（微生物学专业论文）四种白蚁纤维素酶活性的初步研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 华中师范大学学位论文原创性声明和使周授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：许弃l 莨 日期：砌1 年细j 日 学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解华中师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华中师范大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅； 学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手 段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 保密论文注释：本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。 非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：许乖l 琵 日期：如1 年6 月1 日 导师签名： 移 日期：2 0 0 年易月r 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程 ，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库 中全文发布，并可按“章程 中的 规定享受相关权益。回意途塞逞銮卮进卮；旦坐生；旦= 生；旦三生蕉查。 作者签名：许禾l 良 日期l 忏6 月1 日 导师签名： 日期：弘f 日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 摘要 纤维素是地球上最为丰富的自然资源，而白蚁是自然界一种能够高效降解纤维 素的昆虫，如果能模拟白蚁降解纤维素的能力，利用纤维素这种丰富的自然资源于 新型的生物质能源产业，对缓解人类面临的能源危机将具有重要的意义。已有的研 究表明白蚁需要依靠自身纤维素酶和共生微生物的纤维素酶共同发挥作用来降解 纤维素，但白蚁降解纤维素的复杂机制尚待阐明。为了研究不同种类白蚁降解纤维 素的机制，本文采用d n s 法测定了分别代表低等木食性白蚁、培茵类白蚁和高等 木食性白蚁的黑胸散白蚁、黄翅大白蚁、象白蚁n a s u t i t e r m e ss p 和锯白蚁 m i c r o c e r o t e r m e ss p 四种白蚁及其肠道不同组织部位的内切i s 1 , 4 葡聚糖酶( e g ) 、p 葡萄糖苷酶( b g ) 和外切b 1 ，4 葡聚糖酶( c b h ) 三种纤维素酶活性，并利用 n a t i v e p a g e 技术研究了白蚁肠道不同组织部位的内切b 1 ，4 葡聚糖酶( e g ) 的分 布及多样性。结果表明，在所研究的四种白蚁中，e g 酶的比活力均高于b g 酶和 c b h 酶。虽然不同白蚁三种纤维素酶比活力大小有差异，但最适底物浓度均为1 ， 最适反应p h 值均为p h5 6 ，而最适反应时间为5 m i n 、1 5 m i n 或3 0 m i n ，最适反应 温度在3 5 5 5 之间。黑胸散白蚁e g 酶比活力最高( 7 1 3 1 3 9 u m g ) ，其次为 锯白蚁、黄翅大白蚁和象白蚁。黄翅大白蚁b g 酶比活力最高( 3 3 0 d ：1 7 u r a g ) ，其 次为锯白蚁、黑胸散白蚁和象白蚁。锯白蚁c b h 酶比活力最高( 1 6 7 士1 3 u m g ) ， 其次为黄翅大白蚁、象白蚁和黑胸散白蚁。对四种白蚁肠道不同组织部位的纤维素 酶活测定结果表明，不同种类白蚁、同种白蚁不同组织部位和不同纤维素酶比活力 均有可能有较大差异。对白蚁肠道不同组织部位内切p 1 ，4 葡聚糖酶( e g ) 的 n a t i v e - p a g e 研究表明，e g 酶酶谱具有多样性，每种白蚁肠道的不同部位均有不同 的带型，说明在白蚁不同部位起作用的内切b 1 ，4 葡聚糖酶( e g ) 种类不同，而白 蚁对纤维素的降解是一个复杂的需要多种酶参与的过程。 本文通过对代表低等木食性白蚁、培菌类白蚁和高等木食性白蚁的四种白蚁及 其肠道不同组织部位纤维素酶活性的初步研究，揭示了不同类群白蚁体内三种纤维 素酶的活性及分布等特征，为进一步阐明不同白蚁降解纤维素的机制和开发利用白 蚁来源的纤维素酶于新型的生物质能源产业奠定了基础。 关键词：白蚁；内切- p 1 ，4 葡聚糖酶；外切一p - 1 ，4 - 葡聚糖酶；i s - 葡萄糖苷酶； 酶活；n a t i v e p a g e a b s t r a c t c e l l u l o s ei st h em o s ta b u n d a n tn a r l r a lr e s o u r c eo ne a r t h a so n eo ft h em o s t e 伍c i e n te e l l u l o s ed e c o m p o s e r si nt h en a t u r e t e r m i t e sa r eb e c o m i n gm o r ea n dm o r e a t t r a c t i v ef o rs c i e n t i s t sf o rt h e i rc a p a b i l i t i e st od e g r a d ec e l l u l o s ea n dp o t e n t i a la p p l i c a t i o n i nt h en e wb i o m a s se n e r g yi n d u s t r y i th a sb e e nr e p o r t e dt h a tt e r m i t e sd e g r a d ec e l l u l o s e b yt h eu s eo fb o t hc e l l u l a s e ss e c r e t e db yt h e m s e l v e sa n dt h ec c l l u l a s e so r i g i n a t e df r o m t h e i rg u ts y m b i o t i cm i c r o b e s 啊c c l l u l a s e si n v o l v e di n t h ec e l l u l o s ed e g r a d a t i o ni n c l u d e e n d o - p - 1 ，4 一g l u c a n a s e ( e g ) ，1 3 - l ，4 - g l u c o s i d a s e ( b g ) ， a n d e x o p - 1 ，4 - g l u c a n a s e o r c e l l o b i o h y d r o l a s e ( c b h ) h o w e v e r , t h em e c h a n i s mo fc e l l u l o s ed e g r a d a t i o no ft e r m i t e s a l es t i l ln o tc l e a r t oi l l u m i n a t et h em e c h a n i s mo fe e l l u l o s ed e g r a d a t i o no fd i f f e r e n tt y p e so ft e r m i t e s ， e e l l u l a s ea c t i v i t i e so ff o u rd i f f e r e n tt e r m i t es p e c i e sr e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r , m a c r o t e r m e sb a r n e y il i g h t , n a s u t i t e r m e ss p ，a n dm i c r o c e r o t e r m e ss p a n dt h e i r d i f f e r e n tg u ts e g m e n t sw e r es t u d i e dw i t hd n sa s s a y i na d d i t i o n , t h ed i v e r s i t ya n d d i s t r i b u t i o no fe n d o - p - 1 , 4 - g l u c a n a s ei nd i f f e r e n tg u ts e g m e n t so ft h ef o u rt e r m i t e sw e r e a n a l y z e dw i t hn a t i v e p a g ee l e c t r o p h o r e s e s 1 1 1 e r e s u l t ss h o w e dt h a te n d o - 1 3 1 , 4 g l u c a n a s eh a st h eh i g h e s te n z y m ea c t i v i t i e sa m o n gt h et h r e ec e l l u l a s e si nt h ef o u r s t u d i e dt e r m i t e s d n sa s s a yw i t ht h ec r u d ee n z y m ee x t r a c to b t a i n e df r o mt h ef o u r t e r m i t e ss h o w e dt h a t t h eo p t i m u mr e a c t i o ns u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nf o rt h et h r e ec e l l u l a s e s w a s1 a n dt h eo p t i m u mr e a c t i o np hf o rt h et h r e ee e l l u l a s e sw a s5 6 n 圮o p t i m u m r e a c t i o nt i m ew a s5r a i n , 15m i no r3 0m i nf o rd i f f e r e n te e l l u l a s e se x t r a c t e df r o m d i f f e r e n tt e r m i t e s a n dt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ef o rt h et h r e ec e l l u l a s e sw a sb e t w e e n3 5 t 05 5 a sf o re n d o p l ，4 - g l u c a n a s e ，t h eh i g h e s te n z y m ea c t i v i t y ( 7 1 3 = t = 1 3 9u m g ) w a sf o u n di nt h ec r u d ee x t r a c to b t a i n e df r o m & c h i n e n s i s 。t h en e x tw a sf o u n di nt h a to f m i c r o c e r o t e r m e ss p ，mb a r n e y la n dn a s u t i t e r m e ss p ，r e s p e c t i v e l y mh i g h e s te n z y m e a c t i v i t y ( 3 3 0 1 7 u r a g ) o fp 一1 ，4 一g l u c o s i d a s ew a sf o u n di nt h ec r u d ee 删o b t a i n e d f r o mmb a r n e y i ，a n dt h en e x tw a sf o u n di nt h a to fm i c r o c e r o t e r m e ss p ，兄c h i n e n s i s ， a n dn a s u t i t e r m e ss p ，r e s p e c t i v e l y a sf o re x o - p 一1 ，4 g l u c a n a s e ，t h eh i g h e s te n z y m e a c t i v i t y ( 16 7 士1 3 u m g ) w a sf o u n di nt h ec r u d ee x t r a c to b t a i n e df r o mm i c r o c e r o t e r m e s s p ，w h i l et h en e x tw a sf o u n di nt h a to fmb a r n e y i , n a s u t i t e r m e ss p a n d 足c h i n e n s i s ， r e s p e c t i v e l y t h ee n z y m ea c t i v i t i e so ft h r e ed i f f e r e n tc c l l u l a s e sr e t r i v e df r o md i f f e r e n t g u ts e g m e n t so f 足c h i n e n s i s ，必b a r n e y i ，n a s u t i t e r m e ss p a n dm i c r o c e r o t e r m e ss p w e r e d i f f e r e n tf r o mo i l ea n o t h e r , i n d i c a t i n gt h a tt h ea c i t i v i t i e so fd i f f e r e n tc e l l u l a s e sm a yb e c l o s e l yr e l a t e dt ot h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft e r m i t e sa n dt h ed i s t r i b u t i o no ft h e c e l l u l a s e s i nt h eg u ts e g m e n t s n a t i v e - p a g ee l e c t r o p h o r e s e ss h o w e dt h a tt h e r ew e r e d i f f e r e n te n z y m ea c t i v i t yb a n d sc o r r e s p o n d i n gt oe n d o p 一1 ，4 一g l u c a n a s e st h a td i s t r i b u t e d i nd i f f e r e n tg u ts e g m e n t so ft h ef o u rt e r m i t e s ，i n d i c a t i n gt h a tc e l l u l o s ed e g r a d a t i o ni nt h e t e r m i t eg u ti sac o m p l i c a t e dp r o c e s st h a tn e e d st h ei n v o l v e m e n to fm a n yd i f f e r e n t e e l l u l a s e s t h i ss t u d yc h a r a c t e r i z e dt h ea c t i v i t y , d i v e r s i t ya n dd i s t r i b u t i o no ft h r e ec e l l u l a s e si n t h e g u t so f f o u rd i f f e r e n tt e r m i t e st h a t r e p r e s e n tw o o d - f e e d i n g l o w e rt e r m i t e s ， f u n g u s c u l t i v a t i n g t e r m i t e sa n dw o o d - f e e d i n gh i g h e rt e r m i t e s t h ep r i m a r yr e s u l t s o b t a i n e di nt h i ss t u d yf o r mt h eb a s e sf o rf u r t h e rs t u d i e so nt h em e c h a n i s m so ft h e e e l l u l o s ed e g r a d a t i o ni nd i f f e r e n tt e r m i t e s ，a sw e l la st h ee x p l o i t a t i o na n du t i l i z a t i o no f t e r m i t ec e l l u l a s c si nt h en e wb i o m a s se n e r g yi n d u s t r y k e yw o r d s ：t e r m i t e ；e n d o d 一1 ，4 一g l u c a n a s e ；e x o - p 1 ，4 一g l u c a n a s e ；p - 1 ，4 - g l u c o s i d a s e ； e n z y m ea c t i v i t y ；n a t i v e p a g e 1 1 1 目录 摘要”“一一一一一”一”i a b s t r a c t 1 前言 1 1 1 白蚁的分类l 1 2 白蚁的生物学特性1 1 3 白蚁肠道和肠道共生微生物2 1 4 纤维素和纤维素酶3 1 4 1 纤维素的分子结构和组成3 1 4 2 纤维素酶的组成3 1 4 3 纤维素酶的结构4 1 4 4 纤维素酶的应用”5 1 5 白蚁纤维素酶及相关研究6 1 5 1 白蚁自身分泌的内源性纤维素酶”6 1 5 2 白蚁肠道共生原生动物来源的纤维素酶7 1 5 3 白蚁肠道共生细菌来源的纤维素酶7 1 5 4 白蚁共生真菌来源的纤维素酶8 1 6 白蚁纤维素酶的活性及分布8 1 7 研究目的及意义9 2 实验材料和方法一o o o o o o o o o o b o o o o o ”一1 0 2 1 实验材料10 2 1 1 白蚁的采集与饲养1 0 2 1 2 主要实验仪器”1 0 2 1 3 主要化学试剂1 0 2 2 实验方法1 1 2 2 1 白蚁纤维素酶粗酶液的提取1 1 2 2 2 白蚁肠道不同组织部位纤维素酶粗酶液的提取1 l 2 2 3 蛋白质含量标准曲线及回归方程1 1 2 2 4 葡萄糖标准曲线及回归方程1 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 2 5 内切一d l ，4 _ 葡聚糖酶，p 葡萄糖苷酶，外切一p - 1 ，4 - 葡聚糖酶活性的测定1 2 2 2 6 酶活力单位定义”1 2 2 2 7 白蚁纤维素酶最适反应条件的测定13 2 2 8 白蚁不同组织部位纤维素酶活性的测定1 3 2 2 9n a t i v e - p a g e 电泳技术显示内切p - 1 ，4 葡聚糖酶活性1 3 4 实验结果 1 4 4 1 黑胸散白蚁r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r 体内纤维素酶的活性测定1 4 4 1 1 黑胸散白蚁r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r 纤维素酶粗酶液的提取1 4 4 1 2 蛋白质标准曲线及回归方程的确定”1 4 4 1 3 葡萄糖标准曲线及回归方程的确定1 5 4 1 4 黑胸散白蚁r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r 纤维素酶的最适反应时间1 5 4 1 5 黑胸散白蚁r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r 纤维素酶的最适底物浓度1 6 4 1 6 黑胸散白蚁r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r 纤维素酶的最适反应温度1 7 4 1 7 黑胸散白蚁r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r 纤维素酶的最适反应p h 1 8 4 1 8 黑胸散白蚁r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r 各组织部位纤维素酶活测定1 9 4 1 9 黑胸散白蚁r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r 各组织部位纤维素酶 n a t i v e p a g e 电泳1 9 4 2 黄翅大白蚁m a c r o t e r m e sb a r n e y il i g h t 纤维素酶活性测定”2 0 4 2 1 黄翅大白蚁m a c r o t e r m e sb a r n e y il i g h t 纤维素酶粗酶液制备2 0 4 2 2 蛋白含量的测定及回归方程的确定2 1 4 2 3 葡萄糖标准曲线及回归方程的确定2 2 4 2 4 黄翅大白蚁m a c r o t e r m e sb a r n e y il i g h t 纤维素酶的最适反应时间2 2 4 2 5 黄翅大白蚁m a c r o t e r m e sb a r n e y il i g h t 纤维素酶的最适底物浓度2 3 4 2 6 黄翅大白蚁m a c r o t e r m e sb a r n e y il i g h t 纤维素酶的最适反应温度2 4 4 2 7 黄翅大白蚁m a c r o t e r m e sb a r n e y il i g h t 纤维素酶的最适反应p n ”2 4 4 2 8 黄翅大白蚁m a c r o t e r m e sb a r n e y il i g h t 不同组织部位的纤维素酶活性测定 ”2 5 4 2 9 黄翅大白蚁m a c r o t e r m e sb a r n e y il i g h t 肠道各组织部位e g 酶的种类和分布 “2 6 4 3 象白蚁n a s u t i t e r m e ss p 纤维素酶活性测定2 6 4 3 1 象白蚁n a s u t i t e r m e ss p 纤维素酶粗酶液的提取2 6 4 3 2 蛋白含量的测定及回归方程的确定2 7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 4 3 3 葡萄糖标准曲线及回归方程的确定2 7 4 3 4 象白蚁n a s u t i t e r m e ss p 纤维素酶的最适反应时间”2 8 4 3 5 象白蚁n a s u t i t e r m e ss p 纤维素酶反应的最适底物浓度“2 9 4 3 6 象白蚁n a s u t i t e r m e ss p 纤维素酶的最适反应温度3 0 4 3 7 象白蚁n a s u t i t e r m e ss p 纤维素酶的最适反应p h 3 0 4 3 8 象白蚁n a s u t i t e r m e ss p 各组织部位纤维素酶活测定3 l 4 3 9 象白蚁n a s u t i t e r m e ss p 白蚁肠道不同部位e g 酶的种类和分布3 2 4 4 锯白蚁m i c r o c e r o t e r m e ss p 纤维素酶活性测定“3 2 4 4 1 锯白蚁m i c r o c e r o t e r m e ss p 纤维素酶粗酶液的提取方法3 2 4 4 2 蛋白含量的测定及回归方程的确定3 3 4 4 3 葡萄糖标准曲线及回归方程的确定3 3 4 4 4 锯白蚁m i c r o c e r o t e r m e ss p 纤维素酶的最适反应时间3 4 4 4 5 锯白蚁m i c r o c e r o t e r m e ss p 纤维素酶反应的最适底物浓度3 4 4 4 6 锯白蚁m i c r o c e r o t e r m e ss p 纤维素酶的最适反应温度3 5 4 4 7 锯白蚁m i c r o c e r o t e r m e ss p 纤维素酶的最适反应p h ”3 6 4 4 8 锯白蚁m i c r o c e r o t e r m e ss p 各组织部位纤维素酶活测定3 7 4 4 9 锯白蚁m i c r o c e r o t e r m e ss p 肠道不同部位e g 酶的种类和分布3 7 5 讨论3 9 5 1 纤维素酶活的测定方法3 9 5 2 四种白蚁三种纤维素酶最适反应条件的比较3 9 5 3 四种白蚁肠道及其不同组织部位的纤维素酶活性的比较4 0 5 4 白蚁不同组织部位e g 酶的n a t i v e p l a g e 电泳4 l 参考文献 硕士期间发表的论文 致谢 4 3 4 8 4 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 前言 白蚁是地球上最为古老的社会性昆虫之一，属于节肢动物门( a r t h r o p o d a ) 昆 虫纲( i n s e c t a ) 等翅目( i s o p t e r a ) 。白蚁分布广泛，主要分布于年平均气温在2 2 5 以上的气温带。根据有关资料记载，全世界白蚁种类达3 0 0 0 余种，分属2 8 1 属h 2 1 。 我国白蚁种类也比较丰富，目前统计有5 0 0 余种，主要分布在长江以南的大部分地区 。白蚁和人类生活关系密切，一方面白蚁能够啃食树木、草及富含有机质的土壤 等，危害林木、农作物、建筑，对国民经济造成巨大的损失；另一方面，白蚁及其共 生的鸡枞菌等营养丰富，可以食用，又有一定的药理作用；在热带、亚热带森林中， 白蚁取食、筑巢的过程可以有效加速自然界物质循环、改善土壤理化性质。作为自然 界木质纤维素的天然高效降解者，白蚁纤维素酶及其降解机制的研究对合理利用白蚁 资源和开发新型的生物质能源具有重要意义。 1 1 白蚁的分类 根据白蚁的食性、解剖学特征及系统发生规律等，将白蚁分为低等白蚁和高等 白蚁两大类，二者的区别在于低等白蚁后肠中有共生鞭毛虫，而高等白蚁没有共生 鞭毛虫，低等白蚁包括澳白蚁科( m a s t o t e r m i t i d a e ) 、草白蚁科( h o d o t e r m i t i d a e ) 、 原白蚁科( t e r m o p s i d a e ) 、木白蚁科( k a l o t e r m i t i d a e ) 、齿白蚁科 ( s e r r i t e r m i t i d a e ) 、鼻白蚁科( r h i n o t e r m i t i d a e ) 六个科；高等白蚁中唯一的 一科是白蚁科( t e r m i t i d a e ) ，也是等翅目中最大的一个科嘲。现存最原始的白蚁是 达尔文澳白蚁，现在只在澳大利亚分布，该白蚁在土壤中筑巢，群体很大嘲。食木 性白蚁是白蚁中比较原始的，随后又进化为土食性和培菌类白蚁口1 。食土性白蚁在 热带森林地区分布较广。培菌类白蚁与真菌共生，工蚁负责采集木质碎屑，进行简 单消化排便，在此基础上建立菌圃来培养真菌，而培养出来的真菌又可以供给白蚁 营养需要。白蚁所需要的食物类型和白蚁的种类有很大关系盯。 1 2 白蚁的生物学特性 白蚁是具有高度分工的多型性昆虫，主要营群体生活。白蚁发育经历了卵、幼 虫、若虫、成虫几个阶段，幼虫分化为若虫和工蚁，若虫发育为有翅成虫，成虫分 为原始型和补充型繁殖蚁。工蚁经过进一步发育，或成为成熟工蚁，或蜕变为前兵 蚁、兵蚁；或分化发育为无翅的繁殖蚁，与补充型繁殖蚁作用类似。白蚁有工蚁、 兵蚁和繁殖蚁3 种品级类型，工蚁主要担负采食、喂食等任务，是巢群中数目最大 的一类；兵蚁主要在巢群中起防御和战斗等作用，在其发育过程中，形态结构有很 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 大的变化，尤其是头部和胸部的变化更大。一般情况下一个巢群只有一对原始繁殖 蚁( 分别发育成为蚁后和蚁王) ，主要负责产卵n 们。 1 3 白蚁肠道和肠道共生微生物 白蚁肠道为不对称的螺旋形管状结构，分为前肠、中肠和后肠。前肠主要包括 狭长的食道，膨大的嗉囊和前胃三部分，主要负责摄食、磨碎食物和暂时储藏食物 及部分的消化作用( 当唾液和中肠消化液有倒流时起消化作用) ；中肠是白蚁消化 食物和吸收营养的主要场所；后肠是由肠道瓣前节，肠道瓣、囊形胃、结肠和直肠 组成，主要负责吸收水份和无机盐、排除代谢废物等h 1 。 白蚁及其共生微生物在降解木质纤维素的过程中是协同发挥作用的，被啃食的 木材，经过白蚁前胃骨片磨细后，被送往中肠，前肠和中肠分泌的纤维素酶帮助消 化纤维素，产生的单糖在中肠被白蚁吸收，到达后肠之后，后肠共生微生物分泌的 纤维素酶也可以辅助白蚁降解纤维素，使其被氧化为乙酸、c 0 2 和h 2 ，乙酸作为白 蚁和共生微生物的能量来源f 1 2 j 。 m i d g u t 秽a l b ap 】ii r t 一一一一1 l lr - 。 、麓爹l - = l 丁 。；飞 - - l 4：o5 a a n d i b l e 毒8 2s a l i v a r yg 陋n d $7 3p r o v e n t r i c u l u s 4m i d g u te p i t h e l i u mg 5m 蹦p 磅m a nt u b u l e sp p h r g o s o m e 瞎 l p r a 亡t o d e a - f e e c l i n gc n g u t | 盯n e f p r o t o z o a u 口n o c e l l u l o s e c a r b o h y d r a t e s n ，t r o ；舒n f “珏c o m p o u n d s f o c a ln 、穗n o r 图1 1 低等木食性白蚁肠道木质纤维素消化过程中发生的主要事彳牛【1 2 】 f i 9 1 1m a j o re v e n t si nt h es y m b i o t i cd i g e s t i o no fl i g n o e e l l u l o s eb yw o o d - f e e d i n gl o w e r t e r m i t e s 埘 白蚁肠道共生微生物包括原生动物、细菌和真菌等，白蚁为共生微生物提供了 适宜的生存环境，使共生微生物能正常生长繁殖，共生微生物的代谢活动又为白蚁 提供了营养物质，如共生固氮菌通过固氮作用为白蚁提供氮源；共生原生动物，在 纤维素降解过程中能够产生醋酸纤维及有机酸，为白蚁提供原料和能源；培菌类白 蚁如黄翅大白蚁，与t e r m i t o m y c e s 共生，白蚁建立菌圃培养真菌，巢上的菌圃为白 蚁生存提供了适宜的温度、湿度以及所需要的营养物质；而有研究表明，被木腐菌 寄生过的木材更有利于白蚁取食 1 3 - 1 7 】。 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 4 纤维素和纤维素酶 1 4 1 纤维素的分子结构和组成 木质纤维素是地球上最为丰富的可再生资源，主要包括纤维素、木质素和半纤维 素等n ，其分子结构如图1 2 。纤维素是植物细胞初生细胞壁和藻类的主要结构成分， 是由多个葡萄糖分子通过1 3 - 1 ，4 一糖苷键连接而成的生物多聚体，可以形成有晶体结构 的结晶纤维素和无定形纤维素两种类型，纤维素的的聚合度一般是1 4 0 0 0 左右n 钔。 半纤维素是一类能溶于碱的由1 3 - 1 4 糖苷键和1 3 - 1 ，3 糖苷键连接而成的多聚糖， 其中含量最丰富的是木聚糖n 钆蒯。半纤维素分子量较低，且有分支结构而容易被降解。 木质素是一种无定形、不溶于水的多聚体，苯丙烷为其基本单元，通过醚键和碳一碳 键相连。主要存在于植物细胞壁中，可以对细胞起支持和维持渗透压的作用。木质素的 降解往往被视为自然界碳循环的限速步骤，是一种比纤维素还难降解的高分子化合物。 宁q_铲宁蚺坤爷 c 胡墨i 一e 广飞k 连1 9 x m i c r o f i b r i h翻q 一 撕m 图1 2 木质纤维素的组成删 f i 9 1 2m a j o rc o m p o n e n t so f w o o d s 1 9 】 1 4 2 纤维素酶的组成 纤维素酶的发现最早可追踪至1 j 1 9 0 6 年，s e i l l i e r e 在蜗牛的消化液中发现了这种 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 酶，随后，g r a s s m a n 等( 1 9 3 3 年) 研究了一种真菌纤维素酶，发现该纤维素酶有2 个亚基组成。依据纤维素酶结构和催化作用类型，发现了三种主要的纤维素酶：内 切p - 1 ，4 一葡聚糖酶( e n d o p - 1 ，4 一g l u c a n a s e ，e g ) ，p - 葡萄糖苷酶( p g l u c o s i d a s e s ，b o ) 和外切p 1 ，4 葡聚糖酶( e x o p 1 ，4 ，g l u c a n a s e ，c b h ) ，外切p 1 ，4 葡聚糖酶又包括纤 维二糖水解酶( c e l l o b i o h y d r o l a s e ) 和外葡萄糖水解酶( e x o g l u c o h y d r o l a s e ) 2 种成分。内 切1 3 1 ，4 葡聚糖酶( 简称为e g 酶) 能够随机切开纤维素内部的b 1 ，4 糖苷键；外 切b 1 ，4 葡聚糖酶( 简称为c b h 酶) 从纤维素末端每次切下一个纤维二糖或是葡 萄糖分子，能从微晶结构上分解纤维素长链。1 3 葡萄糖苷酶( 简称为b g 酶) 主要将 纤维二糖及较长的纤维素链水解成葡萄糖【2 i 忽】。纤维素彻底转化为葡萄糖的过程至 少需要上述三种类型的纤维素酶共同发挥作用。通过对氨基酸序列的结构分析，纤 维素酶属于糖基水解酶家族( g l y c o s y lh y d r o l a s e sf a m i l y ) ，简称g h f 四j 。碳水化合 物活性酶数据库( c a r b o h y d r a t ea c t i v ee n z y m e sd a t a b a s e ，c a z yd a t a b a s e ) 显示，糖基水 解酶家族中有1 4 个家族含有纤维素酶，见表1 1 ，一类属于g h f l 的b g 酶和属于g h f 9 的e g 酶均是来自于白蚁自身的纤维素酶【l 】。 1 4 3 纤维素酶的结构 纤维素酶通常包含催化结构域、结合结构域和富含p r o t h r s e r 序列的常见结构。 催化结构域通过糖苷键连接到纤维素酶结合结构域。结合结构域的构象可以影响到 纤维素酶与底物的结合，使纤维素酶催化结构域作用于不溶性底物，逐步使底物( 如 棉花、滤纸等) 表面腐化。大部分植物和动物纤维素酶没有糖苷键连接结构和纤维 素酶结合域，而只有一个催化域。有研究指出，白蚁利用食物泡把纤维素送到纤维 素酶作用位点附近，这样可以弥补纤维素酶结合域的缺失【1 9 】。纤维素酶系统比单个 酶有更高的聚合作用，已经报道了四种形式的协同作用：( i ) 内切一1 3 - 1 ，4 一葡聚糖 酶和外切一b - 1 ，4 一葡聚糖酶的e n d o e x o 协调作用；( ii ) 外切一1 3 - i ，4 一葡聚糖酶间的 e x o - e x o 协调作用；( i i i ) 外切一b - 1 ，4 一葡聚糖酶和b 一葡萄糖苷酶的协调作用，( i v ) 结构域与催化域的分子内协调作用【2 l 】。不同纤维素酶对纤维素的降解位点如图1 3 所示。 4 e 熵伽1 - 4 岣m c a 怕髓 飘弋a - 1 , 4 - 0 l u 铀舶釉 婚菇3 分心写k 名蹴岫舳s 一名嚣才瓢c e o b 晒 a 1 , 4 - g l u c o s i d a s e一 v 吣臻 g l u c o s e 图1 3 纤维素酶对纤维素分子的消化【1 9 l f i 9 1 3e n z y m a t i cd i g e s t i o no fc e l l u l o s e 【1 9 】 表1 1c i a z y 数据库公布的纤维素酶信息f 1 1 t a b l e l 1c e l l u l a s ei n f o r m a t i o nf r o mt h ec a z yd a t a b a s e 1 】 与c b h 不同，c b h 从纤维素分子的还原性末端释放出纤维二糖 1 4 4 纤维素酶的应用 目前，纤维素酶已被广泛应用于很多领域，如工业、污染处理和基因工程等方 面洲。 在食品工业方面，植物经纤维素酶适当处理，细胞壁软化、崩溃，简化了食品 加工工艺，提高了果汁和油脂的提取效率。改善了酱油质量和发酵食品的营养，利 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 于海藻中琼脂的提取等。在酿酒工业方面，纤维素酶通过水解p - l ，3 和p 1 ，4 糖苷键， 在大麦的低级处理和啤酒的过滤净化中起重要作用，可以改良酒的品质和稳定性， 提高出酒率。在动物饲养方面，纤维素酶可以应用于纤维素材料的预处理和改善饲 料的消化性。纤维素酶还可以除去棉织物中的微纤维，使纺织品表面光滑，颜色柔 和瞄】。 1 5 白蚁纤维素酶及相关研究 研究表明白蚁能够消化木材中7 4 9 9 的纤维素 2 5 , 2 6 ，n a k a s h i m a 等人发现了台 湾乳白蚁( c o p t o t e r m e s f o r m o s a n u s ) 的唾液腺和共生原生动物均能分泌纤维素酶，共 同降解纤维素，这种双重作用系统提高了纤维素