（凝聚态物理专业论文）固定化酶：新载体新方法.pdf

a b s t r a c t i m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e s ： n e w s u p p o r t sa n dn e w m e t h o d i m m o b i l i z e de n z y m e sa r ew i d e l ya p p l i e da sb i o c a t a l y s t si nv a r i o u s f i e l d s ，s u c hf o o dt e c h n o l o g y , b i o t e c h n o l o g y , e n v i r o n m e n t a lt e c h n o l o g y , b i o m e d i c i n ea n da n a l y t i c a lc h e m i s t r yb e c a u s eo ft h e i rv a r i o u sa d v a n t a g e s i m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e sf a c i l i t a t e st h ep u r i f i c a t i o no ft h er e a c t i o n s y s t e m ( e a s ys e p a r a t i o no ft h er e a c t a n t sa n dp r o d u c t sf r o mt h er e a c t i o n m e d i a ) ，t h er e c o v e r yo ft h ee n z y m ea n dm a k e si tp o s s i b l et ou s et h e e n z y m er e p e a t e d l yo rc o n t i n u o u s l y i m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e sa l s o e n h a n c e ss t a b i l i t yo f e n z y m e s t h ep r e s e n ts t u d yi n c l u d e st h r e ep a r t s ：t h ef i r s tp a r ti n v o l v e di n p r e p a r a t i o no fn e w c h i t o s a ng r a n u l e sa n dt h e i ra p p l i c a t i o na ss u p p o r tf o r i m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e s ；t h es e c o n dp a r ti n v o l v e di nan e wm e t h o df o r i m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e s ，e n t r a p m e n to fc r o s s l i n k e d c r y s t a l s o f e n z y m ei np o r o u ss i l i c a ；t h et h i r dp a r ti n v o l v e di np r e p a r a t i o no fn o v e l a q u e o u s c o l l o i d a l d i s p e r s i o n s a n dt h e i r a p p l i c a t i o n a s s u p p o r tf o r i m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e s p r e p a r a t i o no fn e we h i t o s a ng r a n u l e sa n dt h e i ra p p l i c a t i o na s s u p p o r tf o ri m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e s ：as o l u t i o no fc h i t o s a nw a sf i r s t o b t a i n e db yd i s s o l v i n gc h i t o s a ni na q u e o u sa c e t i ca c i ds o l u t i o n t ot h i s s o l u t i o ns o l u b l es a l t sw e r ea d d e da n daw h i t em i l k l i k es o l u t i o nf o r m e d n a o hs o l u t i o nw a sa d d e di n t ot h em i x t u r eu n t i lt h ef i n a lp hw a sr a i s e d t oa l k a l i n e t h eo b t a i n e dg r a n u l e sa r ep o r o u sa n df r a c t a lw i t hs i z er a n g i n g w i d e l yf r o ms e v e r a lt of i f t ym i c r o n s ，t h ei n d i v i d u a lf r a c t a lg r a n u l ei s c o m p o s e d o fn a n o 。s i z e d p a r t i c l e s t h e c h i t o s a n g r a n u l e s w e r e c r o s s l i n k e dw i t hg l u t a r a l d e h y d et o i m p r o v et h e i rm e c h a n i c a ls t r e n g t h a n dp r o v i d er e a c t i v eg r o u p ( 一c h o ) f o rb o n do fe n z y m e t h et y r o s i n a s e t h e nw a ss u c c e s s f u l l yc o u p l e do n t ot h es u p p o r t s t h ei m m o b i l i z a i o no f t y r o s i n a s e o n t oc h i t o s a n g r a n u l e s w a s v e r y e f f i c i e n t ，y i e l d i n g i m m o b i l i z e de n z y m ep r e p a r a t i o n sw i t hp r o t e i nc o n t e n t so fu pt o8 0m g p r o t e i np e rg r a ms u p p o r ta n dm a x i m u ma c t i v i t y3 5 0u n i t sp e rg r a m s u p p o r t e n t r a p m e n to fc r o s s l i n k e dc r y s t a l so fe n z y m e ：c r o s s 1 i n k e d e n z y m ec r y s t a l se n t r a p p e di np o r o u ss i l i c aa r e m a n u f a c t u r e di na t h r e e s t a g ep r o c e s s t h ef i r s ts t e pi sf i l l i n gp o r o u sm a t e r i a lw i t he n z y m e s o l u t i o nb yi m m e r s i n gp o r o u ss i l i c ag r a n u l e si nt y r o s i n a s e s 0 1 u t i o n ：t h e s e c o n ds t e pi s c r y s t a l l i z i n ge n z y m em o l e c u l e si nt h ep o r e so fs i l i c a g r a n u l e sb ye x p o s u r eo fp o r o u sm a e r i a lf i l l e dw i t he n z y m es o l u t i o nt o p r e c i p i t a n ts o l u t i o nr e s u l t i n gi nf o r m a t i o no fe n z y m ec r y s t a l si nt h ep o r e s o fs i l i c ag r a n u l e s ，t h et h i r ds t 印i s c r o s s 1 i n k i n ge n z y m ec r y s t a l sw i t h b i f i m c t i o n a l a g e n tg l u t a r a l d e h y d e y i e l d i n gi m m o b i l i z e d e n z y m e p r e p a r a t l o n sw i t hp r o t e i nc o n t e n t so fu pt o 4 2 0 r a gp r o t e i np e rg r a m p o r o u ss i l i c aa n dm a x i m u ma c t i v i t y16 0 0u n i t sp e rg r a ms u p p o r t ，w h i c h a r em u c hh i g h e rc o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a li m m o b i l i z e de n z y m e s t h e r e m a r k a b l et e m p e r a t u r e ，u r e aa n ds o l v e n ts t a b i l i t yw a so b s e r v e dw i t h t y r o s i n a s ec r o s s l i n k e dc r y s t a l se n t r a p p e di np o r o u ss i l i c a p r e p a r a t i o no fn o v e la q u e o u sc o l l o i d a ld i s p e r s i o n sa n dt h e i r a p p l i c a t i o na s s u p p o r tf o ri m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e s ：an o v e l a q u e o u sc o l l o i d a ld i s p e r s i o n so fp o l y ( a r y l a m i n o 1 ，4 - b e n z o q u i n o n e lw a s g e n e r a t e df r o m1 ，4 - b e n z o q u i n o n ea n d4 ，4 m e t h y l e n ed i a n i l i n eu s i n g p o l y ( v i n y la l c o h 0 1 ) a st h es t e r i cs t a b i l i z e r t h ep o l y m e rp a r t i c l e sa p p e a r s p h e r i c a l w i t ha n a v e r a g ed i a m e t e ro f1 5 0r i ma n da r ee x c e l l e n t m i c r o s c o p i cc a r r i e r sf o re n z y m e s 中文摘要 固定化酶：新载体，新方法 由于其优异的性能，固定化酶广泛应用于食品，环境，分析化学，医药以 及生物技术等许多领域。固定化酶具有更好的稳定性，容易从反应介质中分离出 来，可实现多次重复使用。 本研究涉及三方面的内容：一是新型甲壳胺颗粒的制备及在固定化酶方面 的应用；二是建立一种新的固定化酶方法，即在多孔材料中捕捉交联酶微晶；三 新型胶体颗粒的制备及用于酶的固定化。 甲壳胺颗粒的制备及在固定化酶方面的应用：以乙酸水溶液为熔剂配制甲 壳胺溶液，向该溶液中加入可溶性盐类得到乳状混合液，然后用n a o h 调至碱性， 即得甲壳胺颗粒。所得甲壳胺颗粒大小分布在微米级，并表现出多空性。为增强 甲壳胺颗粒的机械强度，防止甲壳胺颗粒在酸性溶液中溶解，并提供固定化酶所 需的活性反应基团，用双宫能团试剂戊二醛对甲壳胺颗粒交联处理。戊二醛处理 后的甲壳胺颗粒作为载体用于固定化酪氨酸酶研究，发现所得的固定化酶具有高 的蛋白载量( 8 0 m g 垤载体) 和高的酶活力( 3 5 0 单位g 载体) 。 在多孔材料中捕捉交联酶微晶：捕捉交联酶微晶过程分为三步：第一步是 把多孔氧化硅浸入酪氨酸酶溶液，使酶溶液充满多孔材料；第二步是使充满酶溶 液的多孔材料与沉淀剂溶液接触，使酶分子在材料的孔道中形成晶体；第三步用 戊二醛进行处理，使孔道中的酶晶体交联形成不溶晶体。所得固定化酶具有高的 蛋白载量( 4 2 0 m g g 载体) 和高的酶活力( 超过1 6 0 0 单位，g 载体) 。固定化 酶具有高的热稳定性，抗有机熔剂及尿素稳定性，以及机械稳定性。 新型胶体颗粒的制各及用于酶的固定化：在聚乙烯醇存在下，苯醌与芳香 二胺反应得到聚合物胶体颗粒；试验证明这种胶体是固定化酶的良好载体。 c h a p t e r1e n z y m e sa n dl m m o b i l i z e de n z y m e s 1 1t h ef e a t u r e so fe n z y m e s ：a d v a n t a g e sa n ds h o r t a g e s i nt h e p a s t d e c a d e sw h i l er o u t i n em e t h o d o l o g i e so fc h e m i c a l p r o c e s s e s h a v eb e e ne s t a b l i s h e dt oa p o i n tp e r m i t t i n gs y n t h e s i s ， s e p a r a i o na n da n a l y t i c a ld e t e r m i n a t i o no fah u g er a n g eo fc o m p l i c a t e d p r o d u c t s ，a l t e r n a t i v em e t h o d o l o g i e st h a ta r en o to n l ye f f i c i e n ta n ds a f e b u ta l s oe n v i r o n m e n t a l l yb e n i g na n dr e s o u r c e - - a n de n e r g y - - s a v i n ga r e b e i n ge v e rm o r ei n t e n s i v e l ys o u g h t o n eo f t h em o s tp r o m i s i n gp o l i c i e st o a c h i e v et h e s eg o a l si st h ea p p l i c a t i o no f e n z y m e s 【1 - 5 e n z y m e s a r eb i o l o g i c a l c a t a l y s t sc a p a b l eo fp r o m o t i n gc e l l u l a r r e a c t i o n sw i t he x t r e m e l yh i g he f f i c i e n c y s o m ea r e s i m p l e ，c o n t a i n i n g s e q u e n t i a lc h a i n s o fd i f f e r e n ta m i n oa c i dr e s i d u e s ，w h i l eo t h e r sa r e c o m p l e x ，c o n s i s t i n go fac o f a c t o ri na d d i t i o nt oa na m i n oa c i dc h a i n t h e c o f a c t o rc a nb eam e t a li o n ( f e ，c u ，z n ，e t c ) o ra no r g a n i cm o l e c u l e ( c o e n z y m e ，e g f i a v i ni ng l u c o s eo x i d a s e ) 6 】 e n z y m e sd i s p l a yan u m b e ro ft r a i t st h a tm a k et h e i ru s ef a v o r a b l ea s c o m p a r e d t oc o n v e n t i o n a lc h e m i c a lc a t a l y s t s p e r h a p st h em o s ti m p o r t a n t a d v a n t a g eo fe n z y m e si s t h a te n z y m e sh a v eah i g hd e g r e eo fc a t a l y t i c e f f i c i e n c y , o f t e nm u c hs u p e r i o rt oc h e m i c a lc a t a l y s t s ，a n dah i g hl e v e lo f c h e m i c a ls e l e c t i v i t y ( s p e c i f i c i t y ) t h a ta l l o wt h e mt od i s t i n g u i s hn o to n l y b e t w e e nr e a c t i o n sb u ta l s ob e t w e e ns u b s t r a t e s ( s u b s t r a t es p e c i f i c i t y ) ， s i m i l a rp a r t so fm o l e c u l e s ( r e g i o s p e c i f i c i 劝a n db e t w e e no p t i c a li s o m e r s ( s t e r e o s p e c i f i c i t y ) t h e b e t t e rc h e m i c a l s e l e c t i v i t y m a k es u r et h e c a t a l y z e dr e a c t i o ni sn o to b s t r u c t e db ys i d e r e a c t i o n s ，r e s u l t i n gi nt h e 6 p r o d u c t i o n o fo n ed e s i r a b l ee n d - p r o d u c t ，w h e r e a sp r o d u c t i o n o f b y p r o d u c t su n w a n t e di se l i m i n a t e d t h i sp r o v i d e sh i g h e rr e a c t i o ny i e l d s r e d u c i n gm a t e r i a lc o s t s i na d d i t i o n ，t h ea b i l i t yt oc a t a l y z er e a c t i o n su n d e r m i l dc o n d i t i o n si sa n o t h e ri m p o r t a n tb e n e f i to fe n z y m e sa sc a t a l y s t s e n z y m e sg e n e r a l l yo p e r a t ea ta m b i e n tt e m p e r a t u r e ，a t m o s p h e r i cp r e s s u r e ， a n dn e u t r a lp hw i t hr e a c t i o nr a t e so ft h eo r d e ro ft h o s ea c h i e v e db y c h e m i c a lc a t a l y s t sa tm u c hm o r es e v e r ec o n d i t i o n s t h i si so fs i g n i f i c a n c e f u rs u b s t a n t i a lp r o c e s se n e r g ys a v i n g sa n dr e d u c e dm a n u f a c t u r i n gc o s t s a l s o ，e n z y m e sf i r ee n v i r o n m e n t a l l yf r i e n d l yc a t a l y s t s b e c a u s ee n z y m e s a r ep r o t e i n s ，t h e ya r ec o m p l e t e l yb i o d e g r a d a b l ea n d e a s i l yr e m o v e df r o m c o n t a m i n a t e ds t r e a m s i na d d i t i o nt ot h eu n q u e s t i o n a b l ea d v a n t a g e s ，t h e r ee x i s tan u m b e ro f p r a c t i c a ll i m i t a t i o n si nt h ea p p l i c a t i o no fe n z y m e s t h es h o r t a g e so fu s i n g e n z y m e sa sc a t a l y s t si n c l u d e ：t h eh i g hc o s to f p r o d u c t i o no fe n z y m e s ，t h e i n s t a b i l i t yo ft h e i rs t r u c t u r e sa n da c t i v i t i e s o n c ei s o l a t e df r o mn a t u r a l e n v i r o n m e n t sa n dt h e i rs e n s i t i v i t yb o t ht oo p e r a t i o n a lc o n d i t i o n sft h e o p t i m a lc o n d i t i o n sa r en o r m a l l yn a r r o w - r a n g e d ) ，a n dt os m a l tq u a n t i t yo f s u b s t a n c e st h a tc a l la c ta si n h i b i t o r s t h el a t t e rt w or e d u c ee n z y m e s o p e r a t i o n a ll i f e t i m e s a l s o ，u n l i k ec o n v e n t i o n a lh e t e r o g e n e o u sc h e m i c a l c a t a l y s t s ，m o s te n z y m e so p e r a t e d i s s o l v e di nw a t e ri nh o m o g e n e o u s c a t a l y s i sf o r m ，w h i c hi sw h yt h e yc o n t a m i n a t et h ep r o d u c ta n dc a n n o tb e r e c o v e r e di nt h ea c t i v ef o r mf r o mr e a c t i o nm i x t u r e sf u rr e u s e s e v e r a l a p p r o a c h e sh a v eb e e nu s e dt oo v e r c o m et h e s el i m i t a t i o n s ，o n eo f t h em o s t s u c c e s s f u lb e i n gi m m o b i l i z a t i o no f e n z y m e 【1 - 5 ，7 ，8 】 1 2i m m o b i t i z e de n z y m e s i m m o b i l i z e de n z y m e sd e n o t ee n z y m e sc o n f i n e do rl o c a l i z e di na c e r t a i nd e f i n e dr e g i o no fs p a c ew i t hr e t e n t i o nt ot h e i rc a t a l y t i ca c t i v i t i e s ， a n dw h i c hc a n b eu s e d m m o b i l i z a t i o ni si l l u s t r a t e da s r e p e a t e d l y a n dc o n t i n u o u s l y e n z y m e f i g t u et 1 【0 ：u - - | 一一一_ 。一q d 一一o 一、 o j 亩：毛、 o 一p h 一一： 1 岫i l i z e i ) 磷姗 - = - jj j 囊 t j ：黪毫 ：。、7 ： s o l y 蛐to rb u l k 乩b s o f i g u r e1 1 i l l u s t r a t i o no f e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n i so n eo ft h ei m p o r t a n t a s p e c t s o f b i o t e c h n o l o g y , a n dr e c e n tt r e n d ss h o w st h a ti t i se q u a l l yv i a b l ei no t h e r f i e l d s t h ev a r i o u st e c h n i q u e sc a nb eu s e df o re n z y m ei m m o b i l i z a t i o n 。 i m m o b i l i z a t i o nt e c h n i q u e sm a yb eb r o a d l yg r o u p e di n t op h y s i c a l ，w h e r e w e a ki n t e r a c t i o n sb e t w e e ns u p p o r ta n de n z y m ee x i s t ，a n dc h e m i c a l ， w h e r ec o v a l e n tb o n d sa r ef o r m e dw i t ht h ee n z y m e 【l - 4 ，7 ，8 t h ep h y s i c a lm e t h o d sc a nb ed i v i d e di n t os i xd i s c r e t ec a t e g o r i e s ： ( i ) c o n t a i n m e n to fa ne n z y m ew i t h i na m e m b r a n er e a c t o r ( i i ) a d s o r p t i o n ( p h y s i c a l ，i o n i c ) o f a r t e n z y m e o na w a t e r - i n s o l u b l em a t r i x ( i i i ) i n c l u s i o n ( o rg e le n t r a p m e n t ) o f a ne n z y m e ( i v ) m i c r o e n c a p s u l a t i o no fa ne n z y m ew i t has o l i dm e m b r a n e v 1 m i c r o e n c a p s u l a t i o no f a ne n z y m ew i t hal i q u i dm e m b r a n e v i ) f o r m a t i o no fe n z y m a t i cl a n g m u i r - b l o d g e t tf i l m s c h e m i c a li m m o b i l i z a t i o nm e t h o d sm a i n l yi n c l u d e ( i ) c o v a l e n ta t t a c h m e n to fa ne n z y m et oaw a t e r - i n s o l u b l em a t r i x ( i i ) c r o s s l i n k i n go fa ne n z y m ew i t hu s eo fam u l t i f u n c t i o n a l ，t o w 8 m o l e c u l a rw e i g h tr e a g e n t ( i i i ) c o c r o s s l i n k i n go fa ne n z y m ew i t ho t h e rn e u t r a ls u b s t a n c e s ， e g p r o t e i n s i n p r e s e n c e o fa m u l t i f u n c t i o n a l ，l o w m o l e c u l a rw e i g h tr e a g e n t e 蛐m t l e b 衄a i n g 婚砖 c o p o l y , m c d u d a e f i g u r el 2 , s o m ed i f f e r e n tm o d e so f e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n n u m e r o u so t h e rm e t h o d sw h i c ha r ec o m b i n a t i o n so ft h eo n e sl i s t e d a b o v eo ro r i g i n a lh a v eb e e nd e v i s e d s o m eo fi m m o b i l i z e di si l l u s t r a t e d a sf i g u r e1 2 h o w e v e r , b e c a u s ed i f f e r e n te n z y m e sh a sd i f f e r e n tc h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ，h a v ed i f f e r e n ts u b s t r a t e s ，y i e l d i n gd i f f e r e n tt a r g e tp r o d u c t s ， a n dc a l lb ea p p l i e dt ot h ed i f f e r e n tu s e s ，n os i n g l ee n z y m e i m m o b i l i z e d m e t h o da n ds u p p o r ti sb e s tf o ra l le n z y m e sa n dt h e i ra p p l i c a t i o n sa n da l l o f t h em e t h o d sp r e s e n ta d v a n t a g e sa n dd r a w b a c k s i m m o b i l i z a t i o n b yc o v a l e n tb o n d i n g ： i m m o b i l i z a t i o n b y c o v a l e n tb o n d i n gt oa c t i v a t e ds u p p o r t si sp r o b a b l yt h em o s te x t e n s i v e t y u s e dm e t h o d e v e nt h o u g ht h i sm e t h o di st e d i o u s ，e x p e n s i v ea n de a s i l y w o r s e n i n gt h ee n z y m ep e r f o r m a n c e ，i t i sm o s tp r e f e r r e db e c a u s ea c o v a l e n tb o n di sf o r m e db e t w e e nt h ee n z y m ea n dt h es u p p o r td u et o w h i c ht h ee n z y m ei sf i r m l yb o u n dt ot h ep o l y m e rs u p p o n 9 t h ef t m c t i o n a lg r o u p st h a ta r ei n v o l v e di nt h ec o v a l e n tb i n d i n go f t h ee n z y m et ot h es u p p o ga r ea m i n o ，c a r b o x y l ，s u l p h y d r y l ，h y d r o x y l ， i m i d a z o l ea n dp h e n o l i cg r o u p s t y p i c a l l y , s o m e w h a th a r s hc h e m i s t r i e s a r eu s e dt oa c t i v a t et h es u p p o r td u r i n gt h ei m m o b i l i z a t i o np r o c e s sa n dt h e e n z y m ei st h e nc o v a l e n t l yb o u n d t ot h ea c t i v a t e ds u p p o r t ( 9 ，l o t i m m o b i l i z a t i o nb ya d s o r p t i o ni sp r o b a b l yt h eo l d e s tm e t h o do f i m m o b i l i z a t i o n ，w h e r e i nt h eb i o m o l e c u l ei sp h y s i c a l l ya d s o r b e do n t ot h e m a t r i xw i t h o u tc o v a l e n tb o n d i n g t h i si sr e l a t i v e l ya l le a s y , s i m p l e ，c h e a p a n de f f e c t i v em e t h o do fi m m o b i l i z a t i o nw h e r et h ee n z y m ea n dt h e a d s o r b e n ta r es t i r r e dt o g e t h e rf o rs o m et i m e e n z y m ei sa t t a c h e dt ot h e s u p p o r tb yi o n i cb o n d i n g ，h y d r o p h o b i cb o n d i n g ，h y d r o g e nb o n d i n go r v a nd e rw a a l s i n t e r a c t i o n t h er e s u l t i n gi m m o b i l i z ee n z y m ei st h e n w a s h e dt or e m o v ea n yn o n a d s o r b e de n z y m e s o m eo ft h ec o m m o n l y u s e da d s o r b e n t sa r ea l u m i n a ，a n i o n e x c h a n g er e s i n s ，c a r b o n ，c e l l u l o s e s ， c l a y s ，d i a t o m a c e o u se a r t he t c t h i sk i n do f i m m o b i l i z a t i o nd o e sn o ta l t e r t h ec h e m i c a la n dp h y s i c a lp r o p e r t i e so fa t le n z y m e ，t h ea c t i v i t yo fa n e n z y m ei m m o b i l i z e db ya d s o r p t i o na p p r o a c h e s t h a to ff r e es o l u b l e e n z y m e h o w e v e r , d e s o r p t i o no f t h ee n z y m eo c c u r so v e ro p e r a t i o n a lt i m e d u et ol e e c h i n go ra b r u p t l yw i t hac h a n g ei np ho ri o n i cs t r e n g t h 1 0 ， 1 1 1 i m m o b i l i z a t i o n b ye n t r a p m e n t ：a s s h o w ni n f i g u r e 1 3 ， m e c h a n i c a le n t r a p m e n to ft h ee n z y m ew i t h i np o r o u ss u p p o r ti st y p i c a l l y d o n eb yp o l y m e r i z i n ga n dc r o s s l i n l d n gam o n o m e ra r o u n da ne n z y m e ，o r b yd i s s o l v i n g ap o l y m e rw i t h a ne n z y m ea n dt h e nc r o s s l i n k i n gt h e p o l y m e r , m a t e r i a l s u s e df o r e n t r a p m e n ti n c l u d ep o l y ( a c r y l a r n i d e ) ， p o