（微生物学专业论文）盐藻的生长特性及逆境下β胡萝卜素积累规律和机理研究.pdf

姐川人学硕l 学位论文 盐藻的生长特性及逆境下b 一胡萝l 、素积累规律和机理研究 微生物学专业 研究生孙辉指导教师曹毅白林含 赫藻( d u n a l i e l l a ) 是一种极具经济学价值的单细胞绿藻，它主要分布在 海洋、盐湖等盐水水体中，是目前世界上最耐盐的真核光合生物。它可以在多 种胁迫条件下生长，主要是通过合成甘油和b 一胡萝h 素来抵抗多种逆境。献 藻在逆境胁迫时可诱导合成大量b 一胡萝h 素，这是盐藻综合抗逆的重要方面 之一。b 一胡萝h 素具有清除氧自由基的能力，是良好的抗氧化剂和氧化保护 剂。积累0 一胡萝h 素的盐藻对于这些逆境胁迫有着很强的抵抗能力，开展盐 藻的生长特性及b 一胡萝卜素的积累特性研究，对于了解盐藻的整个抗逆机制和 综合抗逆水平具有深远的意义。本实验通过对不同胁迫下盐藻的生长特性和p 一 胡萝h 素积累的关系研究，确定b 一胡萝h 素形成规律和机理，试验结果如下： 1 本文通过对盐藻的全波长扫描，确定了盐藻的最佳吸收波长为6 5 4 n m ，且单 位体积盐藻细胞数量与o d 6 5 。的光吸收值呈线性相关。解决了眉前国内外关于 盐藻细胞光吸收值报道不一的问题。 2 针对盐藻具有的综合抗逆生物学特性；研究了杜氏藻属七个种的酸碱耐受 性、极端温度耐受性、耐强光和氮磷比对生长特性影响等问题，发现np a r v a 的耐酸性最强，可在p h 5 0 条件下生存：而口p a i n o a t e 和np a r v a 的耐碱 性最强( p h 9 0 ) ；口印的耐热性较强( 4 5 ) ，口p s r v a 的抗寒性较强( 4 ) 。 每个种生长的最适氮磷比不相同，其中口b a r d a w i 、口印、口p a i n o l a t e 、 口s a l i n a 的最适氮磷比为3 0 ，口b i o c 以a t e 、原种口s a l i n a 、口p a r v a 的最适 氮磷比为5 0 。为下一步抗逆基因的克隆以及0 一胡萝h 索高产奠定了基础。 3 首次系统分析了八种胁迫条件( 高盐、高渗、强光、氧化剂、紫外、缺氮、 缺磷、缺硫) 下，敖藻b 一胡萝i - 素积累的变化趋势，发现在高盐振荡2 4 h 、 高渗振荡2 h 、氧化剂处理0 5 h 、强光( 1 5 0 0 “e m s “) 照射l h 、紫外光照射 叫川人学硕“l 学位论文 1 2 0 s 、n 、p 、s 缺乏时，盐藻b 一胡萝h 素的积累量达到最大，从而为研究0 胡萝h 素积累机理以及利用盐藻： 业化生产1 3 一胡萝h 素提供了更加详细的 理论依据。 4 在确定酸碱性、高盐、强光照、紫外照射、高温刺激、营养元素缺乏 等条件对b 一胡萝h 素积累影响的基础上，比较分析杜氏藻属七个种1 3 一胡 萝p 素积累情况，得出在高盐下口p a i n o j a t e 的b 一胡萝h 索积累量最大， 在强光下口p & r v a 的b 一胡萝h 素积累量最大，在紫外下口s a l i n a 的b 一胡萝 h 素积累量最大。 5 为了探索盐藻细胞p 一胡萝h 素积累的分子机制，初步开展了在有利于盐藻 细胞b 一胡萝h 素积累的不同条件下蛋白表达差异的研究，发现在高盐以及n 、p 和s 营养缺乏胁迫下，盐藻总蛋白电泳出现一条1 5 k d 的特异条带，初步确定该 蛋白的表达与8 一胡萝p 素积累相关。 关键词：盐生杜氏藻生长特性b 一胡萝1 - 素积累逆境种间比较蛋白表达 2 p u 川犬学颂学位论文 b i o l o g i c a lp r o p e r t i e s b - c a r o t e n ea c c u m u l a t i o nr u l ea n d m e c h a n i s mu n d e rt h es t r e s so f d u n a l i e l l as a l i n a m a j o rm i c r o b i o l o g y g r a d u a t e ds t u d e n t ：s u nh u it u t o r ：c a oy ib a il i n h a n d u n a l i e l l as a l i n ai sav a l u a b l eu n i c e l l u l a rh a l o t o l e r a n tg r e e na l g a i tm o s t l y d i s t r i b u t ei ns o m es a l tf i e l d sa n do c e a n s ，i st h em o s te x t r e m eh a l o t o l e r a n ta l g ai nt h e w o r l d t h eh a l o t o l e r a n tc h l o r o p h y t ad u n a l i e l l as a l i n ai sw e l lk n o w nd u et oi t sa b i l i t y t op r o d u c el a r g eq u a n t i t i e so fb c a r o t e n eu n d e rd e f i n e dc o n d i t i o n so fs t r e s s b y c o m m o nc o n s e n t ，i ti san a t u r a ls o u r c et op r o d u c e1 3 - c a r o t e n e t h ep r e s e n ts t u d yi s i m p o r t a n tt ou n d e r s t a n dt h ew h o l es t r e s s - r e s i s t a n t m a c h a n i s ma n dt h el e v e lo f m u t i p l es t r e s s r e s i s t a n ti nd u n a l i e l l a t h r o u g he x p l o r i n gu n d e rt h es t r e s st h er e l a t i o n o fg r o w t hp r o p e r t i e sw i t h1 3 - c a r o t e n ea c c u m u l a t i o no fd u n a l i e l l a ，w ed e t e r m i n e dt h e b c a r o t e n ef o r m e dm l ea n dm a c h a n i s m t h er e s u l ts h o w e d ：( 1 ) t h i ss t u d ys c a n e d t h ew a v e l e n t ho f1 ) s a l i n a ，c o n f i r m e dt h a ti th a so p t i m u ma b s o r b a n c ei n6 5 4 n m t h e n u m b e ro fd s a l i n ac e l l sp e ru n i tv o l u m ei sr e l a t i v ew i t hi t sa b s o r b a n c eo f6 5 4 n mi n c o r r e l a t i o nf u n c t i o n ( 2 ) w eh a v es t u d i e dd u n a l i e l l a sb i o l o g i c a lp r o p e r t i e s ， i n c l u d e di t st o l e r a n c ei nd i f f e r e n tp h i t sg r o w t hu n d e r1 0 6 0n p t h i sr e p o r t c a ng i v eu sag e n e r a li d e ao ft h es t a t eo fd u n a l i e l l a sl i v ei na h i g h e r t e m p e r a t u r e ，ac o o le n v i r o n m e n ta n dw i t h o u ti l l u m i n a t i o n ( 3 ) t h i ss t u d y i n v e s t i g a t e s c e l l g r o w t ha n d a c c u m u l a t i o no fb - , c a r o t e n eo fd s a l i n a ，w e r e e s t a b l i s h e db a s i so ns e r i e so fe x p e r i m e n tw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nu n d e rt h e n o r m a ic o n d i t i o n s r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea l g a lc e l l u l a rm a x i m u mc o n t e n to f b c a r o t e n ew a so b t a i n e da td e f i n e ds t r e s sc o n d i t i o n s t h eb c a r o t e n e c h l o r o p h y l l r a t i oa r r i v e dt h el a r g e s tv a l u e ，b u ti t sg r o w t hr a t ei sl i m i t e du n d e rt h e s ec o n d i t i o n b a s e do nt h ea b o v er e s u l t s ，t h ec o n t r o l l e dm e c h a n i s ma n di t se f f e c to nt h e s es t r e s s 四川人学倾j ：学位论义 f o ra v a i l a b l ec e l la c c u m u l a t i o no fb - c a r o t e n ew a st h u sd i s c u s s e d ( 4 ) w ea n a l y s i s t h a tb c a r o t e n ea c c u m u l a t i o no fs e v e ns t r a i n sd u n a l i e l l ai nd i f i e r e n ts t r e s s c o n d i t i o n s t h es e v e ns t r a i n sw e r eg r o w ni ns u c hc u l t u r ec o n d i t i o n st oe x a m i n et h e d i f f e r e n t1 3 - c a r o t e n ep r o d u c t i o n s ow ec a l lf u r t h e ri n v e s t i g a t et h er u l eo fb c a r o t e n ea c c u m u l a t i o ni nt h e s es t r e s s a n ds e l e c tt h eb e s tv a l u a b l es t r a i ni n c o m m e r c i a lp r o d u c t i o no f b - c a r o t e n e ( 5 ) i no r d e rt oe x p l o r et h em o l e c u l a r m e c h a n i s mo fn s a l i n ap c a r o t e n ea c c u m u l a t i o n w es t u d i e dt h a tt h e p r o t e i n e x p r e s s i o nd i f f e r e n c ei ns o m ep h y s i o l o g i c a ls t r e s sw h i c hb - c a r o t e n ea c c u m u l a t i o n i sh i g h e s t w er e p o r ta1 5 k ds p e c i a ls t r i pi nt h e s ec o n d i t i o n s ，i n i t i a l l yc o n f i r mi ti s r e l a t ew i t hb c a r o t e n ea c c u m u l a t i o n k e yw o r d s ：d u n a l i e l l as a l i n ag r o w t hp r o p e r t i e s s t r e s sc o n d i t i o n b - c a r o t e n ea c c u m u l a t i o n c o m p a r i s o n o fs e v e ns t r a i n s p r o t e i ne x p r e s s i o n 4 叫川人学顾 ：学位论义 前言 盐生杜氏藻( d u n a l i e l l as a l i n a ，以下简称盐藻) 是一类耐盐的单细胞绿 藻，隶属绿藻门、绿藻缨、团藻目、杜氏藻属，藻体呈单细腿，具有两条等长 的鞭毛和一个杯状叶绿体，无细胞壁。它广泛分布于海洋、盐湖等盐水水体中， 是真核生物中抗盐性最强的一种藻类。盐藻可以在多种胁迫条件下生存，它的 综合抗逆体系除了通过合成甘油来抵抗盐胁迫之外，另外个显著抗逆特征是 通过大量积聚b 胡萝h 素来抵御其他多种胁迫。盐藻体内b 胡萝h 素含量可以 高达于重的1 0 左右，最高时可达1 4 【l j ，为自然界中所有生物之首，而植物 叶子和其他藻类中1 3 一胡萝b 素含量仅为0 3 左右【2 l 。0 一胡萝h 素积累于叶 绿体内的中性脂质小体中，分布在内囊体片层之闯。这也是盐藻区别于其他藻 类的典型生理特征。因此盐藻因其独特的细胞组成和生物学特性受到了广泛的 关注。 类胡萝h 素是一种广泛存在于光合生物中的脂溶性捕光色素，b 一胡萝i - 素是其中一种橙黄色色素。在自然界中，植物和一些微生物都可以合成胡萝h 素，动物以不同的方式代谢胡萝h 索但是自身却不能合成。1 3 胡萝h 素在食品、 医学、保健等方面有着广泛的用途。天然b 一胡萝h 素分子呈顺式与反式混合 构型，摄入人体后，一部分裂解为维生素a 分子，另一部分具有淬灭体内自由 基，防止衰老以及癌变的生物学活性。1 3 一胡萝h 素具有清除氧自由基的能力， 是一种良好的抗氧化剂和氧化保护剂。受到逆境胁迫的盐藻可被诱导合成大量 b 一胡萝h 素，积累b 一胡萝卜素的盐藻对于这些逆境胁迫有着很强的抵抗能 力尤其是氧化胁迫。一般认为是b 一胡萝h 素对有害物质一单态氧起到了淬 灭作用。另外研究还发现1 3 一胡萝h 素还可以优先叶绿素被光漂白，从而使叶 绿素免受强光的漂白。可见积累b 一胡萝卜素是盐藻抗逆的重要方式之一，研 究盐藻在胁迫条件下b 胡萝p 素的规律和机理是全面研究稚藻的抗逆性特性 的一个重要方面，可为综合阐述盐藻抗逆特性提供充分的依据。 赫藻在一定的胁迫条件下可以合成和积聚比其他生物高很多的b 胡萝h 素，积累0 一胡萝h 素和盐藻生长的最适条件是相矛盾的。因此研究盐藻的生长 特性和色素秋累规律对于盐藻的犬规模生产b 胡萝h 素有着重大的意义，只有 叫j q k 学硕士学位论文 在充分了解这些特性后，我们才能制定合理的生产方式来解决这一矛盾。一般 认为，利于积累的胁迫条件为高光强、高盐度、高温以及营养元素的缺乏，但 是许多实验都没有将这些胁迫条件下盐藻积累b 一胡萝h 素的规律和机制进行 全面系统的研究，因此进行这样一个全面系统的研究对于了解盐藻的整个1 3 胡 萝p 素积累规律和机理有着很大的意义，同时也会对盐藻的抗逆机制和综合抗 逆水平有了更深入的认识。 本文系统研究了盐生杜氏藻的生物学特性和培养条件，考察了不同胁迫条 件对其b 一胡萝h 素积累的影响，比较了不同的藻种的生长条件以及胁迫条件 下b 一胡萝b 紊产量的差异，以及在蛋白水平上初步探讨了盐藻积累b 一胡萝 h 素的机制，为全面研究盐藻的抗逆性特性以及综合阐述盐藻抗逆特性提供了 充分的理论和实验依据，同时也为大规模开发利用盐藻，建立高产盐藻b 一 胡萝p 素的控制模式以及为筛选高产b 一胡萝p 索藻种提供了相关的基础数掘 和实验技术。 叫川人学颇卜学位论文 第一章盐藻最佳光吸收值及其与细胞数的关系研究 由于目前对于盐藻细胞最佳光吸收值的文献报道不一致，为了实验数 据能够尽量准确且能真实反映出盐藻的生长特性，本章通过对盐藻的金波 长扫描，确定盐藻的最佳吸收波长，研究盐藻细胞数量与光吸收值的关系，解决 目前国内外关于盐藻细胞光吸收值报道不一的问题，为以后几章实验的丌 展，提供方法和技术上的依据。 1 材料和方法 1 t 材料 1 1 1 藻种 赫生杜氏藻( d u n a l i e l l as a l i n a ) ，由本实验室保存 1 1 2 仪器 紫外可见分光光度计t u 1 8 0 0 购自北京普析通用仪器有限责任公司；血 球计数板； 1 1 3 试剂 采用国产分析纯试剂。 1 1 4 盐藻培养液 成分参照文 4 ，5 1 的方法配制。 1 2 方法 1 2 1 盐藻培养方法 采用三角瓶培养，按1 0 接种量接种，在光照与黑暗周期为1 6 h ：8 h ，温 度( 2 8 1 ) 环境中培养。 1 2 2 测定盐藻最佳光吸收波长方法 在资料收集阶段，发现有些资料叙述的盐藻最佳吸收峰对应波长有较 大的差异，为了实验数据能够尽量准确，盐藻培养液进行4 0 0 7 0 0 h m 的紫 外光分光光度计的全波长扫描，测定其吸收值。盐藻培养至对数期，将其 按照l o 倍数量级进行稀释，分别取稀释和来稀释的盐藻培养物3 m l 放入 比色杯中进行波长扫描，重复3 次，比较稀释至相同数量级细胞浓度与不 叫川i 火学坝i ：学位论丈 加以稀释的区别。 1 2 3 细胞生长测试方法 取l o u l 培养液滴入血球计数板计数框内，在光学显微镜下观察，采 用血球计数板进行细胞数目的测定，共观察3 片，取平均数。直接计算出 盐藻细胞数量( c e ll s m 1 ) ，同时测定同一个样品的光吸收值o d 6 5 4 。 2 结果 2 1 盐藻最佳吸收波长的测定 测光方式：a b s 扫描速度：中 采样间隔：1 o n m d 光谱测量 八 7 v 啪 图1 盐藻的波长扫描 为了测定盐藻细胞的生长规律，对盐藻培养物进行4 0 0 7 0 0 h m 波长的 扫描。通过图1 可以看出，盐藻细胞在波长为6 5 4 m 处有一个最大吸收 值0 8 0 1 。因此，选定6 5 4 n m 作为盐藻最佳光吸收波长。 到川大学倾l j 学位论文 2 2 盐藻细胞数量及其与6 5 4 n m 光吸收值的关系 通过对单位体积藻液中盐藻细胞数量与其在6 5 4 n m 的光吸收值的回归分析 发现，细胞数量与6 5 4 n m 的光吸收值呈线性相关( 图2 ) ，其回归主方程是： o d 6 5 4 。= - - 0 0 0 9 9 x 0 0 0 8 6 ，即x = 1 0 1 0 1 0 1 o d 6 5 4 n m + 0 8 6 8 7 ，公式中x 为每m l 藻液的细胞数量，直线方程的相关系数是o 9 9 4 6 。由此可以看出，用o d 6 5 4 。 可以反映盐藻细胞的生长情况。 o 1 0 0 0 0 9 0 0 0 8 0 o 0 7 0 0 0 6 0 0 0 5 0 0 0 4 0 0 0 3 0 0 0 2 0 0 0 1 0 o 0 0 0 567899 5l o 51 11 31 5 5 细胞个数( 1 0 5 m 1 ) 图2 盐藻细胞数量与0 d 6 。的函数关系 3 讨论 3 1 盐藻细胞最佳光吸收波长的确定 目前对于盐藻细胞最佳光吸收值的争议较大，国内报道的文献大部分 描述为：“4 5 0 r i m 是盐藻最佳光吸收波长”1 6 】，而一些国外资料则认为“测 定盐藻是利用其叶绿素含量不同，在6 4 5 至6 6 3 n m 之间用分光光度计测 得的”【7 】以及“测定叶绿素i i 应用6 5 2 n m 分光光度计测a 值最佳”【8 】。 本文针对以上问题，对实验室保存的7 个盐藻藻种细胞的光吸收值进行了 全波长扫描。实验结果表明，7 个藻种在6 5 4 n m 均有最大的吸收峰，而有 几个种在4 5 0 n m 处也有小的吸收峰，说明6 5 4 n m 是盐藻细胞的最佳光吸 收值埘应波长，因此，在以下的试验中，均选用6 5 4 n m 作为盐藻细胞的 最佳光吸收波长，同时也解决了心内外对于盐藻细胞光吸收值报道不一的 四川人学顾上学位论文 问题。 3 2 盐藻细胞数量与光吸收值的关系 在进行全波长扫描中，为了确定细胞浓度对光吸收值的影响，采用细 胞计数的方法，对不同细胞数量的光吸收值进行比较分析。结果表明，盐 藻的光吸收值会随着浓度变化雨变化，但不会影响到峰值对应的波长，即 稀释只会改变光吸收值的大小，但波形整体变化趋势与形状不会发生改 变，进一步证明盐藻细胞的光吸收值为6 5 4 n m 。 为了确定盐藻细胞数量与光吸收值的关系，进行了盐藻细胞数量与 o d 6 s 4 。的关系的研究。从实验结果可以看出，光吸收值o d 6 5 4 。与单位 体积藻液中救藻细胞数量基本成正相关，即与藻液浓度呈正相关，故 o d 6 5 4 。可直接反映藻液的生长情况。 另外，由于6 5 4r i m 是叶绿素的光吸收值，由此可以看出，盐藻细胞 的光吸收值实际上反映了藻体中叶绿素的含量。该实验结果为以后几章实 验的开展，提供了方法和技术上的依据。 叫川1 人学倾l 一学位论文 第二章杜氏藻七个种生长特性的研究 本章针对盐藻具有的综合抗逆生物学特性，研究杜氏藻属七个种的酸碱耐 受性、极端温度耐受性、耐强光和氮磷比对生长特性影响等问题，得出在不同 的条件下它们的生长特性规律和差异。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 藻种 实验藻种为本实验室保存的杜氏藻的七个种d u n a f e h as a l i n a ，原种 d u n a l i e l l as a l i n a ，d u n a l i e l l ap a r v c 2 ，d u n a l i e t l as p , d u n a f f e j1 8b a r d a ii ， d u n a f f e f i ap a i n o l a t e 及d u n a l i e l l 昂b i o c u f a t e 。 1 1 2 培养基 培养液成分参照文【4 - 5 l 的方法配制。 1 2 方法 1 2 1 杜氏藻培养方法 采用三角瓶培养，按1 0 接种量接种，在光照与黑暗周期为1 6 h ：8 h ，温度 ( 2 8 ) 环境中培养， 1 2 2p h 对七种杜氏藻生长的影响 用饱和浓盐酸及i o m 的n a o h 溶液调p h 值，所需溶液的量如表1 所示。 表1 配制不同p h 值盐藻培养液所需的溶液量 l o o m l5 0u 1 i5 u l8 5 u 1 用量hcih c i n a o h 四jj l a ：学硕士学位论文 各做对照及样品l o o m l ，正常培养条件下培养，每目测定其o d 一。值 进行比较与分析。 1 2 3 氮磷比对七种杜氏藻生长的影响 藻液生长至对数生长期，然后转入氮磷浓度比不同的培养基中。先 将磷酸盐的浓度维持在0 m o l l ，不同的氮磷比值通过改变硝酸盐的浓 度实现。配制2 0 0 m l 的培养液，既所需n a n o ；分别为1 7 ，1 7 ，3 4 ，5 l ， 6 8 ，8 5 ，1 0 2m g ，氮磷比则分别为1 ，1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 。然后置 于! f f 常培养条件下培养。7 d 后测定其o d e 值。 1 2 4 温度对七种杜氏藻生长的影响： 耐高温试验： 正常藻液培养至对数生长期，分别在水浴中以3 5 ，4 0 ，4 5 进行高 温刺激实验。分别在第3 0 m i n 移出l o m l 重新在正常培养条件下培养。接 种后每天测定其0 d 一。值。 耐低温试验： 将正常藻液置于4 。c 培养箱内培养，从放入起计时，每隔1 2 小时取 出1 0 m l 的藻液置于正常培养条件下培养，接种7 d 后测定其0 d 。值。 1 2 5 光照对七种杜氏藻生长的影响： 取生长至对数期的藻液l o m l 至新鲜的正常培养基中，将其移至暗室培养 每日测各个藻种的o d e 一。值。 1 2 6 藻液生长测定方法 本实验采用分光光度法来测出藻液的光吸收值，其值大小与藻液浓度 基本成币比关系，故可用于直接反应藻液生长情况。本实验依据第一章的 实验结果选用6 5 4n m 作为盐藻最佳光吸收波长。 叫i l 大学倾i 。学位论文 2 结果 2 1p h 对七种杜氏藻生长情况的影响 杜氏藻在不同的p h 条件下的生长情况不同，而各个种的p h 值适应范 围也不相同。因此有必要研究不同种的杜氏藻在不同p h 值下的生长特性， 为确定这些藻的最适p h 值以及筛选耐酸碱的藻种提供一定的依据。我们 将正常培养的杜氏藻分别接入三个p h 梯度一p h 5 、7 、9 的培养基中，每 天测定它们的o d 一。值，来得出在这三个p h 值下它们的生长情况。 0 l234 5 678 时间( d ) r 二二西石磊：猫j ：o 万b i o c u l a t e 一一- i - d s p 。 4 * 丑p a i n o a t e十皿p a r v ai 口s a l i n a l ! 一劂b s a l i n a 一一。 图1p h 5 时七种杜氏藻的生长情况 由实验结果图1 、2 、3 可知，杜氏藻适宜生长的p h 因种而异。其中在 p h 5 这个酸性条件下，这七种杜氏藻的生长都在一定程度上受到了抑制， 基本的生长规律一致，在前期的生长速率较高，在4 d 之后都处于逐渐凋 亡的过程中。但是相比较而言，口p a r v a 的生长情况要好于其他的种，浇 明它有略高于其他种的耐酸性，这对于以后研究耐酸性的藻种有着重大的 意义。 从图2 上我们可以看出，p h 7 基本上杜氏藻普遍适宜生长的p h 值。在 p h ? 时，各个种的杜氏藻生长情况都较好，在整个对数期细胞量都处于逐 渐上升的趋势。 七埽蝎h伦；宝似穹o 0 m n 吼m 0 n m m 吼 州川i 大学坝 学位论文 1 0 9 0 8 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 o + d b a r d a 毗i * d p a n o l a t e - 墅堡! 霉j n a 4678 时间( d ) 二二酝i 五夏矗万二：二二d ? 菇 + n p a r v a+ n s a l i n a 图2p h 7 时七种杜氏藻的生长情况 删 在p h 9 时七种杜氏藻的生长情况在对数期内也基本上呈直线上升趋势 ( 图3 ) 。这说明杜氏藻对于碱性环境的适应能力要强于酸性环境。 ol23 十d ，b a r d a ，n * 显p a i n o l a t e - 一舔种b js a i i n a 45678 时间( d ) - 皿b i o c u l a t e + 盈p a r v a - r d s 口 + ns a i i n a 圉3p h 9 时七种杜氏藻的生长情况 2 2 氮磷比对七种杜氏藻生长情况的影响 氮磷是抽藻生长的重要营养元素，对盐藻生长的影响很大。其中氮源缺乏 6 5 4 3 2 l o 0 0 0 o o 0 lz日b 叫川人学顺 。学位论文 是盐藻生长的主要限制因素。不同种杜氏藻生长的最适氮磷比会有一些差异。 我们待藻液生长至对数生长期，然后转入一系列的氮磷比( t o 、2 0 、3 0 、4 0 、 5 0 、6 0 ) 不同的培养基中，置于正常培养条件下培养，7 d 后测定其0 阢6 m 值，结果如下表。 从表1 上可咀看出，当氮磷比 3 0 时，细胞数与氮磷比几乎呈线性正 相关；氮磷比3 0 时，细胞数处于恒定状态。且桂氏藻的这七个神都遵 守这个规律，没有显著的差异。但是每个种生长的最适氮磷比不相同，其 中9 b 日r d a w i i 、口印、n p m n 0 1 8 t e 、ns a i i n a 的最适氮磷比为3 0 ，口b i o c u l a t e 、 原种口s a l i n a ，丑p a t v z j 的最适氮磷比为5 0 。 表1 不同的氮磷比下七种杜氏藻的生长情况 2 3 高温对七种杜氏藻生长情况的影响 温度是影响杜氏藻生长的因素之一，在适宜的温度下，它们的细胞生长旺 盛，较高或较低的温度就会对它们的生长起到一定的抑制作用。杜氏藻对温度 有着很宽的适应范围。为了研究这七种杜氏藻在高温刺激后的生长情况，我们 取培养至对数生长期的正常藻液，分别在水浴中以3 5 ，4 0 ，4 5 进行高 温刺激实验。在3 0 m i n 后重新在_ f 常培养条件下培养，每天测定其o d 。 值。 川人学颂1 ：学位论文 l 06 葛 宫0 5 0 4 0 3 02 0 1 0 一一一。 0l23 l j 一一o 5 时岛( d ) 7 十皿b a r d a w i l+ 口b i o c “a t e十皿s p * 皿坤血o l a t e h 且删m+ 口s a l i n a + - 聚种d s a l d n a 酉n 丽潮预后毛稀衽露薪诬苌# 瓯一一 从图4 上可以看出。3 5 。c 对杜氏藻的生长基本没有抑制作用，各个种 的生长情况和正常条件时相似，呈逐日上升趋势。 而经4 0 。c 刺激后( 图5 ) ，除了口印之外，各个藻种的生长都受到一 些抑制，而且印的生长则受到定刺激，反而比正常时的生长速率高些。 0l234567 时间( d ) + d b a r d a w i l np a i n o l a 8 + 琢种0 。s a l i n a - 一d s p + 皿s a l j n a 图54 0 c 刺激后七种杜氏藻的生长情况 8 5 4 3 2 1 0 o 0 o 0 0 0 l=8 p qj i l 大学烦j ：学位论文 在经过4 5 。c 刺激后，图6 我们看出，这个温度对于大多数藻种而言已 经超过了正常的耐受温度，所以它们的生长受到抑制，生长速率缓慢几近 停滞。而口s p 的生长似乎并没有被抑制，仍保持较高的生长速率。 0 5 = 害04 0 3 0 2 0 1 0 时问( d ) 一 1_ 一一”“ i + 皿b a r d a w i l + 口b i o c u l a t e + 皿印 l 十n 阳如o l a t e d p a r v a+ n s m i n 8 i + 励s m i n a 图64 5 c 科澈后七种杜氏藻的生长情况 上述实验结果表明杜氏藻经过一定的高温刺激后仍有一定的存活率， 一般来说，盐藻的温度耐受上限应定为4 0 ( 3 。然而在我们的实验中发现 经过适当时间、适当温度的高温刺激后的口印具有了较高酌生存能力， 这种现象的产生机制可能是一种诱导作用。这种现象以往的资料未见报 道。这一点也是在以后实验研究中需注蒽的。由于盐藻作为一种耐高温的 优良藻种，具有极高的利用价值，所以其产生耐受性的具体机制是值得深 入研究。 2 4 低温对七种杜氏藻生长情况的影响 同样，低温也是影响杜氏藻生长的因素。在低温条件下，杜氏藻的生长速 率变慢甚至停滞，然而在这七个种之间，它们在低温下的存活和生长情况也不 尽相同。因此我们为了研究它们的低温生长特性，将j 下常藻液置于4 培养箱 内培养，从放入起计时，每隔1 2 h 取出t o m l 的藻液置于正常培养条件下 叫川人学硕上学位论文 培养，接种7 d 后分别测定它们的o d 。值，结果如下： 表2低温刺激后七种杜氏藻的生长情况 。篙燥。t e n 州n 埘z n 。；一妇e 。挈a 肚；”咖耙。脚m d , s a l i n n 羼矽a w 鼢 0 0 2 1 4o 2 7 30 31 20 3 8 0 0 3 9 10 3 1 0o 2 3 0 0 0 1 8 0 0 2 1 0 0 1 9 o 0 2 4 0 0 1 5 0 0 1 4 0 0 1 7 o 0 2 0 0 0 1 8 0 0 2 l 0 0 1 20 ，0 2 20 由1 5 0 0 2 0 0 0 3 1 0 0 1 6 0 0 1 90 0 2 30 0 1 0 0 0 3 1 0 0 2 30 0 2 2 0 0 2 20 0 2 20 0 1 1 0 0 2 80 0 2 30 0 1 2 0 0 3 00 0 2 50 0 2 1 0 0 2 7 0 0 3 10 0 2 2 0 0 2 90 0 3 20 0 1 3 0 0 2 80 0 2 8 0 0 1 2 0 0 7 10 0 1 7 0 0 6 40 0 2 2 0 0 6 20 0 2 0 0 0 5 80 0 2 5 0 0 5 30 ，0 1 9 0 0 5 10 0 2 0 0 0 5 50 0 2 1 0 0 5 3 0 0 2 1 o 0 5 40 0 1 9 0 0 5 20 0 1 8 0 ，0 2 3 0 0 2 8 o ，0 2 6 0 0 3 0 o 0 2 5 0 0 2 7 0 0 2 9 0 0 2 8 o 0 2 8 o 0 2 7 表2 说明盐藻在低温下生长受到抑制，无法正常生长，但是n p a r r 8 相对其它种有较强的抗冻性，在低温条件下还是有一定数量的细胞存活下 来。作为一种亚热带藻种，杜氏藻对低温的敏感性是阻碍其工业大量生产 的因素之一，有必要寻求温度要求范围更广的新藻种。这就需要通过基因 工程的方法来进一步筛选优势植株。 2 5 光照对七种杜氏藻生长情况的影响 杜氏藻是一种营自养生活的绿藻，必须依靠光合作用来合成有机物质，因 此光照对杜氏藻的生长至关重要。我们取生长至对数期的藻液1 0 m l 至新鲜的e 常培养基中，将其移至暗室培养，每只测各个藻种的o d 。，值，分析杜氏藻 在暗培养的情况下的生长特性。 1 8 m 。 坫 2 ：3 3 ” 4 帖 5 四川i 大学 0 i fj f j 学位论文 表3 暗培养下七种杜氏藻的生长情况 d b a r d a w i lo 0 4 90 0 4 40 0 6 00 0 6 2 0 0 4 4o 0 5 00 0 2 90 0 2 6 d b i o c u l a t e0 ，0 6 0 0 0 3 30 0 5 80 0 6 1 o 0 4 6o 0 4 30 0 3 40 0 3 0 d 印 0 0 5 9o 0 2 7 0 0 5 80 0 5 6 0 0 5 00 0 50 0 4 50 0 3 9 d p a i n o l a t e 0 0 4 20 0 5 3 0 0 5 20 0 6 10 ，0 4 3o0 2 9 o 0 0 60 0 0 5 d p a r v a 0 0 5 60 0 5 70 0 5 8o 0 5 8 0 0 5 2o 0 6 30 0 5 5 o 0 5 1 d s a l i n a o 0 5 60 0 3 7 0 0 510 0 4 40 0 4 6 0 0 4 80 0 3 1o 0 2 8 原释d s 4 l i n n0 0 4 00 0 3 80 0 4 00 0 3 7 0 0 3 2 0 0 3 80 0 1 50 0 2 3 从上表的结果可以看出，光照是影响杜氏藻生长的主要因子，在暗培养时， 这七种杜氏藻都几乎没有生长，处于停滞期，尤其是在后期出现凋亡现象，这 时光照是其生长的主要抑制因素。 3 讨论 3 1 o h 对杜氏藻生长的影响 从结果音盼可以看出，七个种的杜氏藻在不问的p h 下的生长情况不尽 相同。因而在盐藻培养中应注意针对不同的种采用不同的培养条件。由于 针对盐藻作p h 实验在国内海属首次，在实验方法与结果论证上，不免具 有一定主观性，但与一些外文资料的参考数据还是基本吻合的 7 t8 1 ，盐藻 的最适p h 值为7 7 5 ，大多数的盐藻不耐酸，但是在碱性条件有定的适 应能力。 3 2 氦磷比对杜氏藻生长的影响 通过我们的实验得出，当氮磷比 3 0 时，p 是主要的限制因子。从n 限制到p 限制的转变 叫川人学倾i 。学位论文 以氮磷比3 0 为界限，这说明n 和p 对盐藻生长存在重要的影响作用。其 作用机制呈现一种此消彼长的对应关系。实验结果与资料【9 中“当氯、 磷浓度分别达到3 m m 0 1 l 和0 1 m m o l l 时，盐藻生长最佳”的结论完全一 致，可以基本证明是正确的。说明了当氮、磷浓度低于这一数值时，细胞 生长速率下降，当高于这一数值时，则受到一定程度的抑制，这可能是高浓 度对细胞代谢具有生理毒性。所以在敖藻培养中应注意合理安排培养液成 分，切忌过浓过稀，对盐藻的生长及甘油、类胡萝h 素的工业产量都有极 其不利的影响。还要注意在培养中随时观察培养液成分的变化，随时补充 营养成分。 3 3 温度对杜氏藻生长的影响 在自然环境中，温度是影响杜氏藻生长发育的主要因素。杜氏藻对湿 度的适应范围很广，在适宜的温度条件下，杜氏盐藻分裂旺盛，生长速度 快。据报道，它的温度上限是4 0 。c 左右，下限为5 ，最适生长温度为 2 5 3 0 。c 1 1 0 ) 。当温度为5 时，杜氏藻生长缓慢，细胞不增殖；当温度超 过4 0 时，生长受到抑制。然而本试验发现杜氏藻各个种对温度的适应 能力不同，在高温时口印经过热刺激后的生长速率反而有一些升高，低 温刺激时，口b a r d a w i l 表现出比其他种较强的抗冻能力。 3 4 光照对杜氏藻生长的影响 杜氏藻营自养生活，必须依靠光合作用来合成有机物质。因此，光照 对杜氏藻的生长发育至关重要。杜氏藻是一浮游单细胞藻类，对自然光的 利用率可达总光照量的3 一1 1 ，大于一般高等植物( 0 5 - 7 左右) ，这主 要可能与单细胞藻类的细胞生理机制有关；另外，单细胞藻类的叶绿体无 重叠的情况，可以使阳光直接透入；此外，杜氏藻具鞭毛，可游动并有趋 光性，也提高了对光照的利用率。 p u 川大学顺i j 学位论文 在大量培养的生长初期，由于藻液密度小，藻体能充分吸收光线，这时藻 体的生长主要取决于培养液的成分和其它坏境条件。盟j 长后期，出于藻液密度 继续增大，藻体不能达到饱和，细胞的生长速度会逐渐下降。此时，光照强度 就成了制约藻体生长的主要因素，如果给予1 0 0 0ue m - 2 s 一1 以上的强光照， 会加速其生长速度：同时培养中经常搅拌培养物，使密度变得均匀从而提高光 能利用率。 p hj 1 1 人学硬上学位论文 第三章胁迫条件下盐藻1 3 一胡萝l 、素积累规律 盐藻在一定的胁迫条件下可以大量积聚b 胡萝h 素，一般认为，利于积累 的胁迫条件为高光强、高盐度、高温以及营养元素的缺乏，对这些胁迫条件下 盐藻积累b 胡萝h 素的规律和机制缺乏全面系统的研究。本章首次系统分析了 八种胁迫条件( 高盐、高渗、强光、氧化剂、紫外、缺氮、缺磷、缺硫) 下， 盐藻b 一胡萝b 素积累的变化趋势，从而为研究一胡萝b 紊积累机理和盐藻 抗逆特性提供了充分的依据。 1 材料和方法 1 1 材料 i 1 1 藻种 赫生杜氏藻( d u n a l d e l l as a l i n a ) ，由本实验室保存。 1 1 2 盐藻培养基 培养液成分参照文【4 。】的方法配制。进行不同条件培养时，在此基础上对组 分进行相应调整即可。正常培养基的n a c l 浓度为1 5 m o l l 。 1 2 方法 1 2 1 盐藻培养条件 采用三角瓶培养，按1 0 接种量接种，在光照与黑暗周期为1 6 h ：8 h ，温 度( 2 8 1 ) 玮境中培养。 1 2 2 盐藻高盐胁迫 从i f 常培养液中耿藻液5 0 m l ，3 5 0 0 r 离心4 m i n ，去上清，然后将细胞重悬 入等体积的n a c i 浓度为3 5 m o l l 的高盐培养液中，分别在0 、2 、4 、6 h 时取 样。 叫j 人学颂上学位论文 1 2 3 盐藻高渗胁迫 从j 下常培养液中取出藻液5 0 m ，3 5 0 0 r 离心4 m i n ，再将细胞重悬接入等体 积的n a c 浓度为0 5 m o l l ，甘油浓度为4 m o l l 的高渗培养液