（微生物学专业论文）枯草芽孢杆菌产酱香及蛋白酶液体发酵优化研究.pdf

摘要 本文从枯草芽孢杆菌代谢产生的蛋白酶酶活，蛋白酶种类等角度研究了不同枯草芽孢杆菌发酵 产酱香差异的原因及相同枯草芽孢杆菌在不同条件下产酱香差异的原因。研究结果表明产酱香枯草 芽孢杆菌e 2 0 和b ，菌株具有较高的蛋白酶酶活，而不产酱香的枯草芽孢杆菌c k 没有蛋白酶活力。 利用三株产蛋白酶标准枯草芽孢杆菌发酵大豆，虽然不同菌株发酵的产物具有不同的颜色和气味， 但都能产生酱香气味。在大豆里面加入其它蛋白酶，也可产生酱香气味。这些都说明蛋白酶是产酱 香的必要条件。在大豆里面加入了一定种类和含量的氮基酸并加入了葡萄糖淀粉，蔗糖，为美 拉德反应提供前体物质，模拟枯草芽孢杆苗发酵产香条件结果表明不产酱香。 用分子筛层柝法测定了不同发酵条件下产生的蛋白酶类型研究结果表明在不同发酵条件下， 菌株e 2 0 和b 代谢产生的蛋白酶种类没有变化这说明不同条件下发酵产酱香差异并不是由蛋白 酶引起的。 研究了不同含水量和不同发酵温度下产酱香的差异，筛选出了产酱香的最佳温度和最佳含水 量：在6 0 含水量和最高温度达到5 0 时发酵产生浓郁的酱香味。 利用气谱和质谱联用技术分析了菌株e 2 0 和c k 在5 0 c 下发酵产生的风味物质的差别和不同发 酵条件下菌株e 2 0 产生的风味物质图谱。结果表明菌株e 2 0 发酵产生的风味物质种类多，含量高。c k 菌株发酵产生的风味物质种类少含量低。菌株e 2 0 在3 0 c 下发酵产生的风味物质种类少，含量低： 在4 0 c 下发酵产生的风味物质种类稍多。含量较高；在5 0 c 下发酵产生的风味物质种类最多，含量 最高。 菌株岛p 经3 0 c 、4 0 、5 0 c 簸序升温发酵产生的风味物质经蒸馏后用乙醚萃取，经气相色谱 和质谱联用仪检测，共检出6 3 种物质。通过h p m s d 化学工作站，结合n i s t 9 8 标准质谱图库 和w i l e y 质谱图库，进行物质鉴定，鉴定出2 8 种物质。包含呋哺、吡嗪、噻唑、高级烷烃等， 大部分为包含苯环的芳香物质或其衍生物。按峰面积归化法进行计算求得备化学成分在挥发油 中的相对含量。鉴定出的物质中含量最高的为苯乙醛、其次为4 甲基一2 ，6 - = 叔丁基- 苯酚。其中 一些物质如糠醛、2 ，3 。5 一三甲基毗嗪、苯甲醛、4 一乙烯基愈疮木酚( 4 - 乙基愈创木酚的前体) 是 酱番型白酒中的特征性香味成分这说明枯草芽孢杆菌在酱香风味形成中发挥着重要的作用。 研究了菌株b 液体发酵产蛋自酶的条件以葡萄糖( 3 ，4 ，5 ) 、大豆粉c 3 4 ，5 ) 、 n a c lc o 4 ，0 6 0 8 ) 作为三因素三水平正交实验优化其液体发酵条件。结果表明葡萄糖为3 、 大豆粉为4 、n a c l 为o 6 时为最优培养基组成。极差分析表明各因素对实验结果的影响的大小为： 大豆粉 葡萄糖 n a c l 。同时实验结果表明当韧始p h 为8 0 、发酵温度为4 0 c 、接种量为2 、 接种2 4 h 种龄的种子时蛋白酶的合成量最大。 关键词：枯草芽孢杆菌；酱香：蛋白酶：美拉德反应；层析：g c m s a b s t r a c t t h er e a s o no fs o y s a u c e - l i k ea r o m ap r o d u c e db yt h es t r a i n so fb a c i l l u s s u b t i l i si nt h es a n l ec o n d i f i o n sa n dt h es a n l es t r a i n si nt h e d i f f e r e n tc o n d i t i o n s w e r es t u d i e di nt h ep a p e r t h er e s u l t ss h o wt h a tt h es t r a i n sb l a n d e 2 0 w h i c hc a l lp r o d u c e ds o y s a u c e - l i k ea r o m ah a v eh j 。g hp r o t e a s ea c t i v i t y ，b u tt h e s t r a i nw h i c hc a nn o tp r o d u c e ds o y s a u c e l i k ea r o m ah a sl o wp r o t e a s ea c t i v i t y t h r e es t a n d a r ds t r a i no f b a c i 船s u b t i l i sw h i c hh a v eh i 曲p r o t e a s ea c t i v i t yw e r e u s e dt of e r m e n tb e a n a l t h o u g ht h e s ep r o d u c t i o nf e r m e n t e db yd i f f e r e n ts t r a i n s h a v ed i f f e r e n tf l a v o u r ，a l lo ft h e mh a v es o y s a u c e - l i k ea r o m a i ta l s oc a n p r o d u c es o y s a u c e l i k ea r o m aw h e n s o m ek i n d so f p r o t e a s ew e r ea d d e dt ob e a n a l lt h e s es h o wt h a tp r o t e a s ea r en e c e s s a r yt op r o d u c es o y s a u c e l i k ea r o m a s o m ea m i n oa c i da n ds u g a r sw e r ea d d e dt ob e a n si no r d e rt op r o v i d e d p r e c u r s o r t om a i l l a r dr e a c t i o na n ds i m u l a t i n gt h ec o n d i t i o no fm a i l l a r d r e a c t i o n ，t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e r ea r en os o y s a u c e - l i k ea r o m at op r o d u c e n ep r o t e a s ep r o d u c e db yt h es t r a i n sb l ( 9a n d e 2 0w e r ea l s os t u d i e d b ym e a n so fg e l a t i nc h r o m a t o g r a p h yt od e f n et h ec a t e g o r yo fp r o t e a s e t h e r e s u l t ss h o wt h a tt h e r ei sn oc h a n g eo fp r o t e a s ei nd i f f e r e n t f e r m e n t i n g c o n d i t i o n s i ti l l u s t r a t et h a tt h ed i f f e r e n c eo fs o y s a u c e - l i k ea r o m ap r o d u c e di n d i f f e r e n tc o n d i t i o n sa r en o tc a u s e db yp r o t e a s e t h ei n f l u e n c eo f m o i s t u r ec o n t e n ta n dt e m p e r a t u r et op r o d u c es o y s a u c e - l i k e a r o m aw e r es t u d i e d t h eb e s tm o i s t u r ec o n t e n ta n dt e m p e r a t u r eh a db e e n s e l e c t e d t h er e s u l t ss h o wi tc a l lp r o d u c e dt h er i c hs o y s a u c e l i k ea r o m aw h e n t h em o i s t u r ec o n t e n to f b e a n si s6 0 a n dt h et e m p e r a t u r er e a c h5 0 c 。 g c m st e c h n i q u e sw a sa p p l i e dt od e t e r m i n et h ef l a v o u rm a t t e rp r o d u c e d e d b yt h es t r a i nc k i n5 0 ca n dt h es t r a i ne 2 0i n3 0 ，4 0a n d5 0 t h er e s u l ts h o w t h a tt h ek i n d so ff l a v o u rp r o d u c e db yt h es t r a i n c ki n5 0 i sf e wa n dt h e q u a n t i t yi sl o w ，t h ek i n d so ff l a v o u rp r o d u c e db ye 2 0i n5 0 c i sm o r ea n dt h e q u a n t i t yi sh i g h e r 1 1 舱r e s u l ta l s os h o w t h a tt h ek i n d so ff l a v o u rm a t t e r p r o d u c e d b ye 2 0i n3 0 c i st h ef e w e s ta n dt h eq u a n t i t yi st h el o w e s t ，m o r ea n dh i g h e ri n 4 0 a n dt h em o s ta n dh i g h e s ti n5 0 2 t h ef l a v o u rm a t t e rp r o d u c e db yt h es t r a i ne 2 0w e r ed e t e c t e da n di d e n t i f i e d b ym e a r l so fg c m sw h i c hw e r ed i s t i l l e dw i t ha e t h e r t h er e s u l t ss h o wt h a t6 3 k i n d so f f l a v o u rm a t t e rw e r e d e t e c t e d t h r o u g hh p m s dc h e m i s t r y w o r k s t a t i o n ，l i n k i n gn i s t 9 8s t a n d a r dm a s ss p e c t r u mg a l l e r ya n dw i l e ym a s s s p e c t r u mg a l l e r y2 8k i n d so ff l a v o u rm a t t e rw e r ei d e n t i f i e di n c l u d i n gt h a n o l ， p y r a z i n e ，p h e n o l ，l t h i a z o l e ，d e c a n ea n ds oo na n dm o s to ft h e mw e r es a u c y f l a v o u ri n c l u d i n gp h e n y l t h eq u a n t i t yw e r ec a l c u l a t e db yt h ea r e ao fm a t t e r a p e x a m o n gt h e m ，s o m ea r et h ec h a r a c t e r i s t i cf l a v o u rm a t t e ro fm a o t a iw i n e ， f o re x a m p l e ，f u r a n m e t h a n o l ，t r i m e t h y l p y r a z i n e ，4 - v i n y l 一2 - m e t h o x y p h e n o l ， 2 - a c e t y l t h i a z o l e d e c a n ea n d s oo n t 1 1 i ss h o w st h a tb s u b t i l i s p l a ya i m p o r t a n tr o l ei np r o d u c i n gs o y s a u c e - l i k ea r o r n ai nq uo fm a o t a iw i n e t h ec o n d i t i o n sf o rp r o t e a s ep r o d u c t i o no fs w a i nb 1 ( 9w e r es t u d i e d w e f o u n dt h eb e s tc o n d i t i o n sf o rp r o t e a s ep r o d u c t i o no fs t r a i nb i i nl i q u i d f e r m e n t a t i o n ：c a r b o ns o u r c ei sg l u c o s eo f3 ，n i t r o g e ns o u r c ei sp o w d e ro f b e a n so f 4 ，n a c ii so 6 ，p hi s8 0 ，2 o f i n o c u l u mv o l u m eo f 2 4h t h e r e s u l ta l s os h o ww h e np hi s8 0 ，t e m p e r a t u r ei s4 0 c ，v o l u m eo fi n o c u l u mi s 2 ，t i m eo f i n o c u l u m o ni s2 4 h ，t h ea c t i v i t yo f p r o t e a s ei st h em o s th i g h k e yw o r d s ：b a c i l l u ss u b t i l i s ：s o y s a u c e l i k ea r o m a ；m a i l l a r dr e a c t i o n ；p r o t e a s e c h r o m a t o g r a p h y ；g c m s 月吾 餐香是我国的一种传统香型，其历史悠久，早在北魏贾思勰所著的齐民要术中 已有制酱的记载，到清代这种记载就更为详细了，不仅记载了酱的制作和应用，而且记 载了制酱的一些禁忌。现在酱香已被广泛的应用于食品、制酱、酿酒等方面，尤其在酿 酒上。酱香型白酒茅台酒就是以其酱香突出、幽雅细腻、醇厚丰满、回味悠长、空杯留 香等特点而驰名中外，被誉为中国的国酒。酱香味是一种复合香味，是由多种生香物质 ( 醇、醛、酸、酚、酯等羰基化合物和含氮化合物) f 1 4 1 复合生成的，这些生香物质的 生成机制十分复杂，现在一般认为是通过美拉德反应生成的，美拉德反应在酱香物质的 形成过程中发挥着重要的作用i 】。 1 1 美拉德反应研究历史及现状 美拉德反应是由m a i l l a r d 于1 9 1 2 年在一次不成功的化学合成中发现的，广泛存在 于食品加工和食品长期储存过程中，是食品香味的重要来源之一。研究表明，美拉德反 应机制是十分复杂的，1 9 5 3 年h o d g e 对美拉德反应机理作出了系统的解释3 2 1 ，其反应 分为三个阶段： ( 1 ) 起始阶段 还原糖的羰基与氨基之间进行加成，然后脱水而转化为希夫碱，经a m a d o r i 重排为 卜氨基一1 一脱氧- 2 一酮糖，称阿马多利化合物，它不产生食品香味，但是极其重要的、不 挥发性的香味前体物质。 ( 2 ) 中间阶段 还原酮路线：由阿马多利化合物在2 - 3 位下不可逆烯醇化，从c 1 消去胺基生成甲 基二羰基中间体，进一步生成5 一羟基麦芽酚或甲基醛类、酮醛类、二羰基化合物等裂解 产物。 o s u l o s e 路线：阿马多利化合物在1 - 2 位上烯醇化，消去c 3 上的羟基，水解成3 一脱 氧己酮糖，然后脱水生成糠醛类风味成分。 s t r e e k e r 路线：o r 氨基酸和a - - - 羰基化合物反应。失去一分子c 0 2 而降解成为少一 个碳原子的醛类及烯醇胺。烯醇胺进一步缩合、脱氢生成吡嗪衍生物。 ( 3 ) 最终阶段 此阶段的反应比较复杂至今还不清楚中间阶段产物与氨基化合物进行醛基一氨基 反应最终生成类黑精。类黑精是引起食品产生非酶褐变的主要物质，在产生类黑精的同 时还会产生一系列的美拉德反应中间体还原酮及杂环类香味物质。 美拉德反应的产物主要分为三类：( 1 ) 毗喃类衍生物与酮醛类衍生物( 2 ) 呋喃类 衍生物( 3 ) 醛及吡嚷衍生物，它们是食品中极为重要的风味成分。因此可以利用美拉 德反应所产生的风味物质1 w l 作为食品添加剂，改善食品的风昧和色泽，也可以作为烟 草增香剂f 8 1 ，增加烟草的香味。另外美拉德反应产物还具有抗氧化3 5 1 和抗突变 3 6 - 3 7 1 方面 的功能，这些方面是国外研究的热点。除此之外，从营养观点来看美拉德反应对食品工 业是不利的，因为在长期加热过程中氨基酸与糖的损失会使营养价值下降，另外美拉德 反应产生的色素对某些食品工业也是不利的，如制糖工业上美拉德反应产生的色素使糖 果看起来呈褐色，而不是雪白色，从而影响视觉。高温下发生的美拉德反应也会生成一 些对人体有害的物质的丙烯酰胺 3 8 - 3 9 l ，该物质具有诱发癌变的作用。 一般认为美拉德反应是一个非酶促的化学反应，受p h 、温度、水分活度【3 3 3 4 1 等影 响，在不同的条件下，其反应速度、反应路线、反应产物均有不同程度的差别。所以， 利用美拉德反应制取香味物质时必须控制好反应条件，如温度不超过1 8 0 c ，时间不超 过4 h 、p h 7 、含水量不超过2 5 、注意补充某些活性添加剂等。在温度较高的条件下 有利于一些分子量较低的杂环化合物的生成。吡喃环对热敏感，开环后使产物结合增加， 然后再环化形成新的碳环或杂环化合物，大多数是含有5 、6 、7 个碳原子的芳香族化合 物，如苯、吡喃、呋喃、噻唑、吡咯、毗啶、咪咯等。烯醇胺或。一氨基酸在高温下也 可缩合成吡嗪类化合物。当水分活度在0 3 0 7 之间时美拉德反应速度较快【9 】。此外， 氨基酸和糖的种类，它们之间的比率，反应时间对美拉德反应的速率以及最终产物也有 着很大的影响。 1 2 微生物在发酵产酱香中的作用 酱香型白酒为混合菌种发酵，在发酵过程中有众多的微生物参与，这些微生物生长 繁殖过程中，不断分泌各种酶类物质将原料中的蛋白质、糖、脂肪等大分子逐渐分解为 小分子，一方面供自身代谢利用，另一方面为香味物质的形成提供了前体物质。通过美 拉德反应，这些香味前体物质就转化生成了香味物质。另外，有些微生物在生长过程中 产生的一些物质本身就是呈香物质。 酱香型白酒的工艺特点为“四离一长”即：高温制曲，高温堆积，高温发酵，高 温蒸馏，长期贮存。在高温制曲的过程中，随着温度的升高，使酒曲微生物区系由常温 类群向嗜热类群转化，由类群复杂的微生物区系向单一的微生物区系转化，也就是说在 这一过程中不耐热的微生物如酵母菌和霉菌被淘汰了，只留下了兼性嗜热芽孢杆菌，有 利于特定香味物质的形成，使酱香型白酒有别于其它香型的白酒，同时这也说明了兼性 嗜热芽孢杆菌在酱香味物质的生成过程中起着主要的作用【4 5 “o 。5 l 。 1 3 酒类风味研究的历史和现状 溶于白酒中的醇、醛、酸、酯等种类众多的微量有机化合物( 占总量的1 2 ) 作为 白酒的呈香呈昧物质，决定着白潘的风格质量。酒类芳香成分的分析技术不断进步，研 究成果巨大，鉴定出的成分已达1 0 0 0 种以上，各种白酒中香味成分的种类和作用也各 不相同。白酒风味物质中，绝大部分是具有挥发性的有机化合物，并且都具有呈香呈味 的特定基团，这些风味物质是构成白酒典型特征的物质基础，它们以一定的比例共存于 酒体中，互相配合、补充、衬托和制约，发挥各自的特点，形成不同香型和不同风格的 白酒。 白酒中香味成分一部分来源于酿酒所采用的原料和辅料，另一部分则来自于微生物 的代谢产物，另外在长期的储存过程中通过一些缓慢的化学反应，也会生成一些香味物 质。白酒香味成分种类有：醇类、酯类、酸类、醛酮类化合物、缩醛类、芳香族化合物、 含氮化合物和呋哺化合物等”l 。 白酒中的香味物质通常用香味强度来表示其香味的强弱程度，有些香味成分在 白酒中含量虽然很低，但是如果其香味强度较大，其呈香作用仍然较大。白酒中呈香呈 味物质虽然含量只占白酒的1 一2 ，但是按含量仍可分为色谱骨架成分和微量成分【l 9 1 ， 色谱骨架成分在白酒中的含量大于lm g m l ，有己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙醣、丁酸 乙酯等约2 0 种物质。色谱骨架成分占白酒香味成分总质量的9 5 一9 9 以上，在常规色 谱分析谱图上属大峰物质。这些成分构成了白酒的骨架，是白酒的主干成分，决定白酒 香型。微量成分是指在白酒中含案小于1m g m l 的所有香味成分，占白酒香味成分总质 量的1 5 。微量成分含量虽低，但对于白酒的风格和风味质量起着重要的、有时甚至 是关键性的作用。白酒是很多种香味成分组成的集合体。其表现出来的不仅是单体香味， 更重要的是复合香味【2 0 】。两种以上香味物质相混合，不但改变了单体所特有的香味， 有时还呈现出相乘作用( 呈香单位大幅度增长) 或相杀作用( 呈香单位大幅度下降) 。作为 助香剂，白酒中有些物质，如多元醇类，在相乘相杀过程中起到香味间的缓冲调剂作用 2 h 。 清香型、浓香型和酱香型酒的主体香成份不同，现在清香型和浓香型的主体香成份 已经基本上确定。已经确认己酸乙酯为浓香型自酒的主体香味成分，乙酸乙酯为清香型 白酒的主体香味成分，酱香型白酒的香味成分比较复杂，尚未弄清其香味特征是由哪几 种成分组成。尽管主体香味成分的确定十分困难，科学研究工作者还是确定了与白酒风 格特征相关的特征性成分。见下表【“。 香型 特征性成分 酱香型： 糠醛、苯甲醛、4 一乙基愈创木酚、酪醇、四甲基毗嗪 米香型：乳酸乙酯、乙酸乙酯、伊苯乙醇 凤型： 己酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸羟胺、乙酸羟胺 豉香型： 胪苯乙醇、廿蒎烯、庚二酸二乙酯、王二酸二乙酯、辛二酸二乙酯 芝麻香型：3 - 甲硫基- 1 - 丙醇、丁二酸二乙酯、争苯乙醇、四甲基吡嗪 特型：正丙醇、含奇数碳脂肪酸乙酯、高级脂肪酸乙酯和高级脂肪酸 兼香型： 乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、正丙酵、乙缩醛 董型： 丁酸乙酯、正丙醇、仲丁醇、丁酸 气相色谱法的应用始于1 9 4 1 年。1 9 5 5 年第一台商品气相色谱仪问世。在以后十年 左右的时间内，很快建立了气相色谱( g c ) 与质谱( m s ) 的联用技术。气相色谱法是有力的 分离手段，但对于鉴定则有很大的局限性：质谱法是迄今为止上样置最少、信息量很大 的鉴定工具，但它要求纯样品。这二种技术的完美结合，既发挥了各自的优势又弥补了 各自的缺陷。所以，c - c m s 联用被当时一些化学家称之为划时代的分析技术。 风味成分分析一般是通过c - c m s 分析确定，通过气相色谱可以得到各种物质的色 谱图，然后通过质谱分析并与谱库相连检测每种物质的波峰，进而可以确定各种物质。 g c m s 在白酒香味成分剖析研究过程中，主要是应用于新发现组分的定性确认， 如白酒中的二元酸( 庚、辛、壬) 乙酯、含氮化合物，含硫化合物及多元醇等的检测【1 6 】。 在重视低度白酒理化、卫生指标的同时，为配合白酒标准的修订和完善工作，应用现代 分析仪器，特别是利用g c m s 技术分析低度白酒香气成分组成具有重要的指导作用。 1 4 枯草芽孢杆菌蛋白酶的主要用途 枯草芽孢杆菌是蛋白酶生产的主要菌种之一，其产生的蛋自酶具有广泛的应用前 景。从高温大曲中分离的兼性嗜热芽孢杆菌可以产生比较高活性的蛋白酶，初步研究证 明，这些酶对发酵产酱香有促进作用，所以可以利用其蛋白酶生产风味物质【2 2 1 ，另外这 些蛋白酶还具有较高的抗高温活性，可以利用该蛋白酶生产洗涤剂。有的枯草芽孢杆菌 可以用来生产优良的豆豉，该类菌株产生的蛋白酶一般具有溶栓的功能，作为药物具有 以下优点：( 1 ) 由食品纳豆中提取，安全性好；( 2 ) 易为人体吸收f 删：( 3 ) 可以由消化 道吸收，因此有望成为第一个口服性溶血栓药物【4 l 】；( 4 ) 直接作用于纤维蛋白，而不像 尿激酶等现有药物，是纤溶酶原的激活剂【4 舶，作用迅速：( 5 ) 可以利用细菌发酵生产， 成本低廉【2 3 】。 1 5 酶合成的调节和合成模式 酶的合成受到多种因素，如c 源、n 源、c n 比、温度、p h 值等的影响。某些物 质存在时能够诱导产酶，而某些物质过量存在时，则可能阻遏酶的产生。所以，在酶的 发酵生产过程中，要想提高酶产量必须采取切实有效的措施，如添加诱导物、控制阻遏 物、添加表面活性剂及产酶促进剂等。细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经 历调整期、生长期、平衡期和衰退期四个阶段。通过比较细胞生长与产酶的关系，可 以把酶生物合成的模式分为四种类型：同步合成型、延续合成型、中期合成型和滞后合 成型【2 4 】。 1 6 本论文的立题依据及意义 酱香是中国的一种传统香型，其应用非常广泛，诸如酿酒、制酱、生产酱油等，凿 香也是食品研究的一个热点，尤其在酱香型白酒中。在酱香型白酒茅台酒中产香细菌、 酱香物质构成，产香机理一直是研究的热点问题。2 0 0 4 年贵州茅台酒集团有限公司面向 社会首批出资1 0 0 0 万元设立了“国酒茅台自然科学研究基金”，以推动海内外学者揭开 国酒茅台的神秘面纱，其中“国酒茅台的物质构成特别是香气香味物质到底是什么? 茅 台酒厂的微生物群体对国酒茅台品质形成有什么关系? 国酒茅台里到底有多少种微量 成分? ”等问题就是该课题需要解决的的核心问题。对于产酱香微生物人们认为是高温 制曲中的芽孢杆菌发挥着决定性的作用，但是芽孢秆菌在高温下纯种发酵到底产生了多 少种香味物质，这些香味物质到底是什么，很少有人进行研究。对于产酱香的机理：一 般认为它通过美拉德反应产香，而美拉德反应是一个非酶促反应，需要一定的反应条件 才能进行。而高温制曲中的温度又不满足美拉德反应的条件，所以庄名扬认为高温制曲 中芽孢杆菌产生的一系列酶系起到了催化美拉德反应的作用，但是美拉德反应到底是否 需要酶系来催化以及到底是哪些酶系还有待进一步研究。不同来源的芽孢杆菌其产酱香 的能力是不一样的，即使从同一高温大曲中分离的芽孢杆菌其产酱香也有差异，有的产 酱香有的不产酱香，有的产酱香能力强，有的能力弱，其产酱香差异的原因是什么? 另 外芽孢杆菌产酱香还受到一些外界条件，如水分，温度等的影响，在不同的含水量，不 同的温度下产生不同的气味，产生这些差异的原因是什么? 在不同情况下其产生的香昧 物质有什么差别? 另外前人的研究认为芽孢杆菌是酱香曲中产香的主要微生物，但还没 有人从芽孢杆菌纯菌种发酵产生的风味物质方面来证明这个问题，芽孢杆菌是否能产生 酱香酒中的主要香味物质? 这些都是需要研究的问题。研究这些问题有助于阐明产酱香 机理以及为酱香型白酒的生产提供一定的借鉴。另外，从高温大曲中分离的兼性嗜热芽 孢杆菌可以产生高活性的蛋白酶，初步研究证明，这些酶对发酵产酱香有促进作用，所 以可以利用蛋白酶生产酱制品。对产酱香枯草芽孢杆菌蛋白酶的液体发酵优化进行研 究，对蛋白酶的合成机制、工业化生产及产酱香机理的阐明都有一定的意义。 9 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 供试菌株 1 1 1 1 产酱香枯草芽孢杆菌菌株：e 2 0 分离自贵州茅台酒高温大曲：b l 分离自贵州珍 酒高温大曲，两者均产酱香味。 1 1 1 2 不产酱香菌株：对照枯草芽孢杆菌( c k ) ，贵州大学微生物教研室分离保藏，不 产酱香。 1 1 1 3 产蛋白酶枯草芽孢杆菌标准菌株：1 0 0 8 1 产中性蛋白酶；1 0 0 7 5 产蛋白酶：1 0 1 6 3 产中性蛋白酶，三者均为中国工业微生物菌种保藏中心( c i c c ) 保藏菌株。 1 1 2 实验用培养基 l 。1 2 i 斜面培养基 牛肉膏0 4 9 ，蛋白胨1 o g ，n a c l0 4 9 ，p h 7 0 - 7 2 ，1 2 1 ，0 1 m p a 灭菌3 0 分 钟。 1 1 2 2 种子培养基 2 5 j l b ( l u f i a b e r t a n i ) 液体培养基：蛋白胨l o o g 、酵母膏5 0g 、n a c l1 0 0g 、蒸 馏水1 0 0 0 m l 、p h 7 o _ 7 2 、1 2 1 、o 1 m p a 灭菌3 0 m i n 。 牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏5 0g 、蛋白胨1 0 0g 、n a c i5 0g 、琼脂 1 5 2 0 9 、水1 0 0 0 m l 、p h 7 o - 7 2 、1 2 1 、0 1 m p a 灭菌3 0 r a i n 。 葡萄糖1 0 o g 、蛋白胨5 0 9 、酵母膏5 , 0 9 、n a 2 i - i p 0 40 4 9 、k h 2 i - i p 0 40 0 3 9 、c a c l 2 0 0 2 9 、m g s 0 4 。7 8 2 0 0 0 2 9 、蒸馏水1 0 0 0 m 、p h 7 o _ 7 2 、1 2 1 1 2 、0 1 m p a 灭菌3 0 分 钟。 1 1 2 3 发酵培养基：葡萄糖3 o g 、大豆粉4o g 、n a c l 0 6g 、k h 2 h p o 。0 0 3 9 、c a c h o 0 2 9 、m g s 0 4 7 8 2 0o 0 2 9 、水l o o m l 、p h7 0 - 7 2 、1 2 1 、0 1 m p a 灭菌3 0 分钟。 1 1 3 药品 铝酸钠 酒石酸钾钠 三氯乙酸 硫酸铵 金堆城铝业公司钼化学事业部 天津市化学试剂六厂二分厂 天津大茂化学仪器供应站 重庆北碚精细化工厂 酪氨酸( 标品) 无水碳酸钠 s e p h a d e xg - 1 0 0 琼脂 蛋白胨 干酪素 酒精 乙醚 胰蛋白胨 牛肉膏 酵母膏 术瓜蛋白酶 胃蛋白酶 蔗糖 木糖 乳糖 葡萄糖 上海化学试剂采购供应站试剂厂分装 广东西陇化工厂 上海伯奥生物科技有限公司 福建石狮市狮头琼脂公司 中国医药( 集团) 上海化学医药公司 上海伯奥生物科技有限公司 沈阳化学试剂厂 上海马陆制药厂 u n i p a = r h l t d ，b a s n 叮g s t o k e 、h a m p s h i e r e n g l a n d 成都市华西生化制品厂 上海酵母厂 s i g m a 分装 s i g m a 分装 广州化学试剂厂 上海试剂二厂 北京化学试剂厂 上海化学试剂采购供应站试剂厂 其余常规试剂均为国产分析纯。 1 1 4 主要实验仪器 h d 一9 3 1 型核酸蛋白检测仪上海嘉定康华医疗器械厂 u v 一2 0 0 0 紫外可见风光光度计尤尼卡( 上海) 仪器有限公司 电热恒温水浴锅天津泰斯特仪器有限公司 t h 2 - 8 2 a 台式恒温振荡器上海跃进医疗器械厂 l k l 6 4 一0 1 离心机上海安亭科学仪器厂 手提式压力蒸汽灭菌锅贵州开阳医疗器械厂 电热恒温培养箱天津泰斯特医疗器械厂 h p 6 8 9 0 h p 5 9 7 3g c m s 联用仪 美国惠谱公司 1 2 方法 1 2 1 供试菌株的活化 分别将枯草芽孢杆菌e 2 ”b l 、1 0 0 7 5 、1 0 0 8 1 、1 0 1 6 3 、c k 菌株转接于牛 肉膏蛋白胨斜面培养基上，3 0 c 培养2 4 h ，连续活化两次后备用。 1 2 2 种子培养基的筛选 将活化的b i 菌株分别接种至4 装有5 0 m l ( d o 种子培养基的2 5 0 m l 三角瓶中， 2 0 0 r p m 旋转摇床上培养2 4 h 作为种子培养基。然后再接种于装有5 0 m l 培养基的2 5 0 m l 三角瓶中培养4 8 h ，测酶活。 1 2 3 酪氨酸标准曲线的绘制1 2 6 1 精确称取在1 0 5 烘干的酪氨酸o 1 9 ，用0 1 m o l l 的盐酸溶解，加蒸馏水稀 释，配成1 0 0 pg r n l 的溶液。然后分别吸取0 、l 、2 、3 、4 、5 m l 的该溶液至试 管中，加蒸馏水至1 0 m l ，摇匀。依次加入o 5 5 m o l l 碳酸钠5 m l ，稀释的福林酚 试剂l m l ，于3 0 0 水浴中保温发色1 5 m i n 。在分光光度计上测定o d 6 5 0 。 1 2 4 不同枯草芽孢杆菌对产酱香的影响 将优质大豆煮熟分装2 5 0 m l 三角瓶，每瓶5 0 9 ，灭菌后每瓶加入各种菌株e 2 0 和b i 种子液各0 2 m l 于3 0 、4 0 、5 0 c 下进行升温发酵，每一温度下发酵4 8 h ，1 4 4 h 后观察 嗅闻。 1 2 5 水分对美拉德反应和产酱香及褐变的影响 1 2 5 1 高温下不同含水量对大豆粉产生美拉德反应的影响 取2 5 0 m i 三角瓶，每瓶加入2 0 9 大豆粉并加入不同质量的水，使大豆粉的含 水量分别为0 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 。然后 把不同含水最的大豆粉置于灭菌锅内1 2 1 ，0 1 m p a 灭菌3 0 分钟。观察大豆粉发生 的非酶促美拉德反应及其褐变和产酱香的情况。 1 2 5 2 不同含水量对枯草芽孢杆菌产酱香和褐变的影响 在上述已装有大豆粉的灭菌的三角瓶中，每瓶加入o 2 m 1 种子液，按3 0 、4 0 、 5 0 顺次升温发酵，每一温度下发酵4 8 h ，1 4 4 h 后观察嗅闻。 1 2 6 温度对枯草芽孢杆菌产酱香的影响 将大豆煮熟分装2 5 0 m l 三角瓶，每瓶5 0 9 ，灭菌后每瓶加入o 2 m l 枯草芽孢杆菌种 子液于3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 下进行升温发酵，每一温度下发酵4 8 h ，1 4 4 h 后观察嗅闻。 1 2 7 产酱香和不产酱香枯草芽孢杆菌蛋白酶活力的比较 将大豆煮熟分装2 5 0 m l 三角瓶，每瓶5 0 9 ，灭菌后每瓶加入o 2 m 1 种子液于3 0 、4 0 、 5 0 e - f 进行升温发酵。每一温度下发酵4 8 h ，然后用1 0 0 m l 水进行抽提。将得到的粗酶 液采用f o l i n 酚法测酶活1 2 6 l ，比较产酱香菌株e 2 0 和b l 及不产酱香菌株c k 蛋白酶活 力。 1 2 8 蛋白酶的分离提取 1 2 8 1 粗酶的提取 固体发酵提取方法同上，液体发酵酶的提取直接离心即可。 1 2 8 2 酶的提纯 蛋白酶的分段盐析：固体和液体发酵提取的蛋白酶溶液经在4 冰箱预冷后， 加入硫酸铵，绘制其分段盐析曲线。然后经分段盐析除去杂蛋白。 1 2 8 3 蛋白酶的分子筛层析曲线 上述除杂的蛋白酶过s e p h a d e xg 1 0 0 层析柱，洗脱速度为6 0 m l h ，分步收 集，每管收集5 m l 。经核酸蛋白检测仪测定蛋白质的含量，绘制其层析曲线。 1 2 9 蛋白酶对发酵产酱香的影响 1 2 9 1 枯草芽孢杆菌b l 产生的蛋白酶对发酵产酱香的影响 5 0 9 大豆( 2 5 0 m l 三角瓶) 分别加入1 b 1 种子液，一份加b l 的粗酶，另一 份加入1 b l 种子液和一份粗酶( 5 0 9 大豆经b i 发酵提取的粗酶分为两份) ，于 3 0 、4 0 、5 0 c 下进行升温发酵，每一温度下发酵4 8 h ，1 4 4 h 后观察嗅闻。 1 2 9 2 术瓜蛋白酶和胃蛋白酶对发酵产酱香的影响 两份5 0 9 大豆( 2 5 0 m l 三角瓶) 分别加入木瓜蛋白酶和胃蛋白酶各0 1 9 ，置于3 0 、 4 0 ，5 0 下各发酵4 8 h ，1 4 4 h 后观察嗅闻。 1 2 1 0 氨基酸和糖类对发酵产酱香的影响 1 2 1 0 1 糖液和氨基酸溶液的配制 ( 1 ) 氨基酸溶液的配制：将苯丙氨酸1 1 9 、酪氨酸1 1 9 、谷氨酸1 1 9 、丙氨酸 o 2 2 9 、甘氨酸o 2 2 9 、精氨酸o 2 2 9 、赖氨酸o 1 l g 、甲硫氨酸o 1 l g 、胱氨酸o 1 lg 、 半胱鬣酸o 1 l g 、丝氨酸o 1 l g 、色氨酸o 1 l g 、天门冬氨酸o 1 l g 、天门冬酰胺0 1 l g 、 谷氨酰胺0 1 l g ，稀释至2 2 m l 。 ( 2 ) 糖混合液的配制：将葡萄糖1 5 9 、蔗糖1 5 9 、淀粉1 5 9 ，加水溶解并定容 至5 0 m l 。 1 2 1 0 2 氨基酸和糖类对发酵产酱香的影响 在5 0 9 大豆( 2 5 0 m l 三角瓶) 里面加入上述氮基酸和糖混合液各4m l ，然后置于 3 0 、4 0 、5 0 下各4 8 h ，1 4 - 4 h 后观察嗅闻 1 2 1 1 美拉德反应产物醚溶性成分的g c m s 图谱和醚溶性成分的分析 2 7 1 1 2 1 1 1 美拉德反应产物的分离 两个三角瓶中各装有5 0 9 大豆，灭菌后，各加入0 2 m le 2 0 种子液，按3 0 、 4 0 、5 0 顺序升温发酵，每一温度发酵4 8 h 。两瓶大豆用5 0 0 m l 水进行提取， 4 0 0 0 r p m 离心。将上清夜放入平底烧瓶中进行蒸馏，馏出液1 0 0 m l 用1 0 0 m l 乙醚 分两次( 5 0 x5 0 m 1 ) 进行萃取，然后将乙醚置于通风橱中蒸发至约l m l ，供g c m s 分析。 1 2 1 1 2g c m s 气质联用仪分析条件 色谱柱：h p 5 m s 5 p h e n y l m e t h y ls i l o x a n e ( 3 0 m o 2 5 m m o 2 5pm ) 弹性石 英毛细管柱。柱温5 0 c ( 保留2 r a i n ) ，以5 c r a i n 。升温至2 8 0 ，保持两分钟； 汽化室温度2 5 0 ：载气为高纯h e ( 9 9 9 9 9 ) ；柱前压7 6 2 p s i ，载气流量1 0 m l - r a i n ：迸样量lul ( 用乙醚将挥发油稀释的溶液) ；分流比4 0 ：l ；离子源为 e i 源；离子源温度2 3 0 ；四极杆温度1 5 0 ( 2 ；电子能量7 0 e v ：发射电流3 4 6 m a ；倍增器电压2 0 4 7 v ；接口温度2 8 0 c ；溶剂延迟3 m i n ；质量范围l o 5 5 0 a m u 。 1 2 1 1 3 不同枯草芽孢杆菌在相同发酵条件下的g c m s 图谱( 分析条件同1 2 1 3 2 ) 1 2 1 1 4 同一菌株在不同发酵温度下的g c m s 图谱( 分析条件同1 2 1 3 2 ) 1 。2 1 1 5 高温下发酵产生的挥发性醚溶成分的g c m s 图谱分析( 分析条件同 1 2 1 1 2 ) ：g c m s 图谱通过h p m s d 化学工作站，结合n i s t 9 8 标准质谱国库和 w i l e y 质谱图库，进行物质鉴定。按峰面积归化法进行计算求得各化学成分在 挥发油中的相对含量。 1 2 1 2 不同氮源对产酶的影响 以葡萄糖为碳源，浓度为2 ，分别以大豆粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酵母 膏、硫酸铵为氮源，浓度为2 ，配制发酵培养基，培养基装置为5 0 m y 2 5 0 m l 三角瓶， 自然p h ，4 0 、2 0 0 r p m 发酵4 8 h ，测定酶活力。 1 2 1 3 不同碳源对产酶的影响 以酵母膏作为氮源，浓度为2 ，分别以小麦粉、玉米粉、蔗糖、木糖、乳糖、葡 萄糖作为碳源、浓度为2 ，配制成培养基，培养基装囊为5 0 m l 2 5 0 m l 三角瓶，自然d h ， 接种量2 ，4 0 、2 0 0 r p m 发酵4 8 h ，测定酶活力。 1 2 1 4 发酵培养基优化试验 以葡萄糖、大豆粉、n