（微生物学专业论文）麦草生物制浆和pc菌参与木素降解的小分子物质的研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明；所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：搠鲴日期：迦三：生! 韭 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名_ 蛔 导师签名： 日期：竺! ：苎：堡 山东大学硕士论文 第一部分：麦草生物制浆的研究 摘要 利用微生物发酵技术处理麦草原料生产麦草生物化学机械浆，可大量减少污 染、提高得率、改善纸浆性能，是麦草浆向低污染化发展的一条重要途径。 从大量各具特色的木质纤维素降解真菌中筛选到两株适合麦草生物制浆的 菌株，其中一株对提高纸浆的裂断长效果非常突出。通过对该菌株的生长及产酶 特性进行深入研究，证明该菌株与以往生物制浆所选用的白腐菌明显不同，它主 要通过半纤维素酶的作用使麦草发生明显分丝现象，从而提高化学预浸效率，提 高纸浆强度。通过优化麦草生物预处理的条件，进一步缩短生物处理周期，生物 预处理周期仅为5 天，是目前国内外所见报导的最佳水平。针对麦草化学机械浆 白度低，可漂性差的缺陷，对麦草生物化学机械浆漂白工艺进行深入研究，建立 了对麦草生物化学机械浆行之有效的全无氯漂白新工艺，为实现大规模工业化生 产提供科学依据和保障。用该菌预处理麦草原料生产的麦草生物化学机械浆，强 度明显提高，漂白后裂断长可达4 0 0 0 5 0 0 0 米，可漂性有所改善，全无氯漂白 后白度可达6 0 i s 0 ，应用前景十分可观。 关键词：麦草，生物化学机械浆，裂断长，自度。 山东大学硕士论文 a b s t r a c t t h eb i o t r e a t m e n to fw h e a ts t r a ww i t hm i c r o o r g a n i s mb e f o r ec h e m i m e c h a n i c a l p u l p i n gc a nn o to n l yr e d u c et h ep o l l u t i o n ，b u ta l s oi m p r o v et h ey i e l da n ds t r e n g t h p r o p e r t i e so ft h ep u l p s t h i si sa ni m p o r t a n tw a yf o rt h ed e v e l o p m e n to fn o n w o o d y f i b e r p u l p i n g q k v os t r a i n sw h i c hw e r es u i t a b l ef o rt h eb i o - c h e m i m e c h a n i c a l p u l po f w h e r es t r a w w e r es c r e e n e df r o mm a n y l i g n o c e l l u l o s e - d e g r a d i n gf u n g i o n eo ft h e m c o u l di m p r o v e t h e b r e a k i n gl e n g t h o fb i n c h e m i m e c h a n i c a l p u l pr e m a r k a b l y t h eg r o w t h a n d e n z y m a t i cp r o p e r t i e so ft h i ss t r a i nw e r ei n v e s t i g a t e dt or e v e a lt h ed i f f e r e n c ef r o m o t h e rw h i t e r o tf u n g iu s e df u r b i o p u l p i n gb e f o r e a f t e r5d a y so fi n c u b a t i o nw i t ht h i s s t r a i n ，w h e a ts t r a wf i b r e sw e r es e p a r a t e dm a i n l yb yh e m i c e l h l a s ea c t i o n ，r e s u l t i n gi n t h ei m p r o v e m e n to ft h ec h e m i c a li m m e r s i o ne f f i c i e n c yd u r i n gl a t e rc h e m i m e c h a n i c a l p u l p i n g t or e s o l v et h ep r o b l e mo fl o wb r i g h t n e s so ft h ec h e m i m e c h a n i c a lp u l po f w h e a ts t r a w , t h eb l e a c h i n g t e c h n o l o g yw a sd e e p l ys t u d i e d a n d a ne f f i c i e n tn e w n o n c h l o r i n e b l e a c h i n gp r o c e s s w a s d e v e l o p e d t h eb r e a k i n gl e n g t h o f b i o 。c h e m i m e c h a n i c a l p u l p a f t e r b l e a c h i n g c o u l dr e a c h4 0 0 0 一5 0 0 0 m a n dt h e b r i g h t n e s sc o u l dr e a c h6 0 i s oa f t e rn o n - c h l o r i n eb l e a c h i n g i ti se x p e c t e dt h a tt h i s s t r a i ni s v e r yp r o m i s i n g t ob eu s e di nb i o t r e a t m e n to fw h e a ts t r a wb e f o r e c h e m i m e c h a n i c a l p u l p i n g k e y w o r d s ：w h e a ts t r a w , b i n c h e m i m e c h a n i c a l p u l p ，b r e a k i n gl e n g t h ，b r i g h t n e s s 2 山东大学硕士论文 第一部分 t m p k p d n s c m c f p a x q p a 缩写词表 热磨机械浆 硫酸盐浆 3 5 d i n i t r o s a l i c y l i ca c i d c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e f i l t e rp a p e r a c t i v i t y 木聚糖酶预漂 e d t a 预处理 f 1 2 0 2 漂白 草酸处理 3 ，5 二硝基水杨酸 羧甲基纤维素 滤纸酶活 第二部分： p cp h n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m 黄孢原毛平革菌 l i p l i g n i np e r o x i d a s e木素过氧化物酶 m 1 1 p m a n g a n e s ep e r o x i d a s e 锰过氧化物酶 a b t s 2 ，2 - a z i n o b i s ( 3 - e t h y l b e n z a t h i a z o l i n e 一6 一s u l f i n i ca c i d ) 2 ，2 - 联氮二( 3 一乙基苯并噻唑- 6 - 磺酸) 2 6 一d m p c d h d m s c p z m a 2 c 1 1 4 d m b c a s t b a k t b a e s r 2 ，6 d i m e t h o x y p h e n o l2 ，6 一二甲氧基酚 c e l l o b i o s ed e h y d r o g e n a s e纤维二糖脱氢酶 2 ，2 - d i m e t h y t s u c c i n a t e 二甲基琥珀酸盐 c h l o r p m m a z i n e氯丙嗪 i s o e u g e n o l a c e t a t e 异丁子香酚醋酸盐 2 - c h l o r o 1 ，4 d i m e t h o x y b e n z e n e2 - 氯一1 ，4 - 二甲氧基苯 c h r o m ea z u r o ls铬天青 t h i o b a r b u r i ca c i d硫代巴比妥酸 2 - k e t o 4 t h i o m e t h y l b u t y r i ca c i d 2 - 酮一4 一硫甲基丁酸 e l e c t r o ns p i n n i n gr e s o n a n c e电子自旋共振 山东大学硕士论文 1 1 我国制浆造纸工业发展现状” 论 造纸工业是一个与国民经济发展和人类文明建设息息相关的重要产业部门， 随着我国经济的发展和人们生活水平的提高，对纸和纸板的需求量快速增加，造 纸国内市场潜力巨大，发展迅速，给造纸工业带来了前所未有的发展机遇。在我 国造纸工业快速发展的同时，也出现了许多问题，其中，资金短缺、原料资源和 环境污染问题，是当前困扰我国造纸工业发展的三大难题。 首先，发展造纸工业最主要的问题之一就是资金问题。由于资金的限制，导 致了我国造纸工业企业规模小、产品档次低、质量水平低等非常畸形的局面，给 今天的结构调整带来了极大的困难；同时由于建设资金的严重不足，导致许多建 设项目不能按期投产，不能发挥应有的经济效益。 其次，造纸的纤维原料资源，是造纸工业发展的基础。建国以来，非木材纤 维一直是我国造纸工业的主要原料。由于非木材纤维具有纤维短、强度差、抄纸 性能差等缺点，造成我国造纸工业生产的产品的质量和档次低下。而且草浆厂的 规模一般偏小，废液处理和防治污染技术上难度也较大。因此，长期以来存在的 原料结构不合理的现象，严重阻碍了我国造纸工业的进一步发展。 困扰我国造纸工业发展的第三个大的难题是造纸工业对环境的严重污染问 题。造纸工业对环境的严重污染主要来自制浆、漂白等生产工序的废液。如何减 少制浆和漂白废水对生态环境造成的污染，已成为一个亟待解决的问题，也是我 国造纸工业实现可持续健康发展的重要前提和保证。 1 2 实现造纸工业可持续性发展必须解决资源问题和环境保护问题 可持续发展是人与自然，经济社会与环境的协调发展，它以保护自然资源和 环境为基础，同资源和环境的承载力相协调；可持续发展是对资源实行最优化利 用基础上的发展，它呼吁人们放弃传统的高消耗、高增长、高污染的粗放型生产 方式和高消费、高浪费的生活方式，强调节约资源，保护资源和最优化利用资源， 减少对人类赖以生存的地球资源的浪费等。” 在当前我国造纸工业取得巨大成就和快速发展，而环境污染状况也十分严重 山东大学硕士论文 的情况下，原料资源问题和环境保护问题是关系到我国造纸工业是否能够实现可 持续发展的最重要的问题。 关于我国的造纸原料资源问题，一直就存在着“草木之争”的现象，长期以 来，我国造纸工业走的是“以草为主”的路线。从“以草为主”转向“以木为主”、 “林纸结合”的原料路线，现已成为中国纸业业内人士的共识，从长远观点和国 内外发展的趋势来看，不发展木材造纸，也就不可能实现中国造纸业的可持续发 展。但中国是一个“草浆大国”，形成了世界上近8 0 的生产能力；经过几十年 的努力，中国在草类制浆造纸方面积累了众多的技术成果和丰富的经验；在一段 相当长的时间内，尚不可能实现“以木为主”( 实现这一战略转移，至少需1 5 3 0 年的时间) ；草类纤维原料一般生长周期短，价格比较低廉且比较容易成浆，制 浆成本较低；草类原料也有许多优点，如在纤维长度、长宽比两项指标上有自己 的优势( 纤维平均长度：草类和阔叶木1 0 - 2 o m m ：长宽比：草类8 0 1 2 0 ，木 材5 0 - 7 0 ) ，草浆纸张的匀度较好，有利于生产薄页纸等；在草类制浆治污方面 也开发了许多技术，碱回收、废料、废渣等的综合治理等。因此，在一定时期内， 草类仍是我国制浆的主要原料。“1 由于我国主要采用化学制浆和含氯漂白，对环境造成严重污染。首先，目前 烧碱法硫酸盐法浆仍占有主导性的地位( 1 9 9 5 年占6 5 8 9 的比例) ，其中4 5 为草类浆，而草类浆料中麦草浆又占大多数。而麦草碱法制浆黑液由于其具有的 诸如粘度高、固形物含量少、硅含量高、热值低等一些特殊性质而使得其非常难 以进行有效的碱回收。目前大多数造纸企业的制浆黑液不经处理或只经简单处理 就直接排放，严重污染生态环境。其次，我国大多数造纸企业仍采用以含氯漂剂 为主的单纯次氯酸盐漂白或传统的c e h 三段漂白工艺，致使漂白废水中含有大量 的有毒化合物，其危害性比黑液更大。据资料报道，目前在漂白废水中检测到的 具有致癌、致畸、致基因突变的物质有硝基多环芳烃、氯代二苯并二恶英，氯代 二苯并呋喃、氯代芳烃等许多种，其中大部分物质具有不可代谢性，非常难以被 生物降解，特别是二恶英，由于其具有剧毒。并且在人畜体内不可代谢，可以生 物积累等，已被国际致癌研究中心列为人类一级致癌物质。” 综上所述，由于麦草等草类原料是一种可再生资源，如果以草为原料的选纸 企业能采用各种先进技术有效地防止废水对环境的污染，工厂做到清洁生产，以 草为主的我国造纸工业就可以走上可持续发展之路。而生物技术的迅速发展和其 山东大学硕士论文 在制浆造纸工业中愈来愈广泛的应用，也为此问题的解决提供了一条可行的途 径。 1 3 生物技术在制浆造纸工业中的应用 近年来生物技术的迅猛发展大大刺激了生物技术在制浆造纸工业中的各环 节的应用( 见表1 1 ) 。制浆造纸工业采用生物技术的目的，是促进整个生产降低 对环境的影响程度、节约能源或提高产品质量、获得更大的经济效益和环境效益。 虽然目前许多成果还尚未应用于工业化生产。但随着人们对环境问题的日益重 视，微生物技术和酶技术在制浆造纸工业中的应用将获得更大发展 6 】。 表1 1 制浆造纸工业应用生物技术的概况 采用生物技术的结果 生产工艺过程及处理目的工业性应 性能鉴定试验 用 l 原料处理 剥皮 +一 木材防腐 +一 2 生物制浆 a 机械制浆 节能 + f _一 树脂控制 o + 上 溶解性胶体 +一 b 化学制浆 脱木素 + + f _ 一 降低用碱量 + + - 一 3 漂白 半纤维素酶促漂白 + 酶脱木素 f - j 一 - ， 减少机浆返黄 +一 4 造纸 山东大学硕士论文 废纸脱墨 + + 卜+ - 纤维改性 + + - 卜 微生物污染物与腐浆控制 + f -+ 卜 5 涂布 酶转化淀粉胶粘剂 + 6 废水处理 好氧 + + 厌氧 + 7 废弃物综合利用 木素综合利用 +一一 纤维废渣生产酒精 + + - 一 8 其它 遗传工程改善纤维原料 +一 纤维分析 +十一 环境补救 +一 注：“+ ”结果好，可行“一”结果差，或有待研究 生物制浆是从制浆源头减少环境污染，节约能耗的一项生物技术。它包括生 物化学制浆和生物机械制浆两方面“1 。生物机械制浆是指在机械磨浆前用微生物 或酶代替化学药品对原料进行预处理，除了减少废水污染外，还可以降低磨浆能 耗，提高纸浆强度。对生物机械制浆的研究始于1 9 8 7 年，美国w i s s c o n s i n 大学 生物技术中心等单位采用白腐菌c e r i p o r i o p s i s s u b v e r m i s p o r a 处理针叶木和阔 叶木，发现在磨浆时能节约5 0 的电能，纸浆的强度显著提高。美国林产实验室 采用白腐菌a n t r o d i e l l as p 处理杨木木片时能节约2 6 的电耗，纸浆的强度也 能提高，但处理后的重量损失较大。此外。k i r k 和e r i k s s o n 用p h l e b i a r e g i a t a 和p e 菌处理杨木；k a s h i n o ，y 等人采用i z u 一1 5 4 处理云杉和红松等。都取得了 降低磨浆能耗( 降低近5 0 ) 、提高纸浆强度性能的良好效果。用黄孢原毛平革 菌m e 4 4 6 及其诱变菌株l i p l 4 处理泡裥和美洲黑杨制备生物机械浆实验也获得了 类似的结果，且l i p l 4 处理浆显示出更好的h 扣：可漂性”1 。在草类制浆方面，主 山东大学硕士论文 要以麻类长纤维为主，余惠生等人利用真菌p a n u sc o n c h a t u s 处理稻草能降低稻 草木素含量，s a b h a r w a l 等人用c e r i p o r i o p s i ss u b v v e r m i s p o r a 处理红麻；美 国农业部林产品实验室用p h l e b i ss u b s e r i a l i s 处理红麻韧皮纤维等也取得了有 益的结果。余惠生等利用真菌p a n u sc o n c h a t u s 处理稻草能降低稻草木素含量， 显示有一定的制浆潜力。对木材原料的中试和工业规模的实验结果表明了该技术 的可行性，用真菌o p h i o s t o m ap i i i f e r u m 处理后的杨木木片生产的t m p 浆配抄 k p 浆( 分别占9 6 和4 的比例) 生产新闻纸已经获得成功；采用白腐菌预处理 生产t m p 浆的生产规模已达到4 0 吨同。除了纸浆的白度有所降低外，该工艺具 有以下优点：预处理后纸浆强度有所提高，处理2 周后磨浆能耗降低2 0 4 0 ， 预处理后磨浆的生产量增加，生物处理后不再额外产生废气等。 对生物化学制浆而言，刚开始时期望原料经微生物处理能直接变成纸浆，但 迄今为止，这个过程的时间还太长，不能满足持续生产的要求。目前许多研究者 已转向生物预处理的化学制浆，其目的是利用生物预处理，使纸浆在达到相同硬 度时，减少制浆化学药品和能源的消耗，或者是在化学药品不减少的睛况下降低 纸浆的硬度，以适应无氯漂白的要求，达到减少废水污染的目的。使用的微生物 一般是白腐担子菌类，如，pc h r y s o s p o r i u m ，t r a m e t e sv e r s i c o l o r ，p h l e b i a r a d i a t a ，p 1 e u r o t u se r y n g i l c o r i l u sv e r s i c o l o r , p y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u s 和f o m e sf o m e n t a r i u s 等等”。，依赖它们产生的木素降解酶类，如木素过氧化 物酶、锰过氧化物酶或漆酶等催化降解木素，但迄今为止，对生物化学浆的研究 还仅限于实验室和中试阶段，并没有应用于工业化生产。虽然利用酶液处理，可 以有效减少处理时间，并易于控制生产过程，在连续化大生产中更具有实际意义。 但是因为效果欠佳，大多数研究都是采用菌种直接处理原料。在已发现的菌株中， 具有较高木素降解性、降解速度快的仍然十分稀少，因此，继续进行菌种的选育 和改良，包括采用基因技术提高降解木素的选择性和速率，仍是应致力于研究的 方向。 1 4 本部分研究的主要内容： 1 不同菌种的生物预处理及制浆漂白实验 2 菌株8 号的生长和产酶性质 山东丈学顾士论文 2 不同菌种的生物预处理及制浆漂白实验 生物制浆不仅能节约能耗，提高纸张的物理性能，减少污染保护环境，而且 还可带来可观的经济效益，有着十分广阔的前景。但是，生物制浆也存在一些有 待改进的地方。 改进生物制浆的关键问题是缩短处理周期。处理周期的长短除与培养条件有 关外，归根结底是由菌株本身的特性决定的，因此筛选短培养周期的菌种成为解 决这一问题的关键。我们从腐朽木材和草垛中筛选到5 0 多株木质纤维素降解真 菌，经初筛获得十七株。对它们麦草上的生长能力，降解木质纤维素能力，分泌 木质纤维素酶的能力进行了考察，筛选比较优良的菌株进行了生物制浆实验，最 后筛选出两株具有生物制浆潜力的菌株，其制浆性能明显超过目前生物制浆的常 用菌株。 2 1 材料与方法 2 1 1 菌种 实验用1 7 株菌种由山东大学微生物技术国家重点实验室生物质资源研究室 筛选。 p h s n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mm e 4 4 6 ( a t c c3 4 5 4 1 ) 来自美国麦迪逊国家林 产品研究所。 2 i 2 培养条件 培养基成分： 液体培养：4 麸皮汁( 麸皮煮沸用纱布过滤) 琼脂平板固体：1 0 麸皮汁加入2 琼脂 麦草固体：切段麦草，按1 ：4 添加自来水 培养方法： 液体培养在2 8 c 3 0 4 c ，1 2 0r p m 摇床 固体培养在2 8 温箱静置 山东大学颂士论文 2 1 3 酶活测定的方法 酶活力的测定采用d n s 测定还原糖法，以每分钟产生l u m o l 还原糖为一个 活力单位( i u ) 】 木聚糖酶( x y l a n s e ) 活力的测定：取0 5 m l 适当稀释的待测酶液，加入l m l 用p h 4 8 ，o 2 m 醋酸缓冲液配制的1 的木聚糖( o a ts p e r sx y l a n ，s i g m a ) 溶液， 摇匀，在5 0 下反应1 5 m ir l ，用恒温水浴控制温度，反应完毕后加入lm l d n s 试剂中止反应，煮沸l o m i n ，冷却后用蒸馏水定容至1 5 m l ，于5 4 0 n m 测o d 值， 参照木糖标准曲线计算木聚糖活力。 纤维素酶( c m c a s e ) 酶活的测定：取0 5 m l 适当稀释的待测酶液，加入l m l 用p h 4 ，8 ，o 。2 m 醋酸缓冲液配制的1 的羧甲基纤维素钠( c m c - n a ) 溶液，摇 匀，在5 0 c 下反应1 5 m i n ，用恒温水浴控制温度，反应完毕后加入lm l d n s 试 剂中止反应，煮沸l o m i n ，冷却后用蒸馏水定容至1 5 m l ，于5 4 0 n m 测o d 值，参 照葡萄糖标准曲线计算纤维素酶活力。 滤纸酶( f p a s e ) 活力的测定：取5 0 + 1 m g w h a t r n a n n o 1 滤纸条于刻度管中， 加o 5 m l 适当稀释的待测酶液，混合均匀，在5 0 。c 下反应3 0 m i n ，用恒温水浴控 制温度，反应完毕后加入1m ld n s 试剂中止反应，煮沸1 0 m i n ，冷却后用蒸馏 水定容至1 5 m l ，于5 4 0 n m 测o d 值，参照葡萄糖标准曲线计算酶活力。 2 1 4 生物处理 微生物处理：麦草原料加入4 倍水，在1 2 1 灭菌3 0 分钟，接种菌体，混 和均匀，2 8 - 3 0 c 培养5 天。 2 1 5 化学预浸 麦草原料加入6 n a 2 s 0 3 、1 n a o h ，液比1 ：5 5 ，在实验室z q l - 1 型 1 5 l 电加热回转式燕煮锅上进行，蒸煮锅中升温到1 4 0 保温2 5 分钟a o 山东大学硕士论立 2 1 6 制浆方法 麦草在蒸煮锅内化学处理后，用g n m 一3 0 0 型常压盘磨机进行磨浆，一般磨 三道，磨齿间隙分别为0 5 ，0 - 3 ，0 1 5m i l l 。 2 1 7 抄片 使用西北轻工业学院机械厂生产的z q j l 一b 抄片机进行抄片实验，供分析浆 料的物理性能用。 2 1 8 白度的测定 采用杭州轻通仪器厂生产的y q z 一4 8 b 型白度测定仪测定纸浆的i s o 白度和 不透明度。 2 1 9 物理性能的测定 根据g b 一8 9 的要求，纸样置于物检室平衡1 2 小时后测定纸张各种性能。 2 1 1 0 漂白 浆料的漂白实验在聚乙烯塑料袋中进行。一定量的浆料与所需体积的漂液充 分混合均匀后，在恒温水浴锅中保温至规定的时间。实验时采用过氧化氢漂白。 漂白试剂及浓度 试剂名称用量( ) n a 2 s i 0 3 n a o h m g s 0 4 h 2 0 2 ， o 8 1 5 o 0 5 2 5 麦草浆漂白步骤如下【1 2 山东大学硕士论文 x ：木聚糖酶处理，一定浓度的酶液预处理5 0 。c 、4 小时，浆浓1 0 ； q ：e d t a 预处理，浆样冲洗后用0 5 e d t a 对浆样进行常温预处理，时间 3 0 m i n ，浆浓5 ： p ：一段漂，浆样用自来水冲洗挤干后，加入漂剂，高温水浴2 3 小时，浆浓 2 0 ： a ：草酸中间处理，浆样冲洗、挤干后加入1 草酸，常温放置1 0 分钟，浆浓 5 ： p ：二段漂，冲洗、挤干后，加入漂剂，高温水浴2 3 小时，浆浓2 0 ： a ：草酸后处理，用1 的草酸处理1 0 m i n ，p h 4 ，浆浓5 ，冲洗、挤干。 2 2 结果与讨论 2 2 1 菌株生长及产酶性质 2 2 1 1 各种真菌在麦草上的生长状况 1 7 株真菌和9 c h r y s o s p o r i u m 在麦草上生长比较迅速，一般仅需1 0 天左右 生长就较充分，不需添加外源营养物。两周生长已非常充分，再延长培养时间到 三周，生长量虽有增加，但不明显。其中6 号菌生长最为迅速。1 、6 、9 、1 3 、 1 4 号菌生长最为旺盛，生长量最大。与生物制浆的常用菌株户c h c v s o s p o r i u m 的生长能力相近。8 号菌能很快遍布全部原料，但是生长量非常小，且延长培养 时间生长量也不再增加。 2 2 1 2 各种真菌降解对纤维原料的降解得率 在麦草原料上生长1 0 天后，大部分菌株对麦草的降解得率为8 0 左右，菌 丝的生长量与降解得率之间并不存在密切的相关性，生长旺盛的菌株并不一定对 原料降解强烈。pc h r y s o s p o r i u m 平f l1 7 号菌对麦草降解最为强烈，得率为6 0 左右。8 号菌对麦草降解最弱，得率为9 6 。生物处理得率高，有利于提高产品 的最终得率。 山东大学硬上论文 2 2 1 3 各种真菌的产酶性质 从图2 1 中可以看出，产c m c 酶较高的菌株有7 号和1 8 号pc h r y s o s p o r i u m o 产木聚糖酶较高的菌株有1 0 、1 2 、1 3 、1 8 号菌。产f p a 酶较高的菌株有4 、1 7 、 1 8 号菌。1 、6 、1 5 号菌产酶较低。尤其是6 号菌，虽然生长非常旺盛，产酶却 较少。而8 号菌虽然生长很弱，产酶却比较高，尤其是木聚糖酶活力较高。可以 看出菌丝生长与产酶之间不存在正相关性，所以在进行菌株筛选时，要分别考查 其生长及产酶状况，进行综合评价。 567891 0 s t r a t a f i g u r e 2 1 t h ee 1 1 z y r f l ea c t i v i t i e so f d i f f e r e n t 缸l g iu n d e rl i q u i d - s t a t ef e r m e n t a t i o n t32i 5 3 l 9 7 5 3 1 1 1 l 1 o o 0 0 0 o o o 山东大学硕士论文 1 6 1 2 80 8 0 4 0 1 l1 21 31 41 51 61 71 8 s t r a i l l f i g u r e2 1 t h ee n z y m ea c t i v i t i e so f d i f f e r e n tf u n g iu n d e rl i q u i d s t a t ef e r m e n t a t i o n 2 2 2 生物制浆及漂白实验 2 221 不同生物化学机械浆及其可漂性 通过以上实验对不同菌株的生长和产酶特性的考察。筛选了生长旺盛及生物 处理得率高的几株有代表性的真菌，对其生物化学制浆性能进行了进一步考察。 其纸浆的性能和可漂性如表2 1 所示。 从结果可以看出，未经灭菌的草成浆裂断长较低，说明灭菌处理对提高浆的 强度有一定效果。生物处理的效果比较突出，说明生物处理对原料的部分分解和 软化作用，大大提高了化学预浸的效率，从而使浆的强度得到显著改善。尤其是 8 号和1 3 号，裂断长分别提高4 5 和2 3 。8 号的撕裂度稍有下降( 6 ) ，1 3 号的撕裂度提高约3 3 。8 号对裂断长的提高比较突出，而1 3 号对裂断长和撕 裂度的改善均较好。但是有些菌株处理麦草后反而使强度下降，可能是生物处理 对纤维的直接破坏造成的。 漂白结果表明，未经灭菌处理的麦草漂前白度较高，但漂后与灭菌草几乎一 山东大学硕士论文 致，说明灭菌处理对白度影响不大。不同菌种处理对纸浆白度影响较大。其中6 号菌白度下降5 i s o ，8 号菌对白度提高作用最为显著，为6 i s 0 ，其次为1 3 号( 4 i s 0 ) 。单段5 h 2 0 2 漂白效率非常低。从相对结果可以看出，不同的生 物处理，浆的可漂性有高有低，效果不一。 t a b l e 2 1s t r e n g t hp r o p e r t i e sa n db l e a e h a b i l i t yo f b i o c h e m i m e c h a n i e a lp u l p s c o n t r o l ( 1 ) c o n t r o l ( 2 ) 1 3 8 2 1 5 6 l 1 3 1 0 1 6 8 6 1 8 1 1 1 4 2 8 1 1 3 3 1 2 5 0 2 2 6 2 1 9 2 7 9 9 5 1 7 5 1 6 6 1 3 9 1 9 4 2 0 4 1 9 1 i 8 l 1 5 0 1 5 6 2 2 0 o 9 2 2 3 5 2 0 4 1 6 1 2 1 7 2 2 o 1 6 6 2 1 5 1 5 5 2 6 4 2 4 6 2 3 8 2 9 4 2 9 5 2 6 7 3 0 6 3 l _ 3 2 6 8 3 0 4 2 6 4 3 7 1 3 3 8 3 2 5 p c9 3 3 1 5 41 8 12 6 9 c o n t r o l ( 1 ) i st h ec o n t r o lw i t h o u ts t e r i l i z a t i o na n db i o - t r e a t m e n t c o n t r o l ( 2 ) i st h ec o n t f o lw i t h o u tb i o - t r e a t m e n t 漂白条件为5 h 2 0 ：单段漂白。 通过对纸浆强度和白度的综合评价，我们初步认定8 号和1 3 号菌具有很好 的应用价值，而且其制浆性能明显优越于pc h r y s o s p o r i u m 。 5 1 2 3 4 5 6 8 b 山东大学硕j j 论文 2 2 2 2 漂白程序对白度的影响 目前，麦草浆的难漂性已成为其发展的主要障碍之一。本实验对其漂白进 行了综合实验，结果表明，e d t a 预处理、添加中间处理和漂白后酸处理对白度 的提高均有良好效果。漂白后酸处理不仅能提高纸浆白度，还能改善纸浆的色度， 减少浆的黄色。过氧化氢用量在两段中的分配以1 ：1 的比例最为优越，其次为 先低浓度后高浓度。木聚糖酶的漂前预处理对提高漂白效率也有明显作用。由实 验结果可知x q p 3 a p 3 a 为较为理想的漂白程序，漂后白度可达6 0 i s o 以上。以 后实验中如无特别说明，均按此程序进行漂白。 t a b l e 2 2 b l e a c h i n go f w h e a ts t r a wc m p u n d e rd i f f e r e n tp r o c e d u r e q p 3 q p 6 q p l p 5 q p s p l p 3 p 3 q p 3 p 3 q p 3 a p 3 q p 3 p 3 a x q p 3 p 3 x q p t p 5 x q p 3 a p 3 a 2 3 5 6 0 13 6 6 6 5 6 3 3 2 7 1 5 2 h 博 丝 加 m 拍 勰 巧 ” l o 1 8 8 7 2 6 o 7 竭 舵 町 钙 拍 盯 如 n 锣 钾 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 弱 拐 觞 筋 躬 山东大学硕士论文 2 2 2 3 实验室大批量生物处理麦草的制浆及漂白实验 由于菌株8 号对草浆性能和白度有显著促进效果，在实验室用此菌对大批量 麦草进行生物处理，然后制浆。对照除未接种微生物外，其他处理条件与样品完 全一致。其制浆和漂白结果如表2 3 和2 4 所示： t a b l e2 3 t h ep u l pp r o p e r t i e so f b i o c h e m i m e c h a n i c a lp u l p s ( c o n t i n u e d ) c o n t r o l 1 7 2 1 3 04 5 1 2 s a m p l e 1 8 3 2 8 0 3 4i - 6 由表2 3 结果可知，经菌株8 号生物处理的纸浆裂断长和白度都有明显改善， 耐破度有所提高，但是撕裂度有所下降。可能由于微生物的作用对单根纤维造成 一定损伤，但同时又由于纤维的帚化增强了纤维间的结合力，从而提高了裂断长。 t a b l e 2 4t h ep u l pp r o p e r t i e so f b l e a c h e db i o - c h e m i m e e h a n i c a lp u l p s r e c o v e r yo fb r i g h t n e s s o p a c i t y b r e a k i n g t e a ri n d e xb u r s ti n d e x b l 船c h i l l g ( i s o )( ) l e n g t h ( m n m 2 g ) ( k p ar 一g ) ( ) ( m ) c o n 仃0 l9 3 7 8 5 7 3 8 5 9 4 2 3 03 4 1 5 s a m p l e 9 4 3 5 6 2 8 8 6 75 3 0 5 3 22 4 山东大学硕士论文 表2 4 结果表明，漂白得率较高，相对于对照为9 3 4 。灭菌麦草经生物处 理后，漂前白度较对照提高3 i s 0 ，漂后白度相差5 5 i s 0 。漂后裂断长超过 5 3 0 0 米。漂白有利于提高纸浆的强度和耐破指数，但是撕裂度却有所下降。用 x q p 3 a p 3 a 条件漂白后，生物化学机械浆样品的白度达6 0 i s 0 以上。 2 3 结论 1 通过研究不同菌株的生长、降解得率和产酶特性可知，菌丝的生长量和 降解得率之间并不存在密切的相关性，生长旺盛的菌株并不一定对原料 降解强烈。菌丝生长与产酶之间也不存在正相关性，所以在进行菌株筛 选时，要分别考查其生长及产酶状况，进行综合评价。 2 不同微生物预处理的原料进行化学机械制浆，由结果可知，菌株8 号和 1 3 号的预处理效果比较显著，成纸的裂断长和撕裂度均有不同程度的提 高，8 号菌对白度的提商非常显著。因此在实验室条件下用菌株8 号生 物处理大批麦草原料，经化学机械制浆，所得纸浆具有较好的强度和良 好的可漂性，漂后裂断长可达四千米以上，白度可达6 0 i s o ，应用潜 力很大。 3 通过对漂白条件的摸索，确定x q p 3 a p 3 a - 的漂白步骤对麦草化学机械浆具 有较好的漂白效果，可达6 0 i s 0 以上，且与传统氯漂相比，污染小， 在环保方面具有重要意义。 山东大学硕士论文 3 菌株8 号的生长和产酶性质 用菌株8 号对麦草原料进行生物预处理，其生物化学机械浆的强度和白度的 改善较为显著，可能具有很好的应用价值。因此对菌株8 号的生长和产酶性质进 行深入研究。 3 1 材料与方法 菌种来源、培养方法及酶活测定见2 1 1 ，2 1 2 ，2 1 3 。 3 2 结果与讨论 3 2 1 菌株8 号的生长特性 3 2 1 1 菌株8 号的产孢特点 通过观察，发现斜面接种到麸皮汁液体培养基，第2 天就会产生孢子，孢子 无色透明，呈椭圆形，第3 天就会大量萌发成菌丝，有的一头萌发，有的两头萌 发，渐渐长成细长的菌丝，菌丝再生孢子。 固体培养发现，第二天可见草片上开始出现白色绒毛，到第三天绒毛密集， 菌丝细长，有的孢子于菌丝顶端整齐排列成一簇，菌丝分割形成孢子链。 在琼脂平板上培养，四天左右菌丝开始沿接种点向四周蔓延，菌丝交错，可 见大量孢子链，也有帚状分支孢子丝。总之，该菌株孢子的生成有多种方式。 3 2 1 2 菌株8 号预处理麦草原料 3 2 1 2 1 麦草原料含水量对菌丝生长的影响 由实验知，液质比为4 ：1 ，菌种长势良好。 t a b l e3 1 i n f l u e n c eo f c o n t e n to f w a t e ri nw h e a t s t r a wo i lf u n g a lg r o w t h p r o p e r t i e s 山东大学硕士论文 3 2 1 2 2 接种量对菌丝生长的影响 接种物为该菌的液体培养物。接种量在o 5 一5 之间时，接种量对生长影响 不大，3 天原料即基本布满菌丝，5 天生长已非常完全。接种量大于1 0 时，3 天即生长非常完全，再延长培养时间，生长量也变化不大。接种量小于0 1 时， 生长较为缓慢。7 天左右才能生长完全。总之，该菌株生长较快，对接种量要求 不高，适合进行扩大培养。 t a b l e 3 2 i n f l u e n c eo f i n o c u l a t i o nv o l u m eo nf u n g a lg r o w t hp r o p e r t i e s 3 2 1 2 3 培养温度对菌丝生长的影响 该菌株的最适生长温度在2 0 3 04 c ，在4 5 c 以上几乎不生长，是一株适中温 菌。1 5 以下生长较为缓慢。 t e m p e r a t u r e ( ) 4 5 3 73 02 0 1 5 3 2 1 2 4 培养时间对菌丝生长的影响 培养时间对生长的影响与接种量密切相关，当接种量大于1 0 时，培养3 天 即可达到最高生长量，再延长培养时间菌丝生长缓慢。当接种量在o 5 扣5 时， 培养5 天可达到最高生长量，再延长培养时间菌丝生长情况无明显变化。 3 2 1 2 5 添加营养物质对菌丝生长的影响 对麦草添加1 的硫酸铵和1 葡萄糖对菌丝生长均有一定促进作用，添加 2 麸皮汁也有类似效果，但是作用均不十分明显，而且化学成分分析表明添加 营养物质仅能稍稍提高菌株对麦草的总降解率，对麦草主要化学成分的比例无明 山东大学硕_ 上论文 显影响。因此添加碳氮类营养物对发酵预处理意义不大，这与白腐菌对木材的降 解有所不同。在培养白腐菌时添加一定的碳氮源，可减少微生物对原料纤维素的 降解和破坏。 3 2 1 2 6 通气量对菌丝生长的影响 分别在每天充氧，纱布过滤通气，塑料袋密封，以及抽真空条件下对接种等 量真菌的麦草进行培养。发现菌丝在充氧，纱布过滤通气条件下均生长良好，且 里外均匀。塑料袋密封条件下生长较前者慢，但也能均匀生长。抽真空条件下则 几乎不生长。说明该菌是好氧性的，但是对氧的需求不是很苛刻，在氧气较少时 也能生长，这对大规模培养中保持均匀非常有利。 3 2 1 2 7 微生物预处理对麦草化学成分的影响 图3 1 为微生物预处理对麦草化学成分的影响。可以看出，固体培养第6 天 麦草的半纤维素含量下降了9 2 ，而纤维素和本素含量几乎不变，到第1 0 天纤 维素含量下降了7 3 ，半纤维素含量下降减少，木素含量上升，直到第1 6 天木 素含量才开始下降了1 4 ，而纤维素含量有所回升。这说明第6 天内该菌所产 的酶主要降解麦草的半纤维素，对纤维素和木素降解较少。 f i 9 3 1 c h e m i c a lc o m p o n e n to fw h e a ts t r a wd u r i n g f u n g