含生物物种的所有遗传信息。一般来说，d n a 分 子的结构，可以分成三个层次来描述。 2 玲h 孵 秒 o人一h n 土 枞 p 、， u - ， 啶嘧尿啶嘧 第$ 纬皓 釜i ：霪蓁 鬻黑“鬈饕 。一弧一鹚玛 图卜2n n a 双螺旋结构 1 9 5 3 年，w a t s o nj 和c r i c kf 在前人研究的基础上，根据d n a 结晶的x 衍 射图谱和分子模型，提出了著名的d n a 双螺旋结构模型。d n a 双螺旋结构的特 点： f 1 1 在d n a 分子巾，两条d n a 单链( 多聚脱氧核糖核苷酸链) 围绕 一个其同轴平行盘旋形成右手螺旋结构。 ( 2 ) d n a 双螺旋中的两条链走向是反平行的，一条链是5 _ 3 走向， 另一条链是3 _ 5 走向。两股链之间在空间上形成一条大沟和一条小沟。 3 1 双螺旋链的外侧即为链的骨架是由交替出现的、亲水的脱氧核糖基和 磷酸基构成。双螺旋的内侧是碱基。两股链中的嘌呤和嘧啶碱基在氢键 的作用下互补配对并且具有严格的配对规律，总是出现在腺嘌呤与胸腺 嘧啶之间( a = t ) ，形成两个氢键；或者出现在鸟嘌呤与胞嘧啶之间( g = c ) ， 形成三个氢键。这种氢键也正是形成双螺旋的力。 f 4 1 双螺旋的螺距( 即螺旋旋转一圈) 为34 n m ，直径为20 n m 。每 2 0 0 9 中山大学硕士学位论文于贻灿 条链相邻碱基之间的碱基对层间的距离为0 3 4 n m 。 d n a 双螺旋结构在生理条件下是很稳定的。维持这种稳定的主要作用力是 包括碱基堆积力，它是由芳香族碱基的p 电子相互作用引起的；由于d n a 分子 中的碱基层堆积而在分子内形成一个疏水环境，从而促使互补碱基形成的氢键作 用；第三种力是磷酸残基上的负电荷与介质中的n a + 、k + 、m n 2 + 等阳离子之间 形成离子键。但是，如果改变介质条件和环境温度，双螺旋的稳定性将受到影响。 d n a 是一种柔性的生物大分子，其由于扭转角度和各种碱基排列方式不同 而产生各种各样构型d n a ，如a 、b 、c 、d 和z 等构型。这些结构全为双螺旋， 但构型却明显不同。其中，b d n a ，即最常见的右手螺旋结构是大多数天然 d n a 的存在方式。所以，可以根据d n a 中沟的宽窄、深浅设计具有d n a 识别 功能的分子，也可以根据一些小分子与d n a 作用的性质，来推测d n a 的结构。 第三，d n a 的三级结构，是指d n a 双螺旋结构的进一步扭曲，或者超螺 旋。超螺旋是三级结构中最常见的一种形式，按其方向分为正超螺旋和负超螺旋 两种 鞴9 n t h a n d 酣 飘j p 喇翱1 口 图卜3 正、负超螺旋 1 2 2 钌( ) 配合物与d n a 的相互作用方式 l j 硪- n a l c 培d 孰妒帮a 咖 钌( i i ) 配合物与d n a 有多种结合方式。按化学键划分，主要有共价结合和 非共价结合。 4 第章缔论 共价结合主要是指金属离子与碱基中的亲和性位簧之恻产生配位结合。如 m e t - r u ( i e r p y ) c i ，向核酸结合时会解离掉两个氧离子，金属离予# f ( i i ) 便与嘌呤碱 的n 原子形成配位键瞄i 。其价作用的强度较大，选择性不高如已应用于临床 的c i s p l a t i n ，它的毒性很大，因此非共价作用的研究得至u t e y 泛的关注【2 6 - 3 1 j 。 非共价作用主要是指过渡金属配合物通过插入作用( i n t e r c a h l i o n ) ，沟而结 合( g r o o v eb i n d i n g ) 静电结合( e l e c t r o s t a t i cs u r f a c eb i n d i n g ) 等与d n a 相互作 用。 静电结合是由于核酸带负电荷的多聚阴离子，而会属离子及其配合物通常带 有正电荷，它们与核酸在外层发生静电作用，通常静电结合力是非常弱的。如 r u ( b p y ) 3 】2 + 与d n a 作用，己被实验证宴是静电作用吲。 在d n a 的双螺旋结构中，存在着大沟( m a j o r g r o o v e ) 和小沟( m i n o rg r o o v e ) 两个区域。大量的证据表明，小分子化合物主要作用于小沟区p 3 】。一些小分子 由于自身独特的立体构型，能够在这两个区域，通过氢键或疏水作用与d n a 结 合。比如配合物【c o ( n h 3 瑚3 + 的配体n h 3 上的氢原子与d n a 磷酸上的氧原子和 鸟嘌呤上的氯原子形成氢键1 3 6 1 。而配合物【c u ( d m p ) 2 + ( d r o p = 2 , 9 d i m e t h y l 一1 1 0 一p h e n a n t h r o l i n e ) 则是通过两个d m p 配体依靠疏水作用嵌在d n a 的小沟处i i 。 图卜4 沟面结合 插入作用是指含有平面芳香稠环结构的配合物通过平面芳香杂环配体插入 d n a ，并且与d n a 的碱基对重叠，主要依靠氢键、范德华力和大环的p - p 堆积 作用而稳定。由于插入作用能够强烈的改变d n a 的性质，因此具有芳香平面的 2 0 c t 山大学倾十学位论文 过渡金属配合物作为潜在的化学治疗试剂得到了深入研究。八面体多吡啶钉配合 物，由于具有有机分子所不具备的庞大体积和特殊形状，与d n a 插入的插入结 合往往比有机分子有更好的d n a 序列选择性甚至还能对d n a 进行手性识别 3 9 4 0 1 。 图1 - 6 “i n s e r t i o n 模式 1 2 3 钉( i i ) 多吡啶配合物与d n a 作用的研究进展 第一章绪论 1 2 3 1 分子光开光 钌( i i ) 多吡啶类配合物的金属到配体的电荷转移跃迁( m l c t ) 峰对外界环 境敏感，当它们与d n a 结合时，其荧光光谱均表现出明显的变化。根据这种引 起这种荧光变化原理，能设计一些配合物成为d n a 的分子光开关。 著名的d n a 分子光开关有【r u ( b p y ) 2 ( d p p z ) 】2 + 和【r u ( p h e n ) 2 ( d p p z ) 】“。由于在 d p p z 上有两个n 原子，n 原子容易与水分子产生氢键而发生质子转移，使配合物 激发态能量容易散失，从而导致【r u ( b p y ) 2 d p p z 】2 + 和 g u ( p h e n h d p p z 2 + 荧光淬灭， 因而在水溶液中不发射荧光。但是当插入d n a 碱基对后，产生的疏水环境使其 d p p z 的吡嗪环上的n 原子免受水分子的进攻而导致配合物荧光的恢复，这就显示 了“光开关 的“开启 效果【4 3 4 4 】。 l 、l r e l 留副d 图1 7r u l 2 d p p z 2 + ( l = b p y p h e n ) 与d n a 作用的荧光光谱 随后的研究在于一方面在已知光开关的基础上改变或者修饰辅助配体和插 入配体。一边设计新的具有光开关性质的化合物。如l i uj g 等人报道了一些具 有d m 盼子光开关性能的配合【r u ( b p , y ) 2 ( h n o i p ) 2 + 、 r u ( d m p ) 2 ( a p p z ) “、 g u ( d m b ) 2 ( a p p z ) “，它们在水溶液中没有荧光，但加入b d 卜a 后，配合物发出了 强烈的荧光【4 5 4 6 】。 另外通过加入其它金属离子而产生另一种形式的光开关效应，即“关开关 效应。配合物【r u ( b p y ) 2 t p p l l z 】“，室温下其水溶液没有可被检测到的荧光，而当 t f p h z 插入到d n a 的碱基对中时，受到了d n a 的疏水环境的保护，延长了激发态 的寿命，因而显示出非常强的荧光。这就显示了“光开关”的“开启 效果。而 7 2 0 0 9 中山大学硕士学位论文王贻灿 当加入c u 2 + 后，荧光被淬灭，这可能是由于t p p h z 配体除了与r u 配位以外，还存 在配位点，c u 2 + 在d 卜a 螺旋的对面与【r u ( b p y ) 2 t p p l l z 】2 + 形成了一个双核配合物 r u ( b p y ) 2 t p p h z c u 4 + 【4 7 j 。t u n 0 等发现【r u ( b p y ) 2 t p p l l z 】2 + 通过加入c 0 2 + 和e d l a 可以 调节荧光的开关，使光开关循环1 4 引。加入c 0 2 + 后形成双核配合物，使荧光被淬灭； 再加入比配体t p p h z 络合能力更强的e d t a ，f f c 0 2 + 从配体t p p l l z 上离去而与e d l a 结合，从而荧光恢复。这样通过双核配合物的形成与离解而达到荧光开关的循环。 图1 - 8 r u ( b p y ) 2 t p p h z 2 + ( 左) 和 r u ( b p y ) 2 t a p t p 2 + ( 右) 此外，根据钌( i i ) 配合物自身的氧化还原性质，还可以设计出具有氧化还原 开关性质的配合物。如y u a ny x 等报道了配合物【r u ( b p y ) 2 p a i d h “，在水和 c h 3 c n ( 5 h 2 0 ) 溶液中都没有荧光。通过对其进行氧化还原处理，发现其还原 后表现出很强的荧光【4 9 1 。 l i l ol u t u m e s c e n c ew 屹e + 2 h + - 鼍2 = = = = = = 矗 而f 司h + 8 3 l u m i n e s c e n c , ”o n 。 第一章绪论 b 冀 要 趴 覆 芒 翟 暑 图1 - 9 ( a ) 醌式结构1 和羟基结构3 的可逆互变；( b ) 配合物1 和3 荧光光 谨 旧 1 2 3 2d n a 结构探针 八面体的钌多吡啶配合物具有、人两种构型，决定其与相同d n a 作用时 存在手性识别和序列选择性。而相同的手性钌配合物作用于不同构象的d n a 时， 由于手性匹配或微环境的差异，配合物的光谱特征及其性质会出现不同程度的 扰动，据此也可以判断其识别情况。b a r t o n 在研究金属配合物与d n a 作用时就 发现，z n 2 + ，c 0 3 + ，r u 2 + 等配位饱和的八面体手性配合物具有识别d n a 二级结构 的能力，从而发展了能识别a 、b 、和z 型d n a 的手性配合物探针。同时，她 也发现配合物【z n ( p h e n ) 3 】2 + 的不同异构体与d n a 作用时存在选择性，由此在生物 无机化学方面开辟了用金属配合物作为d n a 结构探针的新的研究领域【5 咐1 1 。 对于两种构型的【r u ( p h e n ) 3 】2 + ，其与b d n a 作用后，电子吸收光谱都出现 减色和荧光增强现象。然后在相同条件下，构型比人构型荧光增强更多，预 示着构型与b d n a 的结合力也更大。用外消旋的 r u ( d n a 透析研究发现，透析液富集人异构体。同样用外消旋的【r u ( p h e n ) 3 】2 + 对类 的鱼精d n a 进行平衡透析发现，透析液中富集的却是异构体。说明构型与 b d n a 优先结合，人构型与a - d n a 优先结合。因此，可用 r u ( p h e n ) 3 】2 + 来区分 这两种d n a 。后来她在s c i e n c e 上系统阐述了f m ( p h e n ) 3 】2 + 对d n a 二级结构的识 别机理【5 2 1 ，即当异构体中一个p h e n 分子插入d n a 碱基之间，另外两个留在 9 2 0 0 9 中山大学硕士学位论文王贻灿 碱基外面的p h e n 正好与b d n a 的右手螺旋在空间上相匹配：而对于a 异构体 的为插入的两个配体与b d n a 磷酸主链产生了位阻效应，不能很好地与之键合， 这也就是【r u ( p h e n ) 3 】2 + 与d n a 作用的立体选择性的根源所在【5 3 1 。另外，由于左 手螺旋的z d n a 的大沟浅而宽，不存在象b d n a 重的空间位阻效应，故 【m ( p h e n ) 3 】2 + 与z d n a 作用没有立体选择性。 目前已有大量的具有d n a 结构探针性质的钌多吡啶配合物被报道。如 【r u ( t m p ) 3 2 + ( t m p = 3 , 4 ，7 ，8 一四甲基邻菲咯啉) 【矧在疏水和静电共同作用下选择性 的结合a - d n a ，因此可以作为a - d n a 结构探针。 r h ( p h i ) 2 ( p h e n ) 2 + 含有较大的 配体p h i ，其中一个p h i 能够插入b d n a 的大沟处与d n a 碱基形成p p 堆积从 而增强体系的稳定性。p h i 的芳香平面。因此可用于对b d n a 的构型识别【5 5 】 比较典型的是【i h ( d i p ) 3 】“，对于a 一 r u ( d i p ) 3 i “，其4 ，7 - 二苯基邻菲哕啉的两个苯 基可扭转成与p h e n 同一平面而插入b d n a 的碱基中，而由于苯环的空问位阻效 应，另一对映体a r u ( d i p ) 3 2 + 几乎不与b d n a 作用，这样大大增强了其手性选 择性。当与z d n a 作用时，z d n a 又平又浅的沟使两种异构体都有较强的结合。 因此，a - r u ( d i p ) 3 2 + 能敏感区分两种不同手性的b d n a 和z d n a ，从而使其 成为z - d n a 的敏感探针 s 6 - s 引。 图1 1 0 r h ( p h i ) 2 ( p h e n ) 3 + ( 左) a n d r u ( d i p ) 3 2 + ( 右) 1 2 3 3d n a 断裂剂 具有插入作用的钌多吡啶金属配合物，在外界环境的影响下，可以选择性的 切割核酸，从而起到了核酸内切酶的作用。因此，设计、合成能够作为核酸断裂 剂的钌多吡啶配合物已成为热点【5 9 1 。 不同的钌多吡啶配合物对d n a 的切割方式与能力不同。一般来说，钌多吡 1 0 第一章绪论 啶配合物通过两种机理切割d n a ：水解断裂和光断裂。 水解断裂的特点在于通过水解d n a 磷酸链的方式断裂d n a ，但是断裂后的 d n a 在d n a 连接酶的作用下，可以重链。目前，这方面的例子很少，仅知 r u ( d i p ) 2 m a c r o 2 + 在金属离子的催化下能够断裂超螺旋d n a ，而断裂后的d n a 可以通过t 4 一d n a 连接酶重新连接，表明其是通过水解断裂d n a 6 嘶1 1 。 图1 1 1 r u ( d i p ) 2 m a c r o 2 + 光断裂是金属配合物最常见的d n a 断裂方式，光断裂的机理主要有单线态 氧机理和电子转移机理。 普通氧气含有两个未配对的电子，等同于一个双游离基。两个未配对电子的 自旋状态相同，自旋量子数之和s = l ，2 s + 1 = 3 ，因而基态的氧分子自旋多 重性为3 ，称为三线态氧。在受激发下，氧气分子的两个未配对电子发生配对， 自旋量子数的代数和s = 0 ，2 s + l = 1 ，称为单线态氧。空气中的氧气绝大多 数为三线态氧。紫外线的照射及一些有机分子对氧气的能量传递是形成单线态氧 的主要原因。单线态氧的氧化能力高于三线态氧，它能够氧化鸟嘌呤中的碱基而 使d n a 断裂。由于单线态氧在有机体的代谢中会不断地生成与猝灭，它将在多种 生理及病理过程中起着好的或坏的作用。目前在医学上，利用光敏剂产生单线态 氧应用于杀死肿瘤细胞已成为一种重要的治疗手段。一些钌多吡啶配合物由于其 良好的光学性质，也能够成为产生单线态氧的断裂剂。如【r u ( p h e n ) 3 】“、 【r u ( b p y ) 3 2 + 、 r u ( p h e n ) 2 d d z 2 + 等被报道产生单线态氧而导致d n a 断裂【6 2 1 。 o 叩 2 0 0 9 中山大学硕十学位论文 干贻灿 激发态的含多氮稠环配体的钉配合物，能够从鸟嘌呤接收一个电子。这类电 子能够稳定配合物前线分子轨道，使配合物的激发态具有很强的氧化性，当配合 物激发态还原电位高于鸟嘌呤的氧化电位时，就会发生氧化还原反应，从而使 d n a 断裂【6 3 】。k e l l y 等报道了【r u ( t a p ) 2 b p y 2 + 与c t - d n a 在近紫外或可见光照 射下，配合物通过光致电子转移生成鸟嘌呤自由基离子( g + ) ，然后还原的配合 物与g + 进一步反应生成共价加合物。该加合物通过鸟嘌呤的n h 2 基团连接在 t a p 配体的c 2 或c 7 位置上【删。 1 2 3 4 抗癌药 1 9 6 9 年，顺铂( 顺二氯二氨合铂) 首次被报道具有抗肿瘤活性，随之被应用于 临床试验，开创了小分子金属配合物作为抗癌药研究的新领域。目前，在寻找具 有高的d n a 键合力的药物分子已经有了很大进展。在对钌( i i ) 配合物的研究中 发现，它能够通过与特定的生物大分子发生关系，利用其序列选择性及强烈的插 入作用，改变生物大分子的形态，进而调控生物功能。国际上普遍认为钌的配合 物将成为最有前途的无机抗肿瘤药物之一。报道的第一代钌的配合物作为抗癌药 于1 9 9 9 年1 0 月起己进入临床试验阶段。作为第二代的二核钌( i i i ) 二甲亚砜配合 物n a 2 t r a n s - r u c l 4 ( m e 2 s o ) ( t t l ) 】( l 为杂环氮桥连配体) 的活性又比第一代要 高出3 5 倍【6 5 】。 此外，钌金属配合物还可作为d n a 介导电子转移剂，作为光氧化剂插入 d n a 能够对d n a 远距离损伤。这种作用与d n a 介导电子转移有关。利用钌金 属配合物来研究这种介导电子转移将有助于了解生命体中d n a 的突变与致癌机 理【6 6 柳】。钌金属配合物作为化学足迹试剂研究生物领域中最广泛。生物学家常用 足迹技术来确定d n a 上蛋白质的结合位点。 总之，钌金属配合物作为d n a 结构探针、光开关、介导转移等研究作为一 个十分活跃的研究领域，已取得了很大进展。 1 3 钌( ) 多吡啶配合物对d n a 拓扑异构酶的作用研究 1 3 1d n a 拓扑异构酶 第一章绪论 天然存在的d n a 是以超螺旋的形式存在，而d n a 转录、复制、基因表达 时必须解开超螺旋。而对于d n a 超螺旋的形成和解旋则依赖于d n a 拓扑异构 酶( t o p o i s o m e r a s e ，t o p o ) 。d n a 拓扑异构酶是存在于细胞核内的一类酶，他 们能够催化d n a 链的断裂和结合( 相当于核酸内切酶和连接酶作用的总和) ， 从而调控着核酸空间结构动态变化、控制核酸的生理功能【6 8 1 。近年来，人们发现 许多抗癌药都是通过拓扑异构酶干扰d n a 复制、重组和基因表达而发挥疗效的， 因此以d n a 拓扑异构酶为靶分子设计各种抑制剂，并使其成为抗肿瘤药物，已 成为肿瘤化疗研究新热点。 拓扑学主要研究几何图形在连续变形下保持不变的性质，d n a 拓扑结构意 味着d n a 具有拓扑学的性质。d n a 是由两股脱氧核糖核苷酸链构成，它们相互 盘绕、扭曲而形成复杂的超螺旋结构，在d n a 转录、复制、基因表达时通过一 种酶解开超螺旋。这种超螺旋状态与解旋状态之间的相互转换过程，也就是d n a 的拓扑异构现象。在这个过程中，d n a 的结构发生了变化，但是其性质不变一 不发生碱基对组成、数目及顺序的任何变化【6 9 铘】。 在7 0 年代发现的这种能催化d n a 拓扑异构体相互变换的酶就是d n a 拓扑 异构酶。最初它被发现于大肠杆菌，后被证实在生物界普遍存在。它通过两个连 续的转酯化反应，断开和连接d n a 主链的磷酸二酯键，介导d n a 单链或双链 的瞬时断裂和再连接，使d n a 的拓扑结构发生变化，催化d n a 分子在双螺旋 基础上的超螺旋状态和解旋态之间的相互转换。 它与有丝分裂期超螺旋染色质 或染色体的组装与分组装、基因组复制、d n a 重组、基因转录及d n a 损伤后 修复等有着密切的关系1 7 1 】，也是许多化疗药物的重要靶标。 d n a 拓扑异构酶主要包括2 类酶：t o p o i 和t o p o l i ，二者具有某些相同和交叉 的功能，起到功能互补的作用，同时也存在一些重要的区别。 1 3 1 1t o p o i t o p o i 是z - - 种单体酶，包括细菌t o p o i 、真核生物t o p o i 和逆旋转酶，有a 、b 两种亚型。它的分子量约为1 0 0 k d ，是一个由单拷贝基因( 位于第2 0 号染色体) 编码的单亚基蛋白。 t o p o i 包含4 个主要结构域，分别为n 端域、连接域、羧基端结构域和核心 2 0 0 9 l lu j 大学颁十学位论立 t 贿灿 域。其中n 端域具有高度正电性，疏水氨基酸很少，不能形成稳定的球形结构 域。连接区与催化活性无关，包括第6 3 6 7 1 2 氨基酸，但通过l v s 6 5 0 ，a r 9 7 0 8 与d n a 切割位点下游的核苷酸形成氢键，从而对d n a 下游有稳定作用，进而 减缓再连接过程。羧基端结构域( 古关键活性位点r y r 7 2 3 ) ，与独立的核心结构域 ( 告关键功能活性位点a r 9 4 8 8 ，a r 9 5 9 0 ，h i s 6 3 2 ) 重组后可以得到接近伞酶的活性 1 7 2 - 7 3 。 t o p o i 其主要功能是松弛超螺旋d n a ，先切开双链d n a 中的一条单链，使 另一条未断丌的链通过此缺口，使链的末端沿解开超螺旋的方向转动，然后再将 切1 3 封闭起柬。解旋扁的d n a 更容易进入转录装置，然后进一步进行复制。此 外它还参与转导、姐妹染色体互换等生物学过程。 引 oa 图1 1 2t o p o i 作用机理 t o p o i 的作用改变了d n a 超螺旋的连环数，t o p o l b 在断裂单链后还允许周 围的d n a 双链进行自旋，而t o p o l a 没有这种功能。t o p o l a 和t o p o l l l 的催化区 域不同，且两者的d n a 断裂端也不同。t o p o i a 在d n a5 - 端断裂，t o p o i 6 则在 3 一端断裂。两者没有细胞周期性，即t o p o i 在细胞周期中保持相对稳定。 所有t o p o i 作用的共同特点是：( 1 ) 仅切丌d n a 双链中的一条。( 2 ) 不需要 高能辅助因子。即反应不需要a t p ，整个t o p o i 的催化过程不需要a t p 供能， 生理浓度的a t p 可以抑制t o p o i 的活性。( 3 ) t o p o i 可被多价阳离子如m g z + 、组 蛋白、多聚精氨酸、多聚胺等活化。 1 3 1 2 t o p o i i t o p o i i 又称为旋转酶，真核生物t o p o i i 为同源二聚体，也有a 、b 两种亚型。 t o p o i i 单体可划分为3 个不同区域：c 端域、n 端域、中部功能域。c 端域序列 霈善；。 誓 第一章绪论 ( 原核生物的t o p o l i 中没有相对应的同源区域) 可变区域富古带电子的氨基酸 残基并且有核酸定位的序列咀及体内的磷酸化位点；n 区域包括前6 0 0 个与原核 生物b 亚型同源的氨基酸残基，其中包含与a t p 结合的同源序列：中部的功能 域延伸至前1 2 0 0 个氨基酸残基，与原核生物的t o p 0 i i a 亚基同源，其中t y r s 0 4 在催化反应中与d n a 形成共价键1 7 s 7 9 】。 t o p 0 i i 主要功能是识别特殊的d n a 序列，暂时切断双链d n a ，并通过第 8 0 4 位点e 酪氨酸与d n a5 - 断端的磷酸基以共价键结台形成易解离复合物 从而使d n a 结构松散。然后t o p o l l 再催化断裂链的重新琏接。叮见，t 0 p o l i 对 于d n a 具有切断、旋转、重接三重功能，以此改变d n a 的拓扑结构。t o p o l l 切丌d n a 双链，而使另一d n a 双链从缺口处穿过，在这个过程中需要a t p 提 供能量。除了能完成所有t o p o i 的功能外，t 0 p o i i 还能在d n a 复制完成后使相互 交联的姐妹染色单体分开。此外，t 0 p oi i 还参与d n a 复制、转录、重组、染色 体的组织等过程，是所有真核生物细胞的生存不可缺少的关键酶1 8 0 1 。 t o p 0 1 1 a 和t o p o i 【b 在功能上互补，都