（有机化学专业论文）毛细管电色谱整体柱的制备与性能研究.pdf

离伟英博士学位论文：毛缨营电色谮整体挂的镑g 备及性能研究 中文摘要 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o 群a p h y ，c e c ) 是集微径液相色谱和毛 细管电泳的优势于一身的微分离技术。由于商品化的填充柱在技术方面存在许多 问题，毛细管电色谱整体柱以其卓越的性能和简单的制各方法日渐受到关注。 首次以甲基丙烯酸丁酯为单体热引发原位合成了高度交联的带负电的毛细 管整体柱。整体柱有效避免了填装困难，柱子易断，分离时易产生气泡等电色谱 操作中常出现的难题。考察了整体柱在酸性、碱性流动相条件下的稳定性和重复 性。并考察了电压、缓冲溶液的种类、离子强度、p h 和有机添加剂比例对电渗 流的影响。分离了酸性、碱性及烷基苯系列和多环芳烃系列化合物；并对中性化 合物的保留机理作了系统研究。 首次以既有疏水基团又有带电可产生电渗流的羧基的肉桂酸为单体热引发 原位合成了高度交联毛细管整体柱。该整体柱制备方法更为简单。对该整体柱的 性能做了系统研究。 分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n o l o g y ，m i t ) 是一种使所得到的聚合 物的作用点对目标分析物具有预定识别选择性的聚合物制备技术。分子印迹聚合 物( m o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e r , m i p ) 已应用于分离科学。 采用分子印迹技术以4 一氨基毗啶( 4 - a p ) 为印迹分子热引发原位合成了 4 一a p 分子印迹聚合物整体柱。对印迹分子4 - a p 有很好的选择性。本文还考察了 1 i 同条件的流动相列分离的影响，并将分析结果与分析物在空白聚合物整体桂上 的迁移规律对比，对4 - a pm i p 的c e c 识别机理进行了探讨。 以消炎药甲氧苄氨嘧啶为印迹分子，采用热引发原位合成了分子印迹聚合物 毛细管整体柱。通过电色谱表征了m i p 对甲氧苄氨嘧啶的特殊选择性。并考察 了不同条件的流动相对分离的影响。 关键词：整体柱，毛细管电色谱，分子印迹聚合物，甲基丙烯酸丁酯，肉桂酸 4 氨基吡啶，甲氧苄氨嘧啶 闫伟英麟士学位论文：毛鲤 管电色潜整体拄曲勘备及性能研究 p r e p a r a t i o n a n de v a l u a t i o no fm o n o l i t h i c c a p i l l a r y c o l u m n si nc a p i l l a r y e l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y b yw e i y i n g y a n f o rt h ed e g r e e o f p h i l o s o p h yd o c t o r a tn a n k a i u n i v e r s i t y a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ( c e c ) i sam i c r o - s e p a r a t i o nt e c h n i q u et h a t c o m b i n e st h es t r e n g t ho fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa n dl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t h e r e a r ean u m b e ro fd r a w b a c k sa s s o c i a t e dw i t h p a c k e dc o l u m n s t h u s ，m o n o l i t h i c c a p i l l a r y c o l u m no b t a i n e dm o r ea t t e n t i o nf o ri t s s i m p l ep r e p a r a t i o n a n dg o o d p e r f o r m a n c e as h o r ta n dh i g h l yc r o s s l i n k e d b u t y lm e t h a e r y l a t eb a s e dn e g a t i v ec h a r g e d m o n o l i t h i cc o l u m nw a s p r e p a r e db y i ns i t ut h e r m a li n i t i a t e dp o l y m e r i z a t i o nf i r s tt i m e t h em o n o l i t h i cc o l u m na v o i d e dt h ep r o b l e m ss u c ha s ：l a b o r - s o m e p a c k i n g ，f l i t p r e p a r a t i o n ，f r a g i l eo ft h ef l i t s ，g a sb u b b l e sf o r m a t i o nt h a ta l w a y se n c o u n t e r e d i n p a c k e dc o l u m n t h er e p r o d u c i b i l i t yo f t h ec o l u n mi nt h eb u f f e rw i t hv e r ye x t r e m ep h v a l u ew a si n v e s t i g a t e d m o r e o v e r , t h ee f f e c t so ft h eo p e r a t i o n a lp a r a m e t e r ss u c ha s ， a p p l i e dv o l t a g e ，s a l tc o n c e n t r a t i o n ，p ha n do r g a n i cm o d i f i e rc o n t e n ti n t h em o b i l e p h a s e o ne o et h es e p a r a t i o no fa c i d i c o rb a s i co rn e u t r a l c o m p o u n d sw e r e p e r f o r m e d r e t e n t i o nm e c h a n i s mo f s m a l ln e u t r a lc o m p o u n d so ns u c hac o l u m nw a s s t u d i e d a h i g h l yc r o s s l i n k e dm o n o l i t h i cc o l u m nw i t hc i n n a m i ca c i da sm o n o m e r w a s p r e p a r e db yi ns i t ut h e r m a li n i t i a t e dp o l y m e r i z a t i o n f i r s tt i m e t h em o n o m e rh a st w o f u n c t i o n a lg r o u p s ：p h e n y lg r o u pf o rh y d r o p h o b i cr e c o g n i t i o n ，c a r b o x y l i cg r o u pt o g e n a r a t ee o f t h ep r e p a r a t i o nm e t h o d i ss i m p l e t h ep e r f o r m a n c eo ft h ec o l u m nw a s i n v e s t i g a t e ds y s t e m a t i c a l l y m o l e c u l a ri m p r i n t i n gi sa t e c h n i q u eu s e df o rp r e p a r i n gp o l y m e r sw i t hs y n t h e t i c r e c o g n i t i o n s i t e s h a v i n g a p r e d e t e r m i n e ds e l e c t i v i t y f o r a n a l y t e ( s ) o f i n t e r e s t m o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e r ( m i p ) w a sa l r e a d yb e e nu s e di ns e p a r a t i o ns c i e n c e 塑笙垄翌兰兰竺i 丝：要型望! 丝鬯壁垄丝堂丝丝竺! 翌! 一 一一 t h e 4 - a m i n o p y r i d i n e ( 4 一a p ) m o l e c u l a ri m p r i n t e d p o l y m e r b a s e d m o n o l i t h c a p i l l a r yc o l u m nw a sp r e p a r e db yi n s i t ut h e r m a l i n i t i a t e dp o l y m e r i z a t i o np r o c e s s 。 r e s u i t ss h o w e dt h a tt h e4 - a pm i ph a dg o o dr e c o g n i t i o no f4 - a rt h ee f f e c t o f m o b i l e p h a s e o n s e p a r a t i o n w a si n v e s t i g a t e d a c c o r d i n gt oc o m p a r i s o n o ft h e m i g r a t i o no f s o l u t e so nab l a n kp o l y m e rb a s e dc o l u m n ，t h em e c h a n i s m o f r e c o g r i i t i o n o f4 a pm i pb yc e cw a sd i s c u s s e d u s i n gt r i m e t h o p r i m ( t m p ) ，a l l a n t i - i n f l a m m a t i o nd r u g ，a si m p r i n t i n gm o l e c u l e ，a m i pb a s e dm o n o l i t h i cc o l u m nw a s p r e p a r e db y i ns i t ut h e r m a li n i t i a t e d p o l y m e r i z a t i o np r o c e s s t h es p e c i f i cs e l e c t i v i t yo f t h em i pt ot m pw a se v a l u a t e db y c e c t h ee f f e c to f m o b i l ep h a s eo nt h es e p a r a t i o nw a si n v e s t i g a t e d k e y w o r d s ：m o n o l i t hc a p i l l a r yc o l u m n ，e l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y , m o l e c u l a ri m p r i n t e d p o l y m e r , b u t y lm e t h a c r y l a t e ，c i n n a m i ea c i d ，4 - a m i n o p y r i d i n e ，t r i m e t h o p r i m 4 锖一。章有桃聚e 物毛锄营电毡谱整体挂研究进展 第一部分 有机聚合物毛细管电色谱 整体柱的制备及性能研究 5 第一章寿机象台物毛细酱屯色潜整体拄研究进展 第一章有机聚合物毛细管电色谱整体柱 研究进展 1 1 前言 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ，c e c ) 是集微径液相色谱和毛 细管区带电泳的特征为一体的微分离技术，既有电泳的高效性又有高效液相色谱 的高选择性。而且c e c 分离对试剂的消耗量小，既有可观经济效益，又符合当 前绿色化学的潮流，所以c e c 分离技术越来越受到诸多科学家的高度关注。 世界上有许多研究小组用不同的方法制备毛细管柱。首先提到的填充柱 ( p a c k e dc o l u m n ) 是继承了高效液相色谱( h p l c ) 技术发展而来的。例如，与液 相色谱极为相似的“硬件”、塞子、填料。c e c 毛细管柱中填充的多半是商品 化的专为h p l c 设计的硅球。但是，作为c e c 的填料必须有两个功能：( 1 ) 提 供色谱识别的作用位点：( 2 ) 能够产生电渗流。因此，有些h p l c 填料根本不能 用于c e c 分离模式。c e c 与h p l c 的这一不同促使人们寻找适合c e c 的填料 和填装技术。 成功制备一根填充柱需3 步完成【l ，2 l ：( 1 ) 在毛细管一端制造一个塞子；( 2 ) 将填料颗粒填入管中；( 3 ) 在另一端制造塞子。这需要相当好的技术和经验。因 为塞子必须能阻止填料漏出，同时允许流体通过。塞子部位往往易产生气泡，流 体就不连续，造成电流断开f 3 】，也就是我们平时说的烧干。用在毛细管两端加压 的办法可以防止气泡产生，但设备会随之变得复杂【4 】。 填充柱在技术上遇到的困难也促使了其它毛细管柱制备技术的发展【5 j 。如 开管柱( o p e n t u b u l a rc o l u m n ) 7 】、整体柱( m o n o l i t h i cc o l u m n ) 限9 1 。特别是毛细管 整体柱由于其卓越的性质和简单的制备方法而倍受关注。所谓整体柱，又称为连 续床层( c o n t i n u o u sb e d ) 、无柱塞柱( f r i t l e s sc o l u m n ) ，是一种用有机或无机聚合 方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相。这种色谱柱制各方法简单。例如， 有机聚合物整体柱的制备，只需把配制好的单体、添加剂、致孔剂和引发剂等混 合物装入空的毛细管内，经过一段时间的聚合反应之后就成为整体柱( 图l - 1 ) 。 第一章寿桃聚台物毛细管电色馨按馋拄磺究进髓 制备毛细管整体柱( m o n o l i t h i cc a p i l l a r yc o l u m n ) 只需要简单的聚合过程。避免 了制造塞子和填装等过程中可能出现的问题。并且可以将毛细管截成任意长度。 还可以使用不同的单体从而得到具有不同基质和表面化学的柱材料。 图1 - 1 毛细管整体丰j ：f i 句制备示意幽 f i g u r e1 - 1s c h e m a t i c sf o rt h ep r e p a r a t i o no f m o n o l i t h i cc a p i l l a r yc o l u m n s 二十世纪6 0 年代后期k u b i n i 】首次使用膨胀性较强的聚( 2 羟乙基甲基丙 烯酸酯) 凝胶代替多糖凝胶制备了有机聚合物毛细管整体柱，用做低压体积排阻 色谱的固定相分离蛋白质，但是这种整体柱渗透性太差，难以在实际中使用。在 7 0 年代初r o s s l l l - 1 4 1 等人使用有孔的聚氯酯泡沫做气相色谱和液相色谱的固定 相，但是这类固定相太易膨润，而且在一些溶剂中易软化，未能得到实际应用。 8 0 年代末9 0 年代初瑞典乌普萨拉( u p p s a l a ) 大学的h j e r t n 实验室系统地 研究了常规液相色谱和微径液相色谱使用的整体柱 1 “旧1 。9 0 年代以后h j e r t 6 n 实 验室对c e c 上使用的整体柱进行了大量的研究。与此同时有许多知名的色谱专 家也进行了各种模式、各种类型整体柱的研究，如日本的f u j i m o t o 及其合作者、 美国f r 6 c h e t 小组的s v e c 、p e t e r s 等人、美国斯坦福大学的z a r e 等人、美国耶鲁 大学的h o r v d t t h 小组、美国俄勒冈州立大学的c h i r i c a 和r e m c h o 、瑞典l u n d 大 学的n i l s s o n 小组及我国大连化物所的邹汉法等人。9 0 年代以后的整体柱大都是 针对c e c 的。目前整体柱的主要类型有：有机聚合物整体柱、原位溶胶一凝胶整 第一章有规聚合物毛细管电色谱整体拄研究进展 体柱1 2 0 - 2 5 、硅胶粒子烧结的整体柱2 6 , 2 7 、粒子截留整体柱泌3 ”。迄今已经制各了 反相、正相和离子模式以及手性毛细管电色谱整体柱。本文将对有机聚合物基质 的毛细管整体柱的特点、制备方法、应用及柱评价方法等方面进行评述。 1 2 几种类型的有机聚合物整体柱 有机聚合物整体柱所用的聚合物十分集中，主要是聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯 酸酯和聚苯乙烯、手性、分子印迹聚合物整体柱，下面将分别进行评述。 1 2 1 以丙烯酰胺为基质的有机聚合物整体柱 1 9 9 5 年f u j i m o t o 【3 8 - 4 1 1 进行聚丙烯酰胺毛细管电色谱整体柱的研究。他们使 用丙烯酰胺，亚甲基二丙烯酰胺和2 一丙烯酰胺一2 一甲基1 丙磺酸混合物在毛细管 柱内进行聚合，虽然管壁没有衍生，但具有很好的稳定性。这种色谱柱的柱效达 1 5 0 0 0 0 p l a t e s m ，但是保留时间太长，要比一般毛细管电色谱柱长十倍。另一方 面f u j i m o t o 用疏水性强的n 异丙基丙烯酰胺代替亲水性的丙烯酰胺，并且把毛 细管壁用双官能团试剂3 ( 三甲氧硅烷基) 甲基丙烯酸酯处理，其官能团与管 壁以菸价键相结合，该化合物的可聚合基团与交联剂聚合，从而使凝胶结合到管 壁上。用缓冲溶液乙腈做流动相可以分离疏水性混合物，这种色谱柱柱效高、 保留时间也短，具有反相色谱的特点。 1 9 9 6 年h j e r t 6 n 研究组【4 2 1 进行了水溶性丙烯酰胺制备整体柱的研究，其聚合 的混合物包括：丙烯酰胺水溶液，哌嗪二丙烯酰胺，、乙烯基磺酸。为了使生成的 整体柱具有疏水性，往聚合混合物中加入甲基丙烯酸十八烷基酯或甲基丙烯酸正 丁酯。因为后者是疏水性物质，和前面的水溶性混合物成两相，所以要加入表面 活性剂进行超声处理，形成乳浊液，在加入引发剂之后注入毛细管柱中进行聚合 反应。得到的整体柱可以很好地分离5 个多环芳烃( p a h s ) 。利用这一整体柱进 行梯度洗脱，可以大大改善分离情况。h j e r t 6 n 4 3 1 还尝试了一种两步聚合的方法， 第步，在内径2 5 t t m 衍生过的毛细管内，注入聚合液反应生成丙烯酰胺聚合物 第一章稳机最台物毛鳓管电也罐整肄柱硎究进艘 基质，第二步聚合反应引入葡聚糖的硫酸盐，使c e c 分离时产生电渗流，随后 将得到的整体柱以疏水试剂( c 1 8 ) 衍生。所得整体柱用于反相c e c 分离p a h s 时 柱效高达1 2 0 0 0 0 p l a t e s m 。后来，他们还通过两步聚合在基质上引入不同量的二 甲基二烯丙基氯化铵( d i m e t h y l d i a l l y l a m m o n i u mc h l o r i d e ) 来控制正极电渗流的 大小，以达到不同的分离目的【4 4 j 。 最近，h o e g g e r 和f r e i t a g 【4 5 】用一系列不同链长的单体制备聚酰胺整体柱。其 使用的单体包括甲基丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、丙烯酸丁酯和丙烯酸己酯，哌 嗪二乙酰胺为交联剂，乙烯基磺酸作为带电单体( 电荷提供者) ，以水溶液或甲 酰胺与水的混合液作为溶剂。色谱分离可通过控制条件以纯反相或纯正相模式进 行。 p a l m 和n o v o t n y 等【4 6 】把高疏水性基团结合到聚丙烯酰胺基质中，使用缓冲 溶液和n 一甲基甲酰胺作为溶剂，亚甲基二丙烯酰胺为交联剂，丙烯酸和c n ，c 6 或c 1 2 甲基丙烯酸烷基酯为单体，聚合相的总浓度控制在5 ，混合物中含有6 0 的二丙烯酰胺，1 0 的丙烯酸，其它3 0 是丙烯酰胺和不同的疏水性单体。混合 溶剂的组成决定于甲基丙烯酸烷基酯的类型，n 甲基甲酰胺的浓度可从5 0 ( 用 于甲基丙烯酸丁酯) 改变到9 5 ( 用于甲基丙烯酸十二烷基酯) 。这种整体柱只 有把聚乙二醇( m r = 1 0 0 0 0 ) 加入到聚合混合物中爿能得到商柱效，聚l s - 醇的 作用是让丙烯酰胺链有侧向凝聚的作用，从而使整体柱具有多孔性。这一系统通 常以过氧化硫酸赫、t e m e d ( n ，n ，n ，n 、四甲基乙二胺) 作引发剂进行聚 合，硫酸铵作为致孔剂，得到的整体柱呈不透明的多孔聚合物，在聚合完成之后 用电渗流把多余的聚乙二醇冲洗出去。这一制备整体柱的方法具有很好的重复 性，它们都含有丙烯酸烷基酯，因而都具有反相色谱的特点。用苯基酮作模型化 合物测定其柱效达3 0 0 0 0 0 - - - 4 0 0 0 0 0 p l a t e s m 。这类色谱柱有很强的承受超载的能 力，但是峰形会拖尾。使用这种色谱柱分离芳香酮，分析时间不到5 r a i n 。他们 还用此柱分离了低聚糖。在2 0 0 0 年他们又利用在聚合物混合液中加入丙烯酸十 二烷基酯和乙烯基磺酸求制各骷负1 1 = i 的疏水性整体柱填利用r 反相模式：或者在 聚合物混合液中加入a e t m s ：( 2 - ( a c r y l o y l o x y ) 一e t h y l 】t r i m e t h y l a n n o n i u m m e t h y ls u l f a t e ) 和a p v e ( 3 a m i n o 1 p r o p a n o l v i n y le t l l e r ) 来制各带正电的氨基整 体柱填料用于正相模式来分析胆汁酸及其结合物【4 “a 耩一章有机聚台物毛粕管电色谱整体桂诤 究进艟 1 2 2 聚苯乙烯为基质的有机聚合物整体柱 聚苯乙烯类整体柱使用的单体种类较少，目前所使用的单体仅为苯乙烯、 2 2 乙烯基苯。例如h o r v h t h 的研究小组把氯甲基苯乙烯，二乙烯基苯和偶氮异丁 ，、 腈混合，加入各种致孔剂( 如甲醇、乙醇、丙醇和甲苯等) 和甲酰胺，装入经硅 烷化衍生的毛细管中进行聚合，得到的整体柱具有典型的多孔结构，这种大孔包 含在薄薄的明显无孔的聚合物结构中，并将氯甲基进行柱上衍生，和n ，n 一二 甲基辛胺或n ，n 一二甲基丁胺 4 9 1 反应，在固定相中引入季胺基团，使整体柱 的表面具有正电荷，可以分离碱性和酸性多肽。 张玉奎等人【5 0 】制备了聚( 苯乙烯二乙烯基苯甲基丙烯酸) 共聚物整体柱， 系统地研究了操作参数如i u 压、电解液、有机改性剂对电渗流的影】j 吼并证实中 性化合物的电色谱分离机趔和反相液相色谱类似。 1 2 3 甲基丙烯酸酯为基质的有机聚合物整体柱 f r c h e t 等人是制备这一类整体柱的代表人物，他们将90 年代初研究h p l c 整体柱的经验 s u 2 l 用于c e c ，对制备出来的毛细管整体柱形态和组成及性能进 行了评价 5 3 - 5 8 t 。制备这类整体柱时【5 5 1 ，石英毛细管不需要经过硅烷化处理，只 要把聚合相混合( 二甲基丙烯酸乙烯酯4 0 ，甲基丙烯酸丁酯5 9 7 ，2 一丙烯 酰胺一2 一甲基一l 一丙磺酸o 3 ) ，并且在聚合相混合物中加入致孔剂和自由 基聚合引发剂，如过氧化苯甲酰、偶氮二异丁腈，用注射器灌入毛细管中，以热 源( 水浴) 引发自由基聚合，形成刚性多7 l 聚合物整体柱。聚合完成后把致孔剂 冲洗除去( 使用泵或电渗流) 。在聚合过程中所加致孔剂的种类和比例对整体柱 有很大的影响，经过充分的研究开发出一类三元致孔剂体系( 水，正丙醇，1 ，4 一。t 二醇) 。使用这一致孔剂体系并用紫外光引发聚合制备出的整体柱，分离多 环芳烃柱效可以达到2 1 0 0 0 0 p l a t c s m ，几乎是热聚合方法制备的整体柱的两倍 5 8 1 。 近来该小组又制各了一种离子交换和j 附日模式的挫体柱”。吼十：二醇和环 己醇为致孔剂，柱效高达2 3 1 0 0 0 p l a t e s m 。 o 臻一牵套机聚台铅毛锄管电色蒋蝗协柱讲究进醺 z h a n 9 1 6 0 l 等人以甲基丙烯酸缩水目油酯和甲基丙烯酸甲酯为单体，乙二醇二 甲基丙烯酸酯为交联剂，丙醇和甲酰胺为溶剂，在硅烷化衍生的毛细管内原位聚 合，利用基质上的环氧基与n 乙基丁胺反应，使得聚合物既有疏水作用，又带 有正电荷，c e c 分离时产生指向正极的电渗流，有效避免了蛋白质被固定相吸 附。在p h 2 5 的水乙腈体系中，分离了蛋白质和多肽。 甲基丙烯酸酯基整体柱即使是在极端p h 条件下，例如p h 为2 或1 2 下也 是稳定的，这种情况使用硅胶填料是绝对做不到的。 1 2 4 手性有机聚合物整体柱 p e t e r s 等【6 1 1 以2 一羟基乙基异丁烯酸l 缬氨酸一3 ，5 二甲基苯胺) 氨基 甲酸酯为手性单体及甲基丙烯酸缩水甘汕酯等物质制成刚性整体刷型手性固定 相实现了对n ( 3 ，5 二硝基苯甲酰基) 亮氨酸二烯丙基酰胺对映体的拆分，显示 了其独特的高效性和选择性。以乙腈磷酸盐缓冲浴液为流动相，加压0 2 m p a 分 离刺映体，塔板数达6 1 0 0 0 p l a t e s m ，分离度为2 0 。该法的特点是引入手性单体，不 需事先对毛细管壁进行处理；通过选择合适的溶剂，并精确控制聚合成分的组成 以调节渗透性。 其后，该小组【6 2 制1 又利用共聚奎尼定氨基甲酸酯形成整体柱的方法来进行手 性分离。聚合混合物包括手性单体、共聚单体、交联剂、致孔剂、引发剂。考察 了影响c e c 分离度和柱效的因素，例如洗脱液组成、离子强度。对2 ，4 - 二硝基 苯衍生的氨基酸的分离柱效达到2 5 0 0 0 0 p l a t e s m 。 k o i d e 6 5 - 6 7 等人将b 一环糊精用烯丙基异氰酸酯衍生后作为手性单体和丙烯 酰胺、交联剂b i s ( n ，n m e t h y l r e n e b i s a c r y l a m i d ) 以及a m p s 等的水溶液制备了带 负电的b 一环糊精手性整体柱成功分离了萘乙醇、扁桃酸甲酯和氨基醇、萘乙胺 等碱性物质的对映体。他们还以类似方法制备了带正电的p 一环糊精聚酰胺整体柱 ( 6 8 , 6 9 1 ，成功分离了丹酰化氨基酸、华法林等带正电的对欧体和安息香、萘乙醇。 后来，该小组又以衍生的冠醚为手性单体【7 0 】，制备了带负电的手性聚酰胺整体 柱，并成功分离了手性伯胺对映体。 蒋一章南机聚台物毛细营电色谱整体柱研究进艟 i 2 5 分子印迹聚合物整体柱 ( 有关此节的详细内容，请阅读第二部分第四章以分子印迹聚合物为基质的毛细 管电色谱柱的制备部分) 1 3 整体柱的评价 1 3 1 整体柱的多孔性 整体柱不能象填充柱一样以颗粒大小来表征其物理性质，而是用孔隙率来表 征。贯穿整体柱的孔隙不仅可以允许流体通过，而且已有初步研究表明，孔隙结 构影响柱效等整体柱的色谱性能呻。因此对整体柱孔隙结构的测定非常重要。 测量孔径及其分布的标准方法为压汞法和氮吸附法。但都是在毛细管干燥 的条件下测定的，而c e c 操作一般均是在毛细管溶剂化状态下进行的。尽管如此， 由于干燥状态下测定的毛细管的孔隙性质数据与色谱性能有相关性，所以这些方 法仍在使用。 对充满流动相的整体柱中填料的孔隙结构进行评价的方法共有三种：其一 为流动法( 采用u - h p l c 系统) ，其二为电导率测定法( c e c 操作条件一f ) ，最后 一种为重量分析法。流动法采用一种示踪物去探测固定相的颗粒内部以及缝隙间 的空间。具体过程为：流动相流速由u h p l c 系统利用示踪物来测定，同时测定 体积流速，总孔径e ，按文献方法计算可得”“。当多孔固定相不导电时，可采用 测定电导率的方法对整体柱总孔径进行估算。该法的具体过程为：分别将整体柱 和空管充满合适的电解质溶液，测定各自的电导率，然后通过计算得到电导率比 率的值。表i - i 中列出了最常用的表示电导率比率与孔径关系的方程式“8 i 。最后 一种方法为重量分析法，由干燥状念下和充满丙酮时色谱柱的重量差计算孔径。 铭一章赢枫聚台物毛钢管电色谱整体拄研究进程 表卜1 电导率比率由与总孔径e ，的关系 方法方程式 t o b i a s 法 也58 t l 5 a r c h i e 法巾= er 3 w y l i e 法 巾= e 一2 h u m b l e 法巾= 1 6 1 3 。2 ” s l a w i n s k j 法( b = e 、( 1 1 3 2 1 9 - 0 3 2 1 9 1 ) 2 1 3 2 孔径的控制 美国加里福尼亚大学伯克利( b e r k e le y ) 分校的f r 6 c h e t 研究组”“自9 0 年代以来一直从事各种模式的整体柱的研究，他们对聚甲基丙烯酸酯类的毛细管 整体柱的孔结构和孔径大小进行了比较深入的研究，并在整体柱多孔性的控制方 法上取得了很大进展。他们开发的三元致孔剂只须调节致孔剂中正丙醇与1 ，4 丁二醇的相对含量，就可以在很宽的范围内( 2 5 0 1 3 0 0 n m ) 控制该类整体柱的 多孔性能。 对填充柱来说，c e c 和h p l c 一样，柱效均随着填料粒度的减小而增加。但 对整体柱来说，与柱效相关的则是柱中孔径的大小。s v e c 等人在分离硫脲及烷 基苯混合物考察整体柱柱效时发现，在孔径4 5 0 h m 及5 5 0 - 7 5 0 h m 范围分别出现 了两个柱效极大点。尽管整体柱的孔径与柱效之间并无简单的关系，但仍能提供 一些有用的信息。文献中常常通过测定不保留物质的柱效来作为评价柱质量的方 法。当硫脲作为不保留标记物时，孔径分别为7 5 0 和4 6 0 n t o 的整体柱具有相似 的柱效，分别为11 0 0 0 0 和9 9 0 0 0 p l a t e s m 。但考察保留性更强的戊苯时，这两根 柱的柱效却显示了非常明显的差异，分别为3 4 0 0 0 和9 1 0 0 0 p l a t e s m ，并且后者 的柱效值与按硫脲计算得到的桂效值非常接近。毫无疑问用实际保留峰的柱效来 评价分离效果更准确。因此精细控制孔径有助于精确控制聚合物的色谱性能a c h i r i c a 等人提出了一种控制孔径的新方法”“。他们的思路是利用二氧化硅 小球作为牺牲材料，形成多孔模板来定制多孔性。这一概念是由j o h n s o n 等人提 出来的”。具体的操作可分为四步：( 1 ) 毛细管壁的硅烷化；( 2 ) 匀浆法填充硅 凳一蕈有扫t 聚台物毛缅管t 毡色避整体牲研究进醚 胶球；( 3 ) 向毛细管内灌注聚合物混合液，原位合成有机基质聚合物；( 4 ) 聚合 反应完成后，将整体柱与注射泵连接，加压至2 0 0 p s i ，以5 0 c m h 的流速驱动 n a o h 溶液冲洗2 4 , - - 4 8 h ，慢慢将二氧化硅小球溶解。电镜照片显示该整体柱具有 均匀的多孔性，并在c e c 模式下分离了多环芳烃，用u h p l c 系统分离多肽和 蛋白质混合物，均取得满意的结果。 1 3 3 表面化学的控制 1 3 3 1 带电荷基团的影响 电渗流的速率与z e t a 电势成正比，因而也与表面电荷有关。与硅胶基质的 c e c 填料不同的是，有机聚合物整体柱中提供电渗流的带电基团的多少和电性是 易于控制的。具体地醣，表面电荷密度和组成可通过改变聚合混合物中带电单体 的比例来控制，这也是聚合物毛细管整体柱的一个主要的优势：可根据需要，通 过添加带电单体来控制整体柱基质表面的电荷数量和种类。f u j i m o t o 在研究交联 聚丙烯酰胺凝胶和交联聚n 一异丙基丙烯酰胺中均观察到：随a m p s 单体含量的增 加，电渗流速度线性增加。与此相似的是，甲基丙烯酸酯型整体柱中，增加磺酸 基的含量能显著增加流速，减少分析时间。目前，通常用作产生负电荷的带电单 体有：a m p s 、乙烯基磺酸、甲基丙烯酸( m a a ) ，c e c 分离时产生向阴极的电 渗流；可产生正电荷的带电单体有：a e t m s ( 2 - ( a e r y l o y l o x y ) 一e t h y l 】 t r i m e t h y l a r m o n i u mm e t h y ls u l f a t e ) 等，c e c 分离时产生向阳极的电渗流。另外， 也可以通过柱上衍生来改变聚合物的表面化学，如疏水性、电性等。 l - 3 3 2 保留与选择性 大部分报道的c e c 操作采用反相模式，因而固定相的疏水性决定了分离的选 择性，保留也可以通过调整流动相的比例，或是通过改变固定相表面的疏水性来 控制。改变流动相比例的方法很容易实现，但是与h p l c 中所使用的丰富的溶剂 种类相比，由于乙腈的高介电常数及低粘度，大多数c e c 中常使用乙腈为基础的 溶剂系统。到目前为止，预制固定相的表面化学的工作开展的还很少。p a l m 和 n o v o t n y 制备了一系列单体由不同链长烷基构成的整体柱，但是在比较实验中无 第一章有机聚合物毛蓟管电色谱整体拄研究避艘 法证明何种链长的单体具有更高的柱效“。 n g o l a 和s h e d i a c 等人通过改变聚合物中的丙烯酸酯的酯基碳链的长度来调 节整体柱的疏水性，同时添加a m p s 或a e t m s 使整体柱带有负电或正电致 使c e c 分离时产生不同方向的电渗流【7 4 , 7 5 。 1 4 有机聚合物毛细管电色谱整体柱的应用 目前，有枫聚合物毛细管电色谱整体柱已成功用于反相色谱、离子交换色 谱、f 相色谱、体积排阻色谱等分离模式，并成功分离了芳烃、氨基酸、手性物 质、多肽和蛋白质等物质。具体内容请参见表l - 2 。 表1 2 有机聚合物毛细管控体柱的制备及应用 c h ir a i( + 1 一t e t r a a l l y l 】8 - c r o w n _ 6e a r b o x y l a t e b i sa m p sp r i m a r ya m i n o 7 0 a ac o m p o u n d s r c v e r s e - p h a s e a h e a 。b a ，l a d a b m a ao rv s aa l k y lp h e n o n e s ， 4 6 o l i g o s a e e h a r i d e 第一章甫执聚e 物毛镪彗电色谱整体柱研究进震 d v bm a ap h e n o l sc h l o r o b e l l 揩n e s 5 n a ri i i l l e w , p h e n y l e n c d i a m m c ， a l k y l b c n z e n e $ e e v e m e d d h a s eb m ae d m aa m p sa i k y l b e n z c n e s ， 5 5 - 5 8 ，7 7 p o l y s t y 他n e s i z e - e x c l u s l o n 川时la c r y l a t e b d d a a m p s ，o r a e t m s a m i n oa c i d p e p t i d e s7 4 - 5 p a h s a b b r e v i a t i o n ：g m a ：g l y c i d y lm e t h a e r y l a t e ；m m a ：m e t h y lm e t h a c r y l a t e ；e g d m a ：e t h y l e n e g l y c o ld i m e t h a c r y l a t e ；s ：s t y r e n e ：b m a ：b u t y lm e t h a c r y i a t e ；, v b c ：v l n y l b e n z e n ec h l o r i d e ；d v b ： d i v i n y l b e n z e n e ；h e m a ：2 - h y d r o x y e t h y l m e t h a c r y l a t e ；e d m a ：e t h y l e n e d i m e t h a c r y l a t e ； d m a e m a ：2 - d i m e t h y l a m i n o e t h y lm e t h a c r y l a t e ； a m p s ：2 - a c r y l a m i d o - 2 - m e t h y l - 1 一p r o p a n e s u l f o n i ca c i d ； a c 一8 c d ：a l l y lc a r b m o y l a t e d , 8 - c y c l o d e x t r i n ； a a ：a c r y l a m i d e ；b i s ：n ，n - m e t h y l e n e b i s a c r y ! a m i d e ；p d a ：p i p e r a z i n e d i a c r y i a m i d e ； d m a a ：d i m e t h y l a c r y l a m i d e ；h e a ：h e x y l a c r y l a t e ；b a ：b u t y l a c r y i a t e ；v s a ：v i n y i s u l f o n i ca c i d ； d a a ：b i s a c r y l a m i d e ；t r i m ：t r i m e t h y l o l p r o p a n et r i m e t h y l a c r y l a t e ；m a a ：m e t h a c r y l i c a c i d ； b d d a ：i ，3 - b u t a n e d i o ld i a c r y l a t e ；l a ：l a u r y la c r y l a t e ； a e t m s ：【2 - ( a c r y t o y l o x y ) e t h y i 】t r i m e t h y l a n n o n j u mm e t h y l s u l f a t e ； a p v e ：3 - a m l n o 1 一p r o p a n o l v i n y le t h e r 1 5 展望 毛细管电色谱整体柱作为一种新型的分离介质由于具有制备简单、无需制作 6 第一章南枫聚合物毛镪管电色谱整体挂研究进曩 柱塞、重复性好等特点，必将在分离分析领域中扮演越来越重要的角色。分析化 学家j i mj o r g e n s o n 曾预测“当色谱就像b i l lg a t e s 的计算机一样存在于每个家 庭中时，它的心脏一定会是c e c ”【7 8 】。如果这个预言能在不久的未来实现的话， 其推动力必定是毛细管整体柱。随着微制造技术的发展，芯片集成电泳因具有集 成与高效的特点而迅速地发展起来。由于有机整体聚合物所具有的独特优势，其 在：矗片集成毛细管电色潜的发展中也具有巨大潜力。 整体柱还具有可控制孔径的优点，这一点在生物大分子的分离中具有一定的 优势，是今后的一个发展方向。分子印迹与毛细管攘体柱的结合，通过分子印迹 制得的m i p 对印迹分子的立体结构具有“记忆”功能，这种预定的对映体选择 性是传统的手性固定相所不具备的，因而在手性药物分析方面具有很大的潜力。 总之，随着毛细管整体柱制柱技术的完善，将会加速c e c 技术的普及。 生二：篁翌丝墨曼! 丝重堑! 篓生鱼壁望丝兰垫竺坚莲壁 参考文献 i fl e l i e v r e ，c h a o c a n ，r i n z a r e ，pg a r e i l ，c h r o m a t o g ，= a ，1 9 9 6 ，7 2 3 ：1 4 5 2 q h w a n ，c h r o m a t o g ra ，1 9 9 7 ，7 8 2 ：18 1 3ra ，c a r n e