（植物学专业论文）木豆叶中牡荆苷与异牡荆苷提取纯化工艺及其抗菌活性研究.pdf

摘要 本文研究了超声提取木豆叶中同分异构体牡荆苷和异牡荆苷的工艺，并确定了大孔 吸附树脂技术和柱层析技术分离纯化牡荆苷和异牡荆苷的较佳工艺条件，同时对木豆叶 乙醇提取物及其乙酸乙酯萃取物的抗菌活性进行了研究。 1 全面系统地确定了检测牡荆苷和异牡荆苷的h p l c 定量分析检测方法：色谱柱 为o d s 柱( 4 6 m m x 2 5 c m ) ，检测波长3 3 0 h m ，流速1 m l m i n ，进样量1 0 1 t l ，流动相 c h o h ：0 4 h 3 p 0 4 = 3 5 ：6 5 。 2 对木豆叶中的牡荆苷和异牡荆苷的超声提取条件进行了优化，对影响提取率的各 个因素进行了考察，确定了最佳的超声提取工艺参数： 溶剂及液固比：6 0 乙醇，2 0 ：1 提取时间：4 5 m i n 提取功率： 2 5 0 w 提取温度：4 0 5 0 提取次数：3 次 实验表明超声提取法提取率高，牡荆苷和异牡荆苷提取率分别为o 1 8 5 6 并1 j0 1 3 8 5 。 3 ，对大孔吸附树脂分离纯化牡荆苷和异牡荆苷进行了研究，确定了a d s 5 大孔吸 附树脂分离纯化牡荆苷和异牡荆苷的分离条件，大孔吸附树脂分离纯化后所得产品中牡 荆苷的含量为3 0 1 4 6 ，收率为5 7 3 1 6 4 ，异牡荆苷的含量为3 6 4 1 6 ，收率为 6 1 8 4 6 7 ，最佳分离参数： 最佳树脂： a d s 5 温度： 2 5 上样液p h ： 3 5 4 上样液浓度： 3 0 m e f lm l 吸附平衡时间： 2 h 动态吸附、解吸流速： 1 m l m i n 4 确定了聚酰胺柱层析分离纯化牡荆苷和异牡荆苷工艺，得到含量为2 8 1 4 5 1 的 牡荆苷和6 5 6 8 2 异牡荆苷粗品，收率分别为3 1 8 6 1 2 干n3 2 1 2 4 8 ；用硅胶柱层析继 续纯化牡荆苷：异牡荆苷粗品，牡荆苷的含量由2 8 1 4 5 1 达到8 3 1 2 1 6 ，收率为 5 7 4 1 5 3 ：异牡荆苷的含量由6 5 6 8 2 达到6 8 3 6 5 3 ，收率为5 2 3 5 1 4 。 5 乙醇提取物对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的m i c 均为 3 0 0 m g m l ，而乙酸乙酯萃取物对三种相应的革兰氏阳性菌的m i c 分别为l ，5 0 m g m l 、 1 5 0 m g m l 和0 7 5 m g m l 。由抑菌动态曲线表明，当木豆乙醇提取物及乙酸乙酯萃取物 的浓度为2 m i c ( m b c ) d , 寸，在前1 2 小时细菌数量一直减少直至1 2 小时，细菌完全被杀 死。 东北林业大学硕士学位论文 关键词木豆叶；牡荆苷；异牡荆苷；超声提取；大孔吸附树脂：柱层析：分离纯化 抗菌活性 a b s t r a c t i nt h ep r e s e n ts t u d y ，t h ee x t r a c t i o no fv i t e x i na n di s o v i t e x i n 舶mt h e1 e a v e so fp i g e o 印e a c a j a l l u sc a j a n ( l ) m i l l s p 】w a sc a r r i e do u t ，t h ec o n d i t i o n sf o rs e p a r a t i o na 1 1 dp u r 试c a t i o s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa n db a c i l l u ss u b t i l i s 、v e r ea l i3 0 0 m g m l ，w h e r e a sm em i co fe t l l v l a c e t a t e e x t r a c tt on l et h r e eg r a mp o s j t i v e b a c t e “am e 州o n e da b o ” w e r e1 5 0 m 幽l 、 1 5 0 m m l 、o 7 5 m m l ，r e s p e c t i v e l y a ss h o 、v ni nt h ed y n a m i cc u r v eo fa n t i m i c r o b i a l a c t l t i e s ，w h e n 出ec o n c e n t r a t i o n so fe m a n 0 1 i ca i l de t h y ia c e t a t ee x t r a c t sw e r e2 m i c m b c l t 1 1 eq u a i l t i 可o fb a c t e r i as u r v i v i n gd e c r e a s e da n da l l t h eb a c t e r i aw e r ek i i l e dw i t h i n1 2h k e y w o r d s p i g e o n p e a c a j a l l u sc a ja i l ( l t ) m i l l s p l e a v e s ；v i t e x i n ；i s o v i 把x i n ：u l t m s o n i c e x t r a c t i o n ；m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n ；c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ；s e p a m t i o na n dp 谢f i c a t i o n ； a m i m i c r o b i a la c t i v i t y i v 绪论 1 1 木豆资源的基本特征 1 绪论 1 1 1 木豆资源的起源与传播 木豆(c巧淞咖犯，纠卸)英文常用名为pigeonpea，别名黄豆树、豆蓉 树、三叶豆、千年豆、树豆、蓉豆、柳豆、花豆、米豆等。木豆，因其豆荚结于树冠枝 梢上，故称木豆：鸽子爱吃，又称鸽豆。对于木豆的起源，尚存在两种观点，第一种观 点认为木豆起源于非洲的安哥拉至上尼罗河带，主要依据是在埃及古墓中发现了一粒 公元前24002200年的木豆种子。第二种观点认为木豆起源于印度，目前有足够充分的 证据支持第二种观点。首先，上世纪70年代从印度的bhokardan发现了公元前2世纪 的小粒木豆种子残存物；其次印度有最广泛的近缘野生种分布，目前己发现的32个近 缘野生种中，分布于印度的有17个；第三，印度语言学家skch甜erii对木豆最初的 梵文名详细考证后指出，它是从印度当地名称tuvarai而来；第四，印度拥有全世界 82的木豆种质资源和近80的种植面积。另外，木豆在印度的加工和食用方法很多， 也为木豆起源于印度提供了间接证据【l“】，因此，木豆起源于印度的观点已被越来越多的学者所接受。 木豆2000多年前起源于印度，驯化成栽培种后，向外传播的时间相当早。木豆从 印度南部传入马来西亚：从印度西北部传入尼罗河流域及非洲其他地区，并在非洲东部 形成了木豆栽培种遗传多样性的次生中心；从印度东部传入中国和澳大利亚；后来又经 非洲传入欧洲和美洲。现在，木豆已广泛栽培于南北纬30度之间的广大地区il5】。 1 1 2 木豆资源的分类学特征 木豆属于豆科，蝶形花亚科，菜豆族，木豆亚族木豆属。木豆为落叶灌木多分枝，茎粗大至3 c m 老枝无毛，棱不明显，嫩枝5 棱状，被短毛而呈灰白色，棱间槽沟状深 绿色。叶互生，三出复叶，小叶片与叶柄连接处略膨大，密被微毛，偶见柔软尖状托叶 2枚。叶披针形至长椭圆形，叶基楔形，叶端渐尖。叶背被灰白色微毛具不明显腺点， 气清香。背脉突起。叶面绿色无光泽，柔软无光滑感。花腋生，总状花序，蝶形花黄 色，花梗被微毛，花萼钟状，不等五裂，花左右对称，旗瓣蝶形，顶端微凹。基部有附 属体，可见纵向脉络，翼瓣2枚，月刀状对称，龙骨瓣向内弯曲，仅上背部连合，雄蕊 10枚，花柱顶端平截，子房上位，花期57月。夹果刀状，顶端渐尖延成长喙状，缩 柔毛，种子间果皮斜状缢缩成沟状，与夹果边沿成深绿色，果成熟期不一，种子36 枚。种子略扁，类圆形，长o6o8cm，宽o507cm，新株肥足可大如黄豆，种皮黄褐色至红棕色，种脐白色，中纵向凹陷成沟状，一端与种皮连接处往往有一深棕褐色的 绪论 1 1 木豆资源的基本特征 1 绪论 1 1 1 木豆资源的起源与传播 木豆( c 巧淞咖犯， 纠卸) 英文常用名为p i g e o n p e a ，别名黄豆树、豆蓉 树、三叶豆、千年豆、树豆、蓉豆、柳豆、花豆、米豆等。木豆，因其豆荚结于树冠枝 梢上，故称木豆：鸽子爱吃，又称鸽豆。对于木豆的起源，尚存在两种观点，第一种观 点认为木豆起源于非洲的安哥拉至上尼罗河带，主要依据是在埃及古墓中发现了一粒 公元前2 4 0 0 2 2 0 0 年的木豆种子。第二种观点认为木豆起源于印度，目前有足够充分的 证据支持第二种观点。首先，上世纪7 0 年代从印度的b h o k a r d a n 发现了公元前2 世纪 的小粒木豆种子残存物；其次印度有最广泛的近缘野生种分布，目前己发现的3 2 个近 缘野生种中，分布于印度的有1 7 个；第三，印度语言学家s k c h 甜e r i i 对木豆最初的 梵文名详细考证后指出，它是从印度当地名称t u v a r a i 而来；第四，印度拥有全世界 8 2 的木豆种质资源和近8 0 的种植面积。另外，木豆在印度的加工和食用方法很多， 也为木豆起源于印度提供了间接证据【l “】，因此，木豆起源于印度的观点已被越来越多 的学者所接受。 木豆2 0 0 0 多年前起源于印度，驯化成栽培种后，向外传播的时间相当早。木豆从 印度南部传入马来西亚：从印度西北部传入尼罗河流域及非洲其他地区，并在非洲东部 形成了木豆栽培种遗传多样性的次生中心；从印度东部传入中国和澳大利亚；后来又经 非洲传入欧洲和美洲。现在，木豆已广泛栽培于南北纬3 0 度之间的广大地区i l 5 】。 1 1 2 木豆资源的分类学特征 木豆属于豆科，蝶形花亚科，菜豆族，木豆亚族木豆属。木豆为落叶灌木多分枝， 茎粗大至3 cm 老枝无毛，棱不明显，嫩枝5 棱状，被短毛而呈灰白色，棱间槽沟状深 绿色。叶互生，三出复叶，小叶片与叶柄连接处略膨大，密被微毛，偶见柔软尖状托叶 2 枚。叶披针形至长椭圆形，叶基楔形，叶端渐尖。叶背被灰白色微毛具不明显腺点， 气清香。背脉突起。叶面绿色无光泽，柔软无光滑感。花腋生，总状花序，蝶形花黄 色，花梗被微毛，花萼钟状，不等五裂，花左右对称，旗瓣蝶形，顶端微凹。基部有附 属体，可见纵向脉络，翼瓣2 枚，月刀状对称，龙骨瓣向内弯曲，仅上背部连合，雄蕊 1 0 枚，花柱顶端平截，子房上位，花期5 7 月。夹果刀状，顶端渐尖延成长喙状，缩 萼留存，干后深褐色，果柄基部膨大成节状，顶端连结缩萼成托盘状，果皮密被白色短 柔毛，种子间果皮斜状缢缩成沟状，与夹果边沿成深绿色，果成熟期不一，种子3 6 枚。种子略扁，类圆形，长o 6 o 8 c m ，宽o 5 0 7 c m ，新株肥足可大如黄豆，种皮黄 褐色至红棕色，种脐白色，中纵向凹陷成沟状，一端与种皮连接处往往有一深棕褐色的 图l l 木豆种子 斑点，子叶两枚肥大。 在木豆属中，现已发现了3 2 个种，有 七个种分布于中国，而其中6 个是野生种 。木豆是唯一的一个栽培种，在木豆种 内，已确定了二个亚种：一个是黄花变种 ( c 面册淞c 叫d n f 月鲫螂d c ) ，旗瓣两面黄 色，植株较矮小，一年生，早熟。豆荚多为 浅绿色，每荚种子2 粒一3 粒：另一个是紫纹 变种( 胁”淞廊 阳，b f c o ，o rd c ) 5 】，旗 瓣正面黄色，背面带紫红色条纹，植株较 高，多年生灌木，豆荚有毛，每荚种子4 粒 7 粒，籽粒较大，有多种颜色并常有褐色斑点，一般次年2 月至3 月才成熟。 图1 2 木豆幼苗 图】3 术豆植株 1 1 3 木豆资源的生态学特征 木豆生命力强，耐早、耐寒、耐瘠。木豆是短日性或中日性植物，较喜温，长温度 范围1 0 3 5 ，最适温度1 1 2 9 ，光照愈短，愈能促进花芽分化，提早开花成熟。 在选择引种和示范点时应考虑这个特点。由于属多年生的越冬植物，要尽量避免越冬时 遭受冻害，所以木豆对温度要求较为严格。最好选择在月均温不低于5 的地区种植； 温度低于一5 时，木豆种植则会受到冻害。较耐干旱，在年降雨量仅为3 8 0 毫米的地区 也能正常生长。木豆对土壤要求不严，能适应各种类型的土壤，砂土、土、石砾土都能 种植，适宜土壤p h 值在5 7 。耐性较好，许多品种能在盐渍土中正常生长旧。j 。目前 新培育的些相对矮化和生育期较短的品种，可在南北纬4 5 的范围内栽培瞵j 。 图l l 木豆种子 斑点，子叶两枚肥大。 在木豆属中，现已发现了3 2 个种，有 七个种分布于中国，而其中6 个是野生种 。木豆是唯一的一个栽培种，在木豆种 内，已确定了二个亚种：一个是黄花变种 ( c 面册淞c 叫d n f 月鲫螂d c ) ，旗瓣两面黄 色，植株较矮小，一年生，早熟。豆荚多为 浅绿色，每荚种子2 粒一3 粒：另一个是紫纹 变种( 胁”淞廊 阳，b f c o ，o rd c ) 5 】，旗 瓣正面黄色，背面带紫红色条纹，植株较 高，多年生灌木，豆荚有毛，每荚种子4 粒 7 粒，籽粒较大，有多种颜色并常有褐色斑点，一般次年2 月至3 月才成熟。 图1 2 木豆幼苗 图】3 术豆植株 1 1 3 木豆资源的生态学特征 木豆生命力强，耐早、耐寒、耐瘠。木豆是短日性或中日性植物，较喜温，长温度 范围1 0 3 5 ，最适温度1 1 2 9 ，光照愈短，愈能促进花芽分化，提早开花成熟。 在选择引种和示范点时应考虑这个特点。由于属多年生的越冬植物，要尽量避免越冬时 遭受冻害，所以木豆对温度要求较为严格。最好选择在月均温不低于5 的地区种植； 温度低于一5 时，木豆种植则会受到冻害。较耐干旱，在年降雨量仅为3 8 0 毫米的地区 也能正常生长。木豆对土壤要求不严，能适应各种类型的土壤，砂土、土、石砾土都能 种植，适宜土壤p h 值在5 7 。耐性较好，许多品种能在盐渍土中正常生长旧。j 。目前 新培育的些相对矮化和生育期较短的品种，可在南北纬4 5 的范围内栽培瞵j 。 l 绪论 1 。1 4 木豆资源的分布学特征 目前世界上9 0 多个国家有木豆栽培。亚洲是世界上最大的木豆产区，面积和产量 均占世界木豆生产的9 2 以上，其中印度又是世界上最大的木豆生产国( f a 0 统计资 料) 。亚洲除印度之外，缅甸、尼泊尔、中国、孟加拉也有较大面积的木豆生产。非洲 是世界上第二大木豆产区，种植面积占世界木豆总种植面积的6 4 8 ，产量占世界总产 量的6 8 8 ：在非洲有四个木豆主产国，依次是马拉维、乌干达、坦桑尼亚和肯尼亚。 另外，中南美洲有少量的木豆种植面积，主要分布在海地、巴拿马、牙买加、特立尼达 和多巴哥、波多黎各及格林纳达，种植面积占世界木豆总种植面积的0 7 1 ，产量占世 界总产量的o ，8 1 左右。澳大利亚约有5 0 0 0 公顷的木豆栽培面积。中国木豆栽培较 少，主要分布于长江以南的海南、云南、广西、贵州、广东以及福建、湖南、四川、江 西、浙江、台湾等省区。据估计，2 0 0 0 年以前每年种植面积一直徘徊在3 5 0 0 - 4 0 0 0 公 顷，总产量约为3 0 0 0 吨。1 9 9 7 年开始，针对中国农业生产、水土保持以及消费习惯的 实际需要，从国际半干旱热带作物研究所( i c r j s a t ) 有选择的引进木豆改良品种进行 推广，到2 0 0 2 年中国木豆种植面积己上升到1 5 0 0 0 公顷以上【9 j 。 1 2 木豆研究与应用概况 木豆为世界第六大食用豆类，也是唯一的木本食用豆类，其籽实含蛋白质约2 0 ， 淀粉5 5 ，含人体必需的8 种氨基酸，是以禾谷类为主食的人类最理想的补充食品之一 【1 1 卸；木豆叶含蛋白质1 9 ，是牛羊喜食的优质牧草 1 4 】；木豆具有耐早、耐瘠、生长 快、繁殖栽培容易等特性，根系深可达地下3 m ，固氮量每年2 0 0 k h m 。2 【】”，是造林困 难的干热地区理想的植被恢复和土壤改良树种。饥荒年代，我国南方农民曾种植木豆以 其籽实为救荒粮食，烹煮后作为主食或添加到菜肴中食用，有的地区以木豆代替大豆制 作酱油和豆腐 。6 】，现在老百姓直接食用木豆的习惯已放弃。我国民间用木豆治疗外伤、 烧伤感染和褥疮等取得了较好疗效。由于某些原因，许多研究成果过去只能内部交流， 使木豆的研究及利用很难找到有关资料。 1 2 1 木豆化学成分的研究 木豆在我国主要分布于云南、四川、江苏、广东等省，资源较丰富。木豆的根部有 清热解毒、止血、止痛和杀虫作用【”】，嫩叶嚼烂用于治疗口疮，压汁内服可消除黄疸， 捣烂的浆汁对外伤和疮毒有祛腐生肌的作用。叶的煎剂对咳嗽、腹泻等有效。民间尚将 其叶制成三种制剂，用于治疗外伤、烧伤感染和褥疮等取得较好的疗效。虽然民间和医 药界都十分重视木豆的医药价值与其保健功能，但是迄今为止，对其有效化学成分分析 的相关研究报道大多己经损毁，国内仅见少数资料，国外尚无。现在的对术豆的成分分 析的报道多集中在营养成分方面，较少涉及其药用成分的系统研究报道。 我国学者林励等对海南产的木豆叶进行了较系统的有效化学成分的研究l l ，对木 豆叶的乙醇提取物，分别以石油醚、乙酸乙酯和甲醇回流提取。各提取物进行抑菌试 验，其中乙酸乙酯提取物的抑菌活性最强。对乙酸乙酯部分的进一步分离，得7 个化合 东北林业大学碗： 学位论文 物，经理化和光谱分析，鉴定了6 个化合物的结构。中国医学科学院药用植物开发研究 所，研究了木豆叶的抗消炎成分，得出1 1 种结晶成分【l “。程菇青等用水蒸汽蒸馏法从 木豆的叶和嫩枝中提取挥发油，并用交联毛细管柱气相色谱质谱计算机 ( g c ，m s m s d ) 联用技术测定木豆精油的化学成分，从中鉴定出2 3 种化合物【1 9 1 。木 豆主要化学成分归纳如下，见表1 1 。 表卜1 木豆中主要化学成分 序号化合物名称序号化合物名称 1 牡荆苷v j t e x i n 2 0 a i d h a _ c u a i e n e 2 异牡荆苷i s o v i t e x i n 21 b 芹子烯b e t a z e l i n e n e 3 芹菜素a p i g e n i n 2 2a i d h a - h 砷a c h a l e n e 4 木犀草素l u t l i n 2 3 榄兰树油烯e n o p h i l e n e c柚皮素4 ，7 - 二甲醚n a r i n g e n i n e 一4 ，7 - 2 4 b e t a - c u a i e n e。 d i m e m v le t h e r 6 口谷甾醇口s i c o s f e m l 2 5 菖蒲二烯a l o r a d i e n e 7 稗牡荆甙v i t e x n 2 6 1 ，2 ，4 a ，5 ，8 ，8 m 六氢4 ，7 二甲基1 一异丙基萘 8 水杨酸s a i i c y i i c ，3 ，7 ，1 1 三甲基7 - 乙基2 ，6 ，1 0 ，1 2 碳三烯醇一 川 1 9 三十一烷h e n t r i c a c o n t a n e 2 8 十六烷n e x a d e c a n e 1 0 2 一羧基3 羟基一4 异戊烯基5 甲氧基一芪 2 9 * 石竹烯醇a l p h a _ c a r 叮o p h y e n ea l c o h o i 1 1 虫膝腊醇( 1 a c e r 0 1 ) 3 0b e t a c e d r o n o l ，3 羟基- 4 异戊烯基5 - 甲氧基芪 3 lc e d r o e l o n 画s i y l i n ea 13 柚皮素- 4 n a r i n 唱e nj n - 4 3 2b e t a - h i m a c h a l e n e 1 4 7 - 二甲醚7 一d i m e t h y ie t h e r 3 3 喇叭醇l e d o i 15 p - 香树脂醇p a m y r i n 3 4 十七烷n _ h e p t a d e c a n e 1 6 异壬基苯i s o m e r i en o n y | b e n z e n e s 3 5 愈疮醇g u a i o e l7 a 1 p h a c o m p a n e 3 6 苯甲酸苄酯b e n 纠lb e n z o a t e 1 8 b 缘叶烯b e 协p a t c h o u i e n e 3 7 二十烷e i c o s a n e 1 9 p - 石竹烯b e t a c a r y o p h y l l e n e 3 8二十一烷h e n e i c o s a l l e 1 2 2 木豆育种与栽培技术的研究 木豆的栽培技术和品种改良工作，主要在印度开展较多，而从事该作物研究的又主 要是国际半干旱热带作物研所。 国际半干旱热带作物研究所( i n t e m a t i o n a lc r o p sr e s e a r c hi n s t i t u t ef o rm es e m i - 埘d i r o p i c s 缩写为i c r i s a t ) 对木豆的研究是全方位的，他们搜集世界各地的木豆品种资 源，从7 4 个国家收集到了1 3 5 4 8 份木豆资源，丰富了基因库，其中收集最多的国家依 次为印度、肯尼亚、马拉维、坦桑尼亚、尼泊尔等【2 0 】。并选育了一大批i c p 系统的木豆 新品种，在世界许多国家推广应用。1 9 9 8 年美国俄克拉荷马州的研究表明，木豆适合和 小麦轮作，是一种良好的接小麦茬的夏季作物【2 ”。同年，美国的研究表明在1 2 0 一2 5 0 天 内成熟的木豆品种适于和美国大平原区的小麦轮作【2 “。scr a o ，swc o i e m a n 等研究 认为，从i c r i s a t 引进的木豆品种p b n a 适应性好、产量高、品质好，能在7 月至1 1 月份保质保量地供应牛需要的饲料【2 3 。scr a o ，wap h i l i l i p s 等研究表明，木豆在美国 南部能够填补夏季末到秋季的饲料空白，为畜牧生产提供新的蛋白质来源 2 4 j 。在老挝， 为了扭转目前土壤肥力下降和人口贫困化的趋势。该国实施了饲料和畜牧系统项目，在 该项目中木豆被大面积推广应用，并取得成功【2 5 j 。在印度，pkj o s h i ，p a k as a x e n a 等研 究，木豆正在向非传统产区发展。但初期需要政府在技术上和政策上予以扶助，在大力 推广前需要对发展地区的环境条件、生产技术条件和经济条件、尤其是潜在有利条件和 不利条件进行研究【2 “。p r e msv a s h i s h t l l a 也认为，木豆正向某些新的地区逐步发展，这 对于这些地区的作物生产的多样性是非常有利的【2 ”。 1 2 3 木豆生物技术研究 m l m o h a n ，k v k r i s h a n a m u n i l y 等人则采用成熟木豆种子的子叶末梢切段作为外 植体进行木豆植株再生，来自2 个基因型( t _ 1 5 1 5 和g a u i - 8 2 9 0 ) 的外植体培养在6 种不同培养基中，直接诱导出大量枝芽。这些培养基中添加了6 一苄基一氨基嘌呤，激动 素和硫酸酯腺嘌呤。把这些枝芽接种在同样的基础培养基( 但激素不同) 时可以发育成 植株，植株成活率可达7 0 7 5 吲。1 9 9 8 年k s r c e n i v a s u ，s k m a l i k ，pa n a n d ak m a r 等人通过体细胞胚胎再生技术进行木豆植株再生，在m s 培养基上添加1 0 ij m 的t d z ， 接种子叶和1 0 目龄幼苗的叶片，能产生愈伤组织和胚胎，移栽后能形成具有正常形态 特征的植株【2 9 】。s b v e n l l k a r1 9 9 7 年在木豆品种u p a s 一1 2 0 中发现一株雄性不育株，并 对其不育性的遗传特性进行了研究，结果表明，该雄性不育性是遗传的，它受一个隐性 基因控制【3 0 】。 1 2 - 4 木豆临床药理研究及应用 在医药方面的研究利用，较早的陆川本草记载：木豆叶“平、淡、有小毒”。 中华药海对此作了进一步说明：木豆叶“平、淡、有小毒、入心径”主治小儿水痘、 痛肿】。台湾将木豆称为树豆，经对树豆进行检索，其介绍为“台湾民间传树豆可作诸 药之引药”。原住民自古多种之，其种子近圆球形，略扁，种皮暗红色，采用熟者入 药，有清热解毒、补中益气、利水消食、止血止痢、散瘀止痛、排痛肿之效。树豆根具 有消炎解毒及解热之效。近几年也有木豆制剂外敷可促进开放创面愈合口“。将木豆叶作 为生脉成骨片的主要药味 3 3 1 ，以及从木豆中提取、分离有关药用成分的报道。 中国、印度、西非、加勒比地区及其他许多国家民间均以木豆不同部位入药，其中 以叶的药用功效最显著，叶内含1 1 种不同的结晶成分，可治外伤、烧伤、褥疮，可止 痛、消肿、止血，其消炎止痛功效优于水杨酸口。 王凌云等在研究长瓣金莲花中黄酮苷的抑菌活性时发现，牡荆苷的抑菌活性最好， 并且中国药典中提到，牡荆营具有抗炎、解痉与降压活性，有优良的抗自由基能力与 s o d 活性，降低血清低密度脂蛋白胆固醇，抗衰老、抗疲劳、抗应激作用。 1 3 溶剂提取法简介 1 3 1 溶剂提取法的原理 溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对有效成分溶解度 查苎堡些= i ! j ；兰竺：! j ：兰些丝兰 大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。 具体操作是：根据所要提取成分的性质，选择合适的溶剂，加到适当粉碎过的中草药原 料中，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性物质，而 造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织 细胞中，如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤出， 浓缩。继续多次加入新溶剂，重复以上过程，反复多次就可以把所需要的成分近于完全 溶出或基本溶出，合并所有的浓缩液，即为含有所需有效成分的混合液。 t 中草药成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为水、亲水性有机溶 剂及亲脂性有机溶剂，被溶解成分也有亲水性及亲脂性的不同。亲水性、亲脂性及其程 度的大小，是和化合物的分子结构直接相关。 有机化合物分子结构中，如果亲水性基团多，则其极性大而疏于油；如果亲水性基 团少，则其极性小而疏于水。中草药化学成分复杂，有效成分分子结构也比较复杂，同 一类有效成分的分子结构还有差异，难以做到用偶极矩和介电常数来比较每一个分子的 极数，更多的情况下是从分子的结构出发去判断和比较有效成分得极性，一般来说，可 分为一下几种情况。 如两种成分基本母核相同，其分子中功能基的极性越大或极性功能基数量越多， 则整个分子的极性也大，亲水性强，而亲脂性就越弱：反之，其分子中非极性部分越大 或碳键越长，则极性越小，亲脂性强而亲水性越弱。如苷与苷元相比，苷分子由于含有 糖的部分，极性基团多，因而亲水性较强，多用水或醇提取。用乙醇从种子中提取苷类 时，由于乙醇的溶解面广，为避免共存亲脂性成分的干扰，常采用石油醚先除去种子中 的油脂等亲脂性成分后再用乙醇或水提取。 如若两种成分的结构类似，分子的平面性越强，亲脂性越强。如黄酮类化合物由 于分子中存在共轭体系，平面性强，亲脂性强，多用亲脂性溶剂提取，但二氢黄酮由于 分子中的吡喃环被氢化，平面性被破坏，其亲水性明显增强。 如若分子中含有酸性基团或碱性基团，常可与碱或酸反应生成盐而增大水溶性。 如生物碱可溶于酸，羟基蒽醌可溶于碱，一些含有内酯环的化台物也可与热碱水共煮开 环而溶解。 溶剂的性质同样也与其分子结构有关。例如甲醇、乙醇的分子比较小，有羟基存 在，与水的结构很相似，能够和水任意混合，是亲水性比较强的溶剂；而丁醇和戊醇分 子中虽都有羟基，保持和水有相似处，但分子逐渐地加大，碳链增长，与水性质也就逐 渐疏远，虽能与水彼此部分互溶，在它们互溶达到饱和状态之后，丁醇或戊醇都能与水 分层。氯仿、苯和石油醚是烃类或氯烃衍生物，分子中没有氧，属于亲脂性强的溶剂。 实验室常用的有机溶剂的极性强弱顺序可以表示如下： 石油醚 苯 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 丙酮 乙醇 ，1 2 ：。0 ：；：；器；墨器 乙酸乙酯层涩獬鬣鬣勰黜黜勰 阳性对照3 潞溜珊黑品咒 ，0 川1 6 。黑嬲 附：a 为阳性对照，链霉索为细菌的阳性对照，联苯苄唑为真菌的阳性对照 由表6 2 可以看出，木豆叶乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物均对革兰氏阳性菌抗菌活 性较强，而对革兰氏阴性菌及真菌抗菌作用较弱，同时还可以看到，乙酸乙酯萃取物比 木豆叶的醇提物的抗菌活性强，乙醇提取物对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽 孢杆菌的m i c 均为3 0 0 m g m e ，对应的m b c 分别均为6 o o m g m l ；而乙酸乙酯萃取物 对三种相应的革兰氏阳性菌的m i c 分别为1 5 0 m g m l 、1 5 0 m g m e 、o 7 5 r c 【g m l ，对应 的m b c 分别为3 0 0 m g m l 、3 0 0 m g m l 、1 5 0 m g m l 。乙酸乙酯萃取物同时也表现出了 对革兰氏阴性菌及真菌的抗菌活性，而乙醇提取物未表现出对革兰氏阴性菌及真菌的抗 菌活性。 6 5 2 杀菌曲线及分析 根据表6 - 2 结果，我们选择木豆醇提物及乙酸乙酯萃取物较敏感的菌株一表皮葡萄 球菌做杀菌曲线试验。采用m i c 及m b c 测定方法，分别选择1 2 m i c ，m i c ，2 m i c 及 m b c 与表皮葡萄球菌( 菌液浓度为1 0 5 c f u m 1 ) 作用，在3 7 。c 下培养，分别于 o ，1 ，2 ，4 ，8 ，1 2 ，2 4 ，3 0 h 从各孔中吸取5 0 u l 用生理盐水1 0 倍稀释法进行稀释，将各浓度药液 吸取2 5 u l 滴入铺有营养琼脂培养基的平板中，并用接菌环将液体均匀涂于平板上，于 3 7 继续培养18 2 4 小时后，查菌落数。 ! 奎星些墼丝堡竺垒垒竺三塑董矍丝苎塑重堡丝垒 表6 - 3 木豆醇提物及乙酸乙酯萃取物杀菌曲线试验的选择浓度 、 品名 木豆醇提物水豆乙酸乙 浓趴 ( m m 1 ) 酯萃取物 ( m g m 1 ) 1 2 m i c1 5o 7 5 m i c31 5 2 m i c63 m b c63 = 瀑a 7 - 耐- - 一 o hl h 2 h 4 h8 h 1 2 h 2 4 h3 0 h 药物及浓度 16 8 65 64 8 x1 9 22 4 2 m i c60 1 0 20 1 0 20 x i 0 。 1 0 51 0 1 0 1 0 4 1 0 3 ( m b c ) l o g l o 5 2 34 8 24 6 84 2 83 3 8o0o 木豆乙醇3 1 6 81 0 464 82 3 21 6 9 2 x1 2 x4 4 8 m i c1 0 51 0 31 0 11 0 41 0 41 0 31 0 51 0 6 提取物 l o g l o 5 2 35 0 24 8 14 3 74 2 03 9 65 0 86 6 5 1 6 81 2 81 6 83 2 x2 0 82 4 43 6 1 9 2 x 1 2 1 5 1 0 51 0 51 0 31 0 31 0 61 0 51 0 71 0 8 m i c l o g l o 5 2 35 1 15 2 35 5 l6 3 26 3 97 5 68 2 8 1 6 87 2 x 3 8 4 1 4 9 6 x 2 m i c3 0 1 0 20 x 1 0 20 x 1 0 2 1 0 5 1 0 4 1 0 11 0 41 0 3 ( m b c ) l o g l o 5 ，2 34 8 64 5 84 1 5 3 9 8oo0 木豆乙酸 1 6 84 ，4 x3 2 1 8 1 2 x9 6 x1 6 x6 4 8 1 5 乙酯萃取 m i c1 0 51 0 41 0 11 0 4 1 0 41 0 31 0 51 0 6 物 l o g l o 52 3 4 6 4 4 ，5 14 2 64 0 83 9 85 2 06 8 i 1 6 81 0 8 17 64 4 2 3 22 4 1 2 4 7 2 x 1 2 o 7 5 1 0 。1 0 5 1 0 51 0 3x 1 0 61 0 61 0 71 0 7 晴l c l o g l o 5 2 35 0 35 2 55 6 46 3 76 3 8 7 0 87 6 7 1 6 82 4 x9 6 x 8 4 2 ，8 x2 6 43 5 2 x1 6 4 阳性对照 1 0 51 0 51 0 51 0 6 1 0 81 0 91 0 1 01 0 “ l o g l o 5 2 35 3 8 5 9 86 9 28 1 59 4 21 05 51 1 2 1 5 1 东北林业大学顺士学位论文 以存活的细菌数量的对数值为纵坐标，以时间为横坐标绘制杀菌曲线，如图6 一l 、 6 2 所示。 o 已 3 蚓 轻 l o 8 蕊6 辍 蛩a 癌 莲z 0 05l o1 52 02 53 03 5 时间( h ) i 一2 m i c ( m b c ) o m i c 士r 一1 2 m i c - c o n t r o l 图6 - 1 木豆乙醇提取物对表皮葡萄球菌的杀菌曲线 1 2 l o 051 01 52 02 53 0 时间( h ) 一2 m i c ( m b c ) 一m i c 0 r 一1 2 m i c 一c o n t r 0 1 图6 2 木豆乙酸乙酯萃取物对表皮葡萄球菌的杀菌曲线 从图6 1 、6 2 中我们可以看出，木豆乙醇提取物及乙酸乙酯萃取物的浓度为 1 2 m i c 时，不同时问存活的细菌数量呈缓慢上升趋势，m i c 浓度细菌数量在前1 2 小时 细菌数量缓慢下降，1 2 小时后细菌数量呈明显上升趋势，可能是因为在1 2 小时后，药 物的作用能力减弱而导致细菌增殖，而2 m i c ( m b c ) 在前1 2 小时细菌数量一直减少直至 1 2 小时，细菌完全被杀死，在后来的1 8 小时内未见细菌生长。而阳性对照的细菌数量 一直持续上升。由以上结果可以看出，木豆乙醇提取物及乙酸乙酯萃取物几种浓度的杀 8 6 4 2 o i叫nb一掣鼎靛棚辍粗暴s蜂砖 6 木豆叶醇提取物及己酸乙酯革取物抗菌栝性研究 菌曲线没有明显不同，在3 0 小时内，当浓度为i 2 m i c 时对细菌数量抑制力较弱，当浓 度为m i c 时，可以使菌液的浓度保持在1 0 6 c f u m l 以内，而当浓度为2 m i c ( m b e ) 时， 在1 2 小时内可以完全杀灭细菌。 6 6 本章小结 本部分对乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物的抗菌活性进行了研究，得出如下结论： ( 1 ) 乙醇提取物对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的m i c 均为 3 0 0 r r l g m l ，而乙酸乙酯萃取物对三种相应的革兰氏阳性菌的m i c 分别为1 5 0 m g m l 、 1 5 0 m g m l 、o 7 5 m g m l 。 ( 2 ) 木豆叶乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物均对革兰氏阳性菌抗菌活性较强，乙酸 乙酯萃取物同时也表现出了对革兰氏阴性菌及真菌的抗菌活性，而乙醇提取物未表现出 对革兰氏阴性菌及真菌的抗菌活性。可以看到，乙酸乙酯萃取物比木豆叶的醇提物的抗 菌活性强。 ( 3 ) 从乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物的动态抑菌曲线可以看出，当它们的浓度 为：a i 2 m i c 时，不同时间存活的细菌数量呈缓慢上升趋势： b m i c 浓度细菌数量在前1 2 小时细菌数量缓慢下降，1 2 小时后细菌数量呈明显上 升趋势； c 2 m i c ( m b c ) 在前1 2 小时细菌数量一直减少直至1 2 小时，细菌完全被杀死。 东北林业大学坝士学位论文 结论 木豆2 0 0 0 多年前起源于印度，驯化成栽培种后，向外传播，中国的木豆从印度东 部传入。木豆生命力强，耐旱、耐寒、耐瘠；目前木豆为世界第六大食用豆类，也是唯 一的木本食用豆类；木豆的根部有清热解毒、止血、止痛和杀虫作用，嫩叶嚼烂用于治 疗口疮，压汁内服可消除黄疸，捣烂的浆汁对外伤和疮毒有祛腐生肌的作用，叶的煎剂 对咳嗽、腹泻等有效。 近年来，随着对黄酮药理作用的深入研究，以及对木豆有效活性成分的探究，本研 究选用超声提取法提取牡荆苷和异牡荆苷，并且采用大孔吸附树脂技术和柱层析技术分 离纯化牡荆苷和异牡荆苷，确定了工艺流程、工艺条件、分析方法和分离纯化条件；同 时，本研究针对木豆叶粗粉乙醇提取物及乙酸乙酯萃取物进行了抑菌活性比较。 全文主要内容总结如下： 1 牡荆苷和异牡荆苷定量分析方法的建立 确定了反相高效液相色谱分析检测木豆叶粗粉中牡荆苷和异牡荆苷的色谱条件色谱 柱o d s 柱( 4 6 t m n x 2 5 c m ) ，检测波长3 3 0 n m ，流速1 m l m i n ，进样量1 0 肛l ，流动相为 c h 3 0 h - h 2 0 - h 3 p 0 4 体系。定量分析牡荆苷和异牡荆苷的流动相比例为c h 3 0 h ：o 4 h 3 p 0 4 = 3 5 ：6 5 ：牡荆苷和异牡荆苷标准曲线的相关系数r 2 分别为o 9 9 9 8 和o 9 9 9 5 ，重 现性试验标准偏差分别为5 2 7 6 6 3 和7 4 7 ，7 0 ：相对标准偏差分别为o 0 9 0 和o 0 0 8 。 此分析方法精密度高、重现性好、准确度高、可靠性强。 2 超声提取木豆中牡荆苷和异牡荆苷工艺条件的优化 本部分对木豆叶中的同分异构体牡荆苷和异牡荆苷的超声提取条件进行了优化，对 影响提取率的各个因素进行了考察，确定了最佳的提取工艺参数。 ( 1 ) 超声提取法的最佳工艺参数为： 溶剂及液固比：6 0 乙醇，2 0 ：1 。 提取时间：4 5 m i n 提取功率： 2 5 0 w 提取温度：4 0 5 0 提取次数：3 次 ( 2 ) 通过对超声提取和常规溶剂提取方法的比较，超声提取法提取率高，牡荆苷 和异牡荆苷提取率分别为o 1 8 5 6 和o 1 3 8 5 ，牡荆苷的超声提取法提取率是浸渍提取 法的1 7 2 倍，是热回流提取法的1 2 1 倍，异牡荆苷的超声提取法提取率是浸渍提取法 的2 0 5 倍，是热回流提取法的1 3 6 倍。 3 大孔吸附树脂分离纯化牡荆苷和异牡荆苷的研究 通过比较牡荆苷和异牡荆苷在1 2 种大孔树脂上的吸附、解吸性能，牡荆苷和异牡 荆苷在各种树脂上达到吸附平衡的时间均为2 h ；用大孔吸附树脂吸附牡荆苷和异牡荆苷 结论 溶液，4 5 乙醇溶液洗脱，洗脱液经过干燥后获得的产品中牡荆苷的含量为3 ，0 1 4 6 ， 异牡荆苷的含量为3 6 4 1 6 ，收率分别为5 7 3 1 6 4 f f 口6 1 8 4 6 7 。分离纯化条件如下： 对牡荆苷和异牡荆苷的吸附、解吸性能最好的树脂是：a d s 一5 吸附温度： 2 5 上样液p h 值： 3 5 4 流速： 1 m l m i n 洗脱液乙醇的体积分数：4 5 乙醇 4 柱层析分离纯化牡荆苷和异牡荆苷的研究 本研究选用聚酰胺柱层析将牡荆苷和异牡荆苷这对同分异构体分开，且得到含量为 2 8 1 4 5 1 的牡荆苷收率为3 1 8 6 1 2 和含量为6 5 6 8 2 异牡荆苷收率为3 2 1 2 4 8 ；用硅 胶柱层析继续纯化牡荆苷、异牡荆苷粗品，牡荆苷的含量由2 8 1 4 5 l 达到8 3 1 2 1 6 ， 收率为5 7 ，4 1 5 3 ：异牡荆苷的含量由6 5 6 8 2 达到6 8 3 6 5 3 ，收率为5 2 3 5 1 4 。 本工艺通过超声提取，大孔树脂分离，聚酰胺、硅胶柱层析纯化，木豆叶原料中牡 荆苷的最终提取率为0 0 1 1 7 ，纯度可达8 3 1 2 1 6 ：异牡荆苷的最终提取率为 0 0 1 2 6 ，纯度为6 8 3 6 5 3 。 5 木豆叶醇提物及乙酸乙酯萃取物抗菌活性的研究 本部分对乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物的抗菌活性进行了研究，得出如下结论： ( 1 ) 乙醇提取物对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的m i c 均为 3 0 0 m g m l ，而乙酸乙酯萃取物对三种相应的革兰氏阳性菌的m i c 分别为1 5 0 m g m l 、 1 5 0 m g m l 和0 7 5 m g m l a ( 2 ) 木豆叶乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物均对革兰氏阳性菌抗菌活性较强，乙酸 乙酯萃取物同时也表现出了对革兰氏阴性菌及真菌的抗