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有机相固定化蛋白酶催化合成蔗糖基聚合物的研究 摘要 蔗糖聚合物是指糖组分通过不同的化学反应途径引入到聚合物分子链 中而形成的一种生物可降解的功能高分子材料。本文以酶化学法合成了一 种具有精确结构的含糖聚合物。 第一步，用多孔无机材料做载体，以载体涂布法作为蛋白酶p r o l e a t h e r f g f 的固定化方法，以福林酚法为固定化酶活的测定方法，对蛋白酶f g f 的固定化进行了研究。结果是：硅藻土为f g f 的最佳载体，在硅藻土与酶 的质量比为6 ：1 的条件下，缓冲溶液的最佳p h 为8 至1 0 ，最佳固定化温度为 4 0 。 第二步，以蔗糖和己二酸二乙烯酯( d i v i n y la d i p a t e ，d v a ) 为原料， 以固定化蛋白酶f g f 为催化剂，在有机相中选择性地合成了己二酸单乙烯 基蔗糖单酯( s u c r o s em o n o v i n y l a d l p i ca c i de s t e r ，s m v a ) 。用t l c 、h p l c 、 f t - i r 、m s 、n m r 等对产物s m v a 进行了表征，确定了s m v a 的结构为2 o 己二酸单乙烯基蔗糖酯。证实了固定化蛋白酶f g f 催化的反应，蔗糖的酰 化位置在c 2 位置。在有机相中，考察了有机溶剂种类及含水量、加酶量、 反应温度、反应时间对d v a 转化率的影响，得到了d v a 的最佳转化率为： 在d m f 介质中，含水量0 2 5 ，反应温度4 5 ，酶质量浓度10 0m g m l 的 条件下，反应3d ，d v a 的转化率率为5 2 。 第三步，以蔗糖和d v a 为原料，以固定化磷酸盐为催化剂，在非水相 t 中也能选择性地合成了s m v a 。用h p l c 、t l c f t - i r 、m s 、n m r 等对产物 s m v a 进行了表征，确定了s m v a 的结构。考察了有机溶剂种类、反应温度、 固定化磷酸盐的加入量、反应时间对s m v a 产率的影响。得到了合成s m v a 的优化条件：在1 0 0m ld m f 中，1 0g 固定化磷酸盐，5 0 ，反应1d ，s m v a 的产率为5 4 7 。 用得到的含双键蔗糖酯s m v a 为单体，以氧化还原体系引发了s m v a 的 均聚，合成了含蔗糖聚合物一聚( 2 o 己二酸单乙烯基蔗糖酯) 。用g p c 对 其进行了表征。结果表明所制备的蔗糖基聚合物具有较高的分子量和较窄 的分子量分布。 蔗糖基聚合物作为非诺落芬钙药物缓释片剂的载体，对其在人工肠液 的缓释性能进行了初步探索，经动态渗析法测定，1 0h 内非诺落芬钙在人工 肠液中能够平稳地缓慢释放，缓释效果较好。 关键词：蔗糖基聚合物己二酸单乙烯基蔗糖单酯蛋白酶固定化聚 合药物缓释 i i s t u d yo nc a t a l y t i cs y n t h e s i s o fs u c r o s e b a s e dp o l y m e r sb yi m m o b i l i z e d p r o l e a t h e ri no r g a n i c s o l v e n t a bs t r a c t s u c r o s e b a s e dp o l y m e r sm e a nt h a t t h r o u g hd i f f e r e n tr e s p o n s e ss u g a r c o m p o n e n t sw e r ei n t r o d u c e di n t op o l y m e rm o l e c u l a rc h a i ng r o u p sf o rf o r m i n g f u n c t i o n a la n db i o d e g r a d a b l ep o l y m e r i cm a t e r i a l s t h i sp a p e rs y n t h e s i s e dt h e s u c r o s e - b a s e dp o l y m e r sw i t ht h ea c c u r a t e l yi d e n t i f i e dc h e m i c a ls t r u c t u r eb y c h e m o e n z y m a t i cm e t h o d f i r s t ，w eu s ec o a t i n gm e t h o dt oi m m o b i l i z ep r o l e a t h e rf g fo n t oi n o r g a n i c p o r o u sm a t e r i a l s ，a d o p t ef o l i n - p h e n o lm e t h o dt ot e s te n z y m ea c t i v i t y b a s e do n t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ，t h ec o n c l u s i o nw a sd r a w nt h a tt h ed i a t o m i t ei st h eb e s t s u p p o r ta n dt h a t ，o nt h ec o n d i t i o no f d i a t o m i t ea n de n z y m em a s sr a t i oo f6 ：l ，t h e o p t i m a lp r o c e s sc o n d i t i o n sf o ri m m o b i l i z a t i o no ff g fa r et h a tp hi s 8 10 ； t e m p e r a t u r ei s4 0 s e c o n d ，u s i n gd i v i n y la d i p a t e a n ds u c r o s ea st h er a wm a t e r i a l s ，t h e r e g i o s e l e c t i v es y n t h e s i so f s u c r o s em o n o v i n y l a d l p i ca c i de s t e rw a ss t u d i e dw i t h t h ei m m o b i l i z ep r o l e a t h e r ( f g f ) a sc a t a l y s ti no r g a n i cs o l v e n t t h es t r u c t u r eo f i i i s m v aw a sc h a r a c t e r i z e db yt l c ，h p l c ，f t i r , m s ，n m r t h er e s u l t i n g c h e m i c a ls t r u c t u r ew a s2 一o v i n y l a d i p a t es u c r o s e t h e yi n d i c a t e dt h a t t h e a c y l a t i o no f s u c r o s eo c c u l t so nc 一2c a t a l y z e db yi m m o b i l i z e df g - f i no r g a n i c p h a s e ，t h ee f f e c t so fv a r i o u ss o l v e n t s ，t h ew a t e rc o n t e n to fo r g a n i cs o l v e n t ， i m m o b i l i z e de n z y m ec o n c e n t r a t i o n ，t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，t h er e a c t i o nt i m e o nt h ec o n v e r s i o no f d i v i n y la d i p a t e w e r e i n v e s t i g a t e d t h eo p t i m i z e d e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sa n da c t u a lc o n v e r s i o no fd i v i n y la d i p a t ew e r eo b t a i n e d i n d i v i d u l l ya sf o l l o w s ：d m f , t h ec o n t e n to fw a t e rw a s0 2 5 ，t h ea d d i t i o no f i m m o b i l i z e de n z y m ew a s10 0m e g m l ，t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s4 5 ，3d ， t h ec o n v e r s i o no f d i v i n y la d i p a t ew a su pt o5 2 t h i r d ，u s i n gs u c r o s ea n dd i v i n y la d i p a t ea st h er a wa r t e r i a l ，t h es e l e c t i v e s y n t h e s i so f s u c r o s em o n o v i n y l a d l p i ca c i de s t e rc a nb es i m i l a r l yp e r f o r m e dw i t h t h ea i do fi m m o b i l i z e dp h o s p h a t e sa sc a t a l y s t t h es t r u c t u r eo fs m v aw a s c h a r a c t e r i z e db yt l c ，h p l c ，f t i rh p l c m s ，n m r t h ee f f e c t so fd i f f e r e n t s o l v e n t s ，t h ea d d i t i o no fi m m o b i l i z e dp h o s p h a t e s ，t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r e ， r e a c t i o nt i m eo nt h ey i e l do fs m v aw e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a le x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n sa n dp r a c t i c a ly i e l do fs m v aw e r eo b t a i n e di n d i v i d u a l l ya sf o l l o w s ： 10 0m ld m f , t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s5 0 ，t h ea d d i t i o no fi m m o b i l i z e d p h o s p h a t e sw a s 10g ，1d ，t h ey i e l do fs m v ar e a c h e d5 4 7 t h er e d o xi n i t i a t i o n s y s t e m w a s a d o p t e d t o h o m o p o l y m e r i z e t h e s y n t h e s i z e d2 - o v i n y la d i p a t es u c r o s e ，w h i c hc o n t a i n sa c t i v ed o u b l eb o n d t h e p o l y m e rw a sc h a r a c t e r i z e db yg p c t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es y n t h e s i z e d i v p o l y m e r sh a dh i g h e rm o l e c u l a rw e i g h ta n dn a r r o wd i s t r i b u t i o n t h es l o w - r e l e a s ec h a r a c t e ro fs u c r o s e b a s e d p o l y m e r s a s f e n o p r o f e n c a l c i u mr e l e a s ec a r t i e ri na r t i f i c i a lg a s t r i cj u i c ew a sp r e l i m i n a r yi n v e s t i g a t e d a f t e rc o n f i r m i n go ft h em e t h o do f d y n a m i cd i a l y s i s ，f e n o p r o f e nc a l c i u mc a nb e r e l e a s e ds l o w l yi na r t i f i c i a lg a s t r i cj u i c ei n10h t h er e s u l t eo fs l o wr e l e a s ei s k e yw o r d s ：s u c r o s e - b a s e dp o l y m e r s ；s u c r o s em o n o v i n y l a d l p i ca c i d e s t e r ( s m v a ) ；p r o l e a t h e r ；i m m o b i l i z a t i o n ；p o l y m e r i z a t i o n ；d r u g c o n t r o l l e dr e l e a s e v 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除己注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：殒放 学位论文使用授权说明 年多b 乡日 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时问： 留即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 一：苏数名：圜一 年。日 广西大掌硕士掌位论文有机相固定化蛋白酎 催化合成蔗糖墓聚合物的研究 1 1 前言 第一章综述 蔗糖是一种绿色可再生的生物资源，广泛存在于绿色植物中，是主要的储能物质。 全球每年生产超过1 3 亿吨的蔗糖，蔗糖最大的用途是做食品甜味剂，同时也是医药制品、 食品添加剂及精细化工品等领域的常用原料。因为它是一种价格低廉且高纯度的化合 物，且蔗糖有许多羟基可以与很多试剂发生衍生反应，所以对制备各种不同性质的化合 物来说蔗糖是一种很理想的原料。蔗糖分子中含有多个氢氧基，极易溶于水，预示其具 有很好的生物相溶性。以蔗糖为起始原料可以合成一系列化学产品，这些化学品往往具 有：可生物降解、对环境友好、安全无毒等特性。因此，国际上已经出现一门专门研究 蔗糖的化学，19 5 2 年由化学革新家、美国砂糖研究基金会主席h h h a s s 博士提出“蔗糖 化学”这个名词【l 】。用蔗糖为原料制备的衍生物种类广泛，女n l s o m a l t ，s u c r a l f a t e ，s u c r a l o s e ， a n do l e s t r a t 2 卅等品牌产品。 蔗糖基聚合物是指蔗糖组分通过不同的化学反应途径引入到聚合物分子链中而形 成的一种具有生物可降解特性的功能高分子材料。根据其结构大致可分为两类，一类是 支链含糖，不但具有良好的水溶性可用于生物医学和生物化学，如蛋白质的分离、缓释 药物及细胞培养【5 】等，而且其支链上的糖有可能被生物体内的糖类受体识别，是深入认 识生命现象，研究细胞间分子识别行为的模型分子，因此含糖聚合物合成研究引起各国 学者的重视，成为一个学术热点；另一类分子主链含糖，具有很好的水溶性，可用作卫 生用品、吸水剂、缓释药物等。 1 2 糖基聚合物的分类 1 2 1 主链含糖聚合物 1 9 9 1 年，d o r d i c k 等1 6 j 用枯草杆菌碱性蛋白酶( p r o l e a t h e r ) 催化己二酸二2 ，2 ，2 三氟 乙酯与蔗糖发生转酯化反应，生成主链含糖的聚蔗糖酯，分子量可达1 3 ，0 0 0 ，能溶于水 也能溶于极性有机溶剂。酶降解实验显示，在蛋白酶作用下，聚蔗糖酯的分子量在9d 后降5 三9 0 0 。c h e n & m a r t t 7 1 采m b a c i l l u ss p 碱性蛋白酶催化己二酸衍生物与蔗糖反应，得 厂西大萼明页士掌位论文有机相同定化蛋白酶催化合成蔗糖基聚合物的研究 到一种蔗糖包含在主链上的交替线性聚酯。p a r k 等8 1 研发出了主链含糖的全酶法两步合 成方法。首先，在丙酮等溶剂中以诺维信4 3 5 催化己二酸二乙烯酯与蔗糖的转酯化反应， 得到6 ，6 酯化的蔗糖二酯( s d v a ) ，产率为7 1 3 。然后在丙酮溶剂中用诺维信4 3 5 催 化二醇与s d v a 的缩合反应，得到分子量最高为2 2 ，2 0 0 的聚合物。酶降解实验显示，该 聚合物能被诺维信4 3 5 迅速降解。 h n i 斧l 卵o q , 沪j - 逊屿叫+ c f ，弋h ：呻- - c 曰* - ( - c h 2 - 4 - c 曰。弋h ：弋f ， l lb hb h h o c ( c h 2 ) 4 c 融 图l l 聚蔗糖己二酸酯的酶法合成 f i g 1 1e n z y m a t i cs y n t h e s i so fs u c r o s ep o l y e s t e r 1 2 2 支链含糖聚合物 p a t i l 等网合成了聚蔗糖丙烯酸酯水凝胶。反应由两步组成，第一步，蔗糖酰化得到 蔗糖丙烯酸酯；第二步，丙烯酸酯经自由基引发聚合得到水凝胶。s e h m i t z e r 等以树枝 状聚合物聚酰胺氨与葡萄糖的l ，5 内酯反应，得到端基为葡萄糖的两亲的树枝状聚合物。 在聚合物的侧链引入糖分子后，可以显著改变聚合物的性质。d o r d i c k t l l l 报道了在吡啶 中以脂肪酶p 催化乙烯基丙烯酸酯与甲基半乳糖苷反应得到含糖单体，在水中用b i s 作交 联剂聚合制备凝胶。1 9 9 1 年，p a t i l ，d o r d i c k 等【1 2 1 以吡啶等极性试剂为溶剂，用枯草杆菌 碱性蛋白酶p r o l e a t h e r 催化丙烯酸乙烯酯与蔗糖的转酯化反应，5 天后，有1 丙烯酸蔗糖 酯生成，产率为2 8 。然后在k 2 8 2 0 s h 2 0 2 ( h e o ) 引发下，2 5 ，反应2 4h ，得到 m w = 9 1 0 0 0 ，m n = 5 7 0 0 0 的聚合物。此聚合物溶于n m p ( n 甲基吡咯烷酮) 和d m f 。如 图1 2 所示。 2 j 西大爿明页士掌位论文有和u 阳固定化叠j 白酶催化合成蔗糖墓聚合物的研究 h h 2 0 h + c h 2 一c h c o o c - - - - c h 2 h + c h 一叫七 c = o i 岽争庠牡剧删 h 6 h o h o h 2 c 图1 2 支链含糖聚合物的酶化学法合成 f i g 1 2c h e m o - e n z y m a t i cs y n t h e s i so fp o l y e s t e rc o n t a i n i n gs u c r o s eb r a n c h 1 3 含糖聚合物的合成方法 含糖聚合物的合成方法分为五类：酶法和化学引发法，糖直接与聚合物反应法，辐 射法。目前这五种方法仅限与实验室试验阶段，且绝大多数的报道来源与国外，国内很 少有相关的报道。 1 3 1 酶法合成糖酯聚合物 k a n e k o 等【1 3 】将2 ，2 ，2 一三氟乙醇i = , - - 酸酯和纤维二糖溶于d m f 中，用固定在多孔聚 丙烯板载体上的脂肪酶作为催化剂，4 5 ，反应1 0 , - - - - 1 5 天后，过滤，有机溶剂沉淀， 得到了由线性聚糖酯制成的薄膜。这种合成的聚合物包含两个以上的重复单元，其中多 个的重复单元中含有糖单元。酶降解实验显示，该聚合物在脂肪酶作用下降解，释放出 纤维二糖和己二酸。进一步研究显示，这种聚合物是高度无定型的固体，形状与催化剂 载体类似。p a r k 等【1 御以吡啶等极性试剂为溶剂，用地衣芽孢杆菌蛋白酶催化对苯二甲酸 3 g - 西大掌硕士掌位论文有机相固定化蛋白酶催化合成蔗糖墓聚合物的研究 与蔗糖的转酯化反应，6 天后，检测到有蔗糖二酯生成，2 0 天后，蔗糖二酯的产率为 1 3 1 8 ，其中6 ，6 二酯和6 ，l 二酯的比例为1 ：2 。蔗糖二酯分别与乙二胺和乙二醇缩聚， 得到主链含糖的聚酰胺和聚酯，其数均分子量分别为4 ，3 0 0 和3 ，2 0 0 。h i r o s h i 等【1 5 】第一次 报道了糖醇作为单体进行酶促聚合的反应。他们以山梨糖醇和癸二酸二乙烯酯为单体， 以乙腈为溶剂，用c a n d i d a a n t a r c t i c a 脂肪酶( c a l ) 催化合成了聚癸二酸山梨酯，1 3 c - n m r 分析结果表明，山梨糖醇的酯化位置在6 、1 位，说明酶促反应具有明显的区域选择性。 他们还研究了反应温度与聚合物分子量及产率的关系，当反应温度在2 0 时，产率最 高，但分子量较低；而反应温度为8 0 时，聚合物分子量最高，超过了1 0 ，0 0 0 ，但产率 较低。 1 3 2 化学法合成糖酯聚合物 1 3 2 1 自由基聚合 f u k u d a 等首次通过自由基引发合成了具有低分子量分布的含糖聚合物【1 6 - 1 8 】，采用硝 基氧化物介质为引发剂来控制聚合反应，得到分子量较高的聚合物。用硝基氧化物介质 引发聚合乳糖的乙烯苯甲酰胺，得到乳糖的乙烯苯甲酰胺聚合物。试验中发现，单体中 糖分子上的羟基必须保护起来，才可防止链转移导致的分散度增大。o h n o 等1 8 1 首先用 原子转移自由基聚合方法( a t r p ) 得到了含糖聚合物。以2 溴异丁酸乙酯溴化亚铜体 系为引发剂，在邻苯二甲醚中，8 0 ，聚合得到了单体1 ，产物分子量分布在1 2 1 5 之 间，数均分子量可达2 0 0 ，0 0 0d a 。采取分步加料的方法可得到苯乙烯与糖基化单体l 的嵌 段共聚物且分子量分布较窄。羟基脱保护后，得到的两亲聚合物可用于具有微相分离结 构的膜的制备，其中糖单体段为连续相，苯乙烯段为球状分散相。n a r a i n 等1 1 9 1 报道了一 种可以不用保护羟基，直接通过a t r p 方法控制聚合含糖甲基丙烯酸酯类单体的方法。 单体2 ( g a m a ) 和单体3 ( l a m a ) 利用a t r p 方法都可以得到分子量分布很窄的均聚 物。在甲醇或甲醇水= 9 ：1 的体系中，都可以得到g a m a 的聚合产物，但随溶剂中水的 含量增多，反应可控性变差。l a m a 不溶于甲醇，在甲醇水= 3 ：2 的混合溶剂中，可得 到分子量分布小于1 2 6 的产物。 4 广西大掌硕士掌位论文有机相固定化蛋白酶催化合成蔗糖基聚合物的研究 图1 - 3 含糖单体 f i g 1 - 3m o n o m e r sc o n t a i n i n gs u g a r s 1 3 2 2 离子聚合 m i n o d a 等以活性阳离子聚合法制备了乙烯醚类聚合物 2 0 - 2 1 1 。用邻苯二甲酰基保护氨 基，乙酰基保护羟基的葡萄糖胺的乙基乙烯醚类单体以三氟乙酸二氯乙基铝引发阳离子 聚合，然后水解去掉保护基，得到分子量分布较窄的支链含葡萄糖胺侧基的亲水性聚合 物。紧接着研究了葡萄糖乙基乙烯醚类单体，以乙酰基保护时，适用的引发体系是三氟 乙酸- 氯乙基铝，而以异亚丙基保护时，适用的引发体系是二磺化锌盐酸。h i r a o 等采 用阴离子活性聚合法制备了一系列苯乙烯的单糖衍生物【2 2 1 。用仲丁基锂引发聚合半乳 糖、呋喃葡萄糖、果糖、山梨糖的间位取代的苄乙烯衍生物单体，得到了较高分子量且 窄分布的聚合物，但对位取代的葡萄糖苄乙烯单体，却没有发生聚合。以问位取代的葡 萄糖苄乙烯聚合物或活性聚苯乙烯作引发剂时，得到了结构确定的嵌段聚合物。 1 3 3 糖与聚合物直接反应 用糖与聚合物反应得到含糖的聚合物，是在支链上接入糖分子，可以大大改变聚合 物的理化性质。k o d a m a 等合成了含的含半乳糖侧基和葡萄糖侧基的聚丙烯酰胺。用聚 丙烯酰氯为原料，与半乳糖胺或葡萄糖胺通过大分子反应，得到亲水性的含糖聚合物2 3 1 。 g a r i ao t e i z a 等以聚乙烯醇为原料，首先与氯甲酰4 硝基苯酯反应，得到聚乙烯醇的4 硝 基苯碳酸酯，然后和葡萄糖胺反应，于聚乙烯醇支链上引入葡萄糖胺2 4 1 。r u e b n e r 等以 聚烯丙胺( p a a ) 为起始原料，与单6 甲苯基磺酰6 脱氧y 环糊精反应，于氨基上接 上了环糊精( 环糊精的环状孔洞结构，接到聚合物的侧链之后，可显著改善聚合物的各 项物理化学性质，在分子识别、超分子组装等方面有重要应用) ，再与丙烯酸n 琥珀酰 亚胺酯反应，引入乙酰基掩蔽的氨基，得到的侧基是y 环糊精的线性烯丙胺聚合物比 5 一 卜n g - 西大掌司e 士学位论文有机相同定化蛋白酶催化合成蔗糖基聚合物的研究 聚烯丙胺的粘度变大，水溶性变高，可用作聚合载体【2 引。 1 3 4 预辐射法 预辐射法合成蔗糖基聚合物即：用蔗糖在6 0 c o 的y 射线下辐照一定时间后，蔗糖被 活化产生自由基，离开辐射场后，活化的蔗糖将和另一体单体一起引发聚合，合成蔗糖 基聚合物。 预辐射法是高分子辐射接枝聚合领域的一分支。高分子辐射接枝聚合 2 6 1 ，是指用高 能射线为辐射源，使单体与聚合物发生聚合反应生成接枝共聚物的过程，是改性制备新 型高分子材料的方法之一。用于辐射接枝方法中的辐射源主要有2 种，如人工放射源( 如 铯1 3 7 ，钻6 0 ，锶9 0 等y 射线) 和天然放射源及各种不同类型的加速器( 如回旋加速 器、直线加速器、x 射线管及其他高能装置) 。它们的作用原理都是通过高能辐射激发聚 合物分子并引起正负离子的分解、电离、电荷的中和，并进一步引发多种化学反应，尤 其是自由基反应。辐射接枝聚合方法简单，可在常温下反应，不需要引发剂、催化剂， 接枝率容易控制，因而在高分子材料改性领域广泛使用。 辐射接枝的方法主要有2 种：预辐射接枝法( 又称连续辐射接枝法或间接辐射接枝 法) 、共辐射接枝法( 又称同时辐射接枝法或直接辐射接枝法) 。预辐射接枝法是在无氧 或真空条件下先对聚合物进行辐射，然后将其浸泡在抽出空气的单体或其溶液中，经一 段时间后聚合物上辐射生成的自由基与单体反应，即得接枝共聚物，或在空气中预辐射 聚合物，生成过氧化物，然后进行单体接枝。共辐射接枝法中，接枝单体和主干聚合物 在射线作用下都生成自由基，既有接枝单体和主干聚合物的接枝共聚物生成，也有接枝 单体的均聚物生成。故此，共辐射法对接枝单体要求较高，否则易生成均聚物。该法的 优点是工艺简单，自由基利用率高，单体对高分子材料有辐射保护作用【2 7 1 。 1 4 糖酯聚合物的应用 1 4 1 药物缓释材料 n i t i n 2 8 】等合成了聚蔗糖丙烯酸酯水凝胶，用这种水凝胶为载体，研究了y 球蛋白 和牛血清白蛋白的释放动力学。释放实验表明：在最开始2 5 4 , 时蛋白质释放量较大，接 着是缓慢且持续释放。故此，水凝胶聚蔗糖丙烯酸酯是一种很好的缓释剂。c h e n 例 在聚合反应中加入发泡剂成功制备了具有快速溶胀特性的多孔水凝胶，因为用作长期的 药物缓释的制剂的一个重要特性是干凝胶的快速溶胀，而c h e n 合成的水凝胶比蔗糖水凝 6 广。因r 大掌硕士学位论文 有机相固定化蛋白m 1 p m - 叱合成蔗糖墓聚合物的研究 胶溶胀速度快而且具有很高的溶胀比，故，这种多孔蔗糖基聚合物水凝胶特别适于药物 缓释剂。 1 4 2 水凝胶 水凝胶，即一种在水中能溶胀且保持大量水分而又不溶解的交联聚合物。含糖的水 凝胶具有良好的亲水保水性和生物相容性。k u r t h 等制备的含乳糖聚合物水凝胶，可吸 水达8 9 ，因此可以用作生物相容材料【3 0 。3 1 1 。d o r d i c k 等合成的特征手性分子水凝胶可作 为选择分离、信号传感等用途3 2 1 ，含半乳糖的水凝胶可作为生物相容材料和吸水剂3 3 1 、 食品添加剂等阴1 和生物医药p 习。王钒等合成的烯丙基葡萄糖水凝胶，对蛋白质混合样品 的分离有一定作用。 1 4 3 对农作物增产，增甜等的作用 蔗糖基聚合物对于荔枝的增甜【3 6 1 、玉米的增产【3 7 1 、平菇的增产3 8 1 以及芒果保鲜3 9 】 等方面有着较好的作用。喷洒了蔗糖基聚合物水溶液的荔枝、甘蔗、玉米等后，能够明 显促进植物叶片内叶绿素的生成，延长叶片功能期，提高光合作用速率与时间，并能有 效降低呼吸作用对糖分的分解，促进了光合作用和光合产物的积累。将蔗糖基聚合物配 成一定比例水溶液喷洒在植物叶片上，待水在叶面上挥发后能够形成一层蔗糖基聚合物 薄膜，从而降低了叶片的呼吸速率和蒸腾速率，减少呼吸消耗，且仍能保证作物的正常 生长，最后的表现即玉米子粒产量增加、甘蔗含糖量变大和荔枝甜度增加。 利用蔗糖基聚合物的无毒、安全和成膜性，而且形成的膜具有自发气调、防霉等作 用，并且蔗糖基聚合物对果蔬贮藏具有保鲜、防止变化的作用，因此，可作为蔬菜及水 果等经济作物的保鲜材料，而且成本低，操作简便，容易推广。蔗糖基聚合物还可以作 为植物生长调节剂应用于其他作物的增产。 1 4 4 医学药学用途 蔗糖基聚合物可以用于病毒抗体的细胞识别过程和组织工程，可以作生物医学材 料，还可以用于接触镜、手术缝合线、皮肤、人工肺等组织器官，尿布、药物释放剂等 卫生用品 4 0 1 。在一定的生理条件下含还原糖的聚合物能产生自由基，作用于病毒的失活 和d n a 的分裂，对生物系统具有重要作用【4 1 1 ，此外用酶促或酶化学方法制备的很多具有 特定结构的蔗糖基聚合物可以作为研究生物体内复杂的寡糖、聚糖以及人工合成的生物 材料的构象分析、生物活性作用的模型化合物4 2 。如具有大孔水凝胶结构聚蔗糖丙烯酸 酯，可以用于手性氨基酸拆分的印迹水凝胶h 3 1 ，蛋白质大分子的控制释放m 1 等多种用途。 7 g - 西大学硕士学位论文有机相同定化蛋白酶催化合成囊 j 暗墓聚合物的研究 1 5 酶的固定化 酶的化学本质是蛋白质，是高催化活性、高选择性、环保无污染及反应条件温和的 生物催化剂。然而游离态的酶对强酸、热、高离子强度、强碱、有机溶剂等因素耐受性 较差，易中毒失活，并且用游离态的酶来催化反应，反应后酶中会混入原料和产物等物 质，纯化困难，大多数基本不能重复使用。基于这些问题，酶的固定化技术于2 0 世纪6 0 年代发展起来。它是模拟体内酶的作用原理( 大多数体内酶与膜类物质相结合并参与特 有的催化反应) ，通过物理或化学的手段，将酶束缚或限制在载体的一定区域范围内， 使酶分子在此区域之中进行特有的催化作用，并可回收及长期重复使用的一种交叉学科 技术【4 5 】。固定化酶( i m m o b i l i z e de n z y m e ) 这个术语是在1 9 7 3 年酶工程会议上被推荐使 用的闱。t r e v a n l 4 7 1 在1 9 8 0 年给固定化酶下了一个定义：酶的固定化就是通过一些方法将 酶与载体相结合后成为不溶于含有反应物的相中，从而使酶被限制或集中在一定的空间 范围内进行酶解反应。人类历史上最早进行酶固定化的实验是在1 9 1 6 年，n e l o s n 和g r i f j f i n 发现蔗糖酶吸附在骨炭微粒上仍保持与游离酶同样的活性。1 9 5 3 年，s c h l e i h t 和g r u b h o f e r 通过重氮化共价结合法将多种酶固定在聚氨基苯乙烯树脂上【4 司；19 6 3 年，w a n 和b e m f e l d 利用聚丙烯酰胺包埋法固定了多种酶【4 9 】；1 9 6 9 年，日本的千烟一郎等将固定化酰化氨基 水解酶用于d l 氨基酸的拆分，并成功地实现了工业化【5 0 】。 1 5 1 酶的固定化方法 传统的酶固定化方法大体可分为4 类：吸附法、包埋法、交联法及共价结合法。 吸附法是最早出现的酶固定化方法，包括离子交换吸附和物理吸附。该法条件温和， 酶的构型基本不变或变化较小，故酶的催化活性改变小，但载体和酶之间只是通过物理 作用而吸附，在不适p h 、高温、高盐浓度等不利条件下，酶极易从载体脱落、失活甚至 污染催化反应产物。朱祥瑞等【5 l 】将稀碱溶液处理后的脱胶蚕丝做载体，以物理吸附固定 q 淀粉酶，成功制备固定化q 淀粉酶。每克固定化酶的总活力为4 3 9 8 1u ，活力表现 率：7 4 1 8 ，固定化酶活力回收率：4 8 3 3 ，。彭立风等【5 2 1 研究了以c a c 0 3 吸附固定脂 肪酶的方法。该固定化酶容易从反应体系中回收，重复使用5 次，酶活力仍留有7 3 3 7 ， 制得的固定化酶能催化棕榈油固相甘油解反应生成单甘酯，有效降低了催化剂的消耗。 交联法是利用多功能交联试剂，在交联试剂和酶分子及交联试剂与载体之间形成共 价键，从而把酶分子与载体联系起来，采用在不同的交联体系和不同的无机载体，在不 同的交联条件下，可以生成物理性质及催化性能各异的固定化酶。交联法可独立做一种 8 广西大掌硕士掌位论文有机相圃定化蛋白1 1 t l - 催化合成蔗糖墓聚合物的研究 固定化方法也可以作为其它固定化方法的辅助手段【5 3 】。钱军民等f 州研究了利用氨基化硅 胶做载体，戊二醛做交联剂，葡萄糖氧化酶( g o d ) 的交联固定化实验，试验了戊二醛 浓度、四甲氧基硅( t m o s ) 用量、温度、给酶量和p h 值等因素对固定化葡萄糖氧化酶 活力的影响，得到了优化的固定化条件：戊二醛的浓度为2 o ，t m o s 用量为1 0 ，最 适p h 和最适温度分别为5 2 和3 2 ，给酶量为1 6 0 0u ，固定化葡萄糖氧化酶具有良好的 贮存稳定性和热稳定性。q u i n n 等【5 5 】用戊二醛作交联剂，石墨为载体固定化1 3 乳糖苷酶， 在石墨特有活性区域2 5 1 0 0 和1 7 1 0 0 时，固载量分别为1 1u c m 2 和1 8u c m 2 时，活性随 酶固载量的增加而增加，固定酶的k m 值约为游离酶5 倍。用此固定酶( 质量分数5 ) 水解乳糖，在3 7 、3 5h 以上乳糖水解接7 0 。实验证明，该固定酶有很好的可操作 性和贮存稳定性。 包埋法的基本原理是含酶的缓冲溶液与载体混合后，用某种引发剂引发聚合，将酶 包埋在载体的网格中的一种酶固定化方法。a r v i n d 等【5 6 】将用丙酮等溶液提纯后的脲酶， 用包埋法将其固定在褐藻酸钙盐形成的小球中。实验证明，以褐藻酸钙盐固定后的脲酶 的酶活高于游离的脲酶酶活且能重复使用。 共价结合法是指载体表面的活性功能基团与酶分子的非必须基团通过形成化学共 价健实现不可逆结合的酶固定方法。w a n g 等t 5 7 】以羟丙甲基纤维素乙酸琥珀酸盐为载 体，用共价结合法固定化绿脓杆菌制备的壳多糖酶。该载体在p h 值5 5 以上是溶于水的， 低于p h = 4 5 时是不溶性物质，对粗酶液固定，有效固定酶量达9 9 。游离壳多糖酶活化 能为4 1 3 8k j g m o l ，而固定化酶活化能为2 4 9 1u g m o l ，固定化酶的最适温度为5 0 ， 最适p h 为8 0 ，其半衰期由9d 提高至1 3d ，且重复使用1 0 次后，酶活仍保持7 0 。 表1 - 1 固定化方法的优缺点比较 t a b l e1 - 1c o m p a r i s o no fi m m o b i l i z a t i o nm e t h o d s 9 广西大掌硕士掌位论文有机相同定化蛋白酶 f l t 化合成蔗糖基聚合物的研究 1 6 本课题的意义 本课题来源于“广西亚热带生物资源保护利用重点实验室建设主任基金功能性新 材料蔗糖基聚合物的酶法合成和反应机理研究( 桂科能0 6 3 0 0 0 6 5 b ) 。 蔗糖是自然界中产量最大的二糖，其全球年产量约为1 2 4 亿吨。由于它是一种可再 生且纯度高的绿色原料，除了作为食品甜味剂外，以其为基础制成的各种新型蔗糖聚合 物已经成了材料科学的研究热点。通过各种途径将蔗糖分子引入聚合物链中而形成的蔗 糖基聚合物就是其中之一。由于引入蔗糖可以改善聚合物的亲水性、生物相容性和生物 降解性，从而使蔗糖基聚合物在医药、精细化工、生物等方面成为具有多种特殊用途的 功能材料。蔗糖基聚合物的合成主要有两类途经，一是先制备聚合物再与蔗糖进行大分 子反应而得到，二是先制备含有不饱和双键的蔗糖酯再迸一步引发聚合而得到，第二种 途径用得较多。前面综述提到在制备蔗糖酯时有酶法和化学法，由于蔗糖分子上存在8 个化学反应活性相近的氢氧基，用化学法合成蔗糖酯往往得到很多酰化位置不同和酰化 程度不同的混合物，且反应的副产物也很多，产品的颜色较深，反应后产物难以分离。 如果使用羟基保护和去保护法将会使得反应冗长且繁琐。相比之下，酶法具有选择性高、 反应条件温和、产物易于分离纯化等特点，但酶在有机相中的活力和使用寿命均较低， 故一般来说酶法合成蔗糖酯的产率不高，使酶法的应用受到限制。本课题选择具有区位 选择性的蛋白酶f g f 和磷酸盐作为催化剂，为了提高其利用率，以硅藻土作为载体分别 制成固定化酶和固定化磷酸盐，可以重复使用多次。在非水介质中这两种固定化材料均 可催化蔗糖和己二酸二乙烯酯合成含有双键的蔗糖酯，取得了较好的产率。再用过硫酸 钾为引发剂合成了蔗糖基聚合物。由于本课题所选的催化剂具有区位选择性，操作过程 简便，而产率较高，很大程度上降低了生产成本，因此具有较高的学术意义和潜在的应 用价值。 广西是中国蔗糖的主要产区之一，据统计2 0 0 8 0 9 年榨季广西蔗糖总产量9 3 7 2 万吨， 我国蔗糖产量1 4 8 0 万吨，广西蔗糖产量占全国产量的6 3 左右，是广西区最主要的支柱 产业，全区有2 0 0 0 多万入口从事甘蔗糖业及其衍生产业的生产，本课题开发环保、无 毒的蔗糖脂肪酸酯及蔗糖基聚合物的生产，为蔗糖的深加工增加了一条可能的新途径， 对延伸蔗糖产业链具有潜在的实际意义。 1 0 广西大学硕士学位论文有机相固定化蛋白m w - 催化合成蔗糖墓聚合物的研究 2 1 前沿 第二章枯草杆菌蛋白酶( f g f ) 的固定化 传统的酶固定化方法大致可分为四类：吸附法、交联法、包埋法、共价结合法。吸 附法是最早出现的酶固定化方法，包括物理吸附和离子交换吸附。以吸附法固定化酶， 酶的构象基本不变或很少改变，因此，酶的催化活力损失小；此外，虽然吸附法主要依 靠载体和蛋白质之间的结合力联结，作用力弱，酶容易脱落，但载体可供选择的范围较 广，价格低廉，固定化操作过程简单，因此吸附法依然是最具吸引力的固定化方法。 用吸附法制备固定化酶，操作比较简单，可以划分为以下四类i 水相固定化法：早期常见的一种吸附固定化方法，将酶溶于一定p h 值的缓冲液中， 加入一定量的无机固定化载体，搅拌或振荡一定时间，抽滤、洗涤、冷冻或真空干燥， 即得固定化酶。此法操作简单，成本低廉，但制得的固定化酶酶活力相差很大。许多文 献报到，大部分酶仍留在缓冲液中，酶的利用率低，一般情况，随着载体疏水性的增大， 载体固载酶的能力有所加强。 载体表面涂布法【5 8 - 5 9 ：即将一定量酶粉溶解于少许一定p h 值的缓冲液，加入固定化 载体，搅拌均匀，冷冻或真空干燥，即得固定化酶。此法是直接将酶涂布于载体上，能 有效避免水相固定化法中酶的大量流失这一缺点，酶在载体上吸附较均匀，酶的分子构 型改变小，酶活损失小，所制得的固定化酶活性与载体性质有较大的关系，选择合适的 载体可以大幅提高固定化酶的酶活，非常适用于非水相酶促反应。 有机溶剂沉淀法【5 9 】：将一定量的酶粉溶解于一定p h 值的且含有固定化载体的缓冲 溶液中，向