（微生物学专业论文）黑胸散白蚁（reticulitermes+chinensis+snyder）肠道共生古菌多样性的初步研究.pdf

摘要 木食性低等白蚁肠道中有高密度的各种各样的共生鞭毛虫、细菌和古菌，它 们在白蚁富含纤维素的食物消化过程中承担着重要的作用。本文应用荧光显微镜 和不依赖培养的分子生物学方法，对广泛分布在我国长江流域及以南地区的黑胸 散白蚁( r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n m ss n y d e r ) 肠道中的共生古菌多样性进行了初步的研 究，研究结果如下： 1 用n i k o n 荧光显微镜对黑胸散白蚁肠道共生古菌进行形态学方面的原位 显微观察，发现黑胸散白蚁肠道有大量的能自发荧光的共生古菌黏附在囊形胃肠 壁上皮，这些共生古菌大多数是短杆状，少数是长杆状。 2 用不依赖培养的分子生物学方法对黑胸散白蚁肠道共生古菌进行了系统发 育多样性分析。用p c r 直接从黑胸散白蚁肠道d n a 中扩增出吉菌的s s ur r n a 基因，扩增产物纯化后连接到p g e m - te a s y 载体上( p r o m e g a ) ，转化大肠杆菌 d h s a ，构建古菌的1 6 sr r n a 基因文库。从文库中随机选择含有正确插入序列的 克隆，用限制性内切酶m s pi 消化黑胸散白蚁肠道共生古菌的1 6 sr r n a 基因，进 行限制性片段长度多态性( r f l p ) 分析，表明黑胸散白蚁肠道共生古菌呈现出明 显的多样性。根据r f l p 分析的结果，挑选代表性克隆进行测序。把得到的序列 与已知的木食性低等白蚁肠道共生甲烷菌的序列进行比对，构建系统发育树，进 行系统发育多样性分析。结果表明黑胸散白蚁肠道共生古菌属于甲烷微菌目甲烷 菌科甲烷短杆菌属。 关键词：黑胸散白蚁；肠道共生古菌；系统发育分析 a b s t r a c t t h eg u to f w o o d f e e d i n gl o w e rt e r m i t eh a r b o r sar e m a r k a b l ed e n s i t ya n dd i v e r s i t yo f s y m b i o t i cf l a g e l l a t e s 、b a c t e r i aa n da r c h a e a , w h i c hp l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h ec e l l u l o s e d i g e s t i o no ft h eh o s t t h es y m b i o t i ca r c h a e ai nt h eg u to fw o o d f e e d i n gl o w e rt e r m i t e ， r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r , w a so b s e r v e di n s i t u b yt h en i k o nu v e p i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ( f 4 2 0 ) t h ep h y l o g e n yo ft h es y m b i o t i c a r c h a e ao f r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e rw a se x a m i n e db yas t r a t e g yt h a td o e sn o tr e l yo n c u l t i v a t i o no f t h er e s i d e n tm i c r o o r g a n i s m s 、刀堆r e s u l t sa r er e p o r t e da sf o l l o w s ： i t h e r ea r el o t so f f 4 2 0a u t o f l u o r e s e e n tc e l l so nt h el u m i n a s u r f a c e o fh i n d g u t ( p a u n c hr e g i o n ) e p i t h e l i u mo fg e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r t h e m a i nm o r p h o l o g yo fm e t h a n o g e n so nt h eh i n d g u te p i t h e l i u mw e r es h o r tr o d s ，t h er e s to f t h e mw e r el o n gc u r v e dr o d s 2 t h erp h y l o g e n e t i cd i v e r s i t yo f f l a es y m b i o n t i em e t h a n o g e n s i n h a b i t i n g t h e g u to fr e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e rw a sa n a l y z e dw i t h o u t c u l t i v a t i o n s m a l ls u b u n i tr i b o s o m a lr n a ( s s rr n a ) g e n e sw e r ed i r e c t l ya m p l i f i e df r o m t h ed n a e x t r a c t i o no f t h et e r m i t eg u tb yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r 、u s i n ga r c h a e a l s p e c i f i cp r i m e r s p c rp r o d u c t sw g r el i g a t e di n t ot h et - e a s yv e c t o r ( p r o m e g a ) ，a n d t r a n s f o r m e dt oe c o l id h 5 ac e l l s r a n d o m l yp i c k e dc l o n e sw e r ec h e c k e df o rt h e i ri n s e r t s i z eb yv e c t o r - t a r g e t e dp c r t h er e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s ma n a l y s i sw a s p e r f o r m e du s i n gm s pir e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o n t h er f l pa n a l y s i sr e v e a l e dt h e d i v e r s i t yo ft h ea r c h a e a lc o m m u n i t yi nt h eg u to fr e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r c l o n e sr e p r e s e n td i f f e r e n tr i b o t y p e sw e r es e q u e n c e d 1 1 1 en u c l e o t i d es e q u e n c e so ft h e 1 6 sr d n aw e r ec o m p a r e dw i mt h o s eo ft h ek n o w nm e t h a n o g e n s a n dt h ep h y l o g e n e t i c t r e ew a sc o n s t r u c t u r e d p h y l o g e n e t i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h et e r m i t es y m b i o m i c m e t h a n o g e n sb e l o n g e dt ot h em e t h a n o b r e v i b a c t e rg e n u si nt h em e t h a n o b a c t e r i a c e a e f a m i l yo f t h eo r d e rm c t h a n o b a c t e r i a l e s k e yw o r d s ：r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r ；g u t ；s y m b i o t i ca r c h a e a ；p h y l o g e n e t i c a n a l y s i s u 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得 的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表 或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明 本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：獬 藿婚 日期：砌年占月z ，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中师 范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位 论文收录到中国学位论文全文数据库并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：髓鸿 日期：叫年6 月二日 导师签名：概 日期州年6 月f 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l l s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回童迨塞握窑垣溢卮! 旦圭生 旦= 生；旦三生蕉鱼! 作者签名：旅蓑鸣 日期：司年6 月2 - 日 导师签名：j 日期砷年月中日 1 白蚁生物学 导论 白蚁是节肢动物门昆虫纲有翅亚纲等翅目( i s o p t e r a ) 的昆虫，在世界上分布广 泛，种类丰富，世界范围内现己报道的白蚁分属于2 8 1 属超过2 6 0 0 种【i i 。白蚁遍布 地球表面大约三分之二的陆地，主要分布在南纬4 5 度与北纬4 5 度之问，特别是热带 和亚热带地区，白蚁数量非常庞大，达6 0 0 0 只m 2 ，以大于5 0 9 m 2 的生物量密度 大大超过食草哺乳动物( 1 3 1 7 ，5g m 2 ) 2 1 。在我国长江以南地区，般都有白蚁危 害，越往南方其危害也越严重，特别是云南、广东、浙江和福建等省份，白蚁分布 区约占全国总面积的3 5 6 0 。而黑胸散白蚁是我国的主要危害蚁种之一，在深林 中的生物量很大1 3 j 。 根据白蚁肠道中是否有鞭毛虫共生，可以把白蚁分为高等白蚁和低等白蚁两大 类。其中低等白蚁肠道中有鞭毛虫共生，而高等白蚁肠道中没有鞭毛虫共生“l 。 在低等白蚁体内，虽然白蚁自身可以产生某些消化纤维素的酶，但是食物中的大部 分纤维素却是由低等白蚁肠道共生的微生物来分解1 4 1 。而肠道缺乏鞭毛虫的高等白 蚁，其食物中的纤维素则主要由白蚁中肠分泌产生的纤维索酶进行消化1 5 “l 。 根据白蚁的食性，形态学，生活史等生物学特征将白蚁分为七个科1 4 个亚科， 其中低等白蚁包括澳白蚁科( m a s t o t e r m i t i d a e ) 、木白蚁科( k a l o t e m a i i d a e ) 、草白 蚁科( h o d o t e r m i t i d a e ) 、鼻白蚁科( r h i n o t e r m i t i d a e ) 、齿白蚁科( s e r r i t e r m i t i d a e ) 和原白蚁科( t e r m o p s i d a e ) 六个科，高等自蚁只有白蚁科( t e r m i f i d a e ) 一个科p 。 跗，但包含了8 5 的白蚁种类。高等白蚁在内部解剖、外部解剖及社会组织等方面 均比低等白蚁复杂【9 l 。 白蚁的食物范围非常广，它们的食物范围非常广，包括木材( 完好的或己腐解 的) 、植物叶片、杂物碎屑以及食草动物粪便等。有些白蚁甚至能以富含腐殖质的土 壤为食，有些白蚁进化程度较高，能够与真菌共生( f u l a g u s - c u k i v a t i n g ) ，培养真菌作 为其营养来源【9 l 。因此，按白蚁的食性，可以把白蚁分为木食性白蚁、食真菌白蚁、 食壤自蚁和食草白蚁。总的来说，白蚁的食物都是富含纤维素、半纤维素和木质 素，但它们的含氮量都不高，白蚁属于典型的寡氮营养型生物i lo “j 。据估计，全世 界所有生态环境中的白蚁( 总个体数量约为2 4 x1 0 ”头) ，每年消耗木质纤维素3 - 7 x 1 0 1 5 克，并分解其中的绝大部分，因此，白蚁在地球的物质循环过程中起着重要的 作用1 。 白蚁是营群体生活的社会性昆虫，但是白蚁的群体不是简单的个体聚集在一起 的。在同一群体中，有严格的社会性组织和分工，存在形态明显不同的发育等级和品 级分化1 1 4 1 。般来讲，高等白蚁的品级分化现象比低等白蚁的更为明显，各个品级 按其生理机能可将白蚁个体分为生殖型和非生殖型两大类1 6 1 。生殖型在整个巢群内 数量最少，生殖型个体体型大，有发育完整的繁殖器官，主要起交配产卵的作用。 根据来源和形态不同，可以分为原始蚁王、蚁后，短翅补充蚁王、蚁后，无翅补充 蚁王、蚁后三个品级。非生殖型个体虽有完整的生殖器官，但发育不完全，没有生 殖机能。在整个巢群内数量最多，并且起着极其重要的作用，是蚁巢的建设者和保 卫者州。包括工蚁和兵蚁两个品级，其中工蚁约占群体总数的8 0 0 - - 9 0 ，工蚁担 任群体的一切事务，如取食、筑巢、修路、运卵、吸水和喂食；兵蚁少于群体总数的 l o ，兵蚁的主要职能是警卫和战斗i l l 】。 与昆虫纲其他一般的昆虫相比，白蚁具有一种非常特殊的行为交哺行为。 在白蚁群体中，交哺行为由工蚁来执行，工蚁获取和加工几乎整个白蚁群体的全部 食物，然后，通过回吐已经初步消化过的食物，或者从肛门排出后肠内的物质，喂 给不能自己取食的蚁王、蚁后、兵蚁、幼蚁、若蚁脚5 i 。交哺行为不仅是白蚁群体 中的营养流动途径，还有助于把肠内的共生鞭毛类原生动物传递下去【1 6 1 。 由于白蚁的卵、幼蚁以及大多数种类的工蚁色泽都星白色或淡白色，各品级的 组织分工，营巢群居生活，以及交哺行为等习性与蚂蚁十分相似，因而有“白蚁”之 称。但是，白蚁和蚂蚁是两类完全不同的昆虫( 蚂蚊为膜翅目h y m e n o p t e r a ) l l7 j ，白 蚁是不完全变态昆虫，在进化系统上，白蚁与蜚蠊( b l a t t a r i a ，即嶂螂) 关系较为近缘 1 唧；而蚂蚁却是完全变态昆虫f 。 2 低等木食性散白蚁的消化道结构 低等木食性白蚁的肠道主要由3 部分组成：即前肠，中肠和后肠【1 41 9 1 。前肠和 中肠为细管状，主要起摄食、储藏、磨碎食物及部分消化食物的作用。与一般昆虫 相比，白蚁后肠相当发达，约占全部肠道总容积的4 5 1 4 1 ，由特别膨大的囊形胃、结肠、 直肠等组成，是白蚁进行木质纤维素消化的主要器官，同时吸收食物和尿中的水分及 无机盐类，并排除食物残渣和代谢废物l l9 】。 低等白蚁的前肠能够分泌一些生物活性物质，对栖北散白蚁( r e t i c u l i t e r m e s s p e r a t u s ) 的研究显示，其唾液腺分泌的溶菌酶【2 0 l 在前肠活性很高，可能参与裂解由白 2 蚁相互交哺进入前肠的细菌；而中肠里蛋白酶的活性也较高1 1 1 ，说明低等白蚁自身也 有部分消化食物的能力。对黄胸散白蚁( r e t i c u l i t e r m e sf l a v i c e p s ) 的研究则显示，前肠 中纤维素酶的种类和活性与后肠是不同的，如内切b 1 ，4 葡聚糖酶( c x 酶) 主要 分布在前肠，其活性在前肠中最高：而在后肠中分布最多，酶活性也最高的纤维素 酶是外切葡聚糖酶( c 1 ) 和b 葡萄糖苷酶( b g ) f 2 2 j 。张大羽等对r e t i c u h t e r m e s f l a v i c e p s 和c o p t o t e r m e sf o r m o s a n u s 的研究，进一步证明了低等白蚁的种类不同其肠道内含 有的纤维素酶的种类和酶活性也不同，甚至，在同一种白蚁群体中，不同的品级其 肠道内含有纤维素酶的种类和酶活性也不同【2 ”。尽管纤维素酶可以由白蚁的唾液 腺、前肠和中肠分泌，但木质纤维素的消化主要是在后肠进行1 2 4 】，因为，后肠中不但 有大量的各种各样的微生物共生，还含有来源于鞭毛虫和细菌的内源性纤维素酶 【2 8 】。 白蚁肠道虽然很小，但是其肠道微环境却很复杂。从前肠向后肠推移，逐渐变 为无氧状态，在后肠部分达到最低的氧化还原电位( 在5 0m v 到- 2 7 0 m v 之问，不同 种变化较大) 和近中性的p h 值( 6 2 7 6 ) 【1 4 2 7 、2 8 l 。白蚁后肠是一个由宿主及微 生物群共同创造的具有纵向及横向差异的结构异质系统( s t r u c t u r e dh e t e r o g e n e o u s s y s t e m ) 1 2 9 1 。b r u n e 及其合作者应用微电极技术( m i c r o e l e c t r o d e s ) 发现：在栖北散白蚁 r f l a v i p e s 后肠囊形胃区h 2 及0 2 的浓度是呈辐射状分布的，在肠腔中心h 2 浓度最 高，从中心到肠壁h 2 浓度逐渐降低，而o ：的浓度分布则冈好与h 2 相反，肠壁晚 的浓度最高【3 0 3 h 翊，0 2 梯度驱使0 2 连续地流向肠道中，使得囊形胃大部分区域处 于微氧状态，而严格厌氧区则集中在肠腔的中心，从而说明白蚁肠道并不仅仅是一 个厌氧的发酵器【2 9 l 。李堵等运用微传感技术( m i e r o s e n s o rt e c h n i q u e s ) 也有力否定了白 蚁肠道是发酵罐的说法，证明由于肠腔微生物的新陈代谢作用，使白蚁肠腔维持着 一定浓度的 1 2 及0 2 ，只有后肠中央才是真正的无氧区，而甲烷菌( m e t h a n o g e n s ) 的 存在使肠道微氧四周形成一个氢壑fh y d r o g e ns i n k ) 口3 1 。杨红等以散白蚁 r s a n t o n e n s i s 为模型，发现白蚁肠道环境的这种异质性对肠道共生的微生物区系结 构有重要影响p 。 3 低等白蚁肠道共生微生物的种类及功能 3 1 低等白蚁肠道共生微生物的种类 在白蚁的整个肠道中，有大量的共生微生物定居。前肠和中肠中仅有少量的共 生性细菌存在，大多数微生物定居于后肠中【1 42 8 1 ，尤其是后肠的囊形胃里含有高密 度多种多样的微生物区系，直接的显微计数表明，每毫升肠液中微生物密度达 1 矿一1 0 个细胞口”。对散白蚁r f l a v i p e s 肠道微生物的原位形态学观察发现，在其后 肠存在着至少1 2 种鞭毛虫和2 0 到3 0 多种不同形态的细菌和古细菌【2 】。b r a u m a n 等 运用f i s h 技术( 荧光原位杂交技术) 对2 4 种不同的白蚁进行研究，进一步证明白 蚁肠道的共生原核生物( 包括细菌和古细菌) 呈现出明显的多样性，其中细菌占绝 对的优势 3 6 1 ，而且原核生物在白蚁肠道中的分布与白蚁的食物有直接的关系。 3 2 低等白蚁肠道的共生鞭毛虫及功能 低等白蚁的囊形胃中聚集着大量厌氧的鞭毛虫，共生鞭毛虫占白蚁总体重的 l 7 到l 3 l j ”，至上世纪中后期，已从2 0 5 种低等白蚁消化道内发现了4 3 4 种不同的 鞭毛虫p ”。所有白蚁共生鞭毛虫均属于原生动物动鞭毛纲( z o o m a s t i g o p h o r e a ) e ? 的 3 个目，即毛滴虫目( t r i c h o m o n a d i d a ) 、超鞭虫目( h y p e r m a s t i g i d a ) 和锐滴虫目 ( o x y m o n a d i d a ) 1 3 8 1 他们吞噬经过白蚁初步消化的木质纤维素【3 射，然后将纤维素水 解并发酵为c h 3 c o o h ( 乙酸) ，c 0 2 和h 21 3 9 1 。因此，共生鞭毛虫是肠道内h 2 的 主要来源，常与甲烷菌或同型产乙酸菌这两种耗氢原核生物共生1 4 0 l 。在台湾乳白 蚁( c o p t o t e r m e sf o r m o s a n u s ) 中8 7 的外- 纤维二糖水解酶活性来自后肠的鞭毛虫而 非白蚁自身合成| 4 1 1o 近年来，运用p c r 技术分别从栖北散白蚁、澳白蚁( m a s t o t e r m e s d a r w i n i e n s i s ) 和台湾乳白蚁肠道共生鞭毛虫中克隆出了不同的纤维素酶基因，并且 原位杂交等技术也证实了这些基因的鞭毛虫来源，这些研究为鞭毛虫降解纤维素 的作用提供了直接证据i j9 】。 3 3 肠道共生细菌及功能 采用1 6 sr r n a 基因分析法和荧光原位杂交等非培养法，证明低等白蚁肠道内 有大量种类和数量都不同的厌氧异养型细菌，包括螺旋体( s p i r o c h e t e s ) 。滑行菌门 ( c y t o p h a g a f l a v o b a c t e r - b a c t e r o i d e sp h y l u m ) 的拟杆菌科( b a c t e r o i d e s ) ，低g + c 含量 的革兰氏阳性菌( 梭状芽孢杆菌样的，c l o s t r i d i u m 2 1 i k e ) ，和紫细菌( p r o t e o b a c t e r i a ) 1 4 2 以及在系统发育上与其它物种十分不同的一类细菌，特称为“白蚁菌群l ”( t e r m i t e g r o u pi ) 1 1 9 l i l b u mt g 等和h o n g o h 等的研究均表明，螺旋体是肠道中最占优势的细菌，在 低等白蚁肠道内的螺旋体在数量上占所有原核生物的5 0 4 3 。低等白蚁 r e t i c u l i t e r m e sf l a v i p 肠道内的螺旋体有1 2 种，在系统发育上属于密螺旋属的两 个亚群j 。l e a d b e t t e r 等首次从白蚁z o o t e r m o p s i sa n g u s t i c o u i s 体内分离出两个密 螺旋属的白蚁肠道中特有的两种分离株，并成功进行体外培养，同时发现这两种 4 螺旋体都能以h 2 还原c 0 2 进行产乙酸作用( c 0 2 + h 2 一c h 3 c o o h ) 【4 5 j ，从而很好 的解释了为什么有些螺旋体与原生动物表共生f 4 0 l 。进一步研究表明，从该白蚁分离 的螺旋体既有同型乙酸菌也有非同型乙酸菌，同型乙酸菌的生长需要其它肠道菌分 泌产生的叶酸 4 6 “”。除此以外，拟杆菌，梭状芽孢杆菌和“白蚁菌群l ”也为明显的 优势细菌 4 4 1 ，杨红最先用d n a 指纹( r f l p ) 图谱技术对木食性散白蚁r e t i c u l i t e r m e s f l a v i p e s ( k o l l a r ) 进行研究，证明滑行菌i ( c y t o p h a g a - f l e x i b a c t e r - b a c t e r o i d e sp h y l u m 。 c f e ip h y l u m ) 的拟杆菌和“白蚁菌群l ”均为与肠道共生鞭毛虫p y r s o n y m p h av e r t e n s 相关的优势共生细菌类群l ”1 。 运用乙炔还原作用分析法( a c e t y l e n er e d u c t i o na s s a y ，c a ) 研究表明，2 0 多种白 蚁肠道具有固氮活性，c l e v e i 由此推断木食性低等白蚁肠道中可能存在具有固氦 功能的细菌1 4 9 j 。虽然b r e z e a k 等早在1 9 7 3 年就采用将乙炔还原作用分析法与固氮 指示剂相结合的实验方法，证明低等白蚁体内的部分细菌能固定氮，但他并没对 其多样性进行研究1 5 0 l 。1 9 9 6 年o h k u m a 成功地从r e t i c u l i t e r m e ss p e r a t u s 肠道混合 微生物区系克隆和分离到编码固氮酶的h i h 基因片段，对嘲r h 编码氨基酸序列 的系统发育学分析表明，白蚁肠道中的固氮酶基因具有明显的多样性，n i f h 基因 序列大部分与硬壁菌门( f i r a v i c u t e ) ，梭菌属( c l o s t r i d i u m ) 和巴斯德菌属 ( p a s t e u r i a n u m ) 有很大的相似性【5 “。除此以外，他还发现不同种白蚁体内的n fh 基因也具有显著的差异【5 2 j 。2 0 0 0 年a b e 等从低等白蚁肠道中得到了固氮菌分离株 3 3 1 ，进一步证明了木食性低等白蚁肠道中固氮菌的存在。虽然白蚁肠道中存在有 大量各种各样的甩矿h 基因，但是由于受到白蚁肠道内铵浓度( a m m o n i u m c o n c e n t r a t i o n ) 的影响【5 3 i ，仅有少量的n fh 基因能够被优先转录并表达出来，大 多数的n f h 基因不能被表达1 5 4 5 5 1 除此以外，在木食性低等白蚁肠道中还存在有一些典型的能利用碳水化合物 的细菌乳酸细菌【3 5 1 ，如链球菌【，它们属于e n t e r o c o c c u s 属和l a c t o c o c c u s 属 【1 4 1 。 肠道细菌种类丰富、数量繁多，但由于它们很难进行分离培养，所以它们在纤 维素消化过程中所起的具体作用至今还不十分清楚，猜测它们可能对鞭毛虫的发酵 产物，如葡萄糖或其他中间产物，转化为可供白蚁利用的乙酸的代谢有重要作用。 s c h u l t z 等f 57 】研究了从r e t i c u l i t e r m e ss p e r a t u s 中分离的链球菌和拟杆菌2 个菌株的单 独培养和共培养，发现共培养时，链球菌发酵葡萄糖为乳酸，拟杆菌发酵乳酸为丙酮 酸、乙酸和c 0 2 ，所以认为这两种细菌之间的乳酸交叉营养可能是构成白蚁肠道内整 个发酵过程的部分。 3 4 低等白蚁肠道的共生古菌及功能 自从1 9 3 2 年c o o k 等最先证明了白蚁体内存在产甲烷作用p 驯以后，大量的显 微观察结果和1 6 sr r n a 基因分析法皆证明，不管低等白蚁还是高等白蚁肠道内都 有能产生甲烷的甲烷菌存在h o 卯6 0 l 。一般说来，高等白蚁特别是沙食性高等白蚁 肠道内甲烷菌的数量和种类都要比低等白蚁肠道内甲烷菌的数量和种类要多，这 与白蚁的食性以及其所处的进化地位有关1 6 1 6 2 1 。白蚁的食性及其所在的进化由于 白蚁种类多( 有2 6 0 0 多种) ，而且分布广泛，以前一直认为由白蚁排放的甲烷是 大气中甲烷的重要来源1 6 ”，是导致全球温室效应的重要因素，但是现在证明，白 蚁释放出的甲烷仅占全球甲烷释放总量的5 以下( 即2 0 t g a ) ”。 甲烷菌是白蚁肠道中的种重要的厌氧耗氢微生物，能够利用h 2 还原c 0 2 合成h2 0 和c 地( 甲烷) ( c o z + h 2 - * h2 0 + c - h ) 6 2 ，隶属于古菌域水生古细 菌门，包括甲烷杆菌目( m e t h a n o b a c t e r i a l e s ) 、甲烷球菌目( m e t h a n o c o c c a l e s ) 、 甲烷八叠球菌目( m e t h a n o s a r c i n a l e s j 、甲烷微菌目( m e t h a n o m i c r o b i a l e s ) 和甲 烷超高温菌目( m e t h a n o p h y r a l e s ) 1 6 4 1 。 低等白蚁肠道的共生甲烷菌仅以c 0 2 和h 2 够作为能源物质，不能利用乙酸和 甲基化合物合成甲烷，因此，在白蚁肠道内，甲烷菌与同型产乙酸菌共同竞争h 2 1 6 2 】。 通常，在木食性低等白蚁肠道中，由同型产乙酸菌完成的同型产乙酸作用比甲烷 菌进行的产甲烷作用占优势1 6 ”，但是，在高等白蚁肠道中却刚好相反，这也是高 等白蚁的甲烷排放量比低等白蚁高的原因之一。由于甲烷菌能利用h 2 还原c o ： 合成h2 0 和c h 4 ( 甲烷) ，所以在白蚁体内，甲烷菌消耗鞭毛虫发酵纤维素和半 纤维素过程中产生的h z ，从而促进纤维素和半纤维素的进一步分解【lo 6 6 1 。 自从1 9 9 5 年o h k u m a 等第一次应用p c r 技术对低等白蚁肠道共生古细菌进行系 统发育分析以来，应用不依赖培养的分子生物学方法，主要是1 6 5r r n a 基因分析法， 用古菌通用性引物，从多种白蚁肠道中，如：r e t i c u l i t e r m e s f l a v _ f p e s 、r e t i c u l i t e r m e s 、 c r y p t o t e r m e sd o m e s t i c u s ，n a s u t i t e r m e st a k a s a g o n e n s i s 和r e t i c u l i t e r m e ss p e r a t u s ， 得到了很多共生吉菌的克隆，f l o 5 9 6 0 6 3 “6 5 6 6 6 7 6 剐，所得到的绝大多数克隆都 属于甲烷微菌目( m e t h a n o b a c t e r i a l e s ) 目甲烷菌科( m e t h a n o b a c t e r i a c e a e ) 甲烷短 杆菌属( m e t h a n o b r e v i b a c t e r ) 1 6 56 9 0 1 ，但是与甲烷微菌目的其他甲烷菌在系统发 育上有明显不同1 6 川：仅有少数的克隆是非甲烷菌的古菌，隶属于t h e r m o p l a s m a t e s 目忙卅。b r a u m a n 等采用f i s h 技术也证明了在不同种的白蚁肠道内共生的甲烷菌中， 甲烷菌科( m e t h a n o b a c t e r i a c e a e ) 的甲烷菌是优势种。 在低等白蚁肠道中，大多数的甲烷菌黏附在白蚁囊形胃的肠壁上皮，少部分甲 烷菌与白蚁肠道共生的鞭毛虫如：d i n e n y p h ap a r v a 和m i c r o j o e n i as p 营内共生关系。 6 而游离在肠液中的甲烷菌几乎没有i 6 0 16 2 7 1 1 。对栖北散白蚁( r e t i c u l i t e r m e s f l a v i p e s ) 和高山原白蚁( h o d o t e r m o p s i s s j o e s t e d t i ) 的研究表明，与鞭毛虫相关的产甲烷菌和生活 于后肠肠壁的产甲烷菌在系统发育上是不同的【6 0 1 。由于过氧化氢酶作用的存在，使 得甲烷菌对0 2 具有一定的耐受能力，这就可以解释为什么大量的甲烷菌可以黏附 在0 2 浓度最高的后肠肠壁上皮【。 在白蚁肠道内甲烷菌的分布不仅存在有径向多样性，在肠道的轴向分布也呈现 出多样性。2 0 0 1 年，f r i e d r i c h 等第一次分别以经过高度划分的白蚁肠道作为实验材 料，并采用p c r 与t - r f l p ( 限制性片段长度多态性分析) 相结合的方法，证明古 细菌在同一条白蚁肠道内的径向分布呈现出系统发育上的多样性，而古细菌的这种 径向分布多样性与白蚁肠道径向微环境的异质性以及各种古细菌对不同微环境的 适应机能直接相关1 7 ”。 甲烷菌体内含有两种特有的辅酶，一种使能自发荧光的辅酶辅酶f 4 2 0 ，另一种是 甲基辅酶m ( c o m ) 1 7 3 7 4 由于辅酶f 4 2 0 f l 够自发荧光，因此，在荧光显微镜下可以 很容易观察到甲烷菌【7 47 5 7 6 1 。借助荧光显微镜和电子显微镜观察，发现木食性低 等白蚁肠道内有大量的共生甲烷菌，而且，大多数是短杆状和长秆状，少数为长纤 维状( 有鞭毛) 【4 8 6 0 6 2 、6 3 1 。但是，迄今为止，仅l e a d b e t t e r 等从r e t i c u l i t e r m e s f l a v i p e s 后肠中分离出三株甲烷菌，分别为短杆状的m c u r v a t u s ，略弯曲杆状的m c u t i c u l a r i s f 6 2 j 和长纤维状的朋= 倒f 7 研m 括f 6 3 1 ，系统发育表明，它们均为甲烷短杆菌属的新种，而 且与白蚁肠道上皮甲烷菌同源性比较高，说明它们黏附在白蚁肠道肠壁上皮。这三 个分离株的纯培养，进一步证明了木食性低等白蚁肠道内甲烷菌的代谢途径 ( c 0 2 + h 2 一h2 0 和c h 4 ) 。 甲烷菌可能具有类似于固氮菌的固氮功能1 5 0 】，但与固氮菌的生物固氮不同。甲 烷菌主要是通过消除c ( 碳) 来降低吸收前的c n ，从而在维持白蚁肠道内的c 小平 衡起到一定的作用1 0 “8 i 。单丽伟等1 7 4 j 也认为甲烷菌是唯一具有固氮功能的古细菌。 从而说明，尽管只有少数的固氮酶基因被表达出来，但是固氮菌和甲烷菌的共同协 作，可以维持足够的氮满足白蚁新陈代谢的需要。 4 纤维素与半纤维素的降j 晖途径 纤维素和半纤维素在低等白蚁肠道中降解的简单过程：首先是纤维素和半纤维 素的水解，其次是水解产物解聚、发酵生成短链脂肪酸，这些短链脂肪酸能够被宿 主重新吸收，为宿主提供营养；最后是肠道氮的流动和分子氮的固定【2 6 6 i 。 在这个过程中，与白蚁共生的微生物发挥重要作用。低等白蚁肠道的各种共生 微生物，包括真核生物鞭毛虫，原核生物细菌和古细菌，在整个纤维素和半纤维 7 硕士擘位论文 m a s t e r si h e $ 1 s 素的降解过程中，各司其职，共同协作，最终把纤维素和半纤维素降解为可供宿主 白蚁和自身吸收利用的营养物质。 具体来说，经过白蚁初步消化过的纤维素和半纤维素在鞭毛虫及主要由其产生 的纤维素酶的共同作用下，经过水解、发酵等化学过程，生成单糖( 主要是葡萄糖) 、 c h 3 c o o h ( 乙酸) 、c 0 2 和h 2 。其中c h 3 c o o h ( 乙酸) 可以直接被宿主白蚁重新 吸收利用，为白蚁提供营养。单糖则由乳酸细菌发酵生成乳酸，乳酸细菌产生的乳 酸再经过拟杆菌发酵成为丙酮酸、c 0 2 和乙酸f 7 ”。由于低等白蚁肠道中至少有两种 能够以c 0 2 和h z 作为反应底物的耗氢微生物，其一为产甲烷菌，其二为同型产乙酸 菌，他们能利用h 2 还原c 0 2 分别通过产甲烷作用和同型产乙酸作用，生成甲烷和乙 酸p ”。而在木食性低等白姒e t i c u l i t e r m e sf l a v i p e s 体内，由同型产乙酸菌执行的同 型产乙酸作用比产甲烷作用占优势1 6 6 1 。因此，鞭毛虫发酵纤维素产生的大量的c 0 2 和h 2 ，大部分由同型产乙酸菌通过同型产乙酸作用生成乙酸 ( c 0 2 + h 广c h 3 c 0 0 h ) 。小部分由甲烷菌通过产甲烷作用生成水和甲烷 ( c 0 2 + h 2 一h2 0 和c 地) ，其中c h 3 c o o h ( 乙酸) 和h2 0 ( 水) 被白蚁吸收利用， 而c i - 1 4 ( 甲烷) 则从白蚁肛门排出体外。 有关纤维素和半纤维素在低等白蚁肠道中的降解过程以及白蚁肠道各种共生 微生物在降解过程中所发挥的功能，可以用下图说明【7 “。 图1白蚁肠道的能量代谢( b r e z n a ka n db r u n e1 9 9 4 ) 8 a 静s o r b e d 姆 t e r m i t e s 硕士擘位论文 m a s t e r st h e s i s 5 本研究的目的与意义 目前，有关木食性低等白蚁及其肠道共生古菌的研究，主要是应用1 6 sr r n a 基 因分析法进彳亍系统发育多样性方面的研究，应用荧光显微镜和电子显微镜等实验工 具进行甲烷菌的原位形态观察，以及采用f i s h 技术对甲烷菌在肠道中的分布进行 研究等。而研究的对象则集中在低等白蚁的鼻白蚁科散白蚁属，如广泛分布在美国 的栖北散白蚁( r e t i c u l i t e r m e s f l a v i p e s ) 和日本的黄胸散白蚁( r e t i c u l i t e r m e s s p e r a t u s ) ， 以及欧洲的r e t i c u l i t e r m e ss a n t o n e n s i s 。但是，在我国有广泛分布的黑胸散白蚁 ( r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r ) 肠道共生甲烷菌的研究尚未见报道。 黑胸散白蚁在分类上为鼻白蚁科散白蚁属的一个亚分支( 7 ”，该种白蚁在我国长 江流域广泛分布，在森林中的生物量也很大，是我国的主要危害蚁种之一。本研究以 广泛分布于我国的黑胸散白蚁( r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r ) 实验对象，用荧光 显微镜对肠道共生的甲烷菌进行形态方面的观察，运用不依赖培养的分子生物学方 法，1 6 sr r n a 基因分析法对共生甲烷菌进行系统发育多样性的分析，探讨黑胸散 白蚁肠道共生甲烷菌的多样性，包括形态多样性和遗传多样性，以及共生甲烷菌在 黑胸散白蚁体内的分布，为进一步阐明共生甲烷菌在复杂的代谢过程中的作用提供 理论依据，并为建立通过消灭肠道共生微生物来杀死白蚁的白蚁生物防治策略奠定 了理论基础，对木食性白蚁的综合防治具有重大的实际意义。 9 1 黑胸教白蚁的采集和饲养： 实验材料 黑胸散白蚁采自武汉狮子山的树林， 盒中，盒子底部铺一层土，顶部留通风孔， 工蚁作为实验材料。 2 常用缓冲液 在实验室中常温下饲养于聚乙烯塑料小 经常洒水保持湿度，喂以木头为食。取 1 ) 磷酸缓冲液( p b s ，p h7 4 ) ：称取n a c i8 0 舀k c l0 2g ，n a h p o 1 4 4g ，k h z p 0 4 o 2 4g 。在9 5 0m l 去离子水中溶解，用h c i 调 p h 到7 4 ，定容到1 l ，高压灭菌室温保存。 2 ) t r i s 硼酸( t b e ) 缓冲液( 5 x ) ：称取t f i s5 4 9 ，硼酸2 7 5 9 ，在9 5 0 m l 去离子 水中溶解，加入2 0m l0 5n l o i le d t a ( p h 8 o ) ，定容到1 l 。 3 ) t e ( t r i s _ e d t a ) 缓冲液( 1 0 x ，p h8 0 ) ：1 0 0 m m o l l t r i s - h c l ( p h8 o ) 与1 0 m m o l le d t a ( p h8 o ) 混合，分装后高压灭菌，室 温保存。 3 常用试剂 1 ) p c r 反应引物：a r l 0 9 f ：5 - a c kg c tc a g t a ac a cg 3 ；a r 9 1 2 r ：5 - c t c c c c c g c c a a t i c c t t t 缸3 由上海基康公司合成。 2 ) p c r 反应试剂； ( 1 ) t a q - b u f f e rf o x ( 8 i o s t a r 公司1 ； ( 2 ) d n t p ( 5 0 0 u m ) ( a m e r s c o 公司) ： ( 3 ) t a q 酶( 2 u u 1 ) ( b i o s t a r 公司) 。 ( 4 ) m 9 2 + ( 2 5 m m ) ：( 上海g e n e c o r e 公司) ( 5 ) 超纯水： 灭菌双蒸水 3 ) 溶菌酶( 1 0m g m 1 ) ：l y s o z y m e ( a m e r s e o 公司) 使用前，称取溶菌酶l o o m g ， 在l o m l1 mt r i s h c i ( n h8 o ) 中溶解 0 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 4 ) 限制性内切酶：m s pi ( t a