（微生物学专业论文）四川地区自然发酵泡菜中乳酸菌的生物特性研究.pdf

四川农业大学论文 摘要 本研究从四川地区采集自然发酵泡菜汁样品3 4 份，从中分离得到1 1 6 株乳 酸菌菌株，其中杆菌9 4 株，球菌2 2 株。以这1 1 6 株未知菌株和1 5 株已知参比 菌株为研究对象，采用数值分类方法，对菌株的表型多样性进行了研究。同时 对分离菌株的产细菌素能力进行了测定，将产细菌素能力强的乳酸菌人工接种 于泡菜中进行发酵，探讨了人工接种乳酸菌对泡菜亚硝酸盐含量的影响。根据 数值分类的结果，对菌株的种属进行了鉴定。 球菌数值分类中，菌株在7 5 相似水平上，只有1 0 株菌株被聚为4 个类群， 表明从不同区域、不同材料来源的泡菜其乳酸菌生理特性较为复杂，有待进一 步研究。杆菌在7 5 相似性水平上，9 4 株乳酸杆菌被分为了2 4 个菌群，并且 来自同一样品的菌株分散到不同的群中，说明四川地区自然发酵泡菜中的乳酸 杆菌，具有种类多样性。 分离得到的乳杆菌属菌株分别归种为：干酪乳杆菌干酪亚种( l c a s e i s u b s p c a s e i ) 1 2 株，棒状乳杆菌棒状亚种以c o r y n i f o r m i s ) 9 株，噬酸乳杆菌 ( a c i d o p h i l u s ) 2 株，植物乳杆菌( l p l a n t a r u m ) 8 株，瑞士乳杆菌( 厶h e l v e t i c u s ) l 株，德氏乳杆菌保加利亚亚种( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u s ) l 株，唾液乳杆菌水杨素亚种( l s a l i v a r i u ss u b s p s a l i c i n i u s ) 2 株，戊糖乳杆菌 ( 厶p e n t o s u s ) 4 株，草乳杆菌( 上g r a m i n i s ) 2 株，绿色乳杆菌( v i r i d e s c e n s ) 2 株，肠乳杆菌以i n t e s t i n a l i s ) 2 株，玉米乳杆菌( 厶z e a e ) 9 株，干酪乳杆菌假 植物亚种( l c a s e i s u b s p p s e u d o p l a n t a r u m ) 4 株，弯曲乳杆菌( 厶c u r v a t u s ) 6 株， 棒状乳杆菌扭曲亚种( l c o r y n i f o 硎缸s u b s p t o r q u e n s ) 3 株，鼠乳杆菌( 三m u r i n u s ) 3 株，类布氏乳杆菌( l p a r a b u c h n e r i ) 3 株，双发酵乳杆菌( 工b i f e r m e n t a n s ) 2 株，混淆乳杆菌( l c o n l l i n o i d e s ) 2 株，耐盐乳杆菌( l h a l o t o l e r a n s ) 2 株。食 品乳杆菌( l a l i m e n t a r i u s ) l 株。 分离得到的乳酸球菌分别归种为：乳酸乳球菌乳酸亚种( l a c t o c o c c u sl a c t i s s u b s p 1 a c t i s ) l 株，乳酸乳球菌乳酸亚种( l a c t o c o c c u sl a c t i ss u b s p 1 a c t i s ) 2 株， 植物乳球菌( l p l a n t a r u m ) l 株，粪肠球菌( e f a e c a l i s ) 2 株，屎肠球菌( e f a e c i u m ) l 株，粪链球菌( s t r e p t o c o c c u s ) 2 株。 四川农业大学论文 通过对分离得到的1 1 6 株乳酸菌，经过筛选得到5 株乳酸杆菌产细菌素， 将所得5 株菌人工接种到泡菜中进行发酵，与未接种的自然发酵比较，人工接 种能显著减少泡菜中亚硝酸盐的含量。该5 株乳酸杆菌分别为：a - 1 3 干酪乳杆 菌干酪亚种( 厶c a a e is u b s p c a s e i ) 、j - 5 棒状乳杆菌棒状亚种c o r y n i f o r m i s ) 、6 7 鼠乳杆菌( 厶m u r n u s ) 、7 4 干酪乳杆菌假植物亚种( 厶c a s e i s u b s p p s e u d o p l a n t a r u m ) 、a - 7 弯曲乳杆菌( 厶c u r v a t u s ) 。 关键词：自然发酵泡菜：乳酸菌；多样性；细菌素：亚硝酸盐 i i ! 四川农业大学论文 i n v e s t i g a t i o no ft h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fl a c t i ca c i d b a c t e r i ai s o l a t e df r o mt r a d i t i o n a lf e r m e n t e dp i c k l es a m p l e s i nt h es i c h u a np r o v i n c e a b s t r a c t o n eh u n d r e ds a ds i x t e e nl a c t i ca c i db a c t e r i a ls t r a i n si n c l u d i n g9 4l a c t o b i l l n sa n d2 2 l a c t o c c u sw e r ei s o l a t e df r o mt h e3 4t r a d i t i o n a lf e r m e n t e dp i c k l es a m p l e s t h ea s s a yt e c h n i q u eo f n u m e r i c a lt a x o n o m yw a su s e dt os t u d yt h ep h e n o t y p i cp r o p e r t i e sa n dd i v e r s i t yo f t h ei s o l a t e sa n d t h e1 5r e p r e s e n t a t i v es t r a i n s t h ea b i l i t yo f b a c t e r o c i np r o d u c t i o no f t h ei s o l a t e sw e r et e s t e d t h e i s o l a t e sw i t hh i g h e rb a c t e r o c i np r o d u c t i o nw e r eu s e da si n o c u l s a t si np i c k l ef e r m e n t a t i o n t h e n i t r i t ec o n c e n t r a t i o nw a sd e t e r m i n e dw i t ht h ec o a t r o li nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s b a s eo nt h e r e s u l t so f n u m e r i c a lt a x o n o m y , t h eg e n u sa n ds p e c i e so f t h ei s o l a t e sw e r ei d e n t i f i e d a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so f n u m e r i c a lt a x o n o m y , o n l y1 0l a c t o c o c c u ss t r a i n sw e r ed i v i d e d i n t o4c l u s t e r sa tt h es i m i l a r i t yl e v e lo f7 5 ，w h i c hi n d i c a t e dt h ec o m p l e xp h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e so fl a bf r o mt h ed i f f e r e n tr e g i o n sa n dd i f f e r e n tm a t e r i a l s a tt h es i m i l a r i t yl e v e lo f 7 5 9 4l a c t o b a c i l l u ss w a i n sw e r ed i v i d e di n t o2 4p h e n o t y p i cg r o u p s , a n dt h es w a i o sf r o mt h e s a m es a m p l ew e r ed i s p e r s e di nd i f f e r e n tg r o u p s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el a c t u b a c i l l u ss t r a i n s f r o mt h et r a d i t i o n a lf e r m e n t e dp i c k l ei nt h es i c h u a np m v i n c eh a dh i g hp h e n o t y p i cd i v e r s i t y b yt h ep h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lt e s t s 。t h el a c t o b a c i l l u ss t r a i n sw e r fi d e n t i f i e da st h e f o l l o w i n gs p e c i e s 。l c a s e is u b s p c a s e i 。l c o r y n i f o r m i s , l a c i d o p h i l u s ，l p l a n m m m ，l h e l v e t i c u s ， l a c t u b a c i l l u sd e l b m a c k i is u b s p b u l g a r i c n s , l s a l i v a r i u ss u b s p s a l i c i n i u s 。l p e n t o s u s , l g r a m i n i s ， l v i r i d e s c e n s , l i n t e s t i n a l i s , l z e a e l c a s e is u b s p p s e u d o p l a n t a r u m , l c u r v a t n s ，l c o r y n i f o r m i s s u b s p t o r q u e u s , l m u r i n u s , l p a r a b u c h n e r i , l b i f e r m e n t a n s ，l c o n l l i n o i d e s ，l h a l o t u l e r a n s , l a l i m e n t a r i u a m o n g2 2c o c c is t r a i n s t h e yw f f oi d e n t i f i e dt ob e6s p e c i e si n c l u d i n g l d 冲o c c 璐 l a c t i s s u b s p 1 a c t i s , l a c t o c o c c u s l a c t i s s u b s p 1 a c t i s 。l p l a n t a m m , e 。f a e c a l i s 。e f a a c i u m , s t r e p t o c o c c u s b yt h en i u j i nc u pt e s t , f i v el a c t o b a c i l l u ss t r a i n sw e r es c r e e n e do u tt ob et h eb a c t e r o c i np r o d u c e r s a m o n g t h e11 6i s o l a t e s t h e s es t r a i n sw e r ei n o c u l a t e di n t ot h ep i c k l e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h en i t r i t ec o n c e n t r a t i o nw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to fn a t u r a lf e r m e n t a t i o n t h ef i v e 四川农业大学论文 s t r a i n sw c r ca 1 3l c a s e is u b s p c a s e i 、j 5 l c o r y n i f o r m i s 、6 - 7l m u r i n u s 、7 - 4l c a s e i s u b s p p s e u d o p l a n t a r u m 、a 一7l c u r v a l u s k e y w o r d s ：t r a d i t i o n a lf e r m e n t e dp i e l d e sl a c t i ca c i db a c t e r i s ；p h e u o t y p i ep r o p e r t i e s ) v 四川农业大学论文 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所 取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农 业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 一躲f a 谚 砌z 年 关于论文使用授权的声明 7 , 9 夕日 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业人学可以用不同方式在不同媒 体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：f 导师签名 毯墟 7 蚀勿 ll 如6 年7 月弓日 利年7 月多日 四川农业大学论文 1 文献综述 1 1 前言 泡菜是一种以白菜、萝卜、黄瓜，甜椒等新鲜蔬菜为原料，添加食盐、水 和调味料，利用蔬菜自身附着的微生物或添加人工培养的乳酸菌发酵剂，在厌 氧环境下进行乳酸发酵而成的深受消费者喜爱的特色风味食品。泡菜不但味美 爽口，而且具有丰富的营养，含有v a v b l 、v b 2 、v c 、c a 、p 、f e 、胡萝b 素、 辣椒素、纤维素和蛋白质等多种丰富的营养成分。由于泡菜在发酵过程中，乳 酸菌利用蔬菜中的可溶性养分进行乳酸发酵，既不具备分解纤维素的酶系统， 也不具备水解蛋白质的酶系统。因此，它们既不破坏植物细胞组织，也不使蛋 白质和氨基酸分解。并且在发酵过程中产生大量乳酸，既起防腐作用，又可以 改善产品风味( 杨洁彬，郭兴华等，1 9 9 6 ) 一般自然发酵的泡菜在发酵初期以异型乳酸菌迅速启动发酵，产生有机酸、 过氧化氢和细菌素等物质。有效抑制一些腐败微生物及其它厌氧微生物如丁酸 细菌的生长、繁殖，是得到优质安全泡菜产品的重要保证( 江汗糊，2 0 0 2 ：施 安辉，周波，2 0 0 2 ) 。同时伴随乙醇、乙醛、甘露醇等风味物质产生，对泡菜特 有风味的形成起决定作用；之后同型乳酸菌逐渐成为优势菌，进一步降低环境 p h 值和抑制有害杂菌( 凌代文，东秀珠，1 9 9 9 ：n a n c y jg , t o n ts ，2 0 0 1 ) 。在 发酵结束后，泡菜中含有大量有机酸、细菌素、益生素等( h u r s t a j1 9 7 2 ) 。泡 菜可以调节动物和人体肠道微生态平衡，对机体的健康十分有益，包括抑制肠 道中腐败菌的生长和减弱腐败菌在肠道的产毒作用，并有帮助消化，防止便秘， 防止细胞老化，降低胆固醇，抗肿瘤以及调节人体生理机能等保健和医疗作用 ( j d e l v e s b r o u g h t o n ，1 9 9 0 ；h u r s t a j1 9 7 2 ；r y a n g ，m c j o h n s o n , 1 9 9 2 ) 乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i a , l a b ) 是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的 革兰氏阳性细菌的统称。在自然界广泛分布，可在土壤，污水，生长的植物上， 动物消化道，体表，人体消化道、生殖道中分离得到( 杨洁彬，郭兴华等1 9 9 6 ) 。 除少数外，绝大多数乳酸菌是正常人、畜肠道中极为重要的生理菌群，担负着 人、畜机体多种重要的生理功能，具有维持人体中微生态平衡的作用，与机体 健康息息相关。由于乳酸菌特殊的生理条件，在厌氧环境下发酵产酸造成环境 p h 值下降，对一些腐败菌与病原菌的生长起到抑制作用并且，乳酸菌在代谢 四川农业大学论文 过程中还会产生有机酸、h 2 0 2 、双乙酰( l i n d g r e n , s w e ta l ，1 9 9 0 ) 及其产生的 抑菌活性代谢产物细菌素( 细菌素是某些细菌产生的具有抗菌活性的多肽、蛋 白质或蛋白质复合物( k l a e n h a m m e rtr ，1 9 9 8 ) ，某些细菌通过核糖体机制产 生的一类具有抑菌生物活性的蛋白质，大多数细菌只对亲缘关系较近的细菌有 毒害作用，产生菌对其产生的细菌素具有自身免疫性( a b e et , k r o c k e ll 1 9 9 5 ) 正因为这些物质的存在，阻止了病原菌的定植，调节机体的免疫系统、降低机 体胆固醇水平和改善机体对乳糖的不适应性的功能( p e t r o n e l l ajl o o i j e s t e i j n , i n g e b o r gcb o e l s ，1 9 9 9 ) 乳酸菌从形态上一般分为球菌和杆菌，革兰氏阳性，厌氧或兼性厌氧，以 单糖( 葡萄糖、果糖、半乳糖) 和二糖( 蔗糖，麦芽糖、乳糖) 为碳源和能源， 代谢产物主要是乳酸。人们利用乳酸菌发酵制作泡菜、酸菜、乳酪、酸奶等食 品目前，乳酸菌己广泛应用于食品工业、农业和医药等与人类生活密切相关 的重要领域。 1 2 国内外泡菜生产研究现状 1 2 1 国内泡菜发展现状 蔬菜泡制是我国一种古老的蔬菜加工保藏方法。大约在3 0 0 0 年前，中国就 有了酱菜制作工艺( 郑云溶，2 0 0 2 ) 。根据中国最早的诗集诗经记载，中国 泡菜的雏形应该是“菹”字。目前，国内泡菜主要集中在西南和中南各省邓 开荣，2 0 0 1 1 ，尤以四川成都泡菜为代表，以其独有的风味闻名于世。驰名中外的 川菜中很多调料必需四川泡菜，诸如酸菜鱼、鱼香茄子、鱼香肉丝等。四川泡 菜以其酸鲜纯正、脆嫩芳香、清爽可口的特性享有盛誉，是川菜中风味小菜的 组成部分，吸引着众多食客。由于成都位于川西平原腹地，温暖潮湿，四季分 明的气候条件既有利于乳酸发酵，又有利于四季蔬菜常青，蔬菜资源极为丰富。 仅成都周边的泡菜厂就在1 0 0 0 家以上目前，成都泡菜已出口到美国、加拿大、 日本、尼伯尔等多个国家和地区。但是，我国生产的泡菜，市场销售额还不足 1 0 亿元，出口总额约为5 0 0 万美元，仅占国际泡菜市场总量的3 ( 陈仲翔，董 英，2 0 0 4 ) 。 国内众多泡菜生产企业中多采用传统自然发酵工艺，其规模小产量低， 为泡菜大规模生产带来诸多弊端。如发酵周期相对较长，生产力低下：卫生条 2 四川农业大学论文 件达不到国家安全标准；发酵质量不稳定，不利于工厂化、规模化及标准生产； 亚硝酸盐、食盐含量高，食用安全性差等。为了解决以上问题，国内学者相继 对泡菜中乳酸菌区系和泡菜中乳酸菌的分离、菌种特性进行研究，以及对乳酸 菌纯菌种发酵的研究，并取得了较好的效果。杨瑞鹏等人( 杨瑞鹏，赵学慧，1 9 9 1 ) 进行了酸泡菜发酵过程中乳酸菌区系的研究；吴红艳等人( 吴艳红等，1 9 9 7 ) 利 用甘蓝，胡萝b 等原料，接种肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、短乳杆菌进行发酵， 进行了菌种配比、菌种添加量、发酵时间及主要工艺参数；毕金峰等人( 毕金 峰，刘长江等，2 0 0 0 ) 从自然发酵酸菜汁中分离鉴定乳酸菌，并进行发酵剂的筛 选；林燕文、黄均红等人( 林燕文，黄君红，2 0 0 1 ) 在含高浓度的泡菜中添加维 生素或氨基酸，检测乳酸菌含量的变化，发现添加适量的维生素或氨基酸可以 提高乳酸菌的含量，维持高含菌量的时间也较长；熊晓辉等人( 熊晓辉，王晓 飞等，2 0 0 4 ) 从泡菜汁中分离乳酸菌，筛选出了3 株产酸量较高、生长良好的菌 株，并发现以其为纯培养发酵剂制备萝卜泡菜，质量优于自然发酵产品；叶淑 红等人( 叶淑红，何连芳, 2 0 0 4 ) 将植物乳杆菌应用在制作泡菜中，发现人工接 种从发酵周期、乳酸产量、感官评定等各个方面都明显优于自然发酵，既适合 家庭制作，又适合工业化大批量生产；沈国华等( 沈国华，2 0 0 2 ) 进行了采用植 物乳杆菌或干酪乳杆菌单独或以l ：l 比例混合的蔬菜接种发酵；毕金峰等人( 毕 金峰等。2 0 0 0 ) 利用明串珠菌和乳酸杆菌进行复配取得了较好效果；罗云波( 罗 云波，2 0 0 1 ) 认为植物乳杆菌、发酵乳杆菌、肠膜明串珠菌以5 ；3 ：2 较为合适； 蒋和体( 蒋和体，1 9 9 4 ) 则认为以上的比例为3 ：1 ：l 比较合适。并且除了为数 不多的具备小规模工业化生产能力外，其余均属零星，分散的作坊式生产。 1 2 2 国外泡菜发展现状 国外泡菜主要集中在韩国和日本，尤以韩国泡菜最为出名早在1 3 0 0 年前 韩半岛三国时代，泡菜由中国传到韩国，并结合韩民族的饮食文化，发展成为 今日的韩国泡菜。欧洲泡菜也是于1 7 世纪由我国引入，其发酵蔬菜制品在1 9 8 5 年为5 l 万吨橄榄、2 2 万吨卷心菜和4 5 万吨腌黄瓜( 杨洁彬，郭兴华，1 9 9 6 ) 1 9 9 9 年韩国国内泡菜市场产值约为1 6 7 亿美元( 钟龙往，2 0 0 5 ) 。1 9 9 8 年日本 泡菜生产量达到1 8 万多吨，已形成了1 0 0 0 亿日元的巨大市场。目前，全球泡 菜份额中，日韩泡菜在国际市场已占据了9 5 。随着泡菜的不断发展，国外学 3 网j i l 农业大学论文 者对泡菜的研究也越来越深入。在韩国尤为明显，2 0 0 0 年还在青州大学增设了 泡菜专业，为韩国培养了第一批专门研究泡菜的人才【李幼筠，2 0 0 1 。 h e r m e b e r y ( h e n e b e r y , w 1 9 2 6 ) 首先在其细菌发酵手册中提到了乳酸 杆菌属和片球菌属的某些种类。p e d e r s o n ( p e d e 】r s o n , c s ，1 9 3 0 ) 在1 9 3 0 年研究 了泡卷心菜( s a u e r k r a u t ) q b 的微生物，首次提出了明串珠菌启动蔬菜的乳酸发酵 过程。d o n gg w a ni g m 等人( d o n gg w a nk i m ，1 9 9 4 ) 考察了泡菜发酵过程中卷 心菜中还原糖的变化；m e ek y u n gk i l n 等人( m e ek y u n gk i m ，1 9 9 4 ) 研究了 泡菜发酵过程中，卷心菜颜色变化与p h 之日j 的关系。9 0 年代后期，研究重点 转向了泡菜中菌种的分离鉴定及其特性的研究，同时采用不同原料开发具有保 健功能的泡菜。研究深度比9 0 年代前期更加深入。j o n gh y e nk i m 等人( j o n g h y e nk i m ，2 0 0 2 ) 研究了泡菜对小鼠大脑中抗氧化酶活性和自由基产生的影响， 研究表明，泡菜，尤其是含有芥菜叶的泡菜有延迟衰老的作用。h e u id o n gp a r k 等人( h e u id o n gp a r k ，2 0 0 1 ) 研究了从泡菜中分离出来的l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m 的抗突变活性。需要进一步认识和挖掘泡菜的营养价值和功能特性。 1 3 乳酸菌在泡菜加工中的作用 1 3 1 提高蔬菜的营养价值和风味 乳酸菌虽然在代谢过程中消耗部分的纤维索，但在泡菜发酵过程中能够利 用蔬菜原料的可溶性物质代谢合成叶酸等b 族维生素，有机酸使p h 值降低， 增加肠内维生素b i b 6 和b 1 2 的稳定性，从而提高了发酵制品的营养价值( 杨 春哲，冉艳红，2 0 0 0 ；e e n i i n i v a r a ，1 9 6 4 ) 。并且，乳酸菌不具备分解纤维素 和水解蛋白质的酶系统，其在发酵过程中既不会破坏植物细胞的组织，也不会 降低蔬菜原料的营养价值( 张华，1 9 9 7 ) 。蔬菜在发酵过程中，由于蛋白质的分 解作用，提高了游离氨基酸的含量和蛋白质的消化率，同时，形成了酸类、醇 类、碳氢化合物、杂环化合物、游离氨基酸和核苷酸等风味物质，使蔬菜制品 的营养价值和风味都得到了改善( 潘润淑，1 9 9 7 ) 。 1 3 2 产生乳酸菌素有效抑制腐败菌。延长食品的保质期 由于乳酸菌特殊的生理条件，在代谢过程中能产生有机酸、h 2 0 2 、c 0 2 、 双乙酰、细菌素( b a c t e r i o c i n s ) 等多种天然抑菌物质( 孔健，1 9 9 5 ) ，这些物质协同 乳酸菌所产生的乳酸菌素来抑制食品中腐败菌和致病菌的生长，具有维持肠道 4 四川农业大学论文 内微生态平衡，提高机体免疫力，促进营养物质吸收等多种功能可以有效地抑 制食品中革兰氏阳性菌的生长，如微球菌、分枝杆菌、棒杆菌、葡萄球菌和利 斯特氏菌等，对于梭状芽孢杆菌也有很好的抑制作用。能有效阻止孢予的萌芽 和毒素的生长。而细菌素本身能够被人体消化道分泌的酶降解，具有抗菌性强、 安全无毒、水溶性好、热稳定性好等优点，作为种生物防腐剂已经越来越受 到人们的重视。不同的乳酸菌所产生的乳酸菌素是不同的，不同的乳酸菌素具 有不同的抑菌谱和抑菌活性，有的乳酸菌素不具有抑菌活性。因此，寻找广谱、 高效、低毒天然食品防腐剂是目静食品科学研究中的热点之一许多乳酸菌在 食品发酵方面具有重要的作用，抑制一些附着在食品表面，使食品酸败或腐败 的微生物( r a y , b a n d m d a e s c h e ，1 9 9 2 ，s t i l e s ，k a ，1 9 9 1 ) 。 国外对乳酸菌细菌素的研究比较早，报道的文献资料很多( k l a e n h a m m e rt 1 9 9 3 ；a b e et ，1 9 9 5 ；j a c krw ：1 9 9 5 ；n e sif , d i e pdb ，1 9 9 6 ；s t i l e sme ，1 9 9 6 ； h e l a n d e rim ，1 9 9 7 ) 而国内则起步较晚，除了n i s i n 的研究外( 环连栋，陈秀 珠，1 9 9 3 ；孔健，马桂荣，1 9 9 5 ；陈秀珠，何松，1 9 9 6 ；刘稳，马桂荣，1 9 9 6 ) ，很少 见到有关其它乳酸菌细菌素的报道。到目前为止已描述了4 0 多种乳酸菌细菌 素，它们是一群复杂的拮抗物质。近年来随着对乳酸菌细菌素研究不断关注， 开发乳酸菌细菌素作为新型的天然食品防腐剂和饲料添加剂已作为研究热点， 并将应用于工业中，具有代表性的例子是研究最早、最成熟的乳酸链球菌素 ( n i s i n ) 已广泛的应用于食品防腐中，尤其是日常快销产品中( h u g e n h o l t z , j ，1 9 9 1 ；h u r s t , a ，1 9 8 1 ；m o l i t o r , e a n dh - g s a h l ，1 9 9 1 ) 如牛奶制品( 包括鲜牛奶、 奶粉、酸奶、奶酪等) 、罐头食品、饮料、肉类食品、鱼类以及酒精饮料等等( 彭 沈军，李东，1 9 9 5 ) 。 1 3 3 增加蔬菜的医疗保健作用 乳酸菌是人体胃肠道的益生菌群( 彭沈军，李东，1 9 9 5 ) 。通过其自身及其 代谢产物和与其它细菌之间的相互作用，调整菌群之间的关系，维持人体肠道 的微生态平衡，增强机体的免疫力，降低胆固醇水平，缓解乳糖不耐症及抑制 肿瘤细胞的形成等( 顾瑞霞，谢继志，1 9 9 5 ) 。因此，食用乳酸菌发酵的蔬菜制 品人体除了吸收蔬菜的营养成分外，还摄入了一些乳酸菌能耐受胃部不利的 酸性条件而到达肠道如嗜酸乳杆菌，这些菌能抑制一些结肠中的细菌酶，特别 5 四川农业太学论文 是那些能促进致癌物前体向致癌物转化的粪便酶。另外，致癌作用是通过具有 致癌物诱导动物细胞突变开始的，而一些乳酸菌可抑制动物细胞的突变( 韩俊 华，盛晓甘，2 0 0 2 ) 。 1 3 4 乳酸菌抑制泡菜中亚硝酸盐的形成 蔬菜是一种富集硝酸盐的植物性食品( e i c h h o l z e rm o u t z u i l e rf ，1 9 9 8 ) ， 当人们食用含有硝酸盐的蔬菜后，硝酸盐经口腔细菌的作用，还原为亚硝酸盐 ( w h i t e j w ，1 9 7 5 ) ( 亚硝酸盐是强致癌物亚硝胺的前体，是影响泡菜品质的 重要原因之一) 。蔬菜经过腌制发酵过程中，有害微生物将蔬菜中的硝酸盐还原 为亚硝酸盐及某些杂菌可将硝酸盐转化为亚硝酸盐。当人体摄入亚硝酸盐后， 亚硝酸盐能和胃中的含氮化合物结合成具有致癌性的亚硝胺，对人体健康产生 危害( 刘青梅，杨性民，2 0 0 1 ；罗晓梅，朱波，2 0 0 3 ) 。因此，泡菜中亚硝酸盐 的含量逐渐引起人们的重视。近年来，众多学者( 郭晓红，杨洁彬，1 9 8 9 ；杨 性民，刘青梅，2 0 0 3 ) 采用人工接种乳酸菌技术缩短蔬菜制品的发酵周期，改 善发酵蔬菜的品质，显著降低亚硝酸盐生成( 蒋和体，1 9 9 4 ) 。 泡菜中的乳酸和乳酸菌对人体的健康有益，乳酸菌在乳酸发酵的冷j ar 方 式对蔬菜营养成分，色香味的保持极为有利，产品既有良好的感官品质，又节 约能源。同时在发酵过程中，乳酸菌产生大量的乳酸，使环境p h 降低，在旷 的作用下，有利于n 0 2 还原成n o ，从而降低亚硝酸盐的残留量( 蒋和体，1 9 9 4 ) 。 同时由于硝酸还原酶的适宜p h 值为7 7 5 ，随着酸度增加，酶活性降低，甚 至无活性，促使亚硝酸盐降解，减少亚硝酸盐与二级胺反应生成致癌物质 亚硝胺，提高了食品的安全性和货架期。 1 4 本研究的目的和意义 我国泡菜生产主要集中在四川地区，尤其是成都平原，这一地区由于其独 特的地理环境和气候条件，造成了该地区有着丰富的自然资源，由于成都位于 川西平原腹地，温暖潮湿。四季分明的气候条件既有利于乳酸发酵，又有利于 四季蔬菜常青，蔬菜资源极为丰富。为该地区泡菜生产提供了丰富的物质条件， 并且其适宜的气候条件为附生于蔬菜表面的微生物提供良好的栖息之所 四川泡菜以其酸鲜纯正、脆嫩芳香、清爽可口的特性享有盛誉。但是，泡 菜的生产是一个十分复杂的微生物学发酵过程，同时伴随着复杂的生物化学变 6 四川农业大学论文 化和物理变化，泡菜在很多方面仍然是“知其然不知其所以然”，在发酵过程中 还存在许多未知的领域，导致泡菜在生产过程中出现了一系列问题，限制了泡 菜行业的进一步发展。长期以来，泡菜的生产方式大都采用传统的自然发酵， 其缺点是泡菜汁中发酵的底物浓度较低，乳酸发酵缓慢，发酵周期较长，酸味 较弱，并且受环境因子影响也很大，使产品质量不稳定，同时亚硝酸含量在很 大程度上得不到有效的控制。近年来，对泡菜的研究不断深入，由传统的自然 发酵方式逐渐转变为人工接种发酵方式，但采用的菌种比较单一，发酵出来的 泡菜风味失去了自然发酵中独特的风味，这可能与泡菜中存在多种乳酸菌有着 密切的关系。因此，本研究以四川地区自然发酵泡菜汁为材料，分离获得的乳 酸菌菌种，采用形态、生理生化鉴定和数值分类的方法，揭示自然发酵泡菜中 乳酸菌资源的种群多样性和表型多样性，并从分离的乳酸菌菌种中筛选细菌素 产生菌，不仅对革兰氏阳性细菌有抑制作用，而且对革兰氏阴性细菌也有抑制 作用。为进一步筛选优良发酵剂菌种奠定基础，为今后工业化人工接种乳酸菌 于泡菜发酵，开发，医药利用提供乳酸菌资源和理论基础。 2 材料和方法 2 1 材料 2 1 1 供试样品 从成都、乐山、泸州、峨眉山、宜宾、内江、雅安、西昌、汶川、双流、 遂宁、金堂、隆昌，贵阳、重庆等1 5 个市县区采集自然发酵泡菜汁样品3 4 份。 表i 样品来源及特点 ! ! ! ! ! ! 生! ! ! ! ! 堕竺! ! ! ! ! 型! ! 璺! ! 坐! ! 翌2 1 1 1 样品采集地点泡菜材料分离乳酸曲数 编号杆菌球菌 i雅安雨城区萝h 、豇豆，青菜 10 3雅安雨城区萝h 、青菜 50 4 雅安雨城区青菜、莲花白，萝p 01 6 雅安雨城区萝h 1 0 7雅安雨城区莲花白、萝i - 、豇豆 60 7 四川农业大学论文 注：在所有泡菜中添加的调料有：姜。辣椒，大蒜 2 1 2 供试菌株 ( 1 ) 分离的纯菌株 ( 2 ) 参考菌株： b 1 德氏乳杆菌保加利亚亚种( l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u s ) b 2 德氏乳杆菌德氏亚种( 厶d e l b r u e c k i is u b s p d e l b r u e c k i i ) b 3 噬酸乳杆菌( l a c i d o p h i l u s ) b 4 植物乳杆菌( l p l a n t a r u m ) b 5 肠膜明串珠菌葡聚糖亚种( l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e ss u b s p d e x t r a n i u m ) 3 四川农业大学论文 b 6 双发酵乳杆菌( b i f e r m e n t a n s ) b 7 干酪乳杆菌干酪亚种( c a s e is u b s p c a s e d b 8 乳酸乳球菌乳酸亚种( l a c t o c o c c u sl a c t i cs u b s p 1 a c t i s ) b 9 瑞士乳杆菌( 厶h e l v e t i c u s ) b 1 1 发酵乳杆菌( l f e r m e n t i u m ) b 1 2 棒状乳杆菌棒状亚种幔c o 硼i f o r m i s ) b 1 3 干酪乳杆菌干酪亚种( l c a s e is u b s p c a s e i ) b 1 4 短乳杆菌( b r e v i s ) b 1 5 布氏乳杆菌( 工b u c h n e r o b 1 6 植物乳杆菌( l p l a n t a r u m ) 菌株b i b 1 6 购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i )枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 菌种来源四川农业大学微生物实验室。 2 1 3 样品的采集 采集自然发酵泡菜汁于灭菌瓶中，放入4 c 冰箱中保存备用。 2 2 供试材料 2 2 1 蔬菜种类 主料：市售萝卜 辅料：大蒜，姜，花椒，辣椒，食盐 2 2 2 泡菜的制作 将萝卜洗净，切成小块( 带皮) ，每个小泡菜坛中分别随机称取2 0 0 9 萝h ， 定量加入2 9 大蒜、2 9 姜、o 5 9 花椒、0 5 9 辣椒，2 3 0 m l 凉开水、8 食盐，装 于小泡菜坛中。 菌种：所有分离、纯化的乳酸菌种 2 2 3 供试培养基 乳杆菌属分离用s l 或m r s 培养基( 凌代文，东秀珠，1 9 9 9 ) ，乳球菌属 分离用e l l i k e r 培养基( 凌代文，东秀珠，1 9 9 9 ) ，链球菌属分离用基础培养基 ( 凌代文，东秀珠，1 9 9 9 ) ，明串珠菌属分离用蔗糖硫胺培养基( 陈天寿，1 9 9 5 ) ， 9 网j i i 农业大学论文 肠球菌属分离用k f 培养基( m j ，j 、佩尔扎，r d 罩德，e c s 詹，1 9 8 4 ) ，纯化 用m r s 培养基( 凌代文，东秀珠，1 9 9 9 ) 。 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌用牛肉膏蛋白胨培养基 2 2 4 主要试剂 革兰氏染色用试剂：草酸铵结晶紫染色液、革兰氏碘液、9 5 酒精、石炭酸复 红溶液 亚硝酸盐测定试剂：盐酸萘乙二胺；对氨基苯磺酸；亚硝酸钠；硫酸锌；氯 化铵；氢氧化钠 过氧化氢酶测定试剂：0 0 1 m o l l 的过氧化氢溶液；1 8 m o l l 的硫酸溶液；1 0 铝酸铵溶液：l 的淀粉溶液；2 0 的碘化钾溶液 考马斯亮蓝g - 2 5 0 测定蛋白质试剂：考马斯亮蓝g 2 5 0 ：9 5 酒精；8 5 的磷酸； 结晶牛血清白蛋白 2 3 研究方法 2 3 1 实验室分离纯化： 样品 挑取一环泡菜汁搅拌接种 于3 0 - 4 0 0 c 琼脂柱培养基中 3 7 培养2 4 - 7 2 h 挑取产生黄色色素的单个菌落， 接入m r s 液体培养基中， 3 7 培养2 4 7 2 h 革兰氏染色涂片镜检， 阳性纯曲株 挑取单个菌落，点接接种于 含b c p ( 1 6 ) 的双层平板上 3 7 培养2 4 - - 7 2 h 挑取产生黄色色素的单个菌落。 划线接种于含b c p ( 1 6 ) 的 双层平扳上 3 7 培养 穿刺接种于含1 的c a c 0 3 m r s 卜_ 一纯培养物 半同体培养基中，3 7 培养2 4 7 2 hl i 4 冰箱保存备用，另收集对数 生长期菌体保存于一7 0 c 2 3 2 结果分析 用n t s y s p c 2 1 将实验数据转化为计算机语言，用n t s y s p c 2 1 软件进行聚类 分析。 2 3 2 1 性状编码 t 0 四川农业大学论文 处理数据之前，必须先将测定的性状转化为计算机语言，通常采用三种不 同的编码方法( 李季抡，1 9 9 5 ) 。 ( 1 ) 定性两态性状 可以用是否来表示性状，如对一碳源或氮源的利用情况，或对一化学药物 的抗性等，结果记录时阳性用“+ ”，阴性用“一”转化为计算机语言时为“1 ” 和“0 ”。 ( 2 ) 定量多态性状 也称有序多态性状，可依次按数量大小有序排列。如耐盐性、对不同浓度 的同种抗生素的抗性等性状。这类性状采用加权分解成多个两态性状来进行编 码。 定量多态性状的编码 n a c l ( ) 菌株编号 1 02 o3 o4 o l + 2 + + 3 + ( 3 ) 定性多态性状 又称无序多态性状，不能按一种明确次序进行。这类性状是通过转化为多 个二态性来处理。 定性多态性状的编码 卤株编号 产酸产碱胨化 l + 2 + 3 + 2 3 2 2 相似性计算 采用s o k u l 和n i c h e n e r ( 1 9 5 8 ) 的简单匹配系数( s i m p l em a t c h i n g c o e f f c i e n t ) 来比较菌株间的相似性计算公式：s s m = ( a + d ) ( a + b + c + d - n c ) 其中“a ”表示被比较的菌株a 和b 都是“十”的结果的编码特征个数 “b ”表示a 为“+ ”结果，b 为“一”结果的编码特征个数 “c ”表示a 为“一”结果，b 为“+ ”结果的编码特征个数 “d ”表示菌株a 和b 都是。一”的结果的编码特征个数 “n c ”表示资料缺失不参与比较的特征个数 四川农业大学论文 2 3 2 3 聚类方法 常用平均连锁法( u p g m a ) 。平均连锁法又称类平均法，它既无全连锁法的 空h j 扩张性质，也无单连锁法的空间收缩性质。该法属于系统聚类法，它将众 多样本逐渐归群，最后归为一个大类。 平均连锁法的原则是把一个样本内的每一个元素到另一个样本内的每一个 元素的距离( 通过相似性来表示) 的总和对所有元素的均值作为两个样本间的 距离，并据此均值由大到小进行逐级归类，归类结果通常以树状图谱的方式表 示。 2 3 3 数值分类实验内容和方法 生理生化试验均设3 个重复及阴性和阳性对照( 陈强，2 0 0 4 ；胡清华，2 0 0 2 ) 。 除温度试验外，均在3 7 培养。 唯一碳源利用( 编码特征1 - 1 9 ) 试验中以甘露醇、d - 海藻糖、d 山梨醇、木糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖，葡 萄糖、葡萄糖酸钠、棉籽糖、