（微生物学专业论文）播娘蒿dscor蛋白的特性及其在拟南芥缺陷株中的功能鉴定研究.pdf

四川大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师曹毅指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获 得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示 谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师曹毅指导下取得 的，论文成果归四川大学所有，特此声明。 申请人： 指导教师： 刘互讲 嗜黏 四川大学硕十学位论文 中文摘要 播娘蒿d s c o r 蛋白的特性及其在拟南芥缺陷 株中的功能鉴定研究 微生物学专业 研究生刘玉坤指导教师曹毅 温度是影响植物生存和生长发育的基本环境因子之一，是严重限制 植物分布区域及影响作物产量的重要因素。低温寒害是一种危害农业生 产的全球性自然灾害，几乎涉及所有的经济植物。每年因低温寒害给农 业生产造成的巨大损失数以亿计。因此，研究植物抗寒的分子机制，用 基因工程的手段对植物进行改造，进而提高植物的抗寒性，不但具有重 大的理论意义，而且对农业生产也具有重要的实际意义。 自从1 9 7 0 年w e i s e r i l l “植物抗寒性诱导过程是基因表达的改变”观点 提出以后，植物抗寒研究上升到了分子水平，越来越多的抗寒相关基因 被发现。c o r ( c o k t - r e g u l a t e d g e n e ) 基因是在上世纪9 0 年代初发现的一 类受寒冷调控的基因。c o r 基因是一种诱发基因，只有在特定条件( 主 要是低温，干旱、离渗也有一定影响) 下才得以启动和表达，进而使细 胞表现出抗寒力。目前研究的最多的就是拟南芥( a r a b i d o p s i s t h a l i a n a ) 中的抗寒基因c o r l 5 a 。 播娘蒿( d e s c u r a n i as o p h i a 亿，w e b b 缩写为d s ) 和拟南芥同属十 字花科，但播娘蒿的抗寒性较拟南芥强得多。播娘蒿具有极强的适应恶 劣环境的能力，在川西高原海拔4 0 0 0 米的地区也生长良好，在西北干旱、 盐碱地区，播娘蒿也成为优势群类。播娘蒿极其耐寒，在春天低于0 8 四川大学硕士学位论文 的条件下亦能抽苔开花，植株甚至还可以忍受冬天一4 0 的低温1 2 】。可是 目前对播娘蒿抗寒机制方面的研究几乎为空白，为了早日开发利用这一 宝贵资源，为其它作物的抗冻保护提供依据，我们对播娘蒿抗寒基因进 行的系统研究是十分有意义的。 本实验室已经对播娘蒿进行了一系列的生理研究，证明播娘蒿较拟 南芥的确具有更强的抗寒性【3 】：本实验室从播娘蒿中克隆得到抗寒相关 基因d s c o r 的c d n a 序列【4 】，并且对其进行了详细的生物信息学分析，发 现它与拟南芥c o r l 5 a 基因具有很高的同源性，蛋白序列也具有很高的相 似性。系统发育分析推测播娘蒿d s c o r 基因和拟南芥、油菜、苜蓿的抗 寒基因属于同源基因。本论文在以上研究的基础之上，对播娘蒿d s c o r 基因的转录规律和d s c o r 蛋白的特性进行研究，并在拟南芥c o r l 5 a 缺陷 株中对d s c o r 基因进行了功能鉴。本文取很的主要结论如下： 一、播娘蒿d s c o r 基因的转录受低温诱导。本文利用半定量g r p c r 技术，以1 8 s 核糖体r n a 基因作为内标，研究了低温胁迫对d s c o r 基因 表达的影响，对实验结果进行分析并得到以下结论：( 1 ) 播娘蒿d s c o r 基因转录受低温胁迫诱导。常温下该基因不表达，当植物受到低温刺激 时，可以在l o m i n 中内检测到该基因的m r n a 转录产物出现，随着低温胁 迫时间的延长，该基因的转录产物逐渐积累达到最大量，并一直保持较 高水平。( 2 ) 当植物受到低温胁迫时，d s c o r 基因的转录产物m r n a 可以 在短时间内迅速积累，但当温度恢复正常以后，m r n a 转录产物在半小时 内发生降解。( 3 ) 诱导播娘蒿d s c o r 基因开始转录的临界温度为8 c 。 二、播娘蒿d s c o r 基因在大肠杆菌系统中实现了高效表达，并纯化 得到d s c o r 融合蛋白。本文选择成熟、经典的大肠杆菌系统进行d s c o r 基因的原核表达，包括：( 1 ) 选用p e t 3 2 a 作为原核表达载体，成功构建 p e t 3 2 a - d s c o r 原核表达载体，然后将重组质粒转化到表达菌ec o l i b l 2 1 中。( 2 ) 对融合蛋白的可溶性表达条件进行了优化，经过i m mi p t g ( 终 浓度) 3 7 诱导表达3 h 后，s d s p a g e 电泳检测表明可溶性的d s c o r 蛋 白得到大量表达，蛋白大小为3 1 k d ，与预期值相符。( 3 ) 根据生物信息 学预测d s c o r 蛋白具有很强的亲水性，建立起“煮沸一镍离子亲和层析法” 9 四川大学硕十学位论文 纯化d s c o r 蛋白的方法体系。( 4 ) 通过制备性电泳和透析袋电洗脱法成 功纯化出d s c o r 重组蛋白，纯化得到的d s c o r 蛋白用于后续实验。 三、播娘蒿d s c o r 蛋白具有很强的生理稳定性。对纯化得到的d s c o r 蛋白进行了高温耐受性、p h 耐受范围、紫外耐受性几个方面的生理性质 研究，结果发现：d s c o r 蛋白在1 0 0 沸水浴处理4 h 后仍然保持很好的 溶解状态，并且蛋白浓度与初始浓度相比，没有明显降低；该蛋白耐受 的酸碱范围大约为p h3 o _ _ p hl o 5 ；该蛋白能耐受紫外照射的最长时 间为1 2 h ，当紫外照射1 2 h 或更长时间时，该蛋白发生分解。播娘蒿d s c o r 蛋白的强稳定性对于其发挥抗寒蛋白的功能具有重要意义。 四、w e s t e r nb l o t i n g 结果表明播娘蒿d s c 0 r 蛋白受低温诱导产生。 本文通过背部皮下多点注射的方法免疫兔子，制备得到d s c o r 蛋白的多 克隆抗体，w e s t e r nb l o t i n g 结果发现，播娘蒿d s c o r 蛋白在常温下不 产生，当植物受到低温刺激时该蛋白才开始产生，这一结果与第一章中 d s c o r 基因的转录调节规律相符，也与拟南芥抗寒蛋白c o r l 5 a 的表达规 律相一致。 五、通过农杆菌介导的花序浸染法，播娘蒿d s c o r 基因在拟南芥 c o r l 5 a 基因的缺失突变株中得到遗传转化。转基因植物是鉴定基因功能 的有效方法，尤其是拟南芥等模式植物的转化。为了鉴定播娘蒿d s c o r 基因的功能，本文特选用拟南芥c o r l 5 a 基因的缺失突变株( 由日本r i k e n 生物资源中心提供，r i k e n8 i o r e s o u r c ec e n t e r 编号：p s t l 5 7 8 1 ) 为转 基因植物材料，并取得以下结果：( 1 ) 在d s c o r 基因o r f 的57 引物和 3 引物中引入构建表达载体所需的b a l i 和船d 限制酶位点，通过双 酶切和连接，成功构建了可以在植物中高效表达的载体 p c a m b i a 2 3 0 l g - d s c o r ，并用冻融法将其转入根癌农杆菌e h a l 0 5 中。( 2 ) 采用经典的农杆菌介导的花序浸染法，在农杆菌浸染液中加入0 0 0 5 表 面活性剂s i l w e tl - 7 7 ，分批次进行拟南芥p s t l 5 7 8 1 突变株的转化，并 且收获了大量转化种子。 六、转d s c o r 基因拟南芥的低温耐受性提高到野生水平，从而获得 了d s c o r 基因具有提高植物抗寒性的直接证据。( 1 ) 本文采用卡那霉素 网川= = 学硕士学位论文 抗性培养基筛选的方法，将收获的转化后的种子播于含k i n5 0 m g l 的筛 选培养基上进行筛选，共获得6 8 株抗性植株。( 2 ) 提取抗性植株的基因 组d n a ，用p c r 的方法对抗性植株进行了分子生物学鉴定，共获得8 株 p c r 阳性苗，初步证明d s c o r 基因已转入拟南芥细胞基因组中，p c r 阳 性率为1 1 7 6 。( 3 ) 在功能分析中，经4 低温胁迫处理4 d ，拟南芥突 变株p s t l 5 7 8 1 的叶片出现严重的低温损伤，叶片大面积褐化萎蔫，而 d s c o r 基因在拟南芥突变株中组成型表达后，转基因拟南芥的低温耐受 性恢复到野生( 正常) 水平。这表明播娘蒿d s c o r 基因在提高植物抗寒 性方面发挥着重要作用。 对播娘蒿抗寒基因d s c o r 以及抗冻蛋白d s c o r 的研究，对于探索播 娘蒿具有强耐寒性的原因、从分子水平深入研究植物抗寒作用机制具有重 要的意义。播娘蔫抗寒基因d s c o r 将会在利用基因工程手段提高农作物和 经济作物的耐寒性方面有广阔的应用前景。 关键词：播娘蒿c o r 基因低温胁迫原核表达蛋白纯化蛋白 性质转基因拟南芥 四川大学硕士学位论文 英文摘要 c h a r a c t e r i z a t i o no fd s c o r p r o t e i nf r o m d e s c u r a n i a s o p h i a 亿) w e b ba n df u n c t i o n i nr e s e a r c h i na r a b i d o p s i sm u t a n t m a j o r m i c r o b i o l o g y a d s o rc a o t e m p e r a t u r ei s o n eo fi m p o r t a n te n v i r o n m e n t a lf a c t o r sf o rp l a n t s b e c a u s et e m p e r a t u r el i m i t st h e g e o g r a p h i c a ld i s t r i b u t i o na n dg r o w i n g o fm o s t p l a n ts p e c i e s l o wt e m p e r a t u r em a yh u r tp | a n t sv a r i o u s l ye v e nm a k et h e m d e a d e v e r yy e a rl o wt e m p e r a t u r es t r e s sc a u s e da d v e r s ee f f e c t so nt h eg r o w t h o fp l a n t sa n dt h ep r o d u c t i v i t yo fe r o p sa n dm a d el a r g el o s s t h ee n h a n c e m e n t o ff r e e z i n gt o l e r a n c ef o rc r o p sh a ss i g n i f i c a n tm e a n i n g sf o rt h ei m p r o v e m e n t o fc r o p so u t p u t i n1 9 7 0 ，w e i s e rf o u n dt h a tc e l l u l a rg e n ee x p r e s s i o nc h a n g e dd u r i n gc o l d a e c l i n a t i o n r e s e a r c ho np l a n tc o l dt o l e r a n c ed e v e l o p e dt om o l e c u l a rl e v e l a t p r e s e n t ，p e o p l e h a sc a r r i e do u t w i d e s p r e a d r e s e a r c ho nc o l di n d u c e g e n e s c o rg e n e ( c o l d - r e g u l a t e dg e n e ) i s ak i n do fg e n ec o u l de n h a n c e f r e e z i n gt o l e r a n c ef o rp l a n t s i t se x p r e s s i o nn e e dt ob ei n d u c e db yt h es t r e s s e s j u s ta sl o wt e m p e r a t u r e ，d r o u g h to rs a l tl o a d i n g t h ec o rg e n ew h i c hi s s t u d i e dm o s tc l e a r l yi sc o r l 5 ac l o n e df r o m a r a b i d o p s i st h a l i a n a j u s tl i k ea r a b i d o p s 豇t h a l i a n a ，d e s c u r a n i as o p h i a 阻jw e b bj s c r u c i f e r a e 。b u td e s c u r a n i as o p h i a 皿jw e b bh a sm u c hm o r et o l e r a n c et ol o w t e m p e r a t u r et h a na r a b i d o p s i st h a l i a n a t h i sk i n do fp l a n tc a nb l o s s o ma t0 ，a n dt h es e e d s 伽g r o wa t 一4 0 b u ta tp r e s e n tt h e r ei sv e r yl i t t l e r e s e a r c ha b o u ti t w eu s ed e s c u r a n i as o p h i a 以jw e b ba so u rm a t e r i a lt o 四川大学硕十学位论文 r e s e a r c hi t sc o l d r e s i s tm e c h a n i s ma tt h eg o n el e v e li no r d e rt od e v e l o pt h i s g o o dc o l d - r e s i s tm a t e r i a l i ti su s e f u lt oi m p r o v ef r e e z i n gt o l e r a n c ef o ro t h e r p l a n t st h o u g hg e n e t i ce n g i n e e r i n g o u rl a bh a sm a d es o m er e s e a r c ho np h y s i o l o g i c a ln a t u r eo fd e s c u r a n i a s o p h i a jw e b ba n ds u c c e s s f u l l yc l o n e dt h eg e n ed s c o r ( c o _ _ m - r e g u l a t e d g e n e ) f r o md e s c u r a n i as o p h i a 阻jw 曲b b i o i n f o r m a t i o na n a l y s i ss u g g e s t e d t h ed s c o r g e n cw a sh i g hh o m o l o g o u s t oa r a b i d o p s i st h a l i a n ac o r l 5 a o n t h i sb a s e ，w em a d ef u r t h e rr e s e a r c ha b o u tt h ec h a r a c t e ro fd s c o rp r o t e i n ， a n da n a l y z e dt h ef o u n c t i o no fd s c o rg e n ei na r a b i d o p s i sm u t a n tm m a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w e d ： i d s c o rm r n aw a si n d u c e do n l yt r a n s i e n t l yb yl o wt e m p e r a t m es t r e s s i no r d e rt oa n a l y z et h ee f f e c t so fl o wt e m p e r a t u r eo nt h eg e n ee x p r e s s i o no f d s c o r ，s e m i q u a n t i t a t i v er t - p c rw a sp e r f o r m e dw i t ha ni n t e r n a ls t a n d a r d o f1 8 sr r n af r o md e s c u r a n i as o p h i a 佤，w e b b ( 1 ) t h er e s u l t ss h o w e d d s c o rm r n al e v e l sc o r r e l a t e dw i t ht h el o wt e m p e r a t u r e 1 1 l et r a n s c r i p to f d s c o rw h i c hc o u l dn o tb ed e t e c t e da tn o r m a lt e m p e r a t u r e ，w e r ei n d u c e db y a1 0 r a i nl o wt e m p e r a t u r et r e a t m e n to f4 w h e np l a n tw a st r e a t e dw i t hl o w t e m p e r a t u r e m e n tl h ，t h et r a n s c r i p ta m o u n t so f d s c o rw a sh i g h e s t a s l o n ga sl o wt e m p e r a t u r et r e a t m e n t ，t h et r a n s c r i p ta m o u n t so f d s c o r k e p t h i g l l c s t ( 2 ) t h e r e s u l ts h o w e dt h a td s c o rm r n aw a si n d u c e do n l y t r a n s i e n t l yb yl o wt e m p e r a t u r e n em r n aa m o u n t sb e g a nt or e d u c ea f t e r t r a n s f e r r i n g t h e p l a n t s f r o ml o w t e m p e r a t o r e t on o m a a lt e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s t h er e s u l t so fs u c har e c o v e r ye x p e r i m e n td e m o n s t r a t e dt h a t d s c o rm r n aw a ss h o r t - l i v e d u n d e rt h et r e a t m e n to fl o wt e m p e r a t u r e ， t h em r n aa c c u m u l a t e dr a p i d l yi n1 0 m i n w h e nt e m p e r a t u r er i s e dt ot h e n o r m a lc o n d i t i o n ，t h em r n a d e g r a d e dq u i c k l yw i t h i n3 0 m i n t h e na sl o n g a sn o r m a lt e m p e r a t u r e ，d s c o rm r n ae x p r e s s i o nw a sg r a d u a l l yr e c o v e r e d t ot h en o r m a ll e v e l ( 3 ) a tt h ec r i t i c a lt e m p e r a t u r eo f8 t h ee x p r e s s i o no f d s c o rm r n ac o u l db ed e t e c t e d 1 3 四川大学硕士学位论文 i i u s i n ge c o l ie x p r e s s i o na n dp r o t e i np u r i f i c a t i o ns y s t e m ，d s c o rg e n e w a se x p r e s s e da n dp u r i f i e d i no r d e rt os t u d yt h em e c h a n i s mo fd s c o r e n h a n c i n gp l a n t sc o l dt o l e r a n c e ，e c o l ie x p r e s s i o na n dp r o t e i np u r i f i c a t i o n s y s t e mw a su s e di nt h ep a p e r t h eo r fo fd s c o rw a sa m p l i f i e db yp c r ， a n dc l o n e di n t o e x p r e s s i o n v e c t o rp e t 3 2 at oc o n s t r u c tr e c o m b i n a n t e x p r e s s i o np l a s m i dp e t 3 2 a - d s c o r ，t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d w a s s t r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 2 1a n di n d u c e dt oe x p r e s sr e c o m b i n a n tp r o t e i n w i t hi f r g a c c o r d i n gt oh y d r o p h i l i cc h a r a c t e r ，t h ef u s i o np r o t e i nw a s f u r t h e r p u r i f i e dt h r o u g h ( 1 ) b o i l i n g a n d a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ( 2 ) e l e c t r o e l u t i o ni n d i a l y s i sb a g s ；c o n c e n t r a t e db yp e g ；a n a l y z e db y s d s - p a g e r e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o na n dd n as e q u e n c i n ga n a l y s s u g g e s t e dt h a tt h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dc o n t a i n e dc o r r e c tc o d i n g r e g i o no fd s c o r s d s p a g ed e m o n s t r a t e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp r o t e i n w a se x p r e s s e dwi t ht h ee x p e c t e dm o l e c u l a rw e i g h ta t3 1 k d t h ee c o l iw a s i n d u e db yi m m o l li p t ga t3 7 cf o r3h o u r s ，t h em o s tr e c o m b i n a n tp r o t e i n c a nb eo b t a i n e d a f t e rp u r i f i e da n dc o n c e n t r a t e d ，t h ec o n c e n t r a t i o no f d s c o rf u s i o np r o t e i nw a s1 1 l m g m l t h eb a s i cw o r k sw o u l dh e l pu st od o f a r t h e rr e s e a r c hi nd s c o r p r o t e i n h i r e s e a r c ha b o u tp r o t e i nr e s i s t a n c et oh e a t ， a c i d a l k a l ia n du v d e m o n s t r a t e dd s c o rf u s i o np r o t e i nh a ss t r o n gs t a b i l i t y a f t e rb o i l i n g4 h ， d s c o r p r o t e i nr e m a i n e dg o o dd i s s o l v e ds t a t e t h ea c i da n da l k a l ir e s i s t a n c e o fd s c o rp r o t e i nw a ss t r o n ga n dt h ep hr a n g ew a s3 0 - 1 0 5 t h el o n g e s t t i m ed s c o rp r o t e i nc o u l dt o l e r a t eu vi s 1 0 0 # m o lm - 2 s 1 f o r1 2 h i f d s c o rp r o t e i nw a se x p o s e dt ou v l o n g e rt h a n1 2 h ，t h ep r o t e i nw o u l d b e g i ni t sd e g r a d a t i o n t h es t r o n gs t a b i l i t yo fa n t i f r e e z ep r o t e i nd s c o rw a s v e r yi m p o r t a n ti ne n h a n c i n gf r e e z i n gt o l e r a n c ef o rp l a n t s ar a b b i tw a si m m u n i z e dw i t ht h ep u r i f i e dd s c o rf u s i o np r o t e i nt o p r o d u c ep o l y c l o n a la n t i b o d y ，a n d t h ep r o d u c t i o no fa n t i b o d yw a sc o n f i r m e d b ye l i s a r a b b i tp o l y c l o n a la n t i b o d yw a so b t a i n e d , t h et i t e ro fw h i c hw a s 1 4 四川大学硕：学位论文 1 ：1 2 8 0 0 w e s t e r nb l o t i n gr e s u l t si n d i c a t e dt h a td s c o r p r o t e i ni si n d u c e db y l o wt e m p e r a t u r ea n dt h e e x p r e s s i o no fd s c o rg e n eo np r o t e i nl e v e l i s r e g u l a t e db yl o wt e m p e r a t u r e t h i sr e s u l ti sa g r e e m e n tw i t hc h a p t e ro u e v b yt h ef l o r a l d i pm e t h o d ，d s c o rg e n ew a st r a n s f o r m e d i n t o a r a b i d o p s i sc o r l 5 a m u t a t i o n i no r d e rt oa s s u r et h ed s c o r g e n ef u n c t i o n ， w eu s e da l la r a b i d o p s i sc o r l 5 ag e n em u t a n t ( r i k e nb i o r e s o u r c ec e n t e r n o p s t l 5 7 8 1 ) a st r a n s g e n i cp l a n tm a t e r i a l f i r s t l y ，t h e v e c t o r p c a m b i a 2 3 0 1 g d s c o r w a sc o n s t r u c t e d t h e nt h e p c a m b i a 2 3 0 1 g d s c o r v e c t o rw a si n t r o d u c e di n t o a g r o b a c t e r i u m t u m e f a e i e n s e h a l 0 5u s i n gt h ef r c e z e - t h a wm e t h o d t h i r d l y ，t h e a r a b i d o p s i sc o r l 5 am u t a t i o nw a st r a n s f o r m e do nal a r g es c a l eb yt h e f l o r a l - d i pm e t h o d f i n a l l y ， w eg o tal o to ft r a n s f o r m e ds e e d c o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o no fd s c o rg e n e si na r a b i d o p s i sm u t a n tr e s t o r e d t h el o wt e m p e r a t u r et o l e r a n c eo ft h e # a n t st ot h ew i l d t y p el e v e la n dt h e f i n d i n g si n d i c a t e dt h a td s c o rf u l f i l laf u n c t i o nt oe n h a n c ef r e e z i n gt o l e r a n c e o fp l a n t s w eg o t6 8k m a m y c i nr e s i s t a n tp l a n t s t h et r a n s f o r m e dp l a n t sw e r e t r a n s p l a n t e di n t ov e r m i c u l i t e ：s a n d ( 1 ：1 ) m e d i u m t r a n s g e n i cp l a n t sw i t h d s c o r g e n ew e r eo b t a i n e da n dt h e i rt a r g e tg e n ew a sd e t e c t e dt h r o u g hp c r a n a l y s i si nt h i ss t u d y f o rf u n c t i o na n a l y s i s ，t h ea r a b i d o p s i sm u t a n tw a s e x p o s e dt ol o wt e m p e r a t u r es t r e s s ，r e s u l t i n gi nl e a fb l e a c h i n g ，w i l t i n ga n d e x t e n s i v ef r e e z i n gd a m a g e c o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o no fd s c o rg e n e si n m u t a n ta f t e rl o wt e m p e r a t u r es t r e s sr e s u l t e di nd s c o ra c c u m u l a t i o na n d r e s t o r e dt h ef r e e z i n gt o l e r a n c eo ft h ep l a n t st ot h ew i l d t y p el e v e l o u r f i n d i n g si n d i c a t e dt h a td s c o r c o u l dp l a ya p a r ti ne n h a n c i n gt h et o l e r a n c et o l o wt e m p e r a t u r es t r e s so ft h ep l a n t s o u rr e s e a r c ha b o u td s c o rg e n ea n dd s c o rp r o t e i nh a ss i g n i f i c a n t m e a n i n g sf o rm a k i n gc l e a rt h e r e a s o nw h yd e s c u r a i n i as o h i ah a ss t r o n g f r e e z i n gt o l e r a n c ea n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f c o l da c c l i m a t i o n d s c o r a n t i f r e e z eg e e na n dd s c o ra n t i f r e e z ep r o t e i nw i l lh a v eg o o dp r o s p e c tf o r 四川大学硕士学位论文 i m p r o v i n gt h ec o l dr e s i s t a n c eo fp l a n t st h r o u g hg e n e t i ce n g i n e e r i n gm e t h o d k e yw o r d s ：d e s c u r a n i as o p h i a ( l ) w e b b ，c o rc ( _ q dr e g u l a t e dg e n e ) ，l o w t e m p e r a t u r es t r e s s ，p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ，p r o t e i np u r i f i c a t i o n ，p r o t e i n c h a r a c t e r ，t r a n s g e n i c a r a b i d o p s i st h a l i a n a 1 6 四川大学硕上学位论文 月i j 昌 随着人口的增长和耕地面积的不断减少，如何提高作物的产量越来 越受到人们的广泛关注，而温度是影响植物生长及分布的重要生态因子 之一。低温寒害对植物来说是严重的自然灾害，一直制约着植物的正常 生长和作物产量的提高。低温影响植物的生长代谢，引起植物相关生理 指标变化，导致植物受到伤害、减产，较为严重的冻害甚至造成植物死 亡、作物绝产。所以，如果能培育出抗冻作物品种，就可能延长作物的 生育期，同时也会抵御骤然低温对作物造成的不良影响，对提高作物的 产量有着非常重要的意义。传统的抗寒育种方法对提高植物抗寒性的作 用不大。目前用传统育种方法得到的最耐寒的小麦品种抗寒能力与上世 纪早期所研制的品种抗寒能力基本上是一样的1 5 】。因此，长期以来，人 们从生理学、形态学、生物化学、生物物理学等多个方面对植物抗寒机 制进行了广泛的研究。特别是近2 0 年来，人们采用分子遗传学研究手段， 深入研究植物抗寒的分子机制，大量冷诱导表达的基因已分离出来，并 证明这些基因对提高植物的抗寒性有一定的作用。 人们在植物抗寒机制的研究中发现，将植物置于低温而非冰冻温度 中( o 1 2 ) 进行一段时间的低温锻炼，会使植物获得抗寒性，人们把这 个过程称为“冷驯化”。对油菜( b r a s s i c an a p u s ) 的抗寒性研究表明，低温 驯化对提高油菜的抗寒力是有效的。可以通过低温驯化的处理来提高油 菜对低温寒害的抵御能力；所有经过冷驯化的株系经过7d 的温暖期后， 抗寒性都有所下降，但仍然高于未经驯化的植株所具有的耐寒水平1 6 j 。冷 驯化可以提高植物抗寒性的事实说明：植物抗寒力具有潜在的遗传特性， 冷驯化能诱导其潜能的表达并使植物发挥最大的抗寒力。 早在1 9 7 0 年，w e i s c r t l j 等首先提出“植物抗寒性诱导过程中基因表 达改变”的观点，指出多年生木本植物的低温适应性可能需要两个条件。 即特异基因的转录激活及在抗寒过程中新蛋白质的低温诱导合成，从而 揭示出植物冷驯化实质上是感受低温信号、调节基因的表达和代谢的环 境适应过程。目前分离鉴定的低温诱导基因有：拟南芥的l t i l 4 0 、l t i 7 8 、 1 7 四川大学硕士学位论文 ! t i 6 8 、r c i l 4 a 、r a b l 8 、r d 2 8 、r d 2 9 和c o r l 5 a ，大麦的h v a l 、b l t l 0 1 和b l t l 4 ， 苜蓿的c a s l 8 、c a s l 5 和m s a c i ，小麦的w c s l 2 0 、w c s 2 0 0 和c o r 3 9 ，以及水 稻的l i p l 5 等 7 1 ，这些低温诱导基因除受低温应答外，有些还对激素( 如 a b a ) 、高盐、干旱胁迫等作出应答。 这类抗寒基因编码的蛋白常会具有以下特性，例如：( 1 ) 它们的表达 一般很迅速，例如在拟南芥中，低温处理1 2 2 4 h 内，即可检测出相应多 肽的合成。( 2 ) 这些新合成的多肽在整个低温驯化的过程中一直维持高水 平。( 3 ) 低温诱导合成的新多肽大多具有极强的亲水性，在沸腾的缓冲 水溶液中仍保持溶解状态；它们有比较简单的氨基酸组成，或少数几种 氨基酸重复多次排列；还有许多多肽包含一段特殊的区域，能够形成亲 水性的n 一螺旋。( 4 ) 同时脯氨酸含量及与抗寒相关的酶的酶活会大大 提高，以共同提高质膜的稳定性。 c o r 基因( t o m - r e g u l a t e dg e n e ) 是上世纪9 0 年代初人们发现的一类 受低温诱导表达的基因。c o r 基因的表达对于植物抗寒性的提高和冷驯 化是很关键的，其基因产物通常是一些具有提高植物抗寒性功能的亲水 性多肤【8 l 。冷驯化能诱导多种c o r 蛋白产生，例如拟南芥在冷驯化过程 中能产生c o r 6 6 ，c o r l 5 a 以及与l e a 蛋白同源的c o r 4 7 等1 9 1 。 在人们对植物的冷诱导基因c o r 的研究中，的了解最为透彻的是拟 南芥c o r l 5 a 基因。拟南芥的c o r l 5 a 基因编码一种1 5 k d 的新多肽c o r l 5 a ， 此多肽合成后运送至叶绿体基质片层中加工成成熟的9 4 k d 的多肽，称为 c o r l 5 a m 。1 9 9 6 年，a r m s 1 0 l 等从拟南芥中分离得到了这种冷诱导多肽 c o r l 5 a 它是高度亲水性的，在沸水中仍保持溶解状态。它富含丙