（植物学专业论文）3种北极微藻的温度适应性研究.pdf

摘要 为了探讨北极微藻对温度的适应机理，本项目以3 种北极微藻一玛氏骨条藻 ( s k e 跆t o n e m am a r i n o i ) 、小球藻( c h l o r e l l as p ) 和衣藻( c h l a m y d o m o n a ss p ) 为试 材，采用不同温度( 0 、4 和8 ) 处理，探讨了3 种北极微藻的生长、抗氧化 酶系统、脂肪酸组成、超微结构以及色素变化的规律，初步得出以下结果： 1 、3 种北极冰川微藻在不同温度下的生长情况各不相同，玛氏骨条藻的生长周 期最长( 5 0d 左右) ，衣藻的生长周期最短( 2 8d 左右) ；玛氏骨条藻具有相对较 为明显的低温适应性( 4 ) ，但过低温度会导致生长速率下降；小球藻则更适应 相对较高的温度：而衣藻的温度适应性较广，不同温度下生长情况没有太大差异。 2 、方差分析结果表明，在玛氏骨条藻的生长期内，0 和4 两组之间的抗氧 化酶活性及m d a 含量差异极显著( p o 0 1 ) ：而玛氏骨条藻和小球藻在0 和8 两组之间的c a t 活性差异显著( p 0 0 5 ) 。0 和4 这两个温度对玛氏骨条藻的抗氧化 酶系统的影响较大；相对于s o d 活性及m d a 含量而言，温度对玛氏骨条藻和小球 藻的c a t 活性影响较衣藻更大。3 种藻生长期内，它们的s o d 、c a t 和m d a 的变 化趋势均为先升高后降低的规律，说明3 种微藻通过自己独特的生理代谢机制，在 不同温度条件下通过保护酶的作用使微藻细胞内的生理代谢达到一个新的平衡，维 持细胞生物体正常代谢和生长，因而对温度变化具有较好的适应性。 3 、3 种藻的脂肪酸组成均主要以多不饱和脂肪酸的形式为主，在不同温度环境 中维持膜流动性方面起着重要的作用。c 2 0 ：4 在玛氏骨条藻的相对最适生长温度下 含量最大，可能在其维持质膜流动性方面起主要作用：两种绿藻c 1 8 ：3 占比例最大， 降低和提高温度都有利于绿藻多不饱和脂肪酸的积累，虽然温度的变化对脂肪酸含 量有一定的影响，但是不明显；脂肪酸的组成及变化因微藻种类不同而有差异。 4 、电镜照片的结果表明，较低温度下两种绿藻以储存脂肪颗粒的形式度过低 温环境；在o 时，玛氏骨条藻和小球藻分别通过类囊体片层扭曲膨大和细胞体积 变大，来维持其正常的生命活动；总体而言，不同温度下3 种藻的重要器官没有发 生结构上的明显变化，能够发挥正常的功能，是3 种藻对本实验的温度具有较好的 适应性的有力说明。 5 、光谱扫描的实验结果表明，3 种藻各光合色素含量的变化情况与生长曲线的 情况基本符合；c h l a 的含量及细胞平均c l d a 含量、及辅助色素c h i c 、c h l b 及光保 护色素c a r 与c h l a 的相对含量( 光谱比值) 变化及各光合系统( p s i 及p s i i ) 对 c h l a 的贡献率等随着藻种和温度的变化而有所不同，说明不同藻种的光合系统通过 不同的反应机制对环境的温度变化进行响应，对温度的变化具有不同的反应。 总之，从生长特性、生理生化变化、超微结构、脂肪酸变化以及光合色素变化方 面分析3 种微藻对不同温度的适应性，发现3 种微藻通过自己独特的生理代谢机制，能 够较好的维持细胞生命活动的正常代谢和生长，因而对本实验所设定的温度变化具有 较好的适应性。 关键词：北极微藻：生境适应性：生长曲线；抗氧化酶系统；脂肪酸；超微结构； 光合色素 s t u d i e so nt h ea d a p t a b i l i t yo ft h r e ea r c t i cm i c r o a l g a et o t e m p e r a t u r e s a b s t r a c t i no r d e rt os t u d yt h ea d a p t a b i l i t yo ft h r e ea l g a ls p e c i e s ( s k e l e t o n e m am a r i n o i ， c h l o r e l l as p a n dc h l a m y d o m o n a ss p ) ，w h i c hs e p a r a t e df r o mm e l t e dg l a c i a lw a t e rt o d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ，t h eg r o w t hc u r v e ，a n t i o x i d a n te i l z y m es y s t e m ，t h ec o m p o s i t i o n o ff a t t ya c i d ，u l t m s t r u c t u ma n dp i g m e n ta td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ( 0 、4 、8 ) w e r e e x a m i n e di nd e t a i l t h er e s u l t sw e r el i s t e da sf o l l o w s ： 1 a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so fg r o w t hc u r v e ，i tw a sf o u n dt h a tt h es i t u a t i o no fg r o w t h i sd i f f e r e n ta td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s t h el i f ec y c l eo fc h l a m y d o m o n a ss p i ss h o r t e s t ( a b o u t2 8d ) ，b u tt h el i f ec y c l eo fs k e l e t o n e m am a r i n o iw e r el o n g e s t s k e l e t o n e m a m a r i n o ih a dt h ea d a p t a b i l i t yo fl o w t e m p e r a t u r ec l e a r l y ，b u tt h el o w e rt e m p e r a t u r ec a n r e s t r a i nt h ev e l o c i t yo fg r o w t h c h l o r e l l as p a r ee a s yt oa d a p tt h er e l a t i v eh i g h e r t e m p e r a t u r e ，a n dc h l a m y d o m o n a ss p h a da d a p t a b i l i t yi nl a r g er a n g eo ft e m p e r a t u r e ， t h e r eh a sn op r o m i n e n td i f f e r e n c ea t d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s 2 i nt h el i f ec h i v eo f s k e 跆t o n e m am a r i n o i ，t h ed i f f e r e n c eb e t w e e n0 a n d4 o f a n t i o x i d a n te n z y m es y s t e ma n dt h ec o n t e n to fm d aw a sv e r yp r o m i n e n t ( p 0 o1 ) a n d t h ed i f f e r e n c eb e t w e e n0 a n d 8 o fc a t a c t i v i t yo fs k e l e t o n e m am a r i n o ia n d c h l o r e l l as pw a sp r o m i n e n tt o o ( p 8 6 0 0 0 1 x ) 的限制，在0 c 仍然有光合活性，同时不会被u v 辐射抑制，细胞光合作用 产生有机物( 有机酸、多糖) 分泌到环境中，使环境中的p h 值降低，因为极地微藻有 一套有效的抗胁迫体系，保护其光合系统、生物膜系统和酶系统，以此来保证微藻细 胞的生理活动可以正常的进行。所以，研究具有抗冻、抗氧化和抗辐射特性的极地微 藻具有十分重要的理论意义和实际应用价值嘲。 1 1极地微藻的种类与生态分布 极地生态系统中，栖息于极地环境海冰表面、内部和底部的微藻群落是重要的初 级生产力。它们可以在海冰中大量的繁殖，使海冰表面呈现棕色；还可利用夏季的有 利条件形成浓密的藻华。在每年夏初，冰体裂解后，微藻就构成了南极地区重要的生 物量和能量流p 一0 1 。在北极地区的格陵兰海地区，硅藻在浮游植物中占主导地位， 属于优势种。何剑锋等人对1 9 9 9 年的北极拉普捷夫海东南部的冰藻和冰下浮游植物群 落的种类和组成进行了分析，同时对丰度和生物量进行了统计和对比。共鉴定出藻种 1 0 0 种，硅藻占绝对优势，其中又以羽纹硅藻为主。甲藻和绿藻等其他种类有1 2 种，优 势种比较集中，微藻主要集中在冰底1 0e m ，平均为6 3 9 0 x 1 0 4 c e l l s l 一，丰度为1 4 6 1 5 6 2 2 1 0 4 c e l l s l ；生物量为7 8 9 - - 2 0 9 3 5 岖c l 1 ，平均为8 8 6 9p g c l 一，总体上比次 冰底高1 个数量级，比冰下表层水柱高2 个数量级n 钉。 1 2 极地微藻对温度的适应机理 生物的生境适应性研究一直以来是一个学术方面的研究热点，其中，温度作为一 个重要的方面来讲，它是影响地球上植物分布与生长的重要因素。在严酷的极地环境 中，低温是一个非常重要的环境因素，极地的低温环境对生存于其中的微生物产生了 深刻而广泛的影响，适合极地微藻生长的温度接近于q 。对其中的微生物产生了广 泛而深刻的影响，低温通过各种途径影响生命活动：降低细胞的生化反应速率、影响 2 3 种北极微藻的温度适应性研究 某些细胞组分的稳定性以及冷冻所造成的破裂作用。尽管低温有着很强烈的负作用， 但是极地的微生物为了生存，需要一系列的耐受低温的特性，或者说适应机理来将极 端环境所造成的损伤降低到最低限度，尽管在温带地区也能够发现这些细胞和其生命 活动的机理，然而极地的特殊理化条件造就了一群非常强壮和有韧性的微生物群落。 主要在酶分子水平、细胞膜以及细胞质等各个方面发生了精细的组成和结构，因而弥 补了低温对细胞生长的消极影响n 习。对于极地的微藻而言，温度对其生长和发育及繁 殖有调节作用，对酶的活性、营养物的吸收利用效率及细胞分裂的周期等诸多方面都 存在不同程度的影响旧：极地微藻能够在- - 8 条件下生长，而且不结冰。所以对于 低温适应性研究而言，极地微生物是极好的模式生物。国内外在南极冰藻的低温适应 性方面做了大量而深入的研究和发现，揭示了极地微藻在低温的环境条件下能够保持 正常生命活动的机理，因此研究极地微藻的抗冷机制具有十分重要的理论意义和实际 应用价值。 1 2 1 低温对极地微藻的影响 生物体中存在着发达的生物膜系统，是由流动着的脂类双分子层组成。作为特殊 屏障的细胞质膜把细胞与外界环境隔离开来，严格而有序地控制着细胞与外晃环境之 间的物质、能量及信息交换。所以说质膜的结构和功能对于植物的生长和生理发育过 程有着极为重要的影响n 町，质膜与生物适应性之间的关系早就引起了人们的注意，随 着研究的不断加深，人们发现原生质膜与植物适应性的关系越来越密切n 卜嘲。膜伤害 假说认为，生物膜因为其结构物质的特点会随着外界环境的变化而相应的发生一系列 的变化，当外界环境条件发生变化的时候，原生质膜会发生相变，膜的流动性也会降 低，导致膜上的结合酶活力下降，膜的透性增加，这些变化又会引起胞内的离子失去 平衡，进一步导致细胞的代谢失调。同时，由于受到许多生物和非生物因素的影响， 浮游植物脂肪酸的组成会发生很大的变化，例如低温、高盐、低光照、强辐射和寡营 养等因素 1 e l 。 细胞膜是细胞最重要的一个结构，是由流动的脂类双分子层组成的，里面镶嵌有 蛋白，负责运输、磷酸化、光吸收和细胞的其他一些功能。细胞膜的流动性是膜蛋白 发挥功能的先决条件。但低温会使膜流动性下降，造成膜的损伤，镶嵌于其上的蛋白 的许多功能将受阻。进而又会影响与膜蛋白相关的功能蛋白，导致细胞膜功能受损， 如选择通透性等一系列生理特性都会受到影响。膜双分子层是由不同类型的脂肪组成 的。随着温度的不断变化，双分子层会在“液晶态 和“胶体态一之间转换，而膜中 的脂肪凝固温度与脂肪酸的组成密切相关，脂肪酸的饱和程度对膜的流动性影响很 大，较小的脂肪酸组成变化就能够引起较大的相变温度变化。对膜的损伤是生物体对 低温反应的一个最好的解释，但低温同时也可以产生其他类型的伤害。 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 1 2 2 国内外目前对极地微藻温度适应性的初步研究 1 2 2 1 胞外分泌物的作用 南北极海冰内的低温往往对生物有着致命的伤害作用，具体的表现之一就是冰晶 在胞内生长会导致微藻细胞膜类的破裂，胞外生长则会使细胞脱水。前人的研究发现 冰藻可以分泌一种胞外多聚物，2 0 0 5 年，阚光锋对低温胁迫下的绿藻l 4 进行了电镜观 察时发现，低温诱导下藻体能够大量的分泌胞外物质，它在冰藻的抗冻方面起着重要 的作用n 刀。r a y m o n d 等人( 1 9 9 4 ) 的研究发现，在南极的蓝藻突变体，以及硅藻、绿藻 和苔藓中，均存在着胞外分泌物，并且活性很强。他们同时对这些胞外的物质进行了 初步的研究，发现这是一类不同于抗冻蛋白的特殊的物质一冰活性物质( i c e a c t i v e s u b s t a n c e s ，l a s s ) ，它是一种重要的胞外分泌糖蛋白，有调整生长冰晶形状的能力。 1 a s s 的最显著的特征就是，附着在增大的冰的表面，蚀刻冰晶或者使冰晶变形n 帕。与 抗冻蛋白不同的是，i a s s 不能明显的降低溶液的凝固点，即它不具有热滞活性。j a n e c h 等人( 2 0 0 6 ) 研究发现海冰硅藻冰川舟形 藻n a v i c u l a g l a c i e i v a n h e u r k 分泌的具有干扰 冰晶生长和防冻作用的胞外多聚物为2 5 k d a 的蛋白，而另一海冰硅藻圆柱拟脆杆藻 f r a g i l a r i o p s i sc y l i n d r u sg r u l o w 的一条c d n a 翻译的蛋白与冰川舟形藻的胞外蛋白的 氨基酸序列部分重合，并且能扩增出冰川舟形藻的胞外蛋白的e d n a 。而嗜温型硅藻 伪矮海链藻t h a l a s s i o s i r ap s e u d o n a n ah a s l e & h e i n d a l 的基因组中没有发现有任何相似 的蛋白。以上两种海冰硅藻分泌的胞外蛋白与嗜冷型雪霉菌的抗冻蛋白相同，并作为 一种新型的抗冻蛋白不同于已在鱼体、昆虫、植物、细菌中发现的抗冻蛋白n 町。 1 2 2 2 代谢的变化 前人的研究结果发现，冰藻会通过降低暗呼吸率和消耗，在低温下能够比常温藻 保持更高的生长率。1 9 9 5 年s u z u k i 等对分离自温暖水域到北冰洋的8 株硅藻进行了 分析研究，每个种类的最大生长率温度被发现均高于现场的采样温度，接近于上限致 死温度，而在现场采样温度条件下各种类的相对生长率均为最高。在低于最大生长率 的温度条件下培养时，分离自北冰洋的寒冷菱形藻( n i t z s c h i a 夕i g i d ag r u n ) 和角毛藻 ( c h a e t o c e r o ss p ) 相对常温藻而言更能够保持较高的生长率例。1 9 9 4 年s m i t h 等对一 种北极常见的海冰冰底藻类一成列菱形藻n i t z s c h i as e r i a t a ，c l e v e 研究分析发现该藻 为嗜冷型微藻，其上限致死温度为1 2 - - 1 5 ，最佳的生长温度为6 1 2 。该藻的 暗呼吸率很低，并且几乎没有发现胞外代谢物，当培养温度降低后，光合作用率能够 在短期内恢复到原来的水平，使其在低温下仍能持续生长，在其最低生长温度之下， 细胞个体( 碳量细胞) 达到最大雎 。另外，冰藻也往往会产生大量的孢子以保证安 全越冬，孢子坚实的孢囊有利于隔绝外界恶劣的环境条件。 43 种北极微藻的温度适应性研究 1 2 2 3 低温酶类的作用 目前对极地微生物的生理研究方面以低温酶的研究工作最为广泛和深入，对其低 温适应性分子机制方面的阐述也最为详尽，关于这方面的研究及综述也较多纠订，极 地微生物由于长期的生活在寒冷的环境当中，在自然选择的作用下会形成一套独特的 与低温环境相适应的分子机制。酶催化生物体内所有的生化反应，也是极地微生物适 应低温等不利环境的一种极为重要的因素，它们所产生的酶在低温时有着比中温酶更 高的催化效率。根据m a r g s i n 等人1 9 9 1 年的定义，通常把最适催化温度在3 0 左 右，在0 左右仍然有一定的催化效率的酶称为低温酶嘲。与中高温环境条件相比， 在低温的环境条件下，水的粘度会明显加大，热运动显著降低。在这样的环境条件下， 由于热运动的下降，酶与底物的结合与分离、酶分子构象的改变都会比在中高温时要 困难，酶分子必须结构变得更加柔顺，才能在这样的环境条件下拥有较高的催化效率， 从而增加构象改变的速度。与中温微生物相比，由这些极地微生物分泌的酶分子能够 体现出一种独特的分子适应性n 羽。3 维结构的研究结果表明，这些来自极地微生物的 酶比中温微生物的酶只是在酶分子的某些特定部位存在着细微的差别。现在人们普遍 认为这些酶分子的低温适应特性主要是依赖于酶分子内基团之间相互作用的减弱以 及酶和溶剂分子的相互作用的增强。这样的分子结构变化使得酶分子更具有柔性，增 强了其与底物的作用，降低了反应的活化能，从而提高了酶的催化活性嘲。 s o d 是活性氧清除反应过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，它能够将超氧物阴离 子自由基快速的歧化为过氧化氢( h 2 0 2 ) 和分子氧。s o d 在清除氧自由基，防止氧自 由基破坏细胞的组成、结构和功能，保护细胞免受氧化损伤等方面有着十分重要的作 用。阚光锋( 2 0 0 5 ) 对南极绿藻抗氧化酶系统测定结果表明，低温环境下的s o d 活性会 迅速的升高并且大量的积累，几乎是对照组的2 倍，能够消除膜脂过氧化产生的超氧 物阴离子自由基。同时p o d 的含量也上升，在消除h 2 0 2 和o h 等活性氧中起一定作 用n 。植物体中的c a t ，主要是清除植物组织产生的h 2 0 2 ，解除组织的氧化胁迫，除 s o d 和p o d 夕i ，抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 能够催化h 2 0 2 还原为h 2 0 ，是清除h 2 0 2 的 主要酶类，对抗坏血酸有着很高的特异性和亲和性。p o d 是一种叶琳环含铁蛋白酶， 其活性的应激性变化被广泛作为反映植物受逆境胁迫的一个重要指标，它的主要功能 就是减轻有机氢过氧化物对机体的伤害。 1 2 2 4 细胞膜的相关变化 众所周知，有功能的细胞膜对细胞的生存和生长来说是必不可少的。在低温的环 境条件下，当细胞膜由液晶相向胶相转变的时候，冰冻及其引起的脱水作用将会对细 胞造成一定程度的损害。极地微生物之所以在低温条件下仍然能够进行主动运输，是 因为它的细胞膜结构与普通微生物的细胞膜构造有一定的区别，即使低温环境也不能 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 抑制膜现象的发生矧。 第一，细胞膜的弹性可以增加由于脱水诱导的收缩和舒张压力的抗性。对结冰已 经适应的原生质体，其对结冰的抗性比没有适应的要高3 0 ，这两种质膜在功能和结 构上是不同的。藻质膜的电子显微镜研究结果表明，质膜的超微结构和结冰抗性之间 有着一种密切的联系删。3 种藻( 其中一种为c h l o r o m o n a s p a l m e l l o i d e s ) 能够抵抗- - 2 0 温度的反复冻溶，超微结构研究结果表明，质膜中有着许多的内陷；而c h l o r o m o n a s 属的另两种常温藻的质膜没有内陷。 第二，在低温的条件下，细胞膜为了维持各项代谢功能的稳定发挥，它的成分也 会发生相应的改变。许多的微生物细胞通过改变细胞膜的脂肪酸组成来保持细胞膜在 低温时较好的流动性。最常见的反应就是增加去饱和酶的活力，来降低脂双层中饱和 脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例，也就是增加不饱和脂肪酸的含量。另一个反应就是缩 短脂肪酸酰基链的长度、增加支链脂肪酸的比例或者降低环状脂肪酸的比例，这对改 善细胞膜的流动性具有相似的效果洲。p u f a s 在细胞膜膜脂中的比例随着生长温度 的变化而有所改变，可能在最低生长温度时会达到最高，进而达到调整细胞膜流动性 的目的l 。膜中脂肪酸的组成能够较好的调节膜的流动性，因此，不饱和脂肪酸比 例的增加、脂肪酸链长度的降低和多不饱和脂肪酸( p u f a ) 含量的增加，都是二些维 持膜流动性的重要因素州。在嗜冷性的硅藻中，营养缺乏到一定的程度会导致膜蛋 白质的损失，为了补偿这种损失，磷脂双分子层会产生脂肪酸来弥补。许多的微生物 细胞通过改变脂类双分子层中脂肪酸的组成，能够在低温下维持正常的膜流动性。其 中最为常见的就是增加不饱和脂肪酸的含量。其次就是缩短脂肪酸链、增加支链和降 低环状脂肪酸的含量，这些都能提高膜的流动性m 1 。但脂肪酸并不是唯一的一种调节 方式，膜中的色素类物质也在起着极为重要的调节作用。近些年来的研究结果表明， 膜的流动性能被胡萝卜素类物质有效地调节蹲1 。当细胞质膜处于膜相变温度之上时， 极性胡萝i - 素起降低膜的流动性作用：相反，当细胞质膜在相变温度之下时，极性胡 萝卜素起着增加膜的流动性作用。同时，胡萝卜素类物质对膜流动性的调节方式是由 膜中各种胡萝卜素类物质的组成和分子结构来决定的例。已有的研究结果表明，胡萝 卜素类物质和膜相互作用并调节着细胞质膜的流动性，但是这种调节作用是取决于膜 中脂肪酸链的长度和不饱和度的洲。 第三，低温下的冰藻具有较高含量的不饱和脂肪酸，特别是较高含量的短链不饱 和脂肪酸降低了膜的相变温度，较好的维持膜的流动性，保证了生物学功能能够正常 的发挥和行使。由于极地的微藻生活在一个低温、高盐、低光照和寡营养的封闭和半 封闭的环境条件里面。因为细胞质膜的选择性，所以说外界环境条件的变化首先作用 的就是细胞的质膜，大量的相关研究已经对细胞质膜中脂肪酸的变化与外界环境条件 影响的适应性进行了深入而广泛的开展口圳。研究结果表明，极地微藻中一些硅藻主 要是通过单不饱和脂肪酸的累积来度过低温环境的；而绿藻是通过提高细胞内的多不 63 种北极微藻的温度适应性研究 饱和脂肪酸含量来度过低温的不利环境条件“。由此可见，微藻细胞中含有大量的脂 肪酸，能够降低细胞的冰点，保证细胞膜在低温下人仍然有足够的流动性，也说明在 极地的环境中，脂肪酸的组成在微藻的生境适应性方面起着十分重要甚至是很关键的 作用。r a c h a dm o r g a n k i s s 等人的研究发现，温度升高，两种南极冰藻类囊体上的不 饱和脂肪酸，特别是单不饱和脂肪酸明显增加“习。侯旭光、姜英辉等人( 2 0 0 2 ) 发现 4 种南极冰藻的脂肪酸组成中主要是不饱和脂肪酸的形式，在低温的条件下( 一2 1 0 ) 不饱和脂肪酸的含量会增加，饱和脂肪酸的含量会下降n 。4 种冰藻都含有较 多的c 2 2 ：6 脂肪酸，这种脂肪酸是许多膜磷脂的重要组成成分。h e n d e r s o n 等人( 1 9 9 8 ) 研究了巴伦支海冰藻后发现，现场的较低温度下冰藻不饱和脂肪酸的含量要比实验室 常温条件培养的高。嗜冷型盐藻t e t r e u t r e p t i a p o m q u e t e n s i s ( 最适生长温度为0 7 ， 1 0 为上限致死温度) 的脂肪酸组成主要是不饱和脂肪酸1 8 ：4 ( n 3 ) ；而新月菱形藻 ( c y l i n d r u sc l o s t e r i u m ) 、等鞭金藻( i s o c h r y s i ss p ) 等通过短链脂肪酸的合成增加来 维持膜的正常流动性。 实验结果证明，温度下降时，不饱和脂肪酸的增加以及饱和脂肪酸的减少与微藻 细胞内n 3 脱氢酶的活性有关。蓝藻中该酶基因的转录水平在 口 0 ： 厶 。 二 o g o o 0 3 0 1 0 加 时问t i m e ( d ) 4 5 4 o 昌 百3 5 t u o 釜3 0 e o 号2 5 u o61 21 82 4 时间t i m e ( d ) o1 02 0加 时间t i m e ( d ) 图1不同温度条件下3 种藻的生长曲线 f i g 1 t h e g r o w t hc u r v co f 3a l g a ls p e c i e sa t d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s 注：乱玛氏骨条藻b 小球藻c 衣藻 乱s k e l e t o n e m am a r i n o ib c h l o r e l l as p c c h l a m y d o m o n a ss p 小球藻的生长周期约为4 0 d ( 图l b ) ，生长速率随着温度升高而加快，0 下延 迟期长达1 8 天，从2 0 天后进入对数期，在第2 8 天达到最大密度( 2 8 5 1 0 6 c e l l s r n l ) ： 在4 时，前1 2 天为延迟期，在第3 4 天达到最大密度( 3 3 1 0 0 c e l l s m 1 ) ，随后进入 衰退期；在8 条件下前1 8 天是延迟期，在第3 4 天达到最大生长密度( 3 7 4 1 0 6 c e l l s m 1 ) 。 衣藻的4 个生长阶段较为明显，但不同温度条件下的生长曲线没有明显差别( 图 l c ) 。在o 、4 和8 c 3 个温度下，分别为前2 、4 和6 天是延迟期，在第2 4 天、 2 0 天和2 2 天达到最大生长量，5 0 皿藻液干重分别为0 1 1 3 、o 11 6 和0 11 8g s 0 m l 。 o o ”、ili一q享hiq 幅牟兰铤 内蒙古农业大学硕士学位论文1 1 2 3 讨论 浮游植物是海洋中主要的初级生产者，提供了海洋初级生产力的9 0 - - - 9 5 n 町。海 洋生态环境的改变将直接导致浮游植物群落结构的变化。从生态学观点来看，温度的 剧烈变化可能引起生物群落的更替，统计分析表明，温度对生长率影响最大。 对于北极微藻而言，3 种藻在不同温度下的生长情况各不相同，由生长曲线结果 分析可知，绿藻的生长周期要小于硅藻，而衣藻的生长周期要小于小球藻，硅藻具有 较为明显的低温适应性( 4 ) ，但过低温度会导致生长速率下降；小球藻则更适应 相对较高的温度；而衣藻的温度适应性较广，不同温度下生长没有太大差异。3 种藻 相较而言，两种绿藻更适合在相对高的温度下生长。 123 种北极微藻的温度适应性研究 3 不同温度下3 种藻的抗氧化酶系统变化与温度适应性的关系 在正常的生理条件下，植物体内活性氧的产生和清除是处于一种动态平衡之中， 这时活性氧的含量极低，不会危害植物体。当植物体在受到轻度的环境条件影响时， 生物体内会发生一定的膜脂过氧化反应，它是在膜脂不饱和脂肪酸中发生的一系列自 由基反应，膜脂过氧化能够降低膜脂的不饱和度，还可以产生大量的中间产物自由基 以及活性氧，以及最终的产物丙二醛( a ) ，这些产物都会对生物膜产生较大的 影响，严重地损害膜中蛋白质的聚合和交联以及类脂的变化。m d a 能够与蛋白相结 合，从而发生蛋白质分子内和分子之间的交联；膜脂过氧化可以降低膜中不饱和脂肪 酸的含量；并引起膜蛋白的变性：这些都是造成质膜流动性降低的重要原因。关于不 同环境条件下的生物体中抗氧化酶系统的变化己经进行了大量而广泛的研究。常见的 抗氧化酶有p o d 、s o d 、g p x 和c a t 等，在这些酶的协调作用下，生物体能够减轻 脂质过氧化产生的不良反应和后果，维持细胞的正常代谢。当生物体受到环境变化的 影响后，s o d 和p o d 的活性会有所升高，来增强植物体对活性氧的清除能力；但当 受到重度的逆境胁迫时，s o d 和p o d 的活性又会大幅度的降低，从而造成活性氧的 积累以及对细胞的伤害嘲。与植物相同，微藻在受到不利的环境条件影响时，组织细 胞内往往会产生大量的活性氧，这些活性氧如果及时得不到清除，那么将会对细胞造 成一定的损伤。另一方面，不利的环境条件对质膜结构和功能造成的影响，通常的表 现是选择透性的丧失，电解质和某些小分子有机物的大量渗漏。膜脂过氧化作用引起 膜透性增加的直接和间接的原因，可能是磷脂性质的改变和膜蛋白在过氧化过程中受 到了伤害。 在极地微藻的抗氧化酶系统方面，目前相关研究以南极分纯藻类的适应机理为主 m ，国内对北极微藻的抗氧化酶系统方面未见报道，为了更好的了解北极微藻的生 境适应机理，本研究从抗氧化酶系统的角度对不同温度下3 种藻的适应机理进行了研 究。通过研究抗氧化酶系统与温度间的关系，以期进一步为北极微藻的生境适应机理 提供科学数据。 3 1 材料与方法 3 1 1材料 同2 1 1 每4 天取样，用于抗氧化酶活性和丙二醛含量的测定。 3 1 2 方法 粗酶液的提取：各样品摇匀并取4 0n i l 藻液，在低温高速离心机中睑_ 8 0 0 0r m m 速 率离- c , , 1 0i n i n 收集藻体，g - 去_ h 清液。加入4t m ( o 1t o o l l ) p h 为7 8 的磷酸缓冲溶液重 悬浮，细胞悬液用超声波细胞破碎仪破碎3 0 次( 破碎功率4 0 0w ，破碎时间间隔各为3 内蒙古农业大学硕士学位论文13 s ，冰浴处理) 。破碎液在4 c 环境下放置1h ，然后用冷冻离心机( 1 2 0 0 0r m i n ，4 ) 离心2 0m i n 。提取上清液即为粗酶液，在4 条件下保存待测。 s o d 活性的测定参照左向宇改进的黄嘌呤氧化酶法嘲1 ，单位数量藻细胞s o d 抑制 率达5 0 时所对应的s o d 量为一个s o d 活力单位( u ) 。c a t 的测定参照左向宇改进的 紫外分光法嘲1 ，单位数量藻细胞中c a t 每分钟分解吸光度为0 5 一_ 0 5 5 之间的底物中过 氧化氢相对量为一个过氧化氢酶活力单位。s o d 与c a t 活性用b e c k m a nd u 8 0 0 分光 光度计测定。m d a 含量采用硫代巴比妥酸法嘲，用b e c k m a nd u8 0 0 分光光度计 测定。采用s p s s1 3 0 软件进行作图和方差分析。 3 2 结果与分析 3 2 1 不同温度条件下3 种藻的丙二醛含量 总体而言，3 种藻的m d a 含量均呈现出先升高后降低的变化趋势( 图2 ) ，但玛 氏骨条藻和衣藻的m d a 含量较低并且变化幅度不明显。其中，玛氏骨条藻的m d a 含 量在0 时最高，4 时最低；0 和8 时的含量均在第4 0 天时达到最大值，而4 时的含量则在第3 6 天时达到最大值。小球藻的m d a 含量在8 时最高，0 时最低； 不同温度下的最高值分别出现在第2 8 、3 2 和2 8 天；衣藻的m d a 含量最低，不同温度 下的含量均介于0 0 1 7 - 0 0 4 3n m o l g 。 要 。 蹇量 警i 运量 宝 。 嚣量 藿 凸 x 081 21 6 “匏柏4 4 鸵 时问t i m m d l o 襄堇 温重 甚至 凸 ： 时间t i m e ( d ) 图2 不同温度条件下3 种藻的i i d a 含量 f i g 2 t h em d ac o n t e n to f3a l g a ls p e c i e sa t ，d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s 注：a 玛氏骨条藻b 小球藻c 农藻 钆s k e l e t o n e m am a r i n o i b c h l o r e l l as p 1 43 种北极微藻的温度适应性研究 ( 图3 ) 。玛氏骨条藻的s o d 活性均在第4 0 天时达到最大值，分别为5 1 7 、8 9 l 和6 7 9 u g ，此后下降明显；在各个时期均是4 下s o d 活性最高，而0 时最低。小球藻在 不同温度条件下的s o d 活性均在第1 6 天达到了最大值，分别为2 8 2 、3 1 5 和3 6 7 u 1 0 6c e l l s ，而1 6 天到3 6 天酶活下降较快，最后8 天3 个温度下酶活相差不多；到了藻 生长的后期随着藻细胞活力的下降，其s o d 活力也下降。衣藻在3 个温度条件下的s o d 活性分别在第2 0 天，2 4 天以及1 6 天时达到了最大值，分别为3 0 3 、5 0 7 及3 6 5u 儋：前 2 0 天为8 时酶活最高，4 时最低，且最后4 天4 时的酶活下降最快。 掣一 蠖攀 毽己 掌皇 髫三 霹藿 罩0 磊易 送竺 羹 基： 錾曼 0481 21 62 0 2 4 2 83 2 柏一柏鼗 时间t i m e ( d ) 毒。3 s2 掣 霉； 掌； 蓐专 翱舌 o 0481 21 62 4勰 时删t i m e ( d ) 时问t i m e ( d ) 图3 不同温度条件下3 种藻的s o d 活性 f i g 3 t h es o d a c t i v i t yo f 3a l g a ls p e c i e sa t d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s 注：a 玛氏骨条藻b 小球藻c 衣藻 扎s k e 括t o n e m am a r i n o i b c h l o r e l l as p c c h l a m y d o m o n a ss p 3 2 3 不同温度下3 种藻c a t 活性的变化 玛氏骨条藻的c a t 活性如图4 a 所示，相较而言，在整个生长周期中，4 时的酶 活最高，而0 1 2 时酶活最低。小球藻在3 个温度下的酶活变化规律不显著( 图4 b ) ，但 酶活性的最高值在8 时出现；衣藻在3 个温度下的酶活较低，仅在8 时呈现出先高 后低的变化规律，且其最高值出现在8 ( 图4 e ) 。 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 5 掣皇 薹詈 薜兰 窜等 妻寒 o 0 0 o4 81 21 62 02 42 83 2 4 0 “4 8 啦 时问t i m e c d ) 一 藿喜 崩尝 晕： 篓毫 o481 21 62 02 4 2 8 时删t i m e ( d ) 口o c 因4 b 8 d 闲 阍阍d d 闲月m 口4墨1 21 02 0矾 刁 3 2葛4 04 4 时问t i m e ( d ) 图4 不同温度条件下3 种藻的c a t 活性 f i g 4 t h ec a ta c t i v i t yo f 3a l g a ls p e c i e sa t d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s 注：a 玛氏骨条藻b 小球藻c 衣藻 乱s k e 括t o n e r n om a r i n o i b c h l o r e l l as p c c h l a r r o , d o m o n a ss p 3 2 4 不同温度对3 种藻抗氧化酶系统的影响 为了量化研究不同温度对3 种微藻抗氧化酶活性及m d a 含量的影响差异，本研 究利用方差分析法对不同温度间影响的差异显著性进行了分析，结果如表l 所示。可 以看出，在玛氏骨条藻的生长期内，o 和4 两组之间的抗氧化酶活性及m d a 含 量差异极显著( p bund扭no 3e+07 28e+07 2 6 + 0 7 2 4 + 0 7 2 2 + 0 7 2e+07 i 8 0 + 0 7 1 6 e + 0 7 i e + 0 7 i 2 + 0 7 i + 0 7 8000000 6000000 4000000 2 0 0 0 0 0 0 1 he - 一 i il i jll5 。1 4 o o6 o o6 0 07 o o8 0 09 o olo o ot i 0 0l2 0 0 b 1 1 jl 。! i 4 o o8 o o6 o o7 o o 8 o o9 o olo o oi1 o ol2 o o 4 o o5 o o6 o o