（微生物学专业论文）地衣芽孢杆菌来源β1314葡聚糖酶基因克隆、改造及其表达.pdf

摘要 p l ，3 1 , 4 - 葡聚糖酶是一种重要的工业用酶，已被广泛应用到酿酒和饲料工业中。国内对 争l ，3 1 ，4 一葡聚糖酶的研究还处于初级阶段，天然菌株的产酶量及酶的性能满足不了实际应用。 然而，分子生物学、基因工程方法的应用为其提供了契机。现在国内外对p l ，3 一i 争葡聚糖酶的 研究集中表现在构建基因工程菌株来提高酶的产量和性能方面。本研究的主要目的就是通过基 因工程及分子生物学方法来提高争l ，3 1 , 4 - 葡聚糖酶表达量，改善其酶学特性，为目前生产中的 问题提供有效的解决途径。主要研究内容及相应结果如下： 1 天然菌株产酶研究 在基础产酶研究的基础上对培养基碳氮源及发酵条件进行优化。结果表明，4 复合碳源燕 麦粉、麸皮等比单一成分葡萄糖、蔗糖效果好，l 天然氮源蛋白胨同样优于无机、有机氮源。 利用优化的营养成分组成培养基，1 5 0r p m ，p h5 0 - 6 0 的情况下天然菌株发酵4 8h 得到最高的 产酶量。 2 p - 1 l ，4 - 葡聚糖酶基因克隆及其在大肠杆菌e s c h e r l c h i n c o l i 中表达 以且l i c h e n i f o r m i se g w 0 3 9 基因组d n a 为模板扩增获得了编码争l , 3 - 1 葡聚糖酶的基因 6 4 8b p ，将它克隆到表达载体p e t 2 8 a ( + ) ，然后转化ec o i lb l 2 1 ( o e 3 ) 。重组萤经i p t g 诱导表 达的重组酶n 末端带有6 个h i s 标签，分子量达2 8 k d a ，表达量占总蛋白的6 0 9 ，占细胞可 溶性蛋白的1 2 5 。重组酶活力分别为1 2 8 6 ( 1 大麦p 葡聚糖为底物) 和9 8 6 ( 1 地衣多糖为底 物) u m i ，比活分别为2 4 7 9 ( 1 大麦争葡聚糖为底物) 和1 9 0 6 ( ! 地农多糖为底物) u m g 1 利用 n 一离子亲和层析柱纯化目的蛋白8 7 4 倍，重组酶最适p h 和温度分鄹为5 6 ，4 0 c 。 3 l # - 1 , 4 - 葡聚糖酶基因改造及其在p i c h i a p a s t o r l sg s i l 5 中表达 对以且l i c h e n i f o , - m i s 基因组d n a 为模板进行p c r 扩增获得的编码b - l ，3 1 , 4 一葡聚糖酶基因 进行密码子优化改造，共改变1 0 2 个碱基，g c 含量从4 3 6 下降到4 1 6 。将优化基因m - e g l 3 1 4 连接到毕赤酵母表达载体p p i c g k 上，重组载体p p i c 9 k - m - e g l 3 1 4 经b g l h 酶切线性化后电转 化p p a s t o r i s g s l l 5 ，通过筛选得到阳性重组子重组酶在| p p a s t o r i s g s l l 5 中实现了分泌表达， 摇瓶水平上争l 3 1 葡聚糖酶活力分别为6 7 9 ( 1 大麦p 葡聚糖为底物) 和5 2 3 ( 1 地衣多糖为 底物) un i l ，较未进行优化的昏l ，3 1 葡聚糖酶表达水平( 4 un i l - ) 提高了约1 5 倍；7 l 发酵罐 水平上蛋白分泌量达2 5 0n a gl 1 ，酶活力达到3 3 3 7 ( 1 大麦p 葡聚糖为底物) 和2 5 6 7 ( 1 地衣 多糖为底物) um l ，比活为1 3 3 4 8 ( 1 大麦 葡聚糖为底物) 和1 0 2 6 8 ( 1 地衣多糖为底物) u n a g 1 ，最高产酶水平比未优化基因高5 0 多倍。 重组酶由于发生糖基化作用分子量高达3 4 k d a ，占总分泌蛋白的5 3 8 ：最适p h 和最适 反应温度分别为6 0 ，4 5 ；f e s 0 4 , c o c l 2 ，m n s 0 4 对酶有激活作用，c u s 0 4 ，e d t a ， 巯基乙醇， c a c h 则对酶有抑制作用：且重组酶表现了严格的底物特异性，作用于大麦b - 葡聚糖或地衣多 糖的产物对乳酸菌等益生菌的生长有显著促进作用。根据s d s p a g e 电泳和酶的功能性分析证 明。优化的重组蛋白已在只p a s t o r , s 中实现表达，且热稳定性有所提高。 关键词： 地衣芽孢杆菌，争l ，3 1 , 4 一葡聚糖酶，巴斯德毕赤酵母，基因改造，表达 a b s t r a c t b - 1 ，3 1 , 4 - g l u c a l l a s e ( e c 3 2 1 7 3 ) ，a 8 a l l i m p o r t a n t i n d u s t r i a le n z y m e , h a s b e e n w i d e l y u s e d i n t h e b r e w i n ga n da n i m a lf e e di n d u s t r y n o w a d a y st h ed o m e s t i cr e s e a r c h e sa b o u t 争l 3 - 1 , 4 - g t u e a n a s ei si n t h eb e g i n n i n g , t h ee x p r e s s i o nl e v e la n dp r o p e l t i e so fn a t u r a le u z y l n ea r en o ts u 伍c i e n tf o ri n d u s t r i a l p l l p o s e ，b u tt h ed e v e l o p m e n to f m o l e c u l a rb j o l o g ya n dg e n ee n g i n e e r i n gp r o v i d e daf e a s i b l ew a yt o r e s o l v et h ep r o b l e m a tp r e s e n tt h er e s e a r c h e sa b o u t1 3 - 1 , 3 - 1 , 4 - g l u c a n a s ei nt h ec o u n t r yo ra b r o a d f o c u so nc o n s t r u c t i n gg a n ee n g i n e e r i n gs t r a i n sa n di m p r o v i n gt h ee x p r e s s i o nl e v e la n dp r o p e r t i e 8 t h e p u r p o s eo f t b i sr e s e a r c hi st oi m p r o v et h ee x p r e s s i o nl e v e la n dp r o p e r t i e so f ! , 3 - i , 4 - g l u c a n a s e 诵m t h em e t h o d so fm o l e c u l a rb i o l o 科a n dg o n ee n o n e c r i n 昏a n di tw o u l db ea ne f f e c t i v ea p p r o a c hf o r a c c e l e r a t i n gt h ea p p l i c a t i o no f l ，3 - i a - g l u c a n a s e i n i n d u s t r y t h es t u d i e sa n dr e s u l t sa b o u t p l ，3 - 1 , 4 一g l i l c a n a s ef r o mb a c i l l u sl i c h i f o n i se g w 0 3 9 ( c g m c c0 6 3 5 ) i nt h i sr e s e a r c ha r ea s f o i l o w s ： 1 t h ee f f e c t e so fm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ht h e a c t i v i t y o f p 1 , 3 - 1 , 4 - g l u c a n u ep r o d u e e db y 且l i c h e n i f o ，m 豇e g w 9 t h r o u l 曲o p t i m i z a t i o no fc a r b o na n dn i t r o g e nn u t r i t i o no ft h em e d i u m ，i tw 8 8f o u n d e dt h a t 粕 c o m p l e xc a r b o nn u t r i t i o n ss u c ha so a t , b r a na l eb e r e tt h a n 豳g l en u t r i t i o ns u c ha sg l u c o s e s u c r o s e , a n d1 c o m p l e xn i t r o g e nn u t r i t i o ni sa l s ob e t t e rt h a ni n o r g a n i ca n do r g a n i cn i t r o g e n t h en a t u r a l s t r a i ny i e l d e d p - 1 , 3 - 1 , 4 - g l u c a n a s e m a x i m u m l y u n d e r t h e o p t i m i z e d m e d i u m a n d f e r m e n tc o n d i t i o n sa t 1 5 0 桃p h 5 0 - 6 o ，4 8h 2 t h e c l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o f p - l ，3 - l ，4 - 窑l u e a n a s e i n e s c h e r i c h i n c o l i t h eg e n ee n c o d i n g 争l ，3 1 , 4 - g l u c a n u s ei sa m p l i f i e db yp c rw i t ht h et e m p l a t eo fg e n o m i ed n a o f 且c h e n f o r m se g w 0 3 9 ，i ti s 6 4 8b p , t h e nc l o n e di n t oe x p r e s s i o nv q k rp e t 2 8 a ( + ) ，t h e r e c o m b i n a n tv e c t o ri st r a n s f o r m e di n t oec o l ih o s ts t r a i nb l 2 1 f d e 3 ) t h em wo fr e c o m b i n a n t 争l ，3 - 1 , 4 - g l u c a n a s ei sa b o u t2 8k d aw i t h6 x h i st a ga tt h ent e r m i n a l t h ee x p r e s s i o nl e v e lo f r e c o m b i n a n tb - 1 , 3 - 1 , 4 - g l u c a n a s ei sa p p r o x i m a t e l y6 0 9 0o ft h et o t a lp r o t e i n , 1 2 5 o ft h es o l u b l e p r o t e i ni nc r u d ec e l ll y s a t es u p e r n a t a u t t h er e c o m b i n a n t 弘1 , 3 - 1 , 4 - g l u c m m ea c t i v i t yi n c e l ll y s a t e 唧a t a n ti s1 , 2 8 6a n d9 8 6um l 诵t h1 ( w v ) b a r l e y 争g l u e a na n d1 ( w v ) l i c h e n a nr e s p e c t i v e l y a c c o r d i n g l y , t h es p e c i f i ca c t i v i t i e sa r e2 , 4 7 9a n d1 , 9 0 6um 9 1w i t ht h e s et w oa n b s t r a t e s w i t hn i 2 + c h r o m a t o g r a p h yp u r i f i c a t i o nt h er e c o m b i n a n tp r o t e i ni sc o n c e n t r a t e db y8 7 4t i m e s t h eo p t i m a l a c i d i t ya n dt e m p e r a t u r eo f t h i sr e c o m b i n a n te l l z y l u ea r cp h5 6a n d4 0 r e s p e c t i v e l y 3 t h eg o n em o d i f i c a t i o na n de q 盯e s 硝o no fp - 1 , 3 - 1 , 4 - g h r c a n a s ei np i e h i a 脚r i sg s l l 5 t h eg e n ee n c o d i n g 争l ，3 1 , 4 - g l u c a n u s ei so b t a i n e db yp c rw i t ht h et e m p l a t eo fg e n o r a i cd n a o f 且l i c h e n i f o r m i se g w 0 3 9 a n dm o d i f i e dw i t hc o d o no p t i m i z a t i o n i nw h i c hat o t a lo f1 0 2 n u c l e o t i d e sa 坤c h a n g e d , t h ec _ r t cr a t i oi ss i m u l t a n e o u s l yd e c r e a s e df r o m4 3 6 t o4 1 6 t h e m o d i f i e da n d0 p t 妇a lg e n e ( m - e 9 1 3 1 4 ) i sl i g a t e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 kt h er e c o m b i n a n t v e c t o rp p i c 9 k - m - e g l 3 1 4a f t e rb e i n gl i n e a r i z e dw i t hb g t hi st r a n s f o r m e di n t op p a s t o r sg s i1 5 w i t he l e c t r o n i cp u l s e ，t h e nt h er e c o m b i n a n ty e a s ti so b t a i n e dt h r o u l g hc u l t u r i n g0 1 1n u t r i t i o nd e f i c i e n t m e d i u m t h e p - l ，3 1 , 4 - g l u e a n a s e i s h i g h l ye x p r e s s e ds e c r e t l y i n 尸p a s t o r i $ g s l l 5 a ts h a k i n g f l a s k l e v e l ，t h ep - l ，3 1 , 4 g l u c a n a s ea c t i v i t yi s6 7 9a n d5 2 3un i l 。w i t h1 ( w v ) b a r l e yp g l u c a aa n d 1 ( w v ) l i e h e n a na t ；s u b s t r a t er e s p e c t i v e l y , i ti si n c r e a s e db ya b o u t1 5t i m e st h a nu n o p a m a lg e n e ( 4 u m l - i ) a t7 ll a b o r a t o r yf e r m e n t o rl e v e l ，t h es e c r e t e dp r o t e i nc o n c e n t r a t i o ni sa p p r o x i m a t e l y2 5 0m g l - 1 ，t h e 争l ，3 - 1 , 4 一g l u e a n a s ua c t i v i t ya 3 3 3 7a n d2 5 6 7un i l 1 谢l h1 ( w v ) b a r l e yb - # u c a na n d 1 ( w v ) l i e h e n a na ss u b s t r a t e r e s p e c t i v e l y , t h es p e c i f i ca c t i v i t ya r c ! , 3 3 4 8a n d1 , 0 2 6 8um g - 谢t l l t h e s et w os u b s t r a t e s ，t h em o s th i g he x p r e s s i o nl e v e li s i m p r o v e da b o u t5 0t h n e sc o m p a r e dw i t h o r i g i n a lh o s t t h em wo f r e c o m b i n a n te n z y m ei sa b o u t3 4k d aw i t hg l y c o s y l a t i o n i ti sa p p r o x i m a t e l y5 3 8 o f t h et o t a ls e c r e t e dp r o t e i n ；t h eo p t i t n u t l la c i d i t ya n dt e m p e r a t u r eo f t h i sr e c o m b i n a n ta y m ea l ep r l 6 0a n d4 5 r e s p e c t i v e l y a n dt h er e c o m b i n a n te n z y m ea c t i v i t yw a sa c t i v a t e db yf e s 0 4 c o c l 2a n d m n s 0 4 , b u ti n h i b i t e db yc u s 0 4 , e 】叽a 争m e r e a p t o e t h a n o ia n dc a c l 2 t h er e c o m b i n a n t l ，3 1 , 4 - g l u c a n a s eh a sh i 曲s u b s t r a t es e l e c t i v i t y , a n dh y d r o l y s a t ec o u l dp r o m o t et h eg r o w t ho f p r o b i o t i c ss u c ha sl a c t o b a c i l l u s s d s - p a g ea n a l y s i ss u g g e s t e dt h a tm o d i f i e dr e c o m b i n a n tp r o t e i n w a ss e c r e t e ds u c c e s s f u l l yw i t hh i g hl e v e li npp a s t o r s a n di t st h e r m o s t a b i l i t yw a si n c r e a s e d o b s e r v a b l y k e yw o r d s ：b a c i l l u sl i c h e n i f o r r n i s , l ，3 - 1 , 4 - g h r a n a s e , p i c h i ap a s t o r i s , g a n em o d i f i c a t i o n ， e x p r e s s i o n i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论 文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也 不包含获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 獒荧 加7 年岁月引日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名； 樊荚如口7 年岁月弓f 日 导师签名： ，f 琶3 l b 中国农业科学院碜上学位论文第奄引言 第一章引言 1 1p 葡聚糖概述 p 葡聚塘是禾本科植物细胞壁多糖成分，它富含在大麦、黑麦、高粱、稻和小麦等作物的 胚乳细胞壁中，不同物种其含量、比例也不相同( 表1 1 ) 早期研究认为大麦肛葡聚糖中含有 连续的争l 3 键；但越来越多的试验证明，大麦p 葡聚糖分子中不存在连续的争l ，3 键，且 l ，3 键和 l 4 键的分布不是随机的。不同来源争葡聚塘中争l ，3 键和p l 4 键所占的比例也不尽相 同，其中争i 3 键占2 5 鼽3 鹏。 表i - i 葡聚糖在各物种中含量及比例 t a b l e i - it h e c o n t e n t a n dr a t i o o f 卜l ，3 - 1 , 4 - g l u c , m a s e i ns p e c i a 查塑 坠堡塞壁垒墨堑：点耋墼堕塑堑 大麦3 ：32 5 - 8 5 燕麦 黑麦 小麦 3 7 j 1 2 7 5 4 5 - 7 1 5 1 8 9 0 6 5 p 葡聚糖具有高黏度，分为水溶性和水不溶性两种。水溶性争葡聚糖所占比例较大，与蛋 白质结合的 葡聚糖大都不溶于水，其中p i 。3 键的含量和糖的聚合度是影响水溶性的主要因 素。p 葡聚糖在水中溶解成为粘性溶液，其浓度愈高，粘度愈大。高浓度b 葡聚糖会形成网状 结构，能够吸收其周围的水分子，从而降低周围环境的物理特性。弘葡聚糖表层带负电荷，在 溶液中极易与带正电荷的物质结合。此外，b _ 葡聚糖还能吸附钙、锌、钠等金属离子以及有机 质。 p 葡聚糖在实际应用中存在一些负面影响。在制造麦芽汁过程中，由于大量高分子b 葡聚 糖存在，致使麦芽汁粘度增大，过滤困难；在发酵过程中过量的8 一葡聚糖还会与蛋白质结合， 使酵母早期沉淀。在动物饲养中，存在于饲料中的争葡聚糖由于自身的种种限制因素( 高粘性、 高亲水性、高吸水活性及吸附性等) 影响营养物质在动物体内的代谢，从而降低动物对营养物 质的吸收效率。 1 2 1 5 - 1 ，3 1 ，4 一葡聚糖酶 2 1 争l ，3 1 ，4 - 葡聚糖酶分布 l ，3 1 , 4 - 葡聚糖酶( 葡聚糖酶) 存在于植物和微生物中，人和动物体内是缺乏的。目前， 在杆菌( a k i t am ，e ta 1 2 0 0 5 ) 、梭菌( s d l 曲m i n gs ，da 1 1 9 9 1 ) 、纤维菌( w e ntn ，e la 1 2 0 0 5 ) 、真 菌( k i msa ，c ta 1 2 0 0 2 ) 、高等植物( h a r v e yaj ，e la i 2 0 0 1 ) q h 都发现了争l ，3 1 , 4 - 葡聚糖酶( 表 1 - 2 ) 。 1 中囝农业科学院硕卜学位论文第一章引言 6 - - 表l - 2 p l j i 一葡聚糖酶的来琢 t a b l e1 - 2 t h e s o l l l c t x o f 争1 , 3 - 1 , 4 - g l u e a n a s e 1 2 2 争1 ，3 1 , 4 一葡聚糖酶结构与性质 1 2 2 1 p l , 3 - 1 , 4 - 葡聚糖酶结构特征 纠d _ 葡萄糖是构成p 葡聚糖的基本结构单位， 葡聚糖是由1 2 0 0 多个争d _ 葡萄糖基通过 争l ，3 键和p t ，4 键按1 2 5 的比例连接而成的链状高分子化合物。将大麦中分离出的水溶性争 葡聚糖用专一性争i ，3 1 4 葡聚糖酶水解，经凝胶过滤层析和甲基化方法确定结构发现，近9 0 的多糖是由争l 3 键所分隔的纤维三糖和纤维四糖单元组成，5 一1 1 个连续的争l 4 糖苷键相连的 寡糖单元也占有较高的比例( b e e r , 1 9 9 7 ) 。来源于杆状细菌的阻l ，3 1 4 葡聚糖酶归类为糖苷水 解酶1 6 家族，均具有一个相似的氮基酸序列，含保守序列e i d i e f ( 其中的两个谷氨酸残基具 有水解催化能力) 。非芽孢杆菌属来源争l ，3 1 葡聚糖酶在催化区序列上与芽孢杆菌属来源高 度相似，但它们还经常带有一个附加区，如r u m i n o c o c c u sf l a v o f a c i e n s 来源皿1 , 3 1 , 4 - 葡聚糖酶 g 末端连有一个3 0 9 个氨基酸的功能区，其中包含一个3 0 个苏氨酸序列。 通过x - r a y 晶体学研究来源最a m y l o l i q u 咖c 蛔”和最m a c e r a ? l $ 杂交获得的争l ，3 1 乒葡聚糖 酶，它同样属于糖苷水解酶1 6 家族，也得到了第一个p l ，3 1 争葡聚糖酶三维结构。芽孢杆菌 产p l ，3 1 葡聚糖酶是反向平行p 折叠体系( 图1 1 ) ，蛋白核心通过两个p 折叠互相堆积形成 一个三明治结构，由七个反平行链组成，每条链是弯曲的，朝外的一面构成一个凹穴，便于基 质的结合。p 折叠环大部分是由p 转角建立的稳定结构，只发现一个具有n 螺旋的转角。主环 表面覆盖了部分由b 折叠形成的基质结合区，c y s 3 0 和c y s 5 9 之间的二硫键将主环和蛋白核心 形成的b 折叠连接起来。在分子凸面远离活性位点处是钙离子结合区域，起到稳定蛋白结构的 作用( p l a n a s 2 0 0 0 ) 。 分子的凹面区域认为是底物结合位点，可被外围的芳香族残基和底部的酸式残基线性化， 催化残基位于具有严格极性和非极性链转换的b 折叠上，该链的第一个催化残基朝向蛋白表面， 能够与基质相互作用，其后的则朝向疏水的内部( s e h e l t i n g a ：a c 1 9 9 5 ) 。这种结构类型在1 6 2 中国农业科肇院硕l - 学位论文第一章弓f 言 家族l ，3 争葡聚耱中由于h i s 残基插入判l l e l 0 6 和g l u l 0 7 之阔而被破坏。 植物和微生物所产该酶无论是在氮基酸序列上还是在三维空间结构上都没有相似性。植物 所产p l 3 l 葡聚糖酶属于糖苷水解酶1 7 家族，拥有( 吖b ) 8 桶状三维结构：微生物所产p l ，3 1 葡聚糖酶则属于1 6 家族，有一个环状争三明治结构( 图1 1 ) a 细菌b 蜊a ) b 植物( p i a n o 图i - ii q , 3 - 1 , 4 葡聚糖酶的p - 三明治结构( a ，细菌) 和邮) s 橘状结构( b ，植物) f i gi - i k s o n d w i c hs t r u c t u r e ( a ，h e c m d a ) a n d ( 邮k i x 锄, e l f o l d ( b ，p l a n t ) o f p - 1 , 3 一i a - g l u c o n a s e 1 2 2 2 l , 3 - 1 , 4 葡聚糖酶性质 争l ，3 1 ，4 - 葡聚糖酶( e c 3 2 1 7 3 ) 是内切糖苷酶，在植物萌芽早期过程中，b 1 ，3 1 葡聚糖 被p l ，3 1 争葡聚糖酶、p - ! ，3 一d - 葡聚糖酶( e c 3 2 1 3 9 ) 、争l , 4 - d 葡聚糖酶( e c 3 2 i 4 ) 等多种 糖基水解酶催化水解。然而，在这些酶中p 1 ，3 一l 务葡聚糖酶最为活跃，能专一性催化大麦p 葡聚糖或地衣多糖( p l ，3 1 4 键型) 中临近争l 3 键的肛l 4 键的水解反应。具有严格的底物专 一性，对纤维素和羧甲基纤维素( p l ，4 键型) 、可溶性淀粉( m l l ，6 键型) 和蔗糖( b 1 2 键型) 、 棉籽糖( 洳i ，6 - 争l ，2 键型) 都不发生作用：其水解大麦争葡聚糖的终产物是三糖( g 4 g 3 g ) 和四 糖( g 4 g 4 g 3 g ) f 图1 - 2 ) 。 早r 吒霉 p 以触一 “+ ( g ) 3 + ( g ) 4 + 臣i - 2p - ，1 4 - 葡聚糖酶的作用机制 f i gi - 2t h e a c t i o n m a c h a n i s m o f 争l ，3 - 1 , 4 - g l u c a a a s e 芽孢杆菌属来源的p 1 ，3 - 1 , 4 - 葡聚糖酶分子量一般是2 5 - 3 0k d a ，p h 一般是6 - 7 ，5 ( b a c i l l u s b r e v i s 为9 o ) ，作片 溢度是4 5 - 6 5 c ；而非芽孢杆菌属来源其分子量、p h 、温度都偏高一些，如 t a l a r o r a y c e s e m e r s o n i i 来源的阻i ，3 一l 牛葡聚糖酶分子量达到了4 0 7 k d a ，温度达到了8 0 c 。 3 中国农业科学院硕卜学位论文第一琵引言 1 2 3p l ，3 一l 葡聚糖酶功麓及应用 在啤酒工业中，国外一些国家已经采用 葡聚糖酶作为主要酶制剂之一。过量的争葡聚糖 是造成啤酒不稳定的重要原因，引起啤酒雾状浑浊和凝胶沉淀。从f l - l , 3 1 葡聚糖酶的存在来 源分析，它是降解淀粉胚乳细胞壁的主要参与者，与麦芽浸出率有关。麦芽糖化时加入争l ，3 一i 4 一 葡聚糖酶可分解其中的b - 葡聚蓿凝胶，糖化麦芽汁，降低粘度，减少啤酒中凝胶状沉淀物，提 高啤酒制造中麦汁的滤速及得率，从而有利于改善啤酒风味，提高啤酒质量。 在以麦类为饲料原料的动物养殖中，争葡聚糖在动物肠道中会形成粘稠物质影响动物对营 养物质吸收，被称为抗营养因子。争l ，3 1 , 4 ，葡聚耱酶通过降解争葡聚糖，降低其亲水性和拈性， 即降低肠道内容物的粘度，有效改善胃肠道环境及动物对营养物质的吸收效率，提高饲料利用 率，去除抗营养因子的作用。争l ，3 1 ，4 一葡聚糖酶可以与细菌细胞壁上的受体结合，从而阻止细 菌与动物肠黏膜上的糖基结合，保护肠黏膜的结构和功能的完整性，具有抑制有害微生物和维 护动物肠道微生态平衡的作用，并减少传统抗生索的使用量。可见在啤酒发酵工业和饲用酶制 剂工业中阻l ，3 1 , 4 葡聚糖酶都具有重要经济价值，已被公认为有效的饲料添加剂、酶制剂 另有研究表明，争l 3 1 ，4 - 葡聚糖酶降解 葡聚糖或地衣多糖得到的产物能够有效促进乳酸 蕴等益生菌的生长。最近，t h o m a s 等( 2 0 0 0 ) 发现一种新的内切争葡聚糖酶也能切割1 ，3 - l 糖苷键，其作用主要与植物的生长调节有关，但尚未见该酶用于啤酒酿造中降解大麦p 葡聚耱。 1 2 4p l ，3 1 葡聚糖酶基因克隆及表达研究 1 2 4 1 争1 , 3 一l ，4 - i i 聚糖酶基因克隆 芽孢杆菌属中很多菌都分泌p l ，3 1 葡聚糖酶。1 9 8 3 年爱尔兰学者c a n t w d l 和m c c o n n e l l 首先从b a c i l l u ss u b t i l i s 中克隆到该基因并建立了检测手段。至今，研究者们已经从许多芽孢杆 菌中克隆到争1 ，3 1 争葡聚糖酶基因并进行了序列分析，包括b a c i l l u ss u b t i l i aw a ne ta 1 1 9 9 7 ) ，b a c i l l u sa m y l o 蛔u e f a c i e n s ( o l s e ae ln 1 1 9 9 1 ) ，b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ( l l o b e r a se ta l1 9 9 1 ) ， b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ( t e n gna 1 2 0 0 6 ) ，b a c i l l u s ，f t a c e r a n s “b i b e ta 1 1 9 9 1 ) ，b a c i l l u sc i r c u l a r s ( k i m2 0 0 3 ) ，b a c i l l u sh a l o d u r a n s ( a k i t ae ia l2 0 0 5 ) , es u e c i n o g e n e s ( w e ne ta 1 2 0 0 5 ) ，c e l l u l o l y t i c r u m e l la n a e r o b es t r e p t o c o c c u sb o v s ( e k i n c ie ta l ，2 0 0 1 ) 等。2 0 0 1 年本实验室从b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i se g w 0 3 9 中克隆到p l 3 1 ，4 - 葡聚糖酶基因，去除了n 端信号肽序列，基因长为6 4 8 b p 。芽孢杆菌来源争l 3 1 葡聚糖酶核苷酸序列和蛋白质序列同源性都非常高( 5 0 ) 。但也 存在个别差异，其中b a c i l l u sc i r c u l a n s 来源f l - l , 3 1 年葡聚糖酶核苷酸序列长度是其余芽孢杆菌 的二倍，并且它还能水解羧甲基纤维素；a l k a l o p h i l i cb a c i l l u ss p n 1 3 7 在c 末端有一个富含赖氨 酸的区域，这在其它芽孢杆菌属来源b - l ，3 1 冉葡聚糖酶中还没有发现。第一个真菌来源 争1 ，3 一l ，4 葡聚糖酶基因是1 9 9 7 年从嗜碱真菌o r p i n o m y c e s 中克隆到的，其核苷酸序列不含内含 子，并且在它的侧翼区富含a t 。 1 2 a 2 i i - 1 , 3 - - 1 葡聚糖酶基因表达 微生物来源争l ，3 1 葡聚糖酶基因已经在不同的生物宿主中实现了表达。目前报道的生物 宿主有大肠杆菌、芽孢杆菌、霉菌、酵母、转基因大麦和烟草、哺乳动物等。不同来源每l ，3 1 4 中国农业科学院硕卜学位论文第一鼋引言 葡聚糖酶基因在不同宿主中的表达机制也不尽相同。 芽孢杆菌属来源叫，3 一i 争葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达可由芽孢杆菌自己的启动子 和信号肽控制，也可以由表达系统的强启动子和信号肽控制。争1 3 1 ，4 葡聚塘酶不仅积累在周 质空间，而且还分泌到细胞外的培养基中。基因来源不同，经大肠杆菌宿主分泌的表达产物在 胞内外和周质空间分配比率也不同，通常2 0 0 撕0 在胞外：6 0 - 2 0 在周质空间；其余的 1 0 - 5 0 为胞内蛋白形式。本研究中，地衣芽孢杆菌来源的弘l ，3 1 , 4 - 葡聚糖酶去除其本身信 号肽后在大肠杆菌中由高效表达载体p e t 2 8 a ( + 1 的t 7 强启动子和信号肽控制成功地实现了表 达，胞内、胞外均有重组蛋白存在且分配比例不同( t e n g e ta 1 2 0 0 6 ) 。 英国h i n c h l i f f 等人( 1 9 8 4 ) 首次将且m b t i l i s 来源p l 3 1 , 4 - 葡聚糖酶基因引入酵母菌表达， 但是酶活水平很低。研究者们意识到启动子是外源阻l ，3 1 争葡聚糖酶基因在受体细胞中表达的 关键因子，于是开始了对酵母启动子的研究。c m l t w e l l ，o l s e n 。m e l d g a a r d 和v a n 等利用酵母启 动子对争l ，3 一l ，4 一葡聚糖酶基因的表达作了研究，研究证明在酵母启动子中，细胞色素启动子， 乙醇脱氢酶启动子，内切蛋白酶b 启动子和磷酸甘油酸激酶启动子等都能提高该酶的表达本平。 本实验室将地衣芽孢杆菌来源的p l ，3 1 ，4 一葡聚糖酶基因通过电转化引入酵母菌pp a s t o r i s g s i l 5 ，利用强启动子a o x l 实现了表达，但表达水平低；故又进行了b - l 3 ，l 冉葡聚糖酶基因 的密码子优化改造，按照毕赤酵母的密码子偏爱性选择利用高频率密码子重新设计目的基因， 同样利用强启动子a o x i 进行表达，结果表达量( 摇瓶农平) 提高了1 5 倍( t e n ge ta 1 2 0 0 7 ) 。 与缺乏糖基化机制的大肠杆菌表达体系相比，在酵母表达系统中n 一端糖基化机制提高了表达产 物的热稳定性，本研究中p p a s t o r i s 表达的重组酶存在3 个糖基化位点，其热稳定性提高了5 1 2 ， 且糖基化程度与菌株和培养条件有关( m e l d g a a r d , e ta l 。1 9 9 4 ) 对于微生物弘l ，3 1 乒葡聚糖酶基因在植物中的表达也有报道，j e n s m 等实现了b a m y l o l i q u e f a c i e n s 和最m a c e r o m 来源热稳定性较好的杂交 l ，3 1 ，4 葡聚糖酶在酿酒大麦中的表 达，并且该酶在大麦萌发的高温条件下仍然保持较高的酶活。p i r u z i a n 等( 1 9 9 8 ) 首次采用烟草转 化系统，使c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m 来源的b _ i ，3 1 , 4 - 葡聚糖酶基因在烟草中得到了表达。 现将本研究中克隆表达的p l ，3 1 , 4 葡聚耱酶同其他来源的争l ，3 1 ，4 一葡聚糖酶的表达情况 进行比较( 见表i ”。 表i - 3 争1 ，3 - i , 4 - 葡聚糖酶基因的克隆与其表达结果的概括 t a b l e l - 3 t h e s m m n a r y o f v ”v i , m r e s u l t s 争1 3 - 1 , 4 - g l u c a n a ”g o n e c l o n i n g a n d “p n s i i n v a r i o u ss y s t e m 5 中国农业科学院硕 一学位论文 第一章引言 产m e l h a n o h c a p m e t u a 2 6u r a l 。t e n ge ta t 2 0 0 5 p m a d l 6 b 1 i c h e n i f o r m i $ p p a s l o r i s 妒i c 9 k 4 um l t e n ge ta 1 2 0 0 7 g s l l 5( 优化基因) 3 3 3 7 u m l 4 o r p i n o m y c e s o y o n 且p o l y m y x a p p a s t o r i sp p i c z u b x 3 3 e c o l ib l 2 1 p e t 2 6 b ( + ) e c o l ib l 2 lp g e ) ( e c o f ib l 2 1 p e r 2 $ a ( + ) a n d1 3 3 4 8u m g l 1 0 8 0 0 u m r 。w e nda 1 2 0 0 5 7 9 9 0a n d7 8 3 3u m r 4 5