（微生物学专业论文）草鱼肝肾cdna文库构建及部分功能基因的序列分析.pdf

摘要 摘要 本文以草鱼肝脏和肾脏为实验材料，采用o l i g o ( d t ) 弓l 物定向克隆技术构建 了草鱼肝肾脏组织的c d n a 文库，随机对其中5 1 0 个克隆测序并利用生物信息 学方法对这些序列进行了初步的分类分析。 首先，利用t r i z o l 法抽提草鱼肝。肾脏组织总r n a ，用o l i g o t e xm r n a k i t s 从总r n a 中分离纯化富含p o l y ( a ) 的m r n a 。反转录合成单链c d n a ，p c r 扩 增得到双链e d n a ，连接e c o ri 接头，末端磷酸化，册i 消化，回收双末端黏 性化的双链c d n a 。筛选收集大于5 0 0 b p 的c d n a 片段，加工后与 p b l u e s e r i p t l l s k ( + ) v e c t o r 连接，转入d h 5 a 宿主菌。挑取阳性克隆，做菌液p c r 检测，文库库容量为1 1 5 x 1 0 6 ，重组率达9 4 。所构建的c d n a 文库容量符合 今后的研究要求。 测序得到草鱼5 1 0 个的c d n a 序列，长度约为4 1 0 8 4 0 b p ，共3 1 5 个u n i g e n e 。 其中已知功能的基因有1 5 0 个，主要与转录调节、翻译、核糖体结构、生物合 成、细胞分裂、免疫、生长发育、生殖、特殊刺激、蛋白质的修饰和降解、生 理调节、细胞膜结构、细胞内物质运输、细胞信号转导、物质代谢等有关。最 后对全长基因进行了初步的结构和功能的分析。 本文构建了草鱼肝肾e d n a 文库，可以方便地从中筛选所需目的基因，更 重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。 关键词：草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o n i d e l l u s ) ；e d n a 文库；功能基因 a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h i s p a p e r ，t h e l i v e ra n dk i d n e yo fg r a s sc a r p sw e r es e l e c t e d a st h e e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l sf o rt h ec d n al i b r a r i e s t h el i b r a r i e sw e r ec o n s t r u c t e db y o l i g o ( d t ) p r i m e rd i r e c t e dc l o n i n gt e c h n o l o g y 5 10c l o n e so ft h ee d n al i b r a r yw e r e s e q u e n c e da n dt h e nt h e yw e r ec l a s s i f i e d a n da n a l y z e db a s i n go nb i o i n f o r m a t i c s m e t h o d s f i r s to fa l l ，m r n ar i c hi np o l y ( a ) w a sp u r i f i e db yo l i g o t e xm r n a k i t sa f t e r t h et o t a lr n aw a se x t r a c t e du s i n gt h em e t h o do ft r i z o lf r o mt h el i v e ra n dk i d n e yo f t h eg r a s sc a r p ，t h e nd s c d n aw a so b t a i n e da f t e rr e v e r s e t r a n s c r i p t i o na n dp c r e c o r ia d a p t e r sw e r el i g a t e dt ot h eb l u n te n d sa n dt h ee n d sw e r ep h o s p h o r y l a t e d d s 。e d n al o n g e rt h a n5 0 0 b pw i t hb o t hv i s c o u st e r m i n a l sw a sc o l l e c t e da f t e rs f ii d i g e s t i o na n dt r a n s f e r r e da f t e rl i g a t i o nw i t hp b l u e s e r i p t l ls k ( + ) v e c t o r , t h e nt h e yw e r e t r a n s f o r m a t e di n t od h 5 a f i n a l l yp o s i t i v ec l o n e sw e r es e l e c t e dt od op c r d e t e c t i o n o fb a c t e r i a t h el i b r a r yr e a c h e s1 15 x10 6i nc a p a c i t y ；t h ep e r c e n y a g eo fr e c o m b i n a t i o n i sa sh i 曲a s9 4 i tc a nm e e to u rf u t u r ew o r k a n dat o t a lo f510s e q u e n c e sw h o s el e n g t hi sb e t w e e n410 - 8 4 0 b pw e r ea c q u i r e d ， i n c l u d i n g3 15n o n r e p e t i t i v es e q u e n c e s a m o n gt h e315u n i g e n e s ，1 5 0u n i g e n e sw e r e f u n c t i o n a l l yk n o w n t h e yp l a y r o l e si n t r a n s c r i p t i o n 、r e g u l a t i o n ，t r a n s l a t i o n ， r i b o s o m a ls t r u c t u r e ，b i o s y n t h e s i s ，c y t o d i e r e s i s ，i m m u n i t y , g r o w t h ，r e p r o d u c t i o n ， s p e c i a ls t i m u l a t i o n ，p h y s i o l o g i c a lr e g u l a t i o n ，p r o t e i nf o l d i n g ，m o d i f i c a t i o n a n d d e g r a d a t i o n ，m e m b r a n es t r u c t u r e ，m a t e r i a lt r a n s p o r ta n dc e l l u l a rs i g n a lt r a n s d u c t i o n ， m e t a b o l i s ma n ds oo n t h e nt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no ft o t a ll e n g t hg e n e sw e r e a n a l y s i s e d b a s e do nt h ec d n al i b r a r y , g e n e sc a nb es c r e e n e dm o r ec o n v e n i e n t l y w h a t s m o r e ，f u l ll e n g t hg e n e sw i l lb es e p a r a t e da n dt h ef u n c t i o nw i l lb ei n v e s t i g a t e dm o r e e f f i c i e n t l y k e yw o r d s ：c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ；c d n al i b r a r y ；f u n c t i o n a lg e n e 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均己在论文中作了明确的说明并表示蹦意。 学位论文作者签名( 手写) ：多k 呻 签字同期： 卵3 年，月w 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授 权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权t t ) 学位论文作者签名( 手写) ：专循坤 签字日期：细b 年j 堋wf t 翩掏：护 签字f t 期：少口g 年) 1 1 , - 月叶日 第一章前言 第一章前言 基因文库的构建是现代生命科学研究中的一项重要技术【lj 。c d n a 文库是包 含某种生物可表达的遗传信息，不含有内含子的基因文库，可由某种特定组织 细胞提取高纯度的m r n a ，经逆转录产生的e d n a 来构建，是克隆、分离目的 基因的重要途径之一【2 】。构建e d n a 文库多用质粒载体，e d n a 文库的完整程度 由重组质粒转化的细菌菌落数来计算。 1 9 7 6 年h o f s t e t t e r 成功的构建了第一个e d n a 文库，至今构建c d n a 文库的 技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。初期e d n a 文库，由于当时技术的 限制，选用质粒载体存在着连接效率低、难以扩增和保存等缺点，而y o u n g 和 d a v i s 重组载体为表达性文库构建和保存提供了质的飞跃。近年来，e d n a 文库 构建的新方法层出不穷，但其共同目的是使e d n a 文库更加迅速，高效的满足 研究的需要。本文就近年来发展的e d n a 文库的构建及其类型特点作一简要综 述。 最初的e d n a 克隆技术主要适合于获得高丰度m r n a 的拷贝，即通过使用 相应的核酸或抗体探针来筛选富含该m r n a 的组织e d n a 文库来克隆目的 e d n a ，但对于那些低丰度m r n a 的拷贝，通常需要筛选文库有大量克隆，才 能获得相应的e d n a 。有时即使筛选克隆的量很大也不能奏效。为了更有效地克 隆到未知的低丰度m r n a 的d n a ，近年来已发展了一些c d n a 文库构建的新方 法和新技术。 1 1 减数c d n a 文库 减数c d n a 文库( s u s t r a c t e x te d n al i b r a r y ) 常用于克隆两种组织或同一组织在 不同生理或病理状态下表达有差异的基因。由于减数文库富集了仅在一种组织 中或一种状态下表达的e d n a 克隆，使筛选克隆的总数减少数十倍。最初构建 e d n a 文库是通过羟基磷灰石柱层析或生物素一卵清蛋白体系去除两种组织或 状态下共有的m r n a ，以此来富集表达有差异的e d n a ，但普遍的问题是回收 的e d n a 量少，易丢失一些m r n a ，以及m r n a 的降解使合成的c d n a 过短。 近年来，在方法学上进行了改进，常用的有：使用磁珠的减数技术、o l i g o ( d t ) 3 0 第一章前言 乳胶和p c r 结合的方法【3 , 4 1 、代表性差别筛选法【5 】和酶降解减数法【6 l ，现将上述4 种方法分述如下。 1 1 1 使用磁珠的减数技术 使用磁珠的减数技术( m a g n e ta s s i s t e ds u b t r a c t i v e t e c h n i q u e ，m a s t ) ，其中“驱 动”m r n a 通过一个固定于流动磁珠上的o l i g o ( d t ) 2 5 逆转录或c d n a ，另一“目 的”m r n a 则在合成双链c d n a 后用填充法形成平头末端，这种带平头末端的双 链c d n a 与数倍过量的连接于磁珠的驱动c d n a 作减数杂交，能与驱动c d n a 杂交的目的c d n a 通过磁珠吸引而被去除，构成减数c d n a 文库。使用磁珠的 减数技术法只需经过磁珠吸附的简单操作即可有效地去除目的c d n a 中与驱动 c d n a 杂交部分，同时c d n a 之间的减数杂交使文库中的c d n a 常有较长的片 段。 1 1 2o l i g o ( d t ) 3 0 乳胶和p c r 结合的方法 o l i g o ( d t ) 3 0 乳胶和p c r 结合的方法是以a 组织的m r n a 为模板，与乳胶颗 粒共价结合的o l i g o ( d t ) 3 0 为引物合成c d n a 链，这种过量a 组织的c d n a 乳胶 颗粒与b 细胞的m r n a 进行减数杂交，c d n a 一乳胶颗粒连同与其杂交的b 组织 的m r n a 通过离心沉淀去除，分离上清液得到b 细胞特异的m r n a ，这种m r n a 经r t - p c r 合成c d n a ，以此构建成c d n a 文库【3 】。该方法操作简便，仅在 e p p e n d o r f 管中即可进行，但由于减数杂交发生在m r n a 与c d n a 之间，m r n a 易被降解，使得构建文库中的c d n a 片段常小于l k b ，针对这一问题，出现了一 种改进的使减数杂交发生在c d n a 之间的方法，在这一方法中，b 组织的m r n a 用o l i g o ( d t ) 3 0 乳胶颗粒逆转录成为反义c d n a 链，然后2 1 ：1 ( d c ) n 尾，通过 o l i g o ( d g ) n 不对称p c r 合成为有意义的c d n a 链，用该链代替m r n a 进行减数 杂交，从而减少m r n a 的降解频率，使合成足以分析其编码顺序的较长c d n a 片段成为可能【9 】。 1 1 3 代表性差别筛选法 代表性差别筛选法( r e p r e s e n t i t i v ed i f f e r e n t i a la n a l y s i s ，r a o ) 构建的是过短片 段的c d n a 文库，它是先用一种限制性内切酶酶解c d n a 样本，给d n a 连上接 头后作p c r 扩增，可获得“目的”和“驱动”两种扩增子，酶切去除两侧接头，其 中“目的”扩增子5 端接上一种新的接头，使“目的”扩增子与过量的“驱动”扩增子 2 第一章前言 作减数杂交，用单链核苷酸酶去除单链后，用新接头引物对双链作p c r 扩增， 其中使“目的”同源双链被扩增，这些扩增子可重复减数杂交，最后将扩增子克隆 到载体中，构成减数c d n a 文库，这种长片段的c d n a 文库覆盖了整个c d n a 样本，从而弥补了可能发生的信息丢失 5 1 。 1 1 4 酶降解减数法 酶降解减数法( e n z y m a t i cd e g r a d i n gs u b t r a c t i o n ，e s d ) 应用p c r 技术可对有限 的原起始材料进行几轮杂交选择，与r n a 同样，两种c d n a 酶解后被扩增，其 中“目的”c d n a 经3 外切后掺入硫代核苷酸，这种经过修饰的c d n a 与过量的未 经处理的“驱动”e d n a 作减数杂交，杂交后先用外切酶i i i 从3 端外切“驱 动”c d n a ，而“目的 c d n a 因掺有硫代核苷酸而被保护，再用外切酶降解单链 核酸，未降解的双链“目的”c d n a 经p c r 扩增，即可富集差示表达的e d n a 。 用于文库的构建及c d n a 克隆的分析，这种技术克服了其它p c r 技术构建e d n a 文库方法中修饰与未修饰e d n a 分离不完全的缺点【6 1 。 1 2 标准化e d n a 文库 标准化e d n a 文库( n o r m a l i z e de d n al i b r a r y ) 又称为等量化e d n a 文库 ( e q u a l i z e de d n al i b r a r y ) ，即某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中， 且含量相等的e d n a 文库。这种文库主要有三方面的优点： 第一，增加克隆低丰度m r n a 的机会，特别是经过减数和选择杂交仍难以 克隆的转录样本，适用于分析分化发育阶段的基因表达及突变检查【丌。第二，等 量化的e d n a 可做探针来发现基因组序列中的转录区，尤其是普通探针所不能 发现的稀有转录区。第三，与原始丰度的m r n a 拷贝数相对应的e d n a 探针与 标准化的e d n a 文库作杂交，可估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织 表达特异性的基因。 该文库的构建方法分为两类：一种是用基因组d n a 做选择杂交，所捕获的 e d n a 丰度与对应的基因组d n a 丰度一致，其缺点是约2 0 的非单一拷贝基因 在构建的文库中丰度偏高；另一种是二次复性的方法，根据e d n a 退火的二级 动力学特性，即拷贝数少的e d n a 比拷贝多的e d n a 复性或杂交慢，使未复性 部分的单链e d n a 拷贝数渐趋均衡。而这第二类方法效果更好，应用更多。此 类方法又分为：( 1 ) 用短片段、双链c d n a 复性的方法【8 】；( 2 ) 克隆在e d n a 自身 3 第一章前言 杂交的方法；( 3 ) 半固相m r n a 和c d n a 杂交系统的方法【9 】；( 4 ) 环状单链进行 杂交的方法【9 】。用短片段、双链c d n a 复性的方法构建的c d n a 文库主要包含3 端短片段的c d n a 等量化文库，这在估计基因的表达水平和发现组织特异性基 因方面优于长片段的等化c d n a 文库，同时也避免了同源基因之间的减数杂交 【7 】；用克隆化c d n a 自身杂交方法产生的c d n a 文库增加了覆盖m r n a ，包括5 端的各个部分的可能性，其优点是结合杂交选择的方法可迅速发现基因组中编 码c d n a 的区域：用半固相m r n a 和c d n a 杂交系统的方法构建的c d n a 文库 常含有全长的c d n a 分子，因此可用来筛选表达文库的方法来分离c d n a 的克 型8 】；用环状单链进行杂交的方法构建c d n a 文库，在文库的构建过程中省去了 亚克隆的步骤，同时也保证了文库中的c d n a 长度，由于复性发生在3 端的 2 0 0 b p ，避免了基因家族之间的交叉杂交，保证了c d n a 的代表性【1 0 1 。 1 3 固相c d n a 文库构建 e d n a 的固相合成是人们早为熟知的技术，但局限之处o l i g o ( d t ) 与纤维素胶 粒或磁珠的结合比较牢固，将c d n a 洗脱下来时得率不是很高，而且以后的反 应步骤也不能都在介质上进行，这可能是该技术应用并不十分广泛的原因。 1 9 9 8 年，t h o m a sr o e d e r 开发了一种快速高效的c d n a 文库构建方法b 1 。 它基于传统的c d n a 文库合成方法，克服了以前文库构建中存在的缺点，包含 通常所需的全部步骤，所用的酶和试剂与传统方法也完全相同，不同的是在c d n a 合成过程中引入了固相支持物磁珠。c d n a 的合成和修饰均在磁珠上完成【l2 1 。 c d n a 通过一个生物素固定在链霉素偶联的磁珠上，这样在反应过程中就可以简 便而迅速的实现酶和缓冲液的更换，因此它将快速与高质量的文库构建结合在 一起( 构建文库只需一天) ，并且构建的文库适合大多数的研究目的【u 】。 该方法的关键步骤为： 第一、r n r n a 提取：使用一个修饰的5 生物素化o l i g o ( d t ) 2 5 引物，【5 一生 物素一g a g a g a g a g a g a g c g g c c g c t 2 5 g a c 3 】，其内部含一个n o ti 识别序 列，通过5 生物素连接在链霉卵白素包裹的磁珠上。m r n a 通过与o l i g od t 引 物互补，结合在磁珠上。 第二、第一链合成：1 ) ! t n 果c d n a 合成以o l i g o ( d t ) 弓l 物进行，则m r n a 不 用低盐缓冲液洗脱，淋洗后直接进行第一链合成反应( 加入酶、缓冲液等) 。2 ) 如 4 第一章前言 果e d n a 合成是以一个修饰的随机的寡核苷酸5 一生物素为引物，【5 一生物素 g a g a g a g a g a g a g c g g c c g c 叮n n n n n 3 】，此引物与链霉卵白素包裹的 磁珠结合。m r n a 从o l i g od t 磁珠上洗脱后，加入到随机引物磁珠中，然后进 行第一链合成反应。 第三、第二链生成，补平末端，加接头，激酶磷酸化等步骤的实现是通过 吸去上清，并用下一步反应缓冲液冲洗来完成的。磷酸化是在固相上进行的最 后一步酶反应。 固相e d n a 合成法的主要优点是可以简便e d n a 合成的操作。在进行缓冲 液更换时既没有e d n a 的丢失之忧，也无其它物质污染之忧。另外，用此方法 可以得到真实的代表性文库，它包含有短小的e d n a ，这是因为在克隆之前省去 了分级分离的步骤。总之，固相法结合了传统的c d n a 合成的优点并弥补了其 不足。这种方法简便易行，可靠低廉，所建文库高质量。 1 4 差示e d n a 文库 差示文库又称为扣除文库或削减文库，是反映不同组织和细胞或同一细胞 在不同功能状态下，基因表达差异的e d n a 文库。主要用于研究细胞的发育、 分化、细胞周期、细胞对药物和生长因子韵诱导反应以及肿瘤等疾病的研究。 它是通过杂交使两种细胞相同的表达基因彼此湮没，而只呈现特异表达基 因的文库。由于消减c d n a 文库的富集作用，使所需筛选的克隆数少几十到上 百倍。这种文库常用于克隆不同组织或同一组织在不同生理或病理状态下的差 异表达基因【1 3 1 。h a k v o o r t 等【1 4 】报道了一种将消减杂交技术与r e , c a 介导的三链 复合物形成技术结合的方法，可快速高效地构建特异e d n a 文库。 基本流程：分别提取不同组织细胞或同一种细胞在不同功能状态下细胞的 m r n a ，将其中一种细胞的m r n a 反转录成e d n a 第一链，然后将该e d n a 与 另一细胞过量的m r n a 进行杂交，第一种细胞中若存在不同于第二种细胞的特 殊基因，则会产生特殊基因的m r n a 和e d n a ，它们不能与第二种细胞的m r n a 形成杂交体。将未形成杂交体的e d n a 分出，合成与之互补的e d n a 第二链， 再以此双链e d n a 构建e d n a 文库，即差示文库。 传统一般利用轻基磷灰石柱层析的方法分离杂交单体，这种技术存在着操 作复杂，周期长，核酸损失量大等缺点赵大中等利用磁珠分离杂交单体缩短了 s 第一章前言 实验周期，简化了实验程序，减少了杂交体的损失量，并且以一种m r n a 为处 理，两种m r n a 为对照，进行消减杂交，可以扣除多一些的非特异基因，利于 寻找更加特异的基因或基因片段，而且所建库容要比使用同种材料的传统方法 所建库容大得多15 1 。 1 5 抑制消减杂交 抑制消减杂交是1 9 9 6 年d i a t c h e n k o 等建立的一项以杂交和p c r 为基础的 基因克隆技术。该技术主要通过消减杂交将待比较双方共同的c d n a 进行消减， 再通过抑制p c r 技术特异性地扩增在t e s t e r 中特异表达的c d n a 片段，使其得 到大量富集【l6 1 。 基本原理是：将两个群体的m r n a 反转录为c d n a ，其中含有特异性表达 基因的样本为t e s t e r ，另一组为d r i v e r ，先将t ( t e q t e r ) 方与d ( d r i v e r ) 方用限制性 内切酶切割为小片段，将t 方平均分为两份，分别连接不同的接头，然后与过 量的d 方c d n a 进行不充分杂交。根据复性动力学原理，浓度高的单链分子迅 速复性，而浓度低的单链分子仍以单链形式存在。然后混合两份杂交样品，同 时加入新的变性d 方。d n a 进行第二次扣除杂交，杂交完全后补平末端，加入 合适的引物接头进行p c r 扩增。当d n a 两条链含相同接头时，其p c r 扩增受 抑制，而含不同接头的双链d n a 分子才可进行指数扩增，其产物为目的片段。 抑制消减杂交具有三大突出优点：( 1 ) 高度特异性，该技术经过两轮消减杂 交及两步p c r ，使t e s t e r 中代表差异表达基因的c d n a 片段得到大量扩增，同 时抑制了非特异性c d n a 片段的扩增，使各种消减文库的特异性得到极大地提 高；( 2 ) 高敏感性：c d n a 消减杂交、m r n a 差异显示等方法的一个共同缺点， 即不能分离到低丰度的差异表达基因，而抑制消减杂交对单链t e s t e rc d n a 的均 等化过程，使高、低丰度的差异表达基因都能有效分离，是一项很有发展前途 的技术，可望在研究基因表达及新基因分离中得到广泛应用【l 卜旧1 ；( 3 ) 高效率： 一次抑制消减杂交反应可以分离出成百个差异表达的基因。 1 6 本研究的目的和意义 自2 0 世纪7 0 年代中期首例c d n a 克隆问世以来，构建c d n a 文库已成 为研究功能基因组学的基本手段之一【2 0 1 。近年来c d n a 文库构建的新方法层出 6 第一章前言 不穷，但其共同目的是使c d n a 文库更加迅速、高效地满足研究需要。 本文构建了诱导后的草鱼c d n a 文库，可以方便的从中筛选所需目的基因， 更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。在研究具体某类特 定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势，从而 使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象 的研究中具有更为广泛的应用价值。 7 第二章c d n a 文库的筛选及保存 2 1 实验材料 第二章c d n a 文库的构建 1 实验鱼 用于构建e d n a 文库的草鱼由江西省水产科学研究所提供，体重约1 0 0 9 ， 于流水实验槽中暂养一周后使用。 2 主要试剂和试剂盒 t r i z o l ( c a t a l o gn u m b e r ：1 5 5 9 6 0 2 6 ) ：购自g i b c ob r l 公司。 o l i g o t e xm r n a k i t s 。 l k bd n al a d d e r ：g i b c o b r l 公司。 i p t g 和x g a l ：上海生工生物工程技术有限公司。 3 载体和菌株 载体：p b l u e s e r i p ti is k 的改造载体，具体是将e c o ri 和n o ti 之间的序列改 造为跏ia 和靳ib 接头序列。 菌株：大肠杆菌d h 5 a 。 2 2 主要仪器 p c r 扩增仪：mjr e s e a r c h 公司 紫外分光光度计：g eh e a l t h c a r e 公司 电泳仪：f r 一2 8 0 ，上海复日 2 3 实验方法 2 3 1 草鱼的诱导 将饲养一周后的草鱼，背鳍下肌肉注射p o l yi ：c ( 1 m g m l ) ，5 0 0j - t l 条，诱导3 天后加强注射一次，第二天取草鱼的。肾脏和肝脏组织。 2 3 2 草鱼肝、肾组织的分离 解剖所用的铁、钢器具( 解剖盘、解剖刀、剪刀、镊子) 用1 8 0 ( 2 高温干热灭 8 第三章c d n a 文库的筛选及保存 菌超过4 小时；塑料制品( 离心管) 用o 1 d e p c 水浸泡过夜，再1 2 1 湿热灭菌 3 0m i n 。 取草鱼一尾，用o 1 的k m n 0 4 消毒，再用7 5 的酒精棉球擦洗，至于无菌 托盘上剪开其左侧体壁，取出肝、肾，浸泡于灭过菌的o 1 的d e p c 水中，再 用剪刀将其剪碎，装入1 5 m l 的离心管中，迅速放入液氮罐。 2 3 3 样品t o t a lr n a 抽提 称取组织2 9 放入用液氮预冷过的碾钵中，在液氮中研磨至粉末状，转至 匀浆管，加入t m l 的t r i z o l ； 室温放置5 分钟； 加入2 0 0 t l 氯仿，用力震荡1 分钟，冰浴2 0 分钟； 4 ，1 2 0 0 0 r m i n ，2 0 r a i n 离心： 从每管中吸取上清至1 5 m le p p e n d o r f 管。加入等体积一2 0 。c 预冷的异丙醇， 混匀后8 0 。c 沉淀过夜( r n a 沉淀) 4 ，1 3 0 0 0 r m i n 离心2 0 m i n 后，去上清； 加入1 0 m l4 。c 预冷的7 5 乙醇，洗涤沉淀及离心管壁； 4 ，1 3 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，弃上清； 加入适量1 0 山m i l l i q 水，至完全溶解，进行紫外分析测定。 2 3 4m r n a 纯化 采用q i a g e n 公司的o l i g o t e xm r n ak i t s 来分离。 1 准备： ( 1 ) 放置o l i g o t e xs u s p e n s i o n3 7 。c 水浴中加热后充分振匀，放置室温。 ( 2 ) 加热水浴锅至7 0 * ( 2 后，将b u f f e ro e b 放入预保温。 ( 3 ) 将b u f f e ro b b 放3 7 加热，混匀后放室温。 ( 4 ) 所有操作应在室温( 2 0 3 0 。c ) 下执行。 ( 5 ) 离心转速保持1 4 0 0 0 18 0 0 0 9 。 2 操作： ( 1 ) 将t o t a lr n a 约5 3 7 5 p g ，用r n a s e - f r e ew a t e r 补足体积至5 0 0 1 ，将样 品放7 0 保温3 m i n ，取出振匀。 ( 2 ) 加入b u f f e ro b b5 0 0 p 1 ，及o l i g o t e xs u s p e n s i o n6 0 1 充分混匀。将样品 放7 0 3 m i n 。 ( 3 ) 取出样品室温放2 0m i n 。离心2m i n ，上清吸出后冻存于_ 2 0 。c 至实验 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 第二章c d n a 文库的筛选及保存 结束。沉淀中加入5 0 0 p lh 2 0 及5 0 0 p lo b b ，充分混匀。致取出样品 室温1 5m i n ，离心2m i r ，上清倒掉。 ( 4 ) 将沉淀悬浮于b u f f e ro w 24 0 0 p 1 中振荡混匀，将悬浮液加入s p i n c o l u m n 。将s p i nc o l u m n 放入1 5 m l 离心管离心l m i n 。 ( 5 ) 将s p i nc o l u m n 转入一新1 5 m l 离心管，在s p i nc o l u m n 中加入b u f f e r o w 24 0 0 p l ，离心管离心l m i n 。 ( 6 ) 将s p i nc o l u m n 转入一个新1 5 m l 离心管，在柱上加入l o o g lb u f f e ro e b ， 用枪吹打混匀保证充分悬浮介质。离心l m i n 。注意这个过程中一定尽 量使b u f f e ro e b 保持7 0 温度。收集离心液。 ( 7 ) 重复步骤6 ，合并两步骤离心液。 ( 8 ) 吸取1 0 1 t lm r n a 紫外分析。其余部分用酒精沉淀溶于1 0 9 9 水。 2 3 5e d n a 合成、酶切及分级分离 2 3 5 1e d n a 第一链合成 1 在1 个o 5 m l 灭菌离心管中加入以下试n - 3 1 x g样品r n a ( 平行对照反应用l l x l 1 9 9 】的c o n t r o lr n a ) ll a ls m a r ti vo l i g o n u c l e o t i d e lg lc d si i i 3 p c rp r i m e r 2 混匀试剂并稍稍离心。 3 7 2 0 c 温浴2m i n 。 4 冰浴2m i n ，稍稍离心后加入下列试剂： 2 o g l 5 x f i r s t - s t r a n db u f f e r 1 o l a ld t t ( 2 0r a m ) 1 0 1 t l d n t pm i x ( 1 0r n m ) 1 0 1 x lp o w e r s c r i p tr e v e r s et r a n s c r i p t a s e 10 o g lt o t a lv o l u m e 5 混匀试剂并稍稍离心。 6 4 2 0 c 温浴1h 。 7 将离心管置于冰上终止第一链合成。 2 3 5 2l dp c r 扩增e d n a 1 将p c r 仪预热到9 5 0 c 。 2 反应管中加入下列试剂： 1 0 第三章c d n a 文库的筛选及保存 2 p lc d n a 第一链 8 0 1 t l 去离子水 10 t l10 x a d v a n t a g e2p c rb u f f e r 2 p l 5 0 d n t pm i x 2 1 x l 5 p c rp r i m e r 2 p l c d si i i 3 p c rp r i m e r 2 i j ，15 q x a d v a n t a g e2p o l y m e r a s em i x 10 0 p 1t o t a lv o l u m e 3 轻拍混匀各组分，稍稍离心后放到已预热( 9 5 。c ) 的p c r 仪。 4 按下面程序开始p c r ： 9 5 0 clm i n 2 6c y c l e s ： 9 5 0 c1 5s 6 8 0 c6m i n 5 循环结束后取5 1 x l 样品电泳检测。 2 3 5 3 蛋白酶k 消化 1 合并l d p c r 产物o 5 m l 灭菌的离心管中，加入2 1 a l 蛋白酶k ( 2 0 p p 1 ) ； 2 混匀试剂并稍稍离心； 3 4 5 0 c 温浴2 0r a i n ，稍稍离心； 4 加入5 0 1 x l 去离子水； 5 加1 0 0 i t l 酚：氯仿：异戊醇抽提； 6 1 4 ，0 0 0r m i n 离心5m i r a 7 收集上层液体到另一干净的离心管中； 8 加入等体积的氯仿：异戊醇混匀； 9 1 4 ，0 0 0r m i n 离心5m i n ； 1 0 收集上层液体到另一干净的离心管中； 1 1 加入1 1 0 体积的3m o l l 乙酸钠，2 5 倍体积9 5 的室温乙醇，室温条 件下立即1 4 ，0 0 0r m i n 离心2 0m i n ； 1 2 倒掉上清，用1 0 0 1 a l8 0 乙醇洗沉淀物l 1 3 空气干燥沉淀物约1 0 幽； 1 4 加7 9 “l 的去离子水溶解沉淀。 1 1 第二章c d n a 文库的筛选及保存 2 3 5 4 驴i 消化 1 在o 5 m l 离心管中加入序列试剂： 7 9 “l e d n a 10 1 a llo x s f ib u f f e r 1 0 i - t l s f iie n z y m e 山l ! q q 兰旦s 10 0 1 x lt o t a lv o l u m e 2 充分混匀，5 0 0 c 温浴2h 。 3 加2 肛11 - - 甲苯胺染料。 2 3 5 5e d n a 的分级分离 1 准备好1 1 个收集管，标记1 11 ； 2 准备好s p i n 一4 0 0 柱子； 3 用7 0 0 1 x l 的缓冲液洗柱子； 4 待洗柱缓冲液流完，将上面的酶切产物约l o o l x l 平稳地加到胶层中间，直 到产物全部渗到胶面下； 5 加1 0 0 l x l 缓冲液使染料层下降数毫米，放置好第一收集管； 6 加6 0 0 l x l 的缓冲液并开始收集滴出的液体，每管收集3 5 i t l 。 7 合并第1 5 管，一2 0 0 c 乙醇沉淀过夜； 8 1 4 ，0 0 0r m i n 离心2 0m i n 。弃上清，室温干燥1 0m i n ； 9 加1 0 0 t l 去离子水溶解沉淀。 2 3 6 将c d n a 与p b l u e s c r i p ti is k 载体相连 1 反应管中加入下列试剂： e d n a 1 0 i t l v e c t o r ( 2 5n g m 1 )1 0 p l 10 x l i g a t i o nb u f f e r 1 0 - t l a t p ( 1 0m m o l l )1 0 p 1 t 4d n a l i g a s e1 0 p l 旦曼i q 煎圣煎曼q：5 越 t o t a lv o l u m e ( p 1 )10 0 2 1 6 0 cp c r 仪上过夜。 1 2 第三章c d n a 文库的筛选及保存 宰注：克隆载体为p b l u e s c r i p ti is k 的改造载体，具体是将e c o ri 和n o ti 之 间的序列改造为s f ii a 和驴i b 接头序列，酶切后可定向插入c d n a 片 断( 跏ia _ 跏ib ) 。 2 3 7 重组质粒的转化 1 取2 0 0 1 1 感受态宿主菌h 一5 a ) 至灭菌的5 0 m l 离心管中，放置冰水浴融化； 2 加入上述1p l 连接液，轻轻混匀后置于冰上4 5 m i r a 3 4 2 水浴热休克9 0 s ，迅速放入冰上2 m i n ； 4 加入2 m ll b 培养基( 不含抗生素) ，3 7 摇床，转速5 1 5 0 r m i n ，复苏4 5 m i n ； 5 3 0 0 0 r m i n 离心1 0m i n 收菌，用2 5 0 p 1l b 重悬： 6 取2 5 0 i ，t l 菌液涂布于15 c m 培养皿上( a m p r - i p t g x g a ll b 固体培养基) ， 3 7 过夜。 2 4 结果与分析 2 4 1t o t a lr n a 的质量检测 2 4 1 1 紫外分析r n a 的质量 表2 1 紫外分光光度计检测t o t a lr n a 的质量 t a b l e2 1t 0 t a lm r n a q u a l i t yf o ru l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t e rd e t e c t i o n 将总r n a 样品用t e 缓冲液稀释2 0 0 倍，测得0 9 2 6 0 o d 2 s o = 1 9 2 4 ，表明r n a 纯度较好，几乎无蛋白质和d n a 污染。r n a 浓度= 4 0 x o d 2 6 0 x 稀释倍数 1 0 0 0 = 2 1 5 n g l a l ，则r n a 总量为5 3 7 5 1 x g 。 2 412 保温实验检测r n a 质量 从保温实验结果看出，7 0 c 保温6 0 m i n 后与一2 0 c 保存的r n a 电泳条带无明 显差别，说明t o t a lr n a 中无r n a 酶的污染；且2 8 s 的亮度几乎都为1 8 s 的两 倍，r n a 质量较好。 第璋e d n a 史阼的9 i i 选及保存 酗2lt o t a lr n a 保温实验屯泳结聚 f i g u r e2 le l e c t r o p h o r e s i sr e s u l t s m r t h e t o t a lr n a i n s u l a t i o ne x p e r i m e n t l 泳道为4 0 0 n g 的t o t a l r n a 枉7 0 c 保温6 0 m i n 后的l h 泳结果。 2 泳道为4 0 0 n g 的t o t a lr n a 在-