（微生物学专业论文）油藏微生物烷烃羟化酶基因的全长克隆及序列分析.pdf

摘要 摘要 一些油藏微生物可以原油作为唯一碳源生长，其中的一些微生物在代谢过 程中降解原油的部分组分，改变原油的流动性，从而提高残余油的采收率。这 些微生物在提高石油采收率和石油污染治理中具有重要应用价值。目前，国内 关于烷烃好氧降解途径中的关键酶基因氓烃单加氧酶基因口删b 和环境中烷 烃降解菌的检测研究较少。对烷烃单加氧酶基因的研究可以为提高石油采收率， 生物修复和生物催化提供理论依据。烷烃降解菌的检测则有助于石油勘测及评 价环境中石油污染的程度。 根据相同种属的烷烃单加氧酶基因设计引物，从r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s t 7 2 克隆到四个烷烃单加氧酶基因a l k b l ，a l k b 2 ，a l k b 3 ，a l k b 4 ，从g s t e a r o t h e r m o p h i l u sd m - 2 克隆到a l k b 2 和a l k b 3 基因，未得到全长的a l k b l 和 a l k b 4 基因。为了获得a l k b 两翼的全长序列，本文用t a i l p c r 的方法简单快 速地克隆到d m 2 四个完整的a l k b 基因及其侧翼序列，并详细分析了四个a l k b 基因域，四个a l k b 基因的启动子区域，以及a l k b 基因侧翼的辅酶，并为以后构 建a l k b 基因的缺失载体提供基础。 a l k b l 基因下游为编码红素氧还蛋白的基因r u b a l 和r u b a 2 及编码红素氧还 蛋白还原酶的基因r u b b 。a l k b 2 基因下游为编码r u b a 3 和r u b a 4 的基因。红素 氧还蛋白和红素氧还蛋白还原酶组成了烷烃氧化途径中的电子传递系统。a l k b 3 基因的上下游为编码未知功能蛋白的基因。口嬲3 4 基因的上游序列编码推定的乙 酸水解酶家族蛋白，下游序列编码谷氨酰t r n a 合成酶。d m 2 的四个a l k b 基 因在p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n sk o b 2 a 1 和e c o l i g e c l 3 7 ( p g e c 4 7 a b ) 中的功能互 补实验证实四个基因均可以在p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n sk o b 2 a 1 ( 不能在 c 1 2 c 1 6 为唯一碳源的培养基中生长) 得到互补表达，说明克隆到的四个基因为 具有活性的烷烃单加氧酶基因。 对四个烷烃单加氧酶的蛋白序列分析表明四个烷烃单加氧酶属于跨膜蛋 白，a i k b i 和a i k b 2 有六个跨膜区，a i k b 3 和a i k _ b 4 有五个跨膜区，每个跨膜 区均有2 2 个氨基酸( a i k b 4 的两个跨膜区除外) 。四个蛋白具有a i k b 类烷烃单 加氧酶保守区域的h i s 1 ，h i s 2 ，h i s 3 和h y g 四个组氨酸模序。 根据烷烃单加氧酶基因a l k b 保守区域设计不同的兼并引物，用兼并p c r 从 i 摘要 g s t e a r o t h e r m o p h i l u sd m 一2 ，r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i st 7 - 2 ，n o c a r d i as p 3 2 2 9 1 及p s e u d o m o n a s 中克隆了a l k b 基因片段。对a l k b 基因片段和全长a l k b 基因进 行了序列分析，同源性比较。比对结果表明不同a l k b 基因存在一定的差异；同 属不同种的a l k b 基因序列相似性较高。因此，通过a l k b 基因保守区的兼并引物， 可以快速准确地检测烷烃降解菌。 关键词：石油，解烃微生物，烷烃单加氧酶，兼并p c r ，t a i l p c r ，跨膜蛋白 a b s t r a c t ab s t r a c t s o m eo i lr e s e r v o i rm i c r o o r g a n i s m sc o u l dg r o ww i t ht h ec r u d eo i la ss o l ec a r b o n s o u r c e s o m ec o m p o n e n t so ft h ec r u d eo i lc o u l db ed e g r a d e db yt h eo i lr e s e r v o i r m i c r o o r g a n i s m sa n df l u i d i t yo ft h ec r u d eo i lw a sc h a n g e d ，s oo i lr e c o v e r yo fr e s i d u a l o i lw a se n h a n c e d t h em i c r o o r g a n i s m sp l a y e da l li m p o r t a n tr o l ei ne n h a n c i n go i l r e c o v e r ya n dt r e a t m e n to fo i lp o l l u t i o n a tp r e s e n t ，t h e r ew e r ef e wr e s e a r c h e sa b o u t a l k a n em o n o o x y g e n a s eg e n ea l k bw h i c hw a st h ec r u c i a lg e n ei na e r o b i cd e g r a d a t i o n w a yo fa l k a n ea n dd e t e c t i o nf o ra l k a n ed e g r a d i n gb a c t e r i u mi ne n v i r o n m e n t t h e o r e t i c a lb a s i sf o re n h a n c i n go i lr e c o v e r y , b i o r e m e d i a t i o n , a n db i o c a t a l y s tw a s p r o v i d e db yr e s e a r c h e so fa l k n a em o n o o x y g e n a s e d e t e c t i o nf o ra l k a n ed e g r a d i n g b a c t e r i u mw a sh e l p f u lf o ro i le x p l o i t a t i o na n de s t i m a t i n go i l p o l l u t i o nt o t h e e n v i r o n m e n t p r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt oa l k a n em o n o o x y g e n a s eg e n e sf r o mt h es a m e g e n u s a n du s e dt oc l o n ea l k a n e m o n o o x y g e n a s eg e n e sf r o mr h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i st 7 2a n dg s t e a r o t h e r m o p h i l u sd m 一2 a l k b1 ，a l k b 2 ，a l k b 3a n da l k b 4 w e r ec l o n e df r o mr h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i st 7 2 a l k b 3 ，a l k b 4w e r ec l o n e df r o m g s t e a r o t h e r m o p h i l u sd m - 2a n dc o m p l e t eg e n e so fa l k b1a n da l k b 4c o u l dn o tb e c l o n e d i no r d e rt oc l o n ec o m p l e t es e q u e n c e sf l a n k i n gt h ea l k bg e n e ，t a i l - p c rw a s u s e da n df o u rc o m p l e t ea l k b sa n df l a n k i n gs e q u e n c e so fd m - 2w e r ec l o n e ds i m p l y a n df a s t t h er e g i o n so ft h ef o u rg e n e s ，p r o m o t e rr e g i o n s ，a n dc o e n z y m e ss e q u e n c e s f l a n k i n gt h ea l k bg e n e sw e r ea n a l y z e di nd e t a i l ，w h i c hp r o v i d ef o u n d a t i o nf o r c o n s t r u c t i n gn e g a t i v ev e c t o ro f a l k bg e n e t h er e s u l ts h o w e dt h a tr u b a la n dr u b a 2 g e n e se n c o d i n gr u b r e d o x i na n dar u b b g e n ee n c o d i n gr u b r e d o x i nr e d u c t a s ee x i s t e da td o w n s t r e a mo ft h ea l k bg e n e r u b a 3 a n dr u b a 4e x i s t e da td o w n s t r e a mo fa l k b 2g e n e t h er u b r e d o x i na n dr u b r e d o x i n r e d u c t a s ec o m p o s e da ne l e c t r o nt r a n s f e rs y s t e m g e n e sa tu p s t r e a ma n dd o w n s t r e a m o fa l k b 3e n c o d e dp u t a t i v ep r o t e i n s g e n eu p s t r e a mo fa l k b 4e n c o d e dap u t a t i v e f u m a r y l a c e t o a e t a t eh y d r o l a s ef a m i l yp r o t e i n ，a n dg e n ea td o w n s t r e a me n c o d e da g l u t a m y l t r n as y n t h a s e f u n c t i o n a lc o m p l e m e n t a t i o ne x p e r i m e n t so ft h ef o u ra l k b g e n e so fd m 2i nt h ep s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n sk o b 2 a 1a n dec o l ig e c13 7 ( p g e c 4 7 a b ) i n d i c a t e dt h a ta l lo f t h ef o u rg e n e sc o u l db ec o m p l e m e n t a r i l ye x p r e s s e d ， w h i c hs h o w e dt h a tt h eg e n e sw e r ea c t i v e p r o t e i ns e q u e n c ea n a l y s i so ft h ef o u ra l k a n em o n o o x y g e n a s e ss h o w e dt h a tt h ef o u r a l k a r l em o n o o x y g e n a s e sb e l o n g e dt ot h et r a n s m e m b r a n ep r o t e i n a i k b 1a n da i k b 2 h a ds i xt r a n s m e m e b r a n er e g i o n s ，a n da i k b 3a n da l k b 4h a df i v et r a n s m e m b r a n e r e g i o n s e a c ht r a n s m e m b r a n e c o n s i s t e do f2 2a m i n oa c i d s ( e x c e p tf 0 r 俩o t r a n s m e m b r a n er e g i o n 5o fa i k b 4 ) f o u rh i sm o t i f so fh i s 一1 ，h i s - 2 ，h i s 一3a n dh y g w h i c hw e r et y p i c a li nt h ea i k b l i k ea l k a n em o n o o x y g e n a s ep r e s e n t e d1 1 1t h et o u r a l k b s d i f f e r e n tp a i r so fd e g e n e r a t ep r i m e rw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt oa n a l y s i so f t h e c o n s e r v e dr e g i o n so fa l k a n em o n o o x y g e n a s ea l k bg e n e sa n da l k bg e n ef r a g m e n t s w e r ec l o n e db yd e g e n e r a t ep c rf r o mg s t e a r o t h e r m o p h i l u sd m 一2 ，r h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i st 7 2 ，n o c a r d i as p 3 2 2 9 1 a n dp s e u d o m o n a s s e q u e n c ea n a l y s i sa n d h o m o l o g ya n a l y s i sw e r ec a r r i e do u tf o rt h ea l k bg e n ef r a g m e n t sa n dc o m p l e t ea l k b g e n e t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e r ew e r ec e r t a i nd i f f e r e n c e sa m o n gd i f f e r e n t a l k bg e n e ； i d e n t i t ya m o n ga l k bg e n e sb e l o n g i n g t ot h es a m eg e n u sb u ts p e c i e sw a sm u c hh i g h e r s ot h ea l k a n ed e g r a d i n gb a c t e r i u mc o u l db ed e t e c t e df a s ta n da c c u r a t e l yt h r o u g ht h e d e g e n e r a t ep r i m e r sd e s i g n e db yc o n s e r v e dr e g i o n so f t h ea l k bg e n e s k e yw o r d s ：p e t r o l e u m a l k a n ed e g r a d i n gm i c r o o r g a n i s m a l k a n em o n o o x y g e n a s e d e g e n e r a t ep c r t a i l p c rt r a n s m e m b r a n ep r o t e i n 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： 年月日 南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：n 2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 2 0 年月 日 南开大学研究生学位论文作者信息 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 第一章前言 第一章前言 石油不仅是重要的工业原料，也是人类生活的重要能源，石油的组成较复 杂，主要由长链烷烃、环烷烃、芳香烃和一些含硫、氮的化合物组成，不同油 藏中的原油组成和理化性质有很大差异，同时油藏环境具有多样性，这导致油 藏微生物的群落结构的多样性。在油藏环境中存在一类主要的微生物生理群解 烃微生物，是指可以利用石油烃作为生长底物的菌群。解烃微生物通过自身的 代谢作用产生分解酶，裂解重质烃类和石蜡，降低原油粘度，改善原油的流动 性能，以此来提高残余油的洗油率。解烃微生物还可产生表面活性剂、聚合物、 有机酸、醇类和二氧化碳等产物，可以用来驱油或者封堵。解烃微生物大部分 为好氧菌。石油对环境的污染比较广泛，如运输过程中的泄露，采油过程对土 壤的污染等。所以能够以石油为唯一碳源生长的微生物在治理石油污染环境及 微生物提高石油采收率( m i c r o b i o le n h a n c e do i lr e c o v e r y ，m e o r ) 中具有重要 的应用价值【l 捌。因此对烷烃单加氧酶基因的研究可以为提高石油采收率，生物 修复和生物催化提供理论依据。烷烃降解菌的检测则有助于石油勘测及评价环 境中石油污染的程度。 第一节微生物降解烷烃的研究进展 1 1 1 烷烃降解菌 自然界中降解石油烃的微生物分布广泛，约有3 0 属，1 0 0 多种微生物。在 细菌、酵母、丝状真菌、藻类中都发现了能降解石油烃的种类f 2 。之后，很多 学者对解烃菌的分布和分类地位进行了深入研究，特别是对p s e u d o m o n a s 、 a c i n e t o b a c t e r 及n o r c a r d i a 的研究较多。w a t k i n s o n 等【9 1 和v a i lb e i l e n 等旧1 分别对 烷烃降解菌进行了描述，其主要类群见表1 1 。 第一章前言 表1 1 降解烷烃的微生物种类 坠垒竺! 旦! i 塑! 竺璺! 垒! 坠塾g ! 叁! g 璺竺 a c h r o m o b a c t e rc a n d i d a a s p e r g i l l u s p r o t o t h e c a a c i n e t o b a c t e r c r y p t o c o c c u sc l a d o s p o r i u m a l c a n i v o r a x d e b a r y o m y c e sc o r o l l a s p o r i u m a l c a l i g e n e s h a n s e n u l a c u n n i n g h a m e l l a b a c i l l u sp i c h i a d e n d r y p h i e l l a b r e v i b a c t e r i u mr h o d o t o r u l af u s a r i u m b u r k h o l d e r i a s a c c h a r o m y c e s g l i o c l a d i u m c o r y n e b a c 胞r m m s p o r o b o l o m y c e s l u l w o r t h i a f l a v o b a c t e r i u m t o r u l o p s i s p e n i c i l l i u m m y c o b a c t e r i u mt r i c h o s p o r o n v a r i c o s p o r a n o c a r d i ay a r r o w i av e r t i c i l l i u m p s e u d o m o n a s r h o d o c o c c u s s p h i n g o m o n a s 兰2 竺1 2 翌逆箜 之后也分离到一些嗜热解烃菌，如能降解c 1 5 c 1 7 的 b a c i l l u s ( g e o b a c i l l u s ) s t e a r o t h e r m o p h 加【l l 】，能降解c 2 3 的b a c i l l u st h e r m o 跆d 1 移聊2 】。 国内学者对解烃菌的分离鉴定和应用也进行了初步研究。2 0 0 1 年，陈智宇、 刘如林【1 3 】等从中国大港油田官6 9 断块含油层分离能改善原油性质的嗜热芽孢杆 菌，并取得了较好的油藏试验；2 0 0 3 年，曹微寰等【1 4 1 从从腈纶废水中分离出两 株能降解烷烃的诺卡氏菌。2 0 0 6 年，唐贽【7 7 1 等从油藏中分离到一株高温解烃菌 g e o b a c i l l u st h e r m o d e n i t r i f i c a n sn g s 0 2 ，发现其可以降解c 1 2 c 3 6 的直链烷烃， 这是首例关于g e o b a c i l l u st h e r m o d e n i t r i f i c a n s 降解长链烷烃的报道。因此，研究 烷烃降解菌的烷烃降解机制并应用于微生物采油及石油污染治理，有广阔的应 用前景，是值得深入研究的课题。 1 1 2 微生物降解烷烃的途径 微生物对烷烃的降解主要通过以下四种途径： ( 1 ) 单末端氧化途径 m a y 等【1 5 1 指出微生物对烷烃的降解通常是从烷烃链的一个末端开始氧化， 2 第一章前言 这由烷烃单加氧酶完成，氧化产物为伯醇类化合物，伯醇类化合物依次被氧化 成醛和脂肪酸，然后进入d 一氧化途径产生乙酰c o a ，再进入三羧酸循环完全 氧化成c 0 2 和h 2 0 ： r c h 2 一c h 3 一r - c h 2 c h 2 0 h r c h 2 一c h o _ 艮c h 2 c o o h d 一氧化 ( 2 ) 次末端氧化途径 烷烃氧化的第一步是从氧化烷烃一端的第二位碳原子，其产物是仲醇类化 合物，然后进一步氧化成酮、再氧化成酯( e s t e r ) ，酯键裂解产生伯醇和脂肪酸， 伯醇进一步被氧化成醛和脂肪酸，途径如下： r - c h 2 一c h 2 一c h 3 叶r - c h 2 一c h o h - c h 3 一r c h 2 c o c h 3 _ r - c h 2 - o c o - c h 3 h 3 c o o h 一直接氧化成c o z 和h 2 0 c h 2 0 _ r c h o _ r c o o h _ d 一氧化 ( 3 ) 双末端氧化途径 r e h m 等【1 6 1 指出某些细菌和真菌能同时氧化长链烷烃的两个末端甲基，产 生二羧酸产物，即一氧化： h 3 c r c h 3 ，h 3 c r c h 2 0 h ，h 3 c r c o o h h o c h 2 r c o o h ，h o o c r c o o h 上述三条途径中的第一步反应都是由烷烃羟化酶( 又称单加氧酶) 催化完 成。 ( 4 ) 双加氧氧化途径 该途径中的第一步反应是由烷烃双加氧酶催化完成的。 r - c h 2 c h 3 一 r - c h 2 c h 2 0 0 h - - * r c h 2 - c o o h b - 氧化 该途径后来被m a e n g 等【1 刀研究彳c f 玎p 幻6 灯够m 1 证实，并指出烷烃双加 氧酶不需要n a d ( p ) h 辅酶，但必需分子氧( 0 2 ) 的参与。 第二节烷烃羟化酶的研究进展 1 2 1 烷烃羟化酶的种类 3 第一章前言 微生物对烷烃的降解，第一步是在烷烃分子中加入氧使其氧化为醇或酮， 再进一步氧化为脂肪酸进入p 一氧化途径。催化烷烃氧化的第一步酶特别关键， 因此对其研究也较多。目前，已发现的催化烷烃氧化的第一步酶的种类见表1 2 。 表i 2 氧化烷烃的酶种类 f 恤y m e d a s sg 耵咩醯i c l l 刹& l b 5 哺p r 踟小口w n 以 r e l 旨e n c e s e a k , 掣o t i cp 4 5 0 m i c r 0 m do x y g c m 蟹p 4 5 0h a ml k 魄： c l 书1 6q 托盘勿胧龀峨 1 8 ( c y p 5 2 , d a s s n )f a d , f m n , n a d p h 厅日i k 盯瞄 c a r , d 曲 r 蒯p 5 蜘 q 呵啪s y , j a m ( c v p l 5 3 ，d a s s d b u a - e m o n o x y g a 髑e 龇幻砖m 。) b t m mm a r r x y g e r 掘 g 衙i 妇协咖m o ) a i d 3 - t d a 同a l u m h y t t 则, l a s e s d i 嘣携曩l 窿 u d 口咖 p 4 5 0a i ( 、埋a 冒蟹p 4 5 0h e i n ef e n e d o 啦 h m 咀蚰蕾位n 甚蛐f e 血懈f a d , n a d h 1 诵p 0 铆写触伽p 晦i mq 嘁 a i d 嘎曩i e 妇端f a d , n a d h a 算即崎出啦b m d 坷h m a i 艘口f l 圯s l f a d n a d h 雁g l 脚 s t t u 血 k m b 曙h ，d m 衄b i - r u ：k a 油n n l b l e d 【h 缸n 由陀蛐 帕d 誓囱簖f a d , n a d h h 呷的虹c o p 隔f a d 5 4 i 执础偬期豳l f o r t u a a x i d a t i o n 衄触地，忱年懒 r r h o d o c h r o u s 7 e 1 c 1 9 , 2 0 鼢s p e b l 0 4 s h 蛐a b 龇缳蕊 21 , 2 0 ， n c r a - d o 泌s p c f 8 2 2 p s e u d m n t n 篮& 庙，幻咧2 0 2 2 4 d 憎幻& 捌才，4 如叠矗嗽2 3 b u r k h d d 砌, m 扯d 蛔暖咖 产盈d 卿能n 鳆兄垃鞠h x 獬a c 躺s p m - i 2 4 l m m o k a l l a r 1 1 r l o 州m t i oo fh y a t , a 蛔幻c y g mn d 呲足k 瞳战犯西月k 吐d 硒 2 7 堂幽塑堡翌罂理唑兰圣1 2 虫坠坚 1 2 2 烷烃羟化酶系的分子生物学研究 c h a l ( r a b a n y 【2 7 1 在户p u t i d ag p o l ( a t c c 2 9 3 4 7 ，曾被命名为p o l e o v o r a n s g p o l ，或p o l e o v o r a n st f 4 1 l ) 中发现氧化烷烃的酶系是由一个大质粒o c t ( 辛 烷降解质粒) 上的基因编码。之后不同学者对该氧化酶系进行了详细研究。 该酶系由两个基因簇构成，即a l k b a c 和a l k r t 2 8 - 3 0 。a l k b a c 由7 个基因组 成，编码7 个多肽：a l k b 编码烷烃羟化酶a i k b ；a l k f 、a l k g 分别编码红素氧还 蛋白a l l ( f 和a i k g ；a l k h 编码醛脱氢酶a 1 k h ；a l k j 编码醇脱氢酶a l k j ；a l k k 编 码脂酰c o a 合成酶a l l 水：a l k l 编码一个功能未知的外膜蛋白a l l 【l ，后来该操 纵子被重新命名为口船f g h j k l 。 a l k r 由两个基因组成：编码具有诱导物识别功能的转录调节因子a i k s 的 a l k s 及编码红素氧还蛋白还原酶a l k t 的a l k t ，a l k r 后来被重新更名为a l k s t 。 对pp u t i d ag p o l 烷烃氧化酶酶系研究的深入使得各国学者对其它烷烃降解菌的 烷烃羟化酶基因也进行了研究。s m i t s 等【3 l j 用兼并p c r 的方法和基因组测序研 究了不同来源的g + 和g 一烷烃降解菌的a l k 基因，发现其它菌a l k 基因编码的蛋 4 一 嘶一 砜一 一一 第一章前言 白质大都是pp u t i d ag p o l 中相应酶的同系物，同源性为4 3 2 - - 9 3 8 。m a r i n 等吲从b u r k h o l d e r i ac e p a c i ar r l 0 的基因组上克隆出p p u t i d ag p o l 的a l k b 同系 物。s m i t h 等【3 3 】从p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ap a 0 1 、p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n sc h a 0 、 a l c a n i v o r a x b o r k u m e n s i sa p1 、m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sh 37 r v 和p r a u s e r e l l a r u g o s an r r lb 2 2 9 5 中克隆了a l k b 的同系物，并用缺失互补方法验证了其功能， 同时对其a l k 基因的结构进行了比较分析( 如图1 1 ) ，发现不同a i k b 蛋白之间 的氨基酸序列同源性较低，只有3 5 左右；a k 基因的结构在不同菌中有所差异， 有些成簇存在，有些分散存在，并且不同菌株之间除了a l k b 基因外，其它基因 在基因簇内并不一定出现。 i 翌! 翌! 鬯型型竺翌艘竺娑! 翌坐! 罂型：罂型翌宇 迓焉鸯蓊海莎i 寻j 匕亏孑辛= i i 采丢置黜铲一l 。 矾，。矾舢刎掀片诎己一一一 n i t s耐t r 叠二i 手= = 酬霉焉书渺e 焉；拉i 一朋 d = = 婴塑互独= = = = 三廷= j p ：贸s g b i 却sj 铲i | p a i $ 2 6 , d l l t 2 r 抽6 暗， e 懂霹芦辩丢拦p n m2 缓 嗽 fc = = = = 毯墨巫互毒辩日 m i t t | r 玉掰i i 2 k 。t 臻疗i ，1 i k 嚣镪冀 t i 弘 图1 i 不同菌株的a k 基因簇结构 只, e n r m c l i a o s a k a i 3 4 和m a e n 9 0 5 1 等发现能利用长链烷烃自驰c 加p 幻6 口c 册s p m 1 ，降解烷烃 的最长碳链可达c 4 4 。t a n i 等【3 6 】发现a c i n e t o b a c t e rs p m 1 的烷烃降解基因与 a c i n e t o b a c t e rs p a d p i 相似，但在4 c i n e t o b a c t e rs p m l 中存在着两个砒基因： a l k m a 和a l k m b 。m i m m it h r o n e h o l s t t 7 6 1 等在长链烷烃降解菌a c i n e t o b a c t e r 5 第一章前言 s p s t r a i nd s m l 7 8 7 4 中发现在烷烃降解过程中涉及到的两个a l k b 类的烷烃羟化 酶同系物，a l k m a 和a l k m b 。这两个蛋白可以降解c 1 0 c 2 0 的烷烃。文中建立了转 座子突变体库，从6 8 0 0 个转座子突变体中筛选到2 3 个转座插入失活的突变体， 对这些基因的失活和互补实验发现了a l m a 基因，此基因编码一个推定的黄索结 合的单加氧酶。 w h y t e 和v a nb e i l e n 等【3 7 1 联合报道了两株r h o d o c o c c u s 属菌株q15 和n r r l b 1 6 5 3 1 的多重烷烃羟化酶系统，两株菌都有四个烷烃降解基因簇( 图1 2 ) ，q 1 5 和n r r lb 1 6 5 3 l 的a l k b 2 能互补p f l u o r e s c e n sk o b 2 a 1 中的a l k b 缺失( c 1 2 一c 1 6 ) ， 而不能在e c o l ig e c l 3 7 和p p u t i d ag p o l 2 中互补( c 6 c 1 2 缺失) ，表明a l k b 2 与 c 1 2 以上的烷烃羟化有关。之后v a nb e i l e n 等【3 8 】指出a l k b 3 、a i k b 4 常出现在能 降解超过c 2 0 的g + 菌中，这说明a l k b l 、a i k b 3 、a i k b 4 可能分别参与c 1 8 c 3 6 的不同碳链长度烷烃的氧化。 5 0 01 蛹t 鼢和o2 蝴3 0 。o3 鲫。螂4 釉。卿5 5 。o 。岬 l - - j _ j - l j _ - - _ - - ：_ _ _ _ _ - 一 一一_-_。-_-。-。-_-_一m，。o。_-。、一 兄e r y 州s h r r lb 1 髓 、n f r i 蚺，槲2 ，蚺 。砌，锯 l f 爱篓翌王2 翌互驽笾z 互碜一 = ：= 二= 卜 q i 妇l 证鞠m 卸d r i e f 蛳己 ， 。，c ： ! 拍? 神童。纛艟般塾 c j _ = - 一一妻? ，舀笾弦豸 琳 喇 1 1 月1 ：一 ：2 1 堕墅蛙螋些 彬畸 一二= 二二= 二一： 月舟a d 翻x k 硼l i p i t r a i n0 1 5 j 9 7 ，曲4 ，巾m 3 尬8a z k u l 。 2 口协 ( ，翟黧麓琵黧笼雾露孕”馨弦绕帝_ 一 拍n j c 譬嘲聊佣l i n c - ? ? ，u 砂呻4 0龇u 2 二= 二= ：= ，z ：”乞皇乏卜 ，r 口， 一，c 一 图1 2 q 1 5 和n r r l b 1 6 5 3 l 的多重烷烃降解基因簇结构比较 1 2 3 烷烃羟化酶的结构和功能研究 v a nb e i l e n 等 3 9 1 用融合蛋白和定点突变的方法在e c o i l 中表达了 p o l e o v o r a n s 的a l k b 基因，并研究了其拓扑学构象。发现烷烃羟化酶( a i k b ) 包 含6 个跨膜的a 螺旋，而n 端的2 个亲水性的环( 1 0 0 p ) 结构及c 一端的伸展大 片断均位于胞质中，整个肽链的5 2 、11 2 、2 5 1 位置处有3 个短小环( 1 0 0 p ) 结 构暴露于细胞质膜外的周质区。 6 茎二窆监亘 v a l lb e i l e n 等【4 1 i 进一步对p o l e o v o r a n s 降解烷烃的遗传学特性的研究证明 了a k b 是含非血红襄铁的膜整合蛋白，有4 个含h i ：；【 i x x 2 1 x 为任意氯基酸】 的模序( m o t i f ) 。p p u t i d a g p o l 的a i k b 含有6 个跨膜n 螺旋呈六角形分布 形成了一个长的疏水性袋状结构域：位于胞质一侧的袋口处有4 个含h i s 的模序 ( m o t i f )( h l3 s e x x h k l e 1 6 7 h x x g h h l 7 3 ，n 2 6 9 y x e h y g 2 7 5 ， l 3 0 9 q r h x d h h a ) ，该模序中的4 个h i s 可结合2 个f e 2 + 进入疏水袋中的烷 烃末端甲基靠近该结构域，形成了a i k b 的催化中心其中h e x x h k 和 n 2 6 9 y x e h y g 2 7 ，分别位于第四个、第六个跨膜螺旋的胞质侧表面；外侧周质 空间有3 个较为伸展的短肤：第二个跨膜螺旋中w 5 5 的疏水性大侧链伸干疏 水性袋中，形成了底物的结合中心( 图13 左) 。将降解c 5 - - c 1 2 的p p u t i d a g p o l 菌a i k b 的w 5 5 ( t i p ) 突变为$ 5 5 ( s e r ) 或c 5 5 ( c y s ) 后，突变株就能降解 c b 以上的烷烃；将a l c a n i v o r a xb o r k u m e n s i s 能氧化c 6 c 1 2 的a i k b l 中w 5 5 突 变为s 5 5 或c 5 5 后也能降解c 1 3 以上烷烃( 图13 右) 。进一步分析其它能降解 c l ，烷烃的a i k b ( 或a h s ) 氨基酸残基也发现在相应位置都是一些较小侧链的 氪基酸残基( 如a 、v 、l 或i ) ，通过对能降解c 1 0 c 1 6 的m y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i sh 3 7 r v 的烷烃羟化酶定点突变又发现相应位置的氮基酸残基的侧链 越大，所能氧化的烷烃碳链就越小，如l 6 9 f 或l 6 9 w 突变后h 能氧化c 1 0 c l i 烷烃。 2 0 0 5 年，r o j o 对a j k b 结构模型研究给予了很高的评价，并指出该模型有 可能定向改进烷烃羟化酶的特性吲。 w 翳舢8s 蛳- d e r e d 咯# b n 蝉抓，m 图1 3 肋u t i d a g p o l 的烷烃羟化酶a i