（有机化学专业论文）甾体皂甙的糖苷化反应研究.pdf

摘要 甾体皂甙是自然界广泛存在的糖甙，它们多存在于植物中，是许多药用植 物的活性成份，但含量相当少，不利于产业化生产。因此，人工合成活性甾体 皂甙应该是一条出路。目前文献报道的化学合成甾体皂甙不仅试剂昂贵而且步 序较多，也不能应用于产业化生产；而甾体皂甙的酶促合成可能是产业化生产 的一条捷径，但目前对这方面的研究还相当滞后。因此，本论文所做的主要工 作是探索甾体皂甙的糖苷化合成方法。论文分为两部分：1 ) 甾体皂甙的化学合 成；2 ) 甾体皂甙的酶促合成探索。 一、甾体皂甙的化学合成 我们选择了六个常见的糖基给体和三个甙元受体合成单糖皂甙，以经典的 k o e r t i g s - k n o r r 糖苷化方法为基础，通过路易斯酸催化合成了一系列单糖甾体皂 甙。在所有合成的甾体皂甙化合物中，其中有三个是目前文献中未曾报道过的 新化合物。 二、甾体皂甙的酶促合成探索 在本论文中，我们主要是对鼠李糖苷酶在甾体皂甙合成中进行了探索，经 过细致的实验摸索，我们发现植物源和微生物源的鼠李糖苷酶都无法将鼠李糖 基转移到甾体皂甙上去。我们在酶促合成探索过程首次对植物源鼠李糖苷酶在 有机溶剂存在条件下进行了活性定量表征，同时我们也通过实验证实了植物源 鼠李糖苷酶虽然无法将糖基转移到甾体皂甙这种大分子上，但却可以把糖基转 到小分子醇上，侧面证实了植物源鼠糖苷酶的特异性。当然，我们在甾体皂甙 酶促合成过程所做的工作还是初步的，这方面的工作还需要进一步探索，同时 我们希望所做的工作对小组其他成员能有所启发。 关键词：甾体皂甙，糖苷化，甙元，鼠李糖苷酶，酶促合成 v i a b s t r a c t s t c r o i d a ls a p o n i n sa r ec o m p l e xg l y c o s i d e so fs t e r o i d sa n d 、耐d e l yd i s t r i b u t e di n n a t u r e ，e s p e c i a l l yi nt h ep l a n tk i n g d o m t h e ya r et h ea c t i v ei n g r e d i e n t si nm a n y m e d i c i n a lp l a n t s h o w e v e r , t h ea m o u n to fs t e r o i d a ls a p o n i n si np l a n ti sr a t h e rl i m i t e d ， h i n d e r i n gi t sl a r g es c a l eo fi n d u s t r i a lp r o d u c t i o n o nt h eo t h e rh a n d , t h ec u r r e n t d o c u m e n t e dp r o d u c t i o no ft h es y n t h e t i cs t e r o i d a ls a p o n i n sh a se m p l o y e de x p e n s i v e r e a g e n t sa n dm u l t i p l e - s t e pp r o c e s s e s ，w h i c hi su n f a v o r a b l ei nt e r m so fg r e e ni n d u s t r i a l p r o d u c t i o n t h e r e f o r e ，e n z y m a t i cs y n t h e s i so fs t e r o i d a ls a p o n i n ss h o u l db eaw a yo u t t of a c et h el a go fa d e q u a t em s e a r c hi nt h i sa r e a , t h em a i nt a s ko ft h i st h e s i si st o e x p l o r et h es y n t h e s i so fs t e r o i d a ls a p o n i n si nt w os e c t i o n s ：1 ) c h e m i c a ls y n t h e s i so f s t e r o i d a ls a p o g e n i n s ；2 ) e x p l o r a t i o no f e t m y n l a ：t i cs y n t h e s i so fs t e r o i d a ls a p o g e n i n s 1 c h e m i c a ls y n t h e s i so fs t e r o i d a ls a p o g e r i u s ： s i xc o m m o ng l y c o s y ld o n o r sa n dt h r e ea g l y c o n er e c e p t o r sh a v eb e e nc h o s e n , a n da s e r i e so fm o n o s a c c h a r i d e ss t e r o i d a l s a p o g e n i n sh a v eb e e ns y n t h e s i z e db a s e do n c l a s s i c a lk o e n i g s k n o r rg l y c o s y l a t i o n a lm e t h o d s a l ls y n t h e s i z e ds t e r o i d a ls a p o n i n s h a v eb e e nc h a r a c t e a f z e d ，i n c l u d i n gt k r e ec o m p o u n d sn o t 印p e a r a di nt h ep r e v i o u s l i t e r a t u r e 2 e x p l o r a t i o no f e n z y m a t i cs y n t h e s i so f s t e r o i d a ls a p o g e n i n s ： i nt h i sp a p e r ，o u rm a i nc o n c e mi st oe x p l o r er h a t r m o s i d a s ei nt h es y n t h e s i so f s t e r o i d a ls a p o n i n s ，a f t e rm e t i c u l o u se x p e r i m e n te x p l o r a t i o n , w ef o u n dr h a n m o s y lc a n n o tb et r a n s f e r r e dt ot r i l l i nb yr h a n m o s i d a s et h a tf r o mp l a n t so rm i c r o o r g a n i s m s i n e n z y m a t i cs y n t h e s i sp r o c e s s ，w eq u a n t i t a t i v ec h a r a c t e r i z et h ea c t i v i t yo ft h ep l a n t r h a n m o s i d a s eu n d e rt h eo r g a n i cs o l v e n tc o n d i t i o n sf o rt h ef i r s tt i m e ，m e a n w h i l e ，w e a l s oc o n f i r m e db ye x p e r i m e n t st h ep l a n tr h a n m o s i d a s ec a nn o tt r a n s f e rg l y c o s y lt o m a c r o m o l e c u l e ss u c ht h i l l i n , b u tc a ns h i f tt os m a l lm o l e c u l ea l c o h o l ，a n di n d i r e c t l y c o n f i r m e dt h es p e c i f i co ft h ep l a n tr h a m n o s i d a s e o fc o u r s e , o u rw o r ka b o u tt h e e n z y m a t i cs y n t h e s i so fs t e r o i d a ls a p o n i n si sp r e l i m i n a r y ；t h u st h er e s e a r c hi nt h i sa r e a r e q u i r e sf u r t h e rb ee x p l o m t e d w eh o p et h a tt h ec o m p l e t e dr e s e a r c hc a ne n f i g h t e n o t h e rm e m b e r si nt h i sg r o u p k e y w o r d s ：s t e r o i d a lg l y c o s i d e ，g l y c o s y l a t i o n , a g l y c o n e ，r h a m n o s i d a s e ，e n z y m a t i c s y n t h e s i s v n a e a c 2 0 a r a p a m f b n b z c o s y d c m d m f d m s o d m t s t e d 5 0 e s i g a l g l c i c s 0 m p n i s m a n n m r p h p y r h a t b s t e s t s 0 h t 最o x v l 部分缩略语注释 a c e t y l乙酰基 a c e t i ca n h y d r i d e 乙酸酐 a r a b i n o p y r a n o s y l 阿拉伯吡喃糖基 a r a b i n of u r a n o s y l阿拉伯呋喃糖基 b c n z y l苄基 b e n z o y l苯甲酰基 c o r r e l a t e ds p e c t r o s c o p y 相关谱 d i c h l o r o m e t h a n e二氯甲烷 d i m e t h y lf o r m a m i d e n ，n - 二甲基甲酰胺 d i m e t h y ls u l f o x i d e二甲亚砜 d i m e t h y l ( m e t h y l t h i o ) s u l f o n i u mt r i f l a t e 二甲基甲硫基三氟磺酸盐 5 0 m e d i a ne f f e c t i v ed o s e 半数有效剂量 e l e c t r o ns p r a yi o n i z a t i o n g a l a c t o s y l g l u c o s y l 5 0 i n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o n m e l t i n gp o i n t n i o d o s u c c i n i m i d e m a n n o s y l n u c l e a rm a g n e t i cs p e c t r o s c o p y p h e n y l p y r i d i n e r h a m n o s y l t - b u t y l d i m e t h y l s i l y l t r i e t h y l s i l y l p t o l u e n e s u l f o n y l a e i d t r i f l i ea n h y d r i d e ，x y l o s y l v 电喷雾电离 半乳糖基 葡萄糖基 半抑制浓度 熔点 n 一碘代丁二酰亚胺 甘露糖基 核共振谱 苯基 吡啶 鼠李糖基 叔丁基二甲基硅基 三乙基硅基 对甲苯磺酸 三氟醋酸酐 木糖基 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果据我 所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成 果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意 作者签名：陋日期：口7 。 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的 电子版和纸质版有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数 据库进行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学 位论文在解密后适用本规定 f ； - i ，、 学位论文作者签名：j 烈恺 导师签名： 日期：9 ! ! 女五 日期： l l i 张剜? 良 如7 一，6 1 前言 1 1 简介 皂甙( s a p o n i n s ) 又称皂素，是一类复杂的糖苷( g l y c o s i d e ) 化合物。它们在自 然界分布很广，主要集中在单子叶植物的百合科( l i l i a c e a e ) 、薯蓣科 ( d i o s c o r e a c e ) 和龙舌兰科( a g a v a e e a e ) 等植物中；在双子叶植物的豆科 ( f a b a c e a e ) 、玄参科( s c r o p h u l a r i a c e a e ) 和茄科( s o l a n c e a e ) 等少数属种中也有分 布，而且在植物中的各个部位都有分布，但含量有很大的不同，并随植物的生 长季节和地域而变化1 。 皂甙由亲水性的糖链和疏水性的甙元组成，是典型的两亲分子。因而，具 有一些共同的物化性质：它们通常难以结晶，呈白色粉末，易吸水，易溶于水 和甲醇。大多数皂甙能形成泡洙和胶束，是很强的表面活性剂，它能增加水不 溶物在水中的溶解性，能与胆固酵形成复合物，能在细胞膜上打洞和引起溶 血。这些性质决定了它们一些广泛的用途，如它们长期被用于洗涤，食品和化 妆品的乳化，杀鱼，杀虫，杀软体动物等：。 从分子结构上看，皂甙是由糖链与三萜、甾体或甾体生物碱通过碳氧共价 键相连而成的。皂甙中的糖链一般较短，含2 5 个糖基，而且其糖基组成比较 简单，主要包含的糖基有d g l c ，d g a l ，d x y l ，d f u c ，l r h a ，l a r a ，d g l c a 及d g a l a 等，但其结构变化非常多，同时皂甙糖链上的自由羟基经常有修饰基，因 此皂甙中糖链结构的多样性给皂甙分子的研究带来了许多困难。近二十年来， 随着分离和结构研究方法的飞速发展，人们从天然植物中分离得到了难以计数 的结构新颖的皂甙，并阐明了它们的化学结构和生物活性，许多研究结果显示 皂甙具有多种生理活性和良好的药理作用，如抗癌、调节免疫功能、防治心血 管疾病、降血压、抗菌、消炎、利尿、抗病毒、解热镇痛、抗过敏、护肝、抗 疲劳和强壮筋骨等3 ，它们是很多传统药用植物特别是中草药的活性成分，以 甾体皂甙为主要活性成分的传统中药有：重楼、麦冬、黄精、玉竹、山药、穿山 龙、土获荃、积雪草等6 - 7 长期以来，皂甙一直是天然有机化学和药物化学的重要研究对象，但科学 前言 家们对皂甙的研究主要集中在皂甙的非糖部分，即甙元( a g l y c o n e s ) 上面。人们 对甙元部分持续上百年的深入研究，积累了有关甾体、生物碱和萜类化合物的 丰富知识，这已成为经典有机化学的重要组成部分。随着对皂甙研究的深入， 特别是伴随着糖生物学( g l y c o b i o l o g y ) 和糖化学( g l y c o c h e l l l i s 姆) 在近几十年来 的迅猛发展，人们对皂甙中糖链部分发生了越来越浓厚的兴趣，不禁要问“皂 甙既然由甙元和糖链两个部分组成，糖链和甙元在其生物活性方面各自起着什 么样的作用? ”。由于作为皂甙的另一组成部分一糖链的结构变化非常复杂，加 之以前缺少研究糖链的有效手段和技术，导致长期以来人们对糖链结构与皂甙 的生物活性之间关系研究甚少，基本上忽略了糖链的作用。但是，许多事实证 明糖链在皂甙的生物活性方面也起着重要作用，科学家们发现全部去掉糖链， 皂甙的生物活性显著减弱甚至丧失贻尽，而具有细胞识别能力的糖链变化又可 以调控皂甙的生物活性大小8 。因此，皂甙研究正日益引起国内外学者的极大兴 趣和广泛注意。虽然皂甙研究目前仍处于新结构皂甙的发现和数据积累阶段， 但是有关皂甙的不同生物作用方式和机理已经开始在分子生物学水平上逐渐被 阐明。所以，皂甙必将成为一个令人鼓舞的化学与生物学交叉的研究领域，其 中糖链作用的阐释和包括糖链合成在内的皂甙合成将越来越受到更大的注意9 。 皂甙的结构复杂多样，但非常有特点，按皂甙元结构的不同，皂甙通常被 分为三萜皂甙( t r i t e r p e n o i ds a p o n i n ) 、甾体皂甙( s t e r o i d a ls a p o n i n ) 和甾体生物碱皂 甙( s t e r o i d a la l k a l o i ds a p o n i n ) ( f i g u r e1 ) 。而甾体皂甙又可分为胆甾烷型皂甙 ( c h o l e s t a n o ls a p o n i n ) 、螺甾烷型甾体皂甙( s p i r o s t a n o ls a p o n i n ) 和呋喃甾烷型皂甙 ( f u r o s t a n o ls a p o n i n ) ( f i g u r e2 ) 1 。本论文工作所研究的对象主要是甾体皂甙中 的胆甾烷型皂甙和螺甾烷型皂甙。 2 甾体生 皂甙 ( s a p o n i n ) 胆甾烷型 ( c h o l e s t a n o ls a p o n i n ) 皂甙 皂甙 f i g u r e1 c a t e g o r i e st y p e so f s a p o n i n 胆甾烷 螺甾烷 呋喃甾烷 f i g u r e2 s k e l e t a lt y p e so fs t e r o i d a ls a p o g e n i m 1 2 甾体皂甙的研究进展 1 2 1 甾体皂甙的生物学意义 h 尽管科学家们对植物中天然甾体皂甙进行了广泛的研究，并以此为基础建 立了庞大的甾体工业，但对于甾体皂甙，尤其对甾体皂甙中糖链的研究则要滞 后得多。随着科学家们对糖化学及糖生物学的不断深入研究，糖的生物功能不 断的被揭示和认识。科学家们发现，糖不仅仅是作为能量物质和结构物质存 在，它还参与了众多的生理、药理和病理过程1 0 。那么，作为甾体皂甙有机整 体部分的糖链对其活性到底有何作用呢? 甾体皂甙的结构功能关系到底如何? 也许我们通过一些实例就能够窥其一斑。 1 2 1 1 甾体皂甙的细胞毒性和抗肿瘤活性： 目前，有很多科学家从植物中提取出天然甾体皂甙，并对其生理活性进行 了研究。1 9 9 6 年，日本科学家n a l ( 锄啪“测试了一系列来源于茄科植物薯蓣皂 甙、螺旋甾碱型皂甙( f i g u r e3 ) 对不同细胞株：p c 6 ( 肺癌) 、m c f 7 ( 乳腺 癌) 、s w 6 2 0 ( 肠癌) 、n u g c 3 ( 胃癌) $ g p 3 8 8 ( 老鼠白血病) 的细胞毒 性，其结果如t a b l e1 所示： f i g u r e3 s t r u c t u r eo fs t e r o i d a ls a p o n i n s 4 t a b l e1 c y t o s t a t i ca c t i v i t i e so f s a p o n i nl a - l da n d2 a - 2 d ( i c s 0 , p g m 1 ) 前言 从表1 的数据可以看出，甾体皂甙中糖链结构对细胞毒性有很大的影响：三 糖皂甙l a 和2 a 的活性好于相应的单糖皂甙和二糖皂甙；而甾体皂甙葡萄糖基2 位 带有鼠李糖的二糖皂甙l b 和2 b 的细胞毒性也明显高于相应的4 位带有鼠李糖的二 糖皂试l c 和2 c 。这表明甾体皂甙的活性不仅仅取决于甙元，糖链的大小、连接 位置和连接方式等对甾体皂甙的活性也起着关键的作用。从表1 数据我们还可以 看出甾体皂甙糖键部分的鼠李糖基对甾体皂甙的活性有重要影响。 2 0 0 1 年，m i m a k i l 2 等研究了百合科植物中的甾体皂甙的结构与细胞毒性的 关系。其试验结果如( t a b l e2 ) 所示： o t a b l e2 c y t o s t a t i ca c t i v i t i e so f s a p o n i n sl a - 1 j0 1 1h l - 6 0 t r i l l i n ( 1 d ) 对于h l 6 0 并没有表现出细胞毒性，然而在葡萄糖基的2 位羟基 上连接c 一l - r h a 基团后，二糖甾体皂甙1 b 显示了相当的活性( i c s o1 8 i _ t e , m a ) ，进 一步在葡萄糖上的c 3 或c _ 4 上连接d d g l e ，a l r h a , 0 c l 加a 糖基，三糖甾体皂 甙l a ，l e 1 h 的活性并没有明显的改变：然而当在c 3 位上接上尽d g a l 糖基后，三 糖皂甙1 i 的活性明显降低，这也说明了糖基的连接位置对甾体皂甙活性的重要 影响。在二糖皂甙1 b ，1 i 和l c 中，只有l b 具有明显的细胞毒性，分子力学计算 ( m m ) 和分子动力学计算( m d ) 研究表明，活性较高的皂甙l b 的构象为糖基 与薯预甙元所处平面垂直，而皂甙1 j 和l c 的糖链则与甙元在同一个平面上，表现 出较低的活性。 当然，以上主要说明的是甾体皂甙糖链对甾体皂甙的影响，事实上，甾体 皂甙糖环羟基上的取代基对甾体皂甙的活性也具有重要的作用。1 9 9 2 年，日本 科学家s a s h i d a l 3 从南非百合科植物( o r n i t h o g a l u ms a u n d e r s i a e ) 分离得到o s w - i ( 3 a ) 是迄今发现的最强的肿瘤活性甾体皂甙。2 0 0 2 年他们又报道了从 ( o r n i t h o g a l u mt h y r s o i d e ) 中分离得到的一系列o s w 1 类似物以及它们对h l 一6 0 癌 细胞株的毒活性( t a b l e3 ) 1 4 6 r 1 0 m 酵呦以 m e o 咖昭m e o 之减 t a b l e3 c y t o s t a t i ca c t i v i t i e so fs a p o n i n3 a - 3 eo ni l l - 6 0 从表3 我们可以看出，甾体皂甙3 b ，3 d 和3 e 都具有很好的抗癌活性，与3 a 和3 e 比较，抗癌活性有明显的提高。尤其我们可以从3 b 。3 d 以及3 e 看出，糖环上羟基 接取代基比不接取代基的活性要高出两个数量级。由此，不仅仅只有甙元的结 构对于活性是必需的，糖链也十分重要，甚至糖上的取代基对化合物的活性也 有很大的影响。 1 2 1 2 甾体皂甙作为胆固醇吸收的抑制剂1 5 ： 7 t a b l e4 t h ea b i l i t i e so fs a p o n i n4t oi n h i b i tt h ei n t e s t i n a la b s o r p t i o no f 3 h i c h o l e s t e r o li nc h o l e s t e r 0 1 f e dh a m s t e r s 高胆固醇血症的治疗是近几年研究的一个热门领域。如表4 所示，化合物 4 a ( t i q u e s s i d e ) 在进行i i 期临床试验时，尽管显示了一定的效果，但其药效并不高 ( 为了将低密度脂蛋白胆固醇降低2 0 以上，每天需要4 9 的t i q u e s i d e ) 。于是 d e n i n n o 对其进行了改造，将甙元换为核柯甙元，即皂甙4 b 时，其e d s o 值降低了 3 0 倍；在对4 b 的糖链进行修饰的过程中，d e n i n n o 还发现若将4 ”，6 ”的羟基同时用 氨基甲酸酯取代得皂甙4 9 ，其活性大大提高，e d 5 0 由2 o m g 瓜g 降低到 0 0 2 5 m g k g , 在单取代的皂甙4 c ，4 d ，4 e 中，取代在6 位的皂甙4 e 的活性降低了3 5 倍，而取代在4 ”和6 ”位的皂甙4 d 和4 e 的活性分别提高了2 0 倍和l o 倍；比较二取 代皂甙4 e4 9 和三取代皂甙4 h 的活性与皂甙4 9 的活性，均说明取代基的位置和数 量对活性有直接的影响。 1 2 1 3 甾体皂甙结构与溶血活性和抗真菌活性之间的关系1 6 ： h 8 t a b l e5 h e m o l y t i ca n da n t i f u n g a la c t i v i t i e so f t i g o g e n i na n dt i g o g e n y l g l y c o s i d e4 a 4 i - 4 v t a k e e h i l 司时测试- j t i g o g e n i n 的单糖皂甙4 i - 4 q ，二糖皂甙4 a ，4 r - 4 u 以及三糖 皂甙4 v 的溶血活性( 以i - i d s 0 表示) 和抗真菌活性( 以a t d 5 0 表示) ，结果如表5 所示： 对于溶血活性来说，单糖皂甙好于甙元本身，而比二糖和三糖皂甙差得多；比 较二糖皂甙4 s ，4 r - 4 u 和三糖皂甙4 v 可发现，它们的溶血活性儿乎相同。 对于抗真菌活性，皂甙4 i 和锄的活性比其他的单糖皂甙要高很多，说明单糖 的类型对皂甙的抗真菌活性影响很大；比较皂甙4 i 。4 q 和4 v 的活性数据，可发现 在4 - o h 上连接一个或两个a 构型的d o l c ，对于抗真菌活性并没有多大的贡献； 单糖皂甙4 i 的抗真菌活性要比4 q 高出许多，这说明轴向4 - o h 比平伏的4 - o h 要 有效得多；皂甙4 r 和4 a 的抗真菌活性差别说明末端a 构型葡萄糖基比b 构型更有 效；糖苷键的连接位点对活性的影响，可从皂甙4 a 和4 v 的数据中得到说明，前 9 者为l ，4 连接，而后者为1 ，6 连接。与皂甙t i g o g e n i n 类似，t a k e c h i 在比较了 d i o s g e n i l l ，h e c o g e n i n 皂甙的溶血活性和抗真菌活性后，指出甾体皂甙的结构与溶 血活性和抗真菌活性的变化规律是一致的1 7 。 1 2 1 4 甾体皂甙的抑制酵母菌活性： s u g a r o t a b l e 6 a n t i y e a s ta c t i v i t i e so fs a p o n i n 5 a s l 3 1 36 2 53 1 3 3 1 31 2 5 5 b s 2 1 2 51 2 53 1 33 1 3 1 0 0 1 0 0 5 c s 3 1 2 51 2 56 1 3 3 1 3 1 0 0 1 0 0 a n o m a l ah u t7 0 8 3 d l , i c l f i an a i ( a g a w a oh u t1 6 8 8 r r d o e c h e r a a pi c u l a t ai f o1 5 4 f d e b a r y o m y c e sh a n s e n i ii f 0 1 8 日常生活中，我们常见到一些食物的腐化及这一过程中所产生的恶臭，而 造成这种现象的罪魁祸首这一就是一类使食物恶化的酵母菌，因此，人们对酵 母菌的研究也越来越深入，如t a b l e6 所示，5 a - 5 c 是m i y a k o s h i 等1 8 从植物y u c c a s c h i d i g e r a 分离出的一系列甾体皂甙，并对这些甾体皂甙进行了抑制酵母活性的 测试。试验结果( t a b l e6 ) 表明，甾体皂甙5 a - 5 c 具有明显抑制酵母活性。从表中 1 0 我们可以看出，皂甙5 a 与5 b 的结构仅仅是4 - o h 从平伏键变成了直立键，而5 b 比 5 a 低，甚至对有的酵母没有抑制活性：若将3 位的木糖用葡萄糖取代，即皂甙5 c 的活性与5 b 的活性相当，比5 a 降低2 - 4 倍，对有的酵母也没有抑制活性。这表明 4 - o h 和3 位的木糖对皂甙的活性的影响相当。这些数据足以说明甾体皂甙的活 性是由糖链和甙元共同决定的，糖链的大小、糖苷键的立体构型、位置以及羟 基的异构化、取代等都对皂甙的活性有重要影响。 除上述活性外，甾体皂甙还具有抗h i v l 9 、抗细菌2 0 、止血2 1 、抑制c 触旧磷 酸二酯酶2 2 以及杀虫2 3 等活性。 1 2 2 甾体皂甙合成进展 1 2 2 1 甾体皂甙的化学合成进展 尽管天然甾体皂甙很早就被人们所熟知，但由于甾体皂甙中糖链的多样 性、复杂性，因此甾体皂甙的合成只是近些年才得到了较快的发展。事实上甾 体皂甙的合成包括甙元和糖链的合成以及如何将二者高效的结合在一起三方面 的问题，由于甾体甙元可以由商品方便地得到或从工业原料进行半合成而获 得，因此皂甙合成最为关键的问题是糖链的高效合成和糖基与甙元的相互连 接。而糖链的形成是通过糖苷化反应来实现的，其本质就是在一个糖基的异头 位( 糖基给体) 与受体之间进行缩水反应，因此如何巧妙的脱除一分子的h 2 0 就 变成了糖苷化反应的焦点。在生物体内，糖苷化反应是通过异头位磷酸酯在糖 基转移酶的作用下来实现的2 4 ；对于化学合成来说，则是通过糖基给体与受体 在促进剂的存在下进行糖苷化反应而达到合成糖苷键的目的。 1 9 4 1 年，溴代糖苷( 溴苷) 就被用于糖苷化反应，现在被称为k o e n i g s k n o r r 方法( s c h e m e1 ) 2 5 。该方法通常是用重金属盐，例如：a 9 2 c 0 3 ，h g ( c n ) 2 ， h g a r 2 ，a g o t f 等作为促进剂。孔繁祚小组利用a g o t f f 乍为反应的促进剂，将溴 苷与糖基受体偶联得到糖一糖原酸酯，接着用1 m s o t f 催化重排生成糖苷化产 物，该反应具有良好的立体选择性和区域选择性，采用此方法合成了一系列寡 糖片断”。近年来，糖化学取得了长足的发展。不断有人合成高效糖基给体， 发现高选择性、催化量、温和的活化条件以及高立体选择性糖苷化策略的发展 使复杂的合成成为可能，其中最主要的当推s c h m i d t 的三氯亚胺酯给体和硫苷给 体”。 阻0 。h 掣嗡高r o h 汹0 肿。r s c h e m e1 p r e p a r a t i o no f b r o m o - g l y e o s i d ea n di t sg i y c o s y l a t i o nr e a c t i o n 基于s i n a y 的工作2 8 ，s c h i n i c i t 于1 9 8 0 年报道了三氯亚胺酯在糖化学中的应用 ( s c h e m e2 ) 2 9 。在碱的作用下，半缩醛与c 1 3 c c n 反应而制得三氯亚胺酯给体， 由于反应的可逆性，选用不同的碱可以得到不同构型的产物，弱碱k 2 c 0 3 通常 得到p 一构型为主的异构体；而强碱d b u 和n a h 等给出热力学稳定的单一a 一构型 的产物3 0 。 二0 柚o h s c h e m e2 p r e p a r a t i o no f t r i c h o l o a c e t i r n i d a t ea n di t sg l y c o s y l a t i o nr e a c t i o n 在路易斯酸的条件下，如t m s o t f , b f 3 e t 2 0 ，a g o t f 等，三氯亚胺酯可在温 和的条件下与糖基受体高效的进行糖苷化反应。低温、弱酸性的促进剂，如 b f 3 e t 2 0 有利于反应通过s n 2 途径进行；高温、强的路易斯酸促进剂得到热力学 稳定的糖苷化产物。溶剂对糖苷化的产物的构型也有重要的影响，c h 3 c n 有利 于生成动力学的糖苷化产物；e t 2 0 有利于生成热力学的糖苷化产物；当糖环2 位 存在邻基参与功能的保护基时，如酯基，有利于形成1 ，2 - 反式的糖苷键3 1 。 另一种糖苷化反应的给体是硫苷( s c h e m e3 ) ，硫苷在糖化学中的广泛使用 得益于高效、专一的促进剂，女t l n i s a g o t f , n i s t f o h ，d i c p ，d m t s t 。p h s o t f , b s p 等，目前文献中用硫苷作为给体进行糖苷化反应都是在上述促进剂基础上 发展起来的3 2 ，耶3 4 。硫苷通常由全乙酰化的糖在b f 3 e t 2 0 催化下与硫醇反应而制 备。硫苷独特的化学性质在于它一方面可以作为异头位的保护基，对搪环进行 1 2 忱黑 睃 詈 保护基的操作，另一方面它又可以作为糖基给体或转化为其他的给体而参与糖 苷化反应；硫苷的活性可由糖环上羟基的保护基，尤其2 位的保护基进行调控， 2 位醚基保护的硫苷的活性大于酯基取代的硫苷，同时硫原子上的取代基以及反 应所用的溶剂也可调节硫苷的活性”。c h w o n g 、组3 6 于1 9 9 9 报道了大约5 0 个 硫苷的相对活性，这为“一锅法”合成寡糖片断奠定了基础。北大医学部叶新 山小组在w o n g 的基础上用“一锅法”合成了活性多糖缀合物中间体三糖”。 试o a c po 骂m o m r 冬一精rp 丛r o m o t 汛o r - 。r s c h e m e3 p r e p a r a t i o no f t h i o g l y c o s i d ea n di t sg l y c o s y l a f i o nr e a c t i o n 根据糖基与甙元之间糖菅键和糖基之间糖甙键形成的先后顺序，皂甙的合 成可采用两种策略进行：i ) 砌块合成的策略，即先合成保护的寡糖链糖基给 体，然后在进行糖链和甙元的连接；i i ) 线性逐步合成的策略，即先将一个单糖 连接在甙元上形成单糖皂甙，然后以此为基础进行糖链的延伸( s c h e m e4 ) 2 。 s c h e m e4 g e n e r a ls t r a t e g i e so f s t e r o i d a lg l y c o s i d e s 第一条策略显然比较简单，由于减少了甙元在反应中的出现次数，因此对 于一些珍贵的或含有敏感基团的甙元该策略具有应用价值，但由于糖基给体， 特别对于还原端糖基2 位分支的寡糖链，与甙元之间的糖苷化反应缺乏预见性， 丽寡糖给体的再变动与操作又比相应的单糖给体的变动和操作困难得多，因此 使用第一条策略完成皂甙的合成有一定的冒险性，因为最后一步糖苷化反应成 败将决定整个合成的成败。而使用第二条策略易于实现糖与甾体连接这一关键 反应的高产率和大剂量进行，该策略也可以很好地解决糖基和甙元之间糖苷键 的立体化学问题，适于合成具有不同糖链、相同甙元的皂甙，但随后的保护基 操作却变得困难，另外，由于在该策略中甙元需要经受多次糖苷化反应，因此 对于不易得到或含有敏感基团的甙元很不利。当然，这两种策略各有优缺点， 具体反应具体应用，它们在甾体皂甙的合成中都得到了广泛的应用。 中科院上海有机化学研究所的邓绍江博士和刘美正博士，利用砌块合成的 策略分别合成了具有强抗癌活性的二糖皂甙o s w - ks c h e m e5 ) 3 8 和具有较强抗炎 免疫活性的三糖麦冬皂甙( s c h e m e6 ) 卵；李川硕士利用线性逐步合成的策略完成 了地奥心血康活性成分中五个单糖链缁体皂甙的合成4 0 ，张剑波博士利用线性 逐步合成的策略完成了地奥心血康活性成分中三个双糖链甾体皂甙的合成4 1 。 杜宇国等也利用该策略完成了两个天然甾体皂甙的合成( s c h e m e 刀4 2 。 s c h e m e5 s y n t h e s i so f o s w - i 1 4 o s w 1 前言 o p h i o p o g o n i nc s c h e m e6 s y n t h e s i so f o p h i o p o g o n i nc h d 氧。蚺o h o hh 蝉。号r h o i 测 h o s c h e m e7 s y n t h e s i so f d i o s g e n y lg l y c o s i d e 1 2 2 2 甾体皂甙的酶促合成进展 酶促合成是现代有机合成中不可缺少的生物催化方法，酶催化的反应可对 不加保护的高官能团底物进行温和，环境友好的转化，得到具有高度的区域选 择性和立体选择性产物。其优点是：简化合成路线，反应体系不复杂，易于分 离、纯化；可避免使用有机溶剂，能源消耗低4 3 。 近几十年来，对甾体和寡糖或多糖的化学合成研究都f , j t t 深入，在合成过 漤 糯 程中出现了令人振奋的新方法、新技术。但从立体选择性、产率等方面，目前 尚无一种具有广泛适用的方法，更谈不上像自动合成多肽、蛋白质、核酸那样 快速和方便。对于甾体皂甙来说，化学合成甾体皂甙，文献中已有较多的报 道，但化学合成甾体皂甙目前还达不到产业化生产；而甾体皂甙酶促合成工作 目前文献鲜有报道。因此，酶促合成和化学合成相结合的糖苷化方法可能是一 条出路“。 早在7 0 年代，e s d e r s 等在c a n d i d ab o g o r i e r 坫i s 中发现有u d p - 葡萄糖甾体糖 基转移酶的存在4 5 。在九十年代初，u l l m a n n 等深入的研究发现u d p 葡萄糖甾 体糖基转移酶可以将u d p 葡萄糖的糖基转到不同的甾醇上去，比如胆固醇、麦 角甾醇等4 6 。而w o j c i e c h o w s k i 等在生物合成甾体皂甙的3 一糖基转移酶做了大 量的工作，他们从茄子中提取纯化甾体皂甙的糖基转移酶并表征了它的特性， 表明部分纯化的糖基转移酶能把糖基转移给甾体皂甙元4 7 d a n i e l i 在2 0 0 1 年报 道了半乳糖转移酶选择性地把半乳糖转移到人参皂甙上( s c h e m e8 ) 4 8 。 s c h e m e8 e n z y m a t i cg a l a c t o s y l a t i o no f g i n s e n o s i d e s 在2 0 0 5 年，k o h a r a 等4 9 从土豆中得到三种糖基转移酶c d n a 编码，其中 有一种表现出u d p 糖基转移酶的活性，这也是第一次克隆的糖基转移酶进行甾 体皂甙的生物合成，并第一次证实了单一的酶可以对甾体皂甙元和生物碱进行 糖苷化。随后进行的研究表明克隆的甾体糖基转移酶有同样的糖基转移活性， 它们对底物专一性限制更小。对葡萄糖和半乳糖作为底物都可以进行糖苷化甾 体皂甙，但对葡萄糖作为底物时的选择性稍差些。 糖苷酶的发现是在8 0 年代初，在1 9 8 4 年，s a t o h 卯等描述了几类1 3 半乳糖苷 酶，这些糖苷酶相对于糖基转移酶来说更加稳定，即使在水和有机溶剂共存的 1 6 两相体系中也能稳定存在，并具有较高的转糖基活性。之后，s a t o h 等又把来自 a s p e r g i l l u so r y z a e ( 曲霉) 的p 一半乳糖苷酶用于催化合成各类化学不稳定的强 心甙，进一步的研究发现，这些酶能催化合成b 半乳糖苷和e 葡萄糖苷 ( s c h e m e9a n dt a b l e7 ) 。 s c h e m e9 e n z y m a t i cs y n t h e s i so f c a r d i a cg l y c o s i d e sb yp - g a l a c t o s i d a s e t a b l e7 e n z y m a t i cs y n t h e s i so f c a r d i a cg l y c o s i d e s 由t a b l e7 我们可以看出，b 半乳糖苷酶在用于合成强心甙时，表现出了较 强的转糖基活性，尤其当r 1 和r 3 基团为h ，r 2 基团为m e ，给体为葡萄糖苷时， 反应产率达到了7 4 ，说明在酶促反应中，糖苷酶对底物的结构还是有一定选 择性的，虽然一种糖苷酶能选择一类糖苷键进行反应，但是底物结构对酶促反 应的高效性还是有很大影响的。 由于糖甙酶水解活性通常情况下大于转糖基活性，因此，用糖苷酶催化合 成一些次生甾体皂甙的文