（微生物学专业论文）铜绿假单胞菌运动能力相关新基因的筛选和功能研究.pdf

摘要 缺陷 株的表型同m u 插入失活的pa5017突变株的表型一致。由 此证明pa勿17 基因参与了调控运动能力和生物被膜的功能。根据结构域和同源性分析，推测 队5 017可能是一种信号蛋白.利用启动子融合报告基因的方法来研究 paj 0 17 与调控菌体运动能力的化学趋向性系统之间可能的关系。数据分析发现，在 paj 01夕 突变株中，操纵子动 1 乞 4 b的 表达增加约一倍。 根据以上的实验结果， 本文首次提出paj 0 17基因可能通过对化学趋向性操纵子c hel 亿 咬 b 的负调节来调 控菌体的运动能力， 从而影响生物被膜的形成. paj 0 2 2突变株是一株泳动能力减弱和生物被膜形成增加的菌株。遗传互补 未能 使pa万 022 突 变 株的 表型恢复. 用几 叮 d n a聚 合酶单酶r i - p cr 的 方 法初步 排除了转座子d n a插入可能引 起的极性效应。 同源重组的结果排除了可能存在 的菌株特异性影响。 分析突变株表型不能互补的原因可能是由于pa5 022 未能正 确折叠或定位等原因。 据文献报道， pa万 口 2 2基因失活的 突变株毒力减弱，推测 paj 0 2 2基因可能是一个毒力因子的调控蛋白。 群体感应系统是一个重要的毒力 因子调控系统，同时， 还参与生物被膜形成的 调控。 文中 首次将pa万 口 2 2 基因的 功能与群 体感应系 统 联系在一 起， 选择了6 个群 体感 应相 关基因2 瓦 叮 、 rk ll.， 。 万 、 rp os、 qs cr和匆 夕 刀的启动子区融合质粒， 分别转化入野生株pa68和paj 0 2 2 突 变株中. 根据报告基因 表达的差异， 推测pa勿2 2 可能 通过正向 调节v q sr 因 子 来实现对群体感应系统的调控， 进而影响菌株的毒力。 pa万 口 口 1突变株是本文中发现的另一株泳动能力减弱和生物被膜形成增加的 突变株。 遗传互补和同 源重组的结果证实了paj 0 0i基因参与鞭毛泳动能力和生 物被膜形成的 功能。 根据结构域和同 源性分析， 推测pa刃01基因可能编码糖基 转移酶， 可能通过参与能量代谢来参与调控鞭毛的泳动能 力。 通过对运动相关新基因的不断研究，可以为进一步阐述菌体的运动机理， 理解生物被膜的形成机制，为预防和治疗铜绿假单胞菌引起的感染提供实验依 据。 关键词:铜绿假单胞菌;菌毛; 鞭毛;运动能力;生物被膜 ab s t r a c t ab s t 门ct 厂 怡 e u dom on以a e r ug功 o s a isa ty p ic al o ppo rt u n i s ticp at h o g enw hi cho n 叨c ause s 留 约 。 usan d pers l s t e n t i n 丘 父 t l o n inth e 加st.li s p a t h o g en es isand an t i b 1 otic re si s t a n ce are d u e tothe p r e senc e o f se ri ai s v i ru l encefact o r s a n d th e fo rmatio no f hi o fi lin. r ag e l 】 切 皿and禅 l us o f paer ug加 os ap r o vi de the o rg 耐sm withv iru 】 enceand moti l i tyabili tyw hi chpl ayanl m po比 川 t ro leinth e i ni ti atio n o f bi o fi linfo rma t i onand k e e p ing the normals 廿 u c tu reo f b i o fi l m . t 五 e p u rp o seo f 而s s to d y i s todi scovern e w g e n esi n v o lved inthe m otil ity o f p.aer “ 9 王 n os aand d e t e m l l n e the fi m c ti o nsofthe n e wg e n es. itise x pec ted toe x p 】ore th em e c h has mt h em o t i l l ty ， top r e v e n t th e 几 n n a t l ono f b fo fi linad d top r o v l dethe pot e n t i al targ ets iteforthe d ru g desi 笋 hu 五 s s t u d y ， mu tr 姗positioncom p l exeste c 匕 吐 q u e was util l ze d toc o n s tl 刀 c t the m u 。 叮 t l ib r 田 下。 f pa e 尸 ug切 os as tr ai 匕队6 8w h l ch wasa d 面c ali so 】 a t e froma p a t l e ntwithb r o n c hi e c 枉 15 1 5 . f r o ma boutz 0 0 0 m u l n se rt l onm u 加 口 t s ， g m u 加 口 ts俪th deficient 丽t c 幽g m o t i l ity， g m u 加 口 t s w i thl m p a ir e d s w l n u 刀 i n g m o til ityand l m u . 叮 t i m p 出 r e d boths wi n 刀 m ln g an d s w a n n l n g m 0 t i l ityweresc reen ed g e necl 。 川 n g 出 l d d n a se q u e n c ing o f the r e g i onfl 助 苗 n g the 1 ns e rt 1 o n s itereve al edth at the p h e n o types w e redue tothe l n a c t i v a t i o n o f lsdi ffer e n t g e n e s in se 众d b y m u tr anspons o n d n a f o urn ew g e n e s ( paz 好0，paj o 口 了 ， paj 017 and paj 0 2 2 ) were五 r s t l y di sc o vere d tobe i n v o l v e d inthe s 叭 1 田 口 旧 n g ors w aj m 山 n g m o til ity. s o u t h e 邝bl 喊访 g c o 川 分 m e d t b a t the 访 ， 币。 n 、 v a s o cc理 rr edasa s i n gl e e v e n 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v e l b y pr o vi d 1 n g the paj 0 1 7 g ene in加n s . the m u t a n t 砂区 pa5 0 1 7 w a g e n e r a t e d妙 g e ne r e p i 即 e m ent inpaer 切 卯 n o s ap a kb as 曰 on hom o l o gy 卿o m b in at i on.丁 七 ere s ult t h a tthep h e n o t y pe o fth em u 。 口 tp a k pa5 0 1 7 ( 别万 0 1 7 : 汤m ) was co nsl s t e n t w i t h the paj 0 1 7 m u ta nt( pa5 0 7 : : mu ) e x c l u d e d the s tr a i n sp e c i fi c . i t was p r e d i c t e d t h a t pa5 0 1 7 p o s s i b l y b e l ong toa si gna 1 p r o te i n b as ed on the dom ain and hom ol o gyan吻51 5 . the chemo taxissy stemc 】 us t e r l (che ) 2 咬 b 即dche 初 吟哟 胡 dcl uster z( che r 巧 w hi ch c o n t ro lss w ln ” n in gands w aj m 叭 n g m otil ityinp.aer 砚夸n o s a hav e beendesc ri bed topl ayani m port ant ro leinb a c t e ri a m o t l l i ty . to d e t e n n in e w h c t h e r t h e r e w a s a di re ctorin d ir e ctc o rr e 1 at i on抚twe enth e paj 017 ge n e and the c h e m o t axl s s y s t e m ， the predi c t e d p ro m oter re gi ons o f 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l o n . liw i l l b e 】 p ful to p r e v e n t and c u 比 e th e i n fe ctionc ause d by尸a e r ug功 。 j 以 k 叮w o rds: 只口 己 尹 材 9 功 o s a ， pi lus沮a g e l 城m o t l lity ， hi o fi lin. 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、 保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本;学校有权保存学位论文的印刷本和电 子版，并采用影印、缩印、 扫描、 数字化或其它手段保存论文; 学校有权提供目 录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务; 学校有权按有关规定向国家有 关部门 或者机构送交论文的复印 件和电 子版; 在不以 赢利为目 的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学 位 论 文 作 者 签 名 : 手仰丽 如7 年士月寸日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在 二 年解密后适用 本授权书。 指导教师签名: 枷 愁学位论文作者签名:拳迎函 解密时间: 加夕 年 了月 对 日 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文， 是本人在导师指导下， 进行 研究工作所取得的成果。 除文中己 经注明引用的内 容外， 本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、 己公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。 对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体， 均己在文中以明确方式标明。 本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学 位 论 文 作 者 签 名 : 参匆丽 2 呵 年士月才日 第一章 前言 第一章 前言 铜绿 假单胞菌 仔 怡 “ 由m 口 。 。 己 八 心 功 osa ， pa) ， 又称绿脓杆菌， 属于假单 胞菌科 仔b 功 ilrpse u dom ) 假单胞菌属 ( 凡 赵 由用 口 nas ) 。 该菌是革兰氏阴 性 菌，无芽胞， 有数根菌毛和单一端生鞭毛，运动活泼，广泛分布于自 然界 ( 土 壤、水和空气) 、人体的皮肤、肠道和上呼吸道中。 铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌，也是引起严重的医院内获得性感 染的常见病原菌之一，常引起慢性难治性感染。在医院感染中，铜绿假单胞菌 的 检出 率 仅次于 金黄 色葡 萄球菌 和大 肠杆菌 尽 。 在一些 慢 性疾病和 宿主免 疫功能 受损时，易引起支气管一 肺部的原发性铜绿假单胞菌感染;该菌也常引发慢性支 气管炎及囊性纤维化继发感染等疾病，是导致严重烧伤、创伤感染病人，囊性 纤维化病人及晚期肿瘤患者的死亡的重要原因 之一，严重危害着人类的健康和 生命 3 ，4 。 铜绿假单胞菌的致病性和多重耐药性是多 种因素共同作用的结果。一方面， 一系列的毒力因子的存在和产生，如菌毛、 鞭毛、内毒素、外毒素a 、各种蛋白 酶和色素等，使得其致病机理变得非常复杂。另一方面，铜绿假单胞菌易形成 生物被膜，是导致其耐药性不断增强的一个重要原因。目前对铜绿假单胞菌感 染的防治是医学界迫切需要解决的问题， 对其致病机理及耐药性的研究对于预 防和治疗由铜绿假单胞菌引起的感染有重要指导意义。 l l铜绿假单脸菌的生物学特性 铜绿假单胞菌大小为0. 5 刁.8阿xl. 5 弓.0阿， 在普通培养基上生长良 好， 属于专性需氧菌。它的菌落形态不一，扁平湿润，边缘不整齐。铜绿假单胞菌 最适生长温度为2537 ， 但在温度高至42时 仍然可以 存活; 其生存的ph 值 范围 为，9 ，最适ph 值为70 铜绿假单胞菌能产生多种水溶性色素，主要为绿脓素和荧光素。绿脓素为 蓝绿色的吩嗦类化合物， 无荧光性， 溶于水或氯仿中: 荧光素呈绿色，只溶于 水 ， 。 绿 脓素 是 铜绿假单胞菌 特有的 色素， 故 有诊 断 意义. 第一章 前言 1 3铜绿假单胞菌的运动器官 l 3. l菌毛 铜 绿 假单 胞 菌的 菌 毛 是w型菌 毛 ( t y pew pi lus ， 吓p ) . tfp 是 细 菌 表面 独特的附属物， 它们不仅是微生物附着所必需的，而且参与菌体的 运动， 如粘 球菌属的 滑 移运动 ( glid 吨 m o t i l ity) 、 假单胞菌 和奈瑟 ( 氏 ) 菌 属的 蹭行运动 ( 丽忆 场 n g m otil ity) 等. 在至少25种以 上 革兰氏 阴 性 菌中 都 存 在w型菌 毛， 这些菌包括铜绿假单胞菌 仔， “ 由脚 口 nas ae r ug 功 osa )、淋球菌 ( nei“ e r i a gon o 厅 h o eae ) ， 牛莫拉氏 杆菌( 入 勿 r 叮 ilabovis) 、 霍乱弧菌( 叭 西 对 口 ch口 le rae ) 、 粘膜炎布兰汉( 氏) 球菌 ( 刀 m 肋口 功 e lla cata r r hal is )和肠道病原性大肠杆菌 ( ente 尸 opa t h o g e n ic 及c h e r i c h iacoli ， e p e c ) 等， 许多细菌利用t 下 p 感染宿主( 包 括 真 菌、 植 物、 动 物 和 人 类) 15. 在铜绿假单胞菌感染中， w型菌毛是重要的定植因子。 菌体通过iv型菌毛 薪附 到易 感宿 主细 胞 表面， 引 起感染1 ” 。 . 除 此 之外， iv型菌 毛还参 与铜绿 假单 胞菌的 其它过 程， 如 蹭 行运动、 生物被膜的 形 成 21 和自 然转 化 左 刀 等。 铜绿假单胞菌的菌毛是由 重复的15k d a 的菌毛蛋白 亚基组成，排列成螺旋 形构象， 形成丝 状的 多 聚体 表面结 构 ( 见图1 .2)24 泌 泌 。 在 铜绿假单 胞菌中已 发 现有50个以上的 基因参与w型菌毛的生物合成和功能。 a l m和mattl ck描述了 铜绿假单胞菌菌毛的大致合成过程: pi le亚单位前体物转运到周质空间， 这些分 子的n端疏水部分固定于内膜，其c端亲水部分朝向周质空间。 pi 仍信号肚酶 切除菌毛蛋白pi ie上位于细胞质侧的带正电 荷的前导序列，形成成熟的pi 1 eo 然后， 该分子作为亚单 位以 其亲水杆为骨架进行组装. pi 作 ， pi lg和pi rr参与此 组装过程，但是功能尚不清楚。pi 可能是一种a t p酶或激酶; pi lg可能在优 化pi d或pi lf( 或是二者)的定位、维持其稳定性方面发挥作用; pi rr可能参 与蹭行运动和菌毛收缩。 合成的菌毛通过外膜组装复合体 ( o m) 被转运，该转 运 需 要 经 过 一 个 选 择 性 通 过 的p il q 多 聚 体 小 孔 。 脂 蛋白p i护可 能 在 维 持p il q以 多 聚物形式稳定表达的过程中发挥作用。 pilc 粘附素可能 是帮助合成中的菌毛蛋白 通 过pilq多 聚体小 孔， 不 过p il c的 这种作用 及其分 子机制有待于 进一步 研究 ” . 第一章 前言 以推测细胞表面一定存在着一些特异性受体， 细菌靠w型菌毛识别相邻细胞上 的 受体， 统一 行动。 但到目 前为 止， 还没有找 到这 种受 体气 泳动是细菌在单端鞭毛的推动下单个菌体细胞在水分含量高的环境中的运 动方式，是一种个体的行为。铜绿假单胞菌鞭毛的运动的动力是由跨膜的质子 梯度即 膜内 外的h+电 化性电 位梯度差提供能 量的， 不是由a t p 直接供能 5 2 。 蜂群运动则是细菌在半固体环境中的群体之间互相协调运动方式。需要鞭 毛和菌毛及鼠李搪脂表面活性剂的参与。鼠李搪脂表面活性剂被认为可以减少 运动时 在细 胞 和表面之间的 摩擦力 ” ，s4 。 r a s hi d 等首 次 在铜 绿假单 胞菌中 发 现蜂 群运动” 。 与其它进行蜂群运动的细菌相比， 铜绿假单胞菌在蜂群运动时没有细 胞形态的改变和侧生鞭毛的 产生“ 。 鞭毛的泳动和iv型菌毛介导的蹭动是铜绿假单胞菌生物被膜早期的豁附所 必需的2 ， 。 铜绿 假单胞的 运动受 许多 信号 传导系 统的 调控， 如双组分调 控系统和 复杂的 化学 信 号 感 受 系 统 5 7，5 气 1 占铜绿假单脸菌的化学趋向性系统 化学趋化作用是指细菌对环境中的多种化学物质产生的一种趋向或趋避反 应。化学趋向 性系统是一个非常复杂的系统，调控菌体的运动方向，适应不断 变化的环境， 大肠杆菌的 化学趋向 性系统研究的 最清楚5 9，60。 铜绿假单胞菌对一系列的化学刺激物都具有化学趋向 性反应， 例如对2 0 种 常用的 l氨基酸、糖、有机酸和无机磷等营养物质的 趋向 性，以及对硫氰酸、 异硫氰酸酷和一些易挥发性的含氯的脂肪族化合物如三氯乙 烯、四氯乙 烯、三 氯乙 烷和氯仿的趋避性。 在铜绿假单胞菌中，也发现有一个复杂的 化学趋向 性系统调控细菌对多种 刺激物做出反应。 至少有20个以 上的动 基因组成5 个不同的 基因簇，此外， 还有26类m 甲基因 散 布 在整 个 基因 组中 。 在这26个 类勿 印基因中 只有6 个基 因 印 “ 、 声扭 、 尸 、 切 刀 、 切 乙 和夕 才 切的 功能 被鉴定， 其它的20类功 印基因 功能尚 未知。 这意味着铜绿假单胞菌的 化学信号 传导 机制还需要进一步的 研究。 铜绿假单胞菌的 化学趋向 性系统包含5 个基因 簇( 图1 . 6)61 。 其中c h e c l u s t e r 1 和c hecl u st e r z 调 控鞭 毛的 泳 动能 力 风 63 . c h e c l us t e r l 是由 位于 鞭 毛结 构 基因 下游的n个基因切洲， 动 y， c h e z ， 动喇， 动妞， mota， m 口 tb， 。 叨， 。 夕， 第一章 前言 che 附和口 夕) 组成 一个基因 簇。 c hed u st er z是由ch er和ch e 犷 两 个基因 组 成。 c hed u s t e r l 中的che y， c h e z ， ch ea， cheb， 人 平和c hecl us t e r z中的动 已 刀 基 因 编码的 产物是菌体对氨基酸 类和磷酸盐产生趋化性反应所必需的。 c hed u s t e r 3 中的基因参与调控由w 型菌毛介导的蹭行运动。c hed ust e r 3 中 基因 编 码的 产 物 包 括pi u ， pi lk( 类c h er甲 基 转 移酶) ， pi ll 和c hp c( 两 个 c he w的同 系物) ， c h p b( 甲 基酷 酶che b的同 系 物) 及c h p a( 类c h e a 组氨 酸激酶) 。 此外， 还有三个类c hey的应答反应调节子艘收组件: pi lg、 pi lh 和 c h p a 。 c hecl u s t e 招4和 c 】 us l e rss 功能未知。 c hec 】 us 忱 r 4 中的基因编码c hey 、 c h e a 、 c hew、 c her和c h e b的同系物及两个m c p s 。 c l us t e r s 编码c h e r 、 c heb 、 c h e a 、c hew的同 系物和m c p 。 和其它类趋向 性基因不同的 是， c 】 u s t e r s不编 码单独的c hey蛋白 。 其中的c h e a同系物实际 上是c h e a/c h e y杂化蛋白 ， 类 似c h p a ， 在c 端也含有一 个应答调节子的信号接收结构域。 貂毖 厂 韶一 义 掇 溉 瓷硫照 ch ed口 成巴 rl 倒沐留 粉 名墓 护 al 4s s孔、 石 朽 ，护 人1 朽 .叭、 1 月 5 9尸 人1 4 创】 护 人1 司 6 护 启 1 肠zf 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个多 细 胞 发 育的 过 程( 见图1 .7)65. “ : 1 . 浮游细菌感受环境中的营养信号，依赖鞭毛的运动，移行至异物或死亡 组织表面，然后在菌毛或其它粘附结构的作用下牢固地附着于固体表面; 2 . 细菌在附着的固体表面生长繁殖，并不断地吸引周围同种细菌或其它浮 游细菌继续附 着， 使之聚集增殖为微菌落， 最终附 着位点的细菌的生长空间极 度拥挤， 有毒代谢产物堆积，细菌得不到充足的营养; 3 . 细菌 在竞争压力下启动 细 胞间 信号 系统即 群体 感应系统 ( 卿。 rum sens 吨 盯 s te m ) ， 产生细胞间信号. 微菌落间相互传递化学信号分子，并在信号系统调 节下，来感知菌落数量，控制菌群密度。菌体在分泌胞外多糖的同时在固体表 面缓慢移动，调节细菌生物被膜的规模， 形成多细胞蘑菇样和柱状结构，最终 形成成熟的细菌生物被膜。 第一章 前言 够的时间开启抗菌药物耐药基因， 如抗生素水解酶基因的表达。 有研究表明， 某 些抗生素可诱导 生 物被膜内 细菌产生尽内 酞胺酶的 水平显著提高， 而使细菌 显示出高度的耐药性。 4 . 生物被膜影响宿主的免疫功能，可产生免疫逃逸作用.体外实验证明细 菌形成生物被膜后影响宿主的免疫功能，从而可能 逃避机体的免疫作用，使细 菌不易清除。 生物被膜的 形成是细菌为适应自 然环境而采取的一种生存策略， 生物被膜 能 保 护细菌抵抗抗生素 和机体免 疫吞噬 作 用， 产生 难治 性反复 性感染 72，73 。 因 此， 对由细菌生物被膜导致的难治性感染的防治仍然是临床上一个垦待解决的问 题。对生物被膜形成过程中基因表达调控、信号传导途径的 研究有可能为防止 生物被膜形成提供有效的药物靶点，进而有针对性的研发新的药物，预防和治 疗铜绿假单胞引起的感染。 l 7群体感应系 统 ( q uoru msensi 雌卿加 口 ) l 7. 1群休感应系统的概念 长期以来人们一直认为细菌是以单个细胞的方式存在于自 然界中.但是近 年来，人们发现细菌也具有多细胞协作的能力，而这种协作需要细菌与细菌之 间的互相信息交流。 这种菌体间利用化学信号分子来传递信息， 进行信息交流以 感 知 外 界 环 境 变 化 的 方 式 称 为 群 体 感 应 系 统( q u o n n n se ns in g s y s te m ， q s 系 统) ， 4，7 5 . 单个细菌可以合成低分子量的自 诱导物 ( 信号分子)并释放到外界。在细 菌生长的初期， 胞内的自 诱导物浓度明显大于胞外，自 诱导物向 胞外渗透。 到 细菌生长的后期，分泌到胞外的自 诱导物浓度明显增高，内外渗透达到平衡， 自 诱导物开始在胞内积累。当菌群密度达到一定值，即信号分子浓度达到一定 阀 值时，会导致它与特定的传感器蛋白结合，形成有活性的复合物，促进群体 感应系统基因自 身的转录表达和受群体感应系统调控的 基因 大量表达。 菌体细胞可以 通过自 诱导物的富集浓度来感知菌群的密度， 然后再根据菌 群密度的波动来调节基因的表达。 这种调节可以改 变和协调细菌细胞的生活习 性及各种生理学反应，共同展示出它们的某些生理特性，从而表现出 单个细菌 无法行使的某些生理功能和调节机制如共生现象、生物发光、抗生素的产生、 第一章 前言 生 物被膜的 形成、 群体 迁移行为、 基因 结 合转移 及致病菌毒 力因 子的 产生 76 .77 等。 细菌的这种群体行为方式有利于细菌迁移到更适合的环境、获取更好的 营养和 适应新的生长环境。目 前，细菌之间信息传递的研究己 成为 微生物学界新的热 门 领域。 人们希望开发出 针对阻断细菌的 信息系统为靶点的新型抗菌药物来解 决日 趋严重的 耐 药性细菌感染 75 。 l 7 .2铜绿假单胞菌的群体感应系统 铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌， 拥有众多的毒力因子是其致病性 的一个重要因素，如外毒素a 、 胞外蛋白 酶5 、 磷脂酶c 、鼠李糖脂和弹性蛋白 酶等。这些细胞外毒力因子的产生并非单个细菌细胞的行为，而是菌体达到一 定密度时的 细胞群体行为， 都受到q s 系统的 调控。 少量细菌分泌出 来的 胞外毒 力因子可激发宿主免疫反应而被中和，而整个菌群一旦达到某种密度，其毒力 基因协调表达使铜绿假单胞菌分泌的胞外因子达到足以克服宿主防御系统的高 水平，侵入血管、播散，引起宿主全身炎症反应，最终死亡。 c o s t e rt o n 等发现铜绿假单胞菌有两个相对独立但又相互关联的q s 系统: ias 和rhl 系统. las 系 统由介 路 及 去 “ 2 组成， rhl系统由动 从 . 动 汀组 成。 如 系统的 信 号分子是 林3 一 氧一 十二烷酞高丝氨酸内酷 ( n-3 一 。 xo一 dodecanoyl . h o m o senne 1 明 t o n e ，3 一 ox。 一 cl2 h s l );rk l系统的信号分子是 n 一 丁酞高丝氨酸内酷 ( n 七 u ts 口 o yl . b o m o s e n 刀 e 】 ac t o n e ， c 月 . h s l )。 当铜绿假单胞菌细菌密度相对较低时，密度感应系统保持一种沉默状态， 分泌的信号分子很少，由它们调控产生的胞外酶和毒力因子还没有启动，此时 的铜绿假单胞菌并不致病。当细菌的数量急剧上升时，信号分子的水平超过一 个特定的闽 值， 首先引发抽 j 只 . 趾 讨系统的 启动， 信号分子3 一 oxo- clz . h s l 与转录 调节因子l as r结合， 形成助s r . 3 一 oxo- clz 一 h s l 复合体， 该复合体可激活一系列 群体感应调控基因 包括勿 j z 自 身、弹性蛋白 酶基因如 占 丑 、碱性蛋白 酶基因甲“ 等的转录表达。同时兴奋rk 扭 一11 系统， 后者又激活一系列基因 包括尸 儿 汀自 身、 鼠 李 脂 酞 转 移 酶 基因rk “ 、 rp os等的 表达。 伴随 着q s 系 统 信号 分 子的 产 生， 引 发大量毒力因子的产生，使细菌能够抵抗住宿主的防御体系， 具备成功建立感 染的能力。 第一章 前言 l 7. 3铜绿假单胞菌群体感应系统的调控网络 q s 系 统中 的l as和明 系 统 是不 兼 容的 ， 即r 五 1 的 信号 分 子q . a h l 不能 激活l as r ， l as的 信号分子3 一 ox。 一 c12 . a h l 也不能激活r h l r 。 ias 和rk l 系统调 控着大量基因的表达，一些基因同时受这两个系统的调控，而有些基因 只受其 中 一个系统的 调控。 两个系统都是自 我调控又密切联系， 形成一个调控网络79. 500 l as r . 3 一 oxo 一 clz 一 h s l复合物可以正向 调节rh ir 一11的 转录。 左 “ 左基因在整 个生长阶段都表达， 进入稳定期时 表达增加。 l as r/3 一 xo一 cl z . a h l复合物正调 控2 此 乙产生 一 个 正 调 控的 循 环 81 . l as 劝 。 xo cl z 一 a h l 同 时 也 正向 调 控rk ir的 表 达 ， 在 两 个 系 统 之 间 起 到 桥 梁 作 用 82 . 表 明q s 系 统 是 一 个 分 层 管 理 系 统 ， 而 las 处于这个系统的高层管理地位。 铜绿假单胞菌的另一种信号分子2 一 庚基一 3 一 经基斗哇诺酮 (2 七 印 钾 1 一 3 . b y drox y -4 . q u in o l one ， p q s) 连 接加和 尹 月 两 个系 统， 使细 菌q s 系统 的 调 控网 络更 加复 杂。 一方面， ias和动 了 系统控 制着p q s 的 生 成， 另一 方面， p q s 又调制着初和rh l 系统的 基因表达。 与p q s 合成有关的基因转录受ias系统的正调 控 和 rk l 系 统的 负 调 控 83 ， 因 此 p q s 分子的 数量 依 赖 于 信号 分 子 3 一。 一 c lz . h s l 与 c4 一 h sl的比 率， 这 表明 两 个 系 统 之间 存 在 着 精 密的 平衡 调 控 体 系 气 铜绿假单胞菌群体感应系统在调控众多基因表达的同时，自 身也处于一个 复 杂的 多 层次 调 控网 络 之中 ， 见图 1 .85 5 . 这 种 庞 大的 调 控网 络 使 对 外界 环 境 变 化 具有很强的适应能力。目 前， 在铜绿假单胞菌中已 发现了多种重要的 调节因子， 影响 和调 控 q s 系 统， 例如 v fr ( c a m p 受体调 控蛋白) ， 。 因 子 rpos和均 扣 n ， r e l a ( 严谨反 应蛋白 ) ， q 犯 r 和 vqsr ( l u x r 的 类似物) ， 转 录后调节因 子 f 冶 功 a 和 d ks a ， 双组分调控系统 g 留 a . g a c