蛋白-蛋白互作研究方法-于凯.ppt

蛋白-蛋白互作研究,酵母双杂交技术,酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：,泛素酵母双杂交系统,由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示：,将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。,酵母三杂交系统,酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下图所示：,如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用，因此无法使BD和AD靠近，报告基因不能表达；当加入第三种成分后，蛋白X与蛋白Y的距离被拉近，BD和AD靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。,噬菌体展示技术,噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。,荧光共振能量转移技术,FRET，Fluorescenceresonanceenergytransfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：,以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。,免疫共沉淀,免疫共沉淀是探测活体细胞内蛋白间的相互作用的一门技术。它的原理是当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内有相互作用的蛋白Y也能沉淀下来。Co-IP的原理如下图所示，首先从细胞中提取蛋白质，获得蛋白提取液，并将其与抗体孵育，使抗体与蛋白X结合。将预处理过的proteinG琼脂糖珠（Sepharose）加入到抗体与蛋白提取液的孵育液中反应，使抗体与proteinG结合。通过离心将琼脂糖珠沉降到管底，去除上清液，然后再用缓冲液将琼脂糖珠冲洗数次，最后用westernblot（或SDS-PAGE）进行检测。,Pull-down技术,Pull-down，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质亲和层析以及特异的配体（如GSH或者镍）基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。,以下图为例，将GST的基因与蛋白X的基因融合，表达出融合蛋白。将该融合蛋白的溶液过带有GSH配体的层析柱，那么这一融合蛋白就能结合在配体上，然后将待测蛋白的溶液过柱，并让其与融合蛋白反应一段时间。接着开始进行洗脱。如果待测蛋白与蛋白X无相互作用，那么在开始清洗的时候就会被洗下来；如果在用洗脱液洗脱后才能在收集到的样品中发现待测蛋白（以及蛋白X），说明待测蛋白与蛋白X可能有相互作用。,双分子荧光互补技术,利用绿色荧光蛋白及其突变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段N端和C端，再分别与目标蛋白连接并融合表达，若连接的两个目标蛋白发生相互作用，使得两个荧光分子片段N和C端在空间上靠近，重新形成有活性的荧光基团，在一定的激发波下，能够观察到相应的生物荧光，定能够确定目标蛋白相互作用的时间，位置，强弱，稳定性等。,Farwesternblot,Farwesternblot是基于westernblot发