（动物学专业论文）肝源性磷脂酰胆碱的分离纯化及其生物学功能的研究.pdf

摘要 两要 磷脂酰胆碱( p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ，p c ) 也称卵磷脂( 1 e c i t h i n ) 。系统 名称为i ，2 一二酰基一s r 一甘油一3 一磷酸胆碱( 1 ，2 - d i a c y l s n g l y c e r o 一 3 - p h o s p h o c h o l i n e ) 。诸多实验结果已经证明，p c 不但参与维持生物膜正常的结 构和功能，与细胞的生长、增殖、分化及癌变密切相关，其降解产物还参与细 胞的信号转导和代谢调控，具有防衰老、降血脂、健脑、保肝、抗肿瘤等多种 生理作用。缩醛磷脂酰胆碱( p l a s m a n y l c h o l i n e ，p l a s p c ) 属于p c 中的一类 较为特殊的分子种，是一族醚甘油酯，结构中甘油骨架s n 一1 位置上含顺一a ， 0 一不饱和醚( 0 一顺一q ，b 一烯醚键) ( v i n y le t h e rb o n d ) ，主要存在于某些动 物组织和单细胞生物中。它们是真核生物细胞膜的重要组分之，其含量因组 织细胞的特异性不同而有所不同。p l a s p c 具有诸如介导细胞的融合，参与离子 跨膜转运及胆固醇的运输，作为细胞第二信使的储存库等重要的生物学功能， 其抗氧化和抗癌作用已经越来越受到了人们广泛的关注。 我们实验室前期的研究表明，肝中催磷脂酰乙醇胺 ( p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ，p e ) 甲基化生成p c 的磷脂酰乙醇胺甲基转移酶 ( p e m t ) 过表达能显著抑制肝癌细胞的生长并诱发凋亡，提示肝源p c 可能具有 抑制细胞增殖的作用。为了进一步研究肝源性磷脂酰胆碱的生理作用，开发其 保健和医疗功效，本文重点研究了肝源性卵磷脂的工业化分离纯化方法和流程， 分析了肝源性卵磷脂及其特异的缩醛卵磷脂分子种的结构，探讨了其可能的生 物学功能。 首先，建立了氧化铝柱色谱分离肝脏p c 的简易方法。通过实验我们首次证 明，以9 5 乙醇洗脱巾1 5 m m 的a 1 。0 。色谱柱，可以实现肝脏磷腊诸多成分的分离， 尤其是肝源性p c 与p e 的完全分离，并且在初步优化的实验室放大工艺条件下也 达到了理想的分离效果，得到的p c 纯度达l f f j 9 0 以上，为p c 的工业化生产提供 了技术支持。 其次，利用m t t 法测定了1 2 5p - m o l l 、2 5t im o l l 、5 0pm o l lp c 及p l a s p c 对大鼠肝癌c b r h - 7 9 1 9 细胞增殖的影响并与人白血病k 5 6 2 细胞作了比较。结果表 明：( 1 ) 肝源p c 及p l a s p c 对大鼠肝q 音c b r h 一7 9 1 9 细胞的抑制作用明显高于k 5 6 2 细胞，并且存在时间剂量依赖关系；( 2 ) 由柱色谱获得的肝源p c 对癌细胞的增 殖抑制作用具有组织特异性，并且对特异癌细胞的增殖抑制存在时问剂量依赖 性。 第二三，建立了反相高效液相色谱法( r e v e r s e d p h a s eh i g hp e f f o r r r t a n c e l j q u i dc h r o f f l a t o g r a p h y ，r p h p l c ) 分离纯化肝源p c 分子种的有效方法。考察 了流动相中有机溶剂的种类、配比及流速对分离肝源性p c 的影响。研究发现， 摘要 在以甲醇为主的流动相中加入正己烷和醋酸铵有利于肝源性p c 分子种的分离； 甲醇一乙腈一水梯度洗脱不适于分离肝源性p c 分子种。结果表明，采用k r o m a s i1 c 1 8 色谱柱( 4 6 n n 2 0 0 r a m ，i d ，5 i i m ) ，以甲醇一正己烷一0 0 5 m o l l 醋酸 铵一甘油( 8 4 ：6 ：8 ：o 6 ，体积t t ) 为流动相，在流速1 o m l m i n 、检测波长2 0 6 n m 、 柱温3 5 的条件下，实现了肝源性p c 各组分的分离。所建立的方法灵敏，重复 性高，为进一步采用液质连用技术研究肝源性p c 不同分子种的结构奠定基础。 第四，根据h p l c 的分离结果，进一步对p l a s p c 的结构进行了鉴定。首先采 用上述分离系统运用标准品初步确定p l a s p c 的保留时间为1 9 1 l m i n ；然后收集 肝脏p l a s p c 进行红外检测；最后采用q u a t t r om i c r ot a n d e mm s m s 系统对 p l a s p c 进行e s i + 分析，结果表明：采用以下实验条件，毛细管电压：3 o o k v ， 锥孔电压：2 5 v ，离子源温度：1 2 0 。c ，脱溶剂气温度：3 5 0 c ，质量范围：1 0 0 1 0 0 0 m z ，光电倍增器电压：6 5 0 v ，锥孔气体流速：o 8 3l m i n ，溶解气体流速： 6 7 l m i n ，获得了p l a s - p c 准确的分子结构信息。结果提示，本实验分析的肝脏 p l a s p c 分子量为7 9 4 d a ，结构为s n l 一1 8 ：0 ( o - 烃基) ，s n 2 2 0 ：4 ( o _ 酰基) 。 结论： ( 1 ) 通过柱色谱法获得的肝源性磷脂酰胆碱，纯度可以达到9 0 9 6 以上； ( 2 ) 肝源性p c 能够显著抑制肝癌细胞的增殖； ( 3 ) 肝源性p c 的重要成份p l a s p c 的分子量为7 9 4 d a ，s n l 一1 8 ：0 ( o - 烃基) ， s n 2 2 0 ：4 ( o - 酰基) 。 关键词磷脂酰胆碱缩醛磷脂柱色谱分子结构生物活性 2 摘要 a b s t r a c t p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( p c ) i s a l s ok n o w na sl e c i t h i na n d 1 ， 2 - d i a c y l s n g l y c e r o 一3 p h o s p h o c h o l i n e m a n yr e s u l t sh a v eb e e np r o v e d t h a tp h o s p h a t i d y l c h o l i n ei sam a j o rc o n s t i t u e n to fc e l lm e m b r a n e sa n d a l s or e g a r d e da so n eo ft h em e t h y ld o n a t o r si nm e t a b o l i s m m o r e o v e r p h o s p h a t i d y l c h o l i n ew a si n v o l v e di nt h ep r o c e s so fm a i n t a i n i n gt h ec e l l n o r m a ls t r u c t u r ea n df u n c t i o n ，a l s o ，i tw a si n d e e dr e l a t e dw i t ht h ec e l l g r o w t h ，p r o l i f e r a t i o n ，d i f f e r e n t i a t i o n ，a n dc a r c i n o g e n e s i s i t sh y d r o l y z e d p r o d u c t sp a r t i c i p a t e i nt h ec e l l s i g n a l t r a n s d u c t i o na n dm e t a b o l i c m e d i a t i o nw i t hm a n yp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n sl i k ep r e v e n t i n gs e n e s c e n c e ， r e d u c i n gb l o o df a t ，k e e p i n gb r a i nh e a l t h y , a n dp r o t e c t i n ga g a i n s tl i v e r i n j u r y ，a n db e i n ga n t i c a n c e r p l a s m a n y l c h o l i n ea r eau n i q u es u b s e to f p h o s p h a t i d y l c h o l i n ei nw h i c ht h es n 一1c a r b o no ft h eg l y c e r o lb a c kb o n e c o n t a i n sav i n y le t h e r - l i n k e d ( ac sd o u b l eb o n da d j a c e n tt oa ne t h e rb o n d ) l o n gc h a i nh y d r o c a r b o ni n s t e a do ft h et y p i c a l e s t e r - l i n k e df a t t ya c i d p l a s m a n y l c h o l i n ea r ew i d e l yd i s t r i b u t e di nm a m m a l i a nt i s s u e sa n ds o m e m o n a d d i f f e r e n tt i s s u e sa n de v e nd i f f e r e n tc e l lt y p e so ft h es a m et i s s u e m a yh a v ev a r i a b l ea m o u n t o fp l a s m a n y l c h o l i n e t h e p h y s i o l o g i c a lr o l eo f p l a s m a n y l c h o l i n ei s n o tf u l l yu n d e r s t o o ds of a r i th a sb e e np o s t u l a t e d t h a tp l a s m a n y l c h o l i n ec a ns e r v ea se n d o g e n o u sa n t i o x i d a n t s ，s t o r a g e so f p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ( p u f a s ) ，l i p i d m e d i a t o r sa n di nt h e p r o c e s s i o no ff u n c t i o n so nm e m b r a n ed y n a m i c s i na d d i t i o n ，f o r t h e s y n t h e t i cp l a s m a n y l c h o l i n e ，t h e r ei ss e l e c t i v et o x i no nc a n c e rc e l l sw h i c h a t t r a c t sm o r ea n dm o r ea t t e n t i o n s o u re x p e r i m e n t sh a v eb e e np r o v e dt h a tp h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e n m e t h y l t r a n s f e r a s ew h i c hc a t a l y z e st h et r a n s f e ro fam e t h y lg r o u pf r o m s a d e n o s y l m e t h i o n i n e t ot h e p o l a r h e a d g r o u p o f p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n et of o r mp h o s p h a t i d y l c h o l i n ei n t h el i v e r ， m o r e o v e r , t h ea p o p t o s i sh a v eb e e nf o u n di nh e p a t o m ac e l l sd u r i n gp e m t o v e r - e x p r e s s i n g t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a tp h o s p h a t i d y l c h o l i n ef r o m s w i n el i v e rc o u l di n h i b i tc e l l p r o l i f e r a t i o n i no r d e rt oo p e no u tt h e f u n c t i o no f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ，t h e f l o wo ft h e s e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o nh a sb e e ns t u d i e do nt h ep o i n t i na d d i t i o n ，w ea l s od e t e c tt h e 3 摘要 n a t u r es t r u c t u r ea n ds p e c i a lf u n c t i o no fp l a s m a n y l c h o l i n ew h i c hb e l o n g e d t ol i v e rp h o s p h a t i d y l c h o l i n e f i r s t ，p h o s p h a t i d y l c h o l i n ei nc r u d ep h o s p h o l i p i d sf r o ms w i n el i v e r w a ss e p a r a t e da n dp u r i f i e db yu s i n ga 1 2 0 3c o l u m nc h r o m a t o g r a p h yw i t h 9 5 a l c o h o la se l u e n t t h ep u r i t yw a sd e t e r m i n e db vt h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y o ng f 2 5 4s i l i c a p l a t e a n dw i t h c h l o r o f o r m m e t h a n o l w a t e r ( 6 5 ：2 5 ：4 v v ) a sd e v e l o p i n ga g e n t m l e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep u r i t ya n dy i e l dr a t eo ft h ep c ，s e p a r a t e df r o m p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( p e ) c o m p l e t e l y ，r e a c h e dad e g r e eo fm o r e t h a n9 0 a n d8 0 r e s p e c t i v e l ye l u t e dw i t h2 2 5 m lo f9 5 a l c o h 0 1 a n d 8 7 6 a n d8 7 3 w i t hav o l u m eo f4 2 5 m 1 t h es e c o n d ，t h ee f f e c to ft h ep cw i t hd i f f e r e n tc u n c e n t r a t i o n ( 1 2 5 、 2 5 、5 叩m o l l ) o nt h ep r o l i f e r a t i o no fr a th e p a t o m ac e l ll i n e ( c b r h 一7 9 1 9 ) w a sd e t e r m i n e db ym i c r o c u l t u r et e t r a z o l i n m ( m ar ) a s s a y si nv i t r oa n d w a sc o m p a r e dw i t ht h a to fh u m a nl e u k e m i ac e l ll i n ek 5 6 2 r e s u l t s s h o w st h a tt h ep cd e r i v e df r o mt h el i v e ri n h i b i t e dt h eg r o w t ho f c b r h 7 9 1 9c e l ls i g n i f i c a n t l ya f t e r1 2 2 4a n d3 6h o u r st r e a t m e n to ft h e p c i ts u g g e s t e dt h a tp cd e r i v e df r o ma n i m a ll i v e rm i g h tf u n c t i o na s s p e c i f i ci n h i b i t o rf o rh e p a t o m ac e l l si nc o n c e n t r a t i o nd e p e n d e n tm a n n e r t h e t h i r d ， a ne f f e c t i v em e t h o df o rt h e s e p a r a t i o n o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n em o l e c u l e sf r o ms w i n el i v e rw a sd e v e l o p e du s i n gt h e r e v e r s e d p h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p h p l c ) t h ei n f l u e n c e so fo r g a n i cm o d i f i e r s ，t h ec o m p o s i t i o no fm o b i l ep h a s ea n d t h ef l o wr a t eo np cm o l e c u l e ss e p a r a t i o nw e r es t u d i e d i tw a sf o u n dt h a t t h es e p a r a t i o nc o u l db eb e n e f i t e dw i t ha d d i n gh e x a n ea n da m m o n i u m a c e t a t ei nm o b i l ep h a s ew h i c hc o n t a i n e dam a j o r i t yo fm e t h a n 0 1 i tw a s n o t a p p r o p r i a t e f o rt h e s e p a r a t i o n o fp cm o l e c u l e s u s i n g t h e m e t h a n 0 1 a c e t o n i t r i l e - w a t e rg r a d i e n te l u t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r p h p l cm e t h o df o rt h es e p a r a t i o no fp cm o l e c u l e so np r e p a r e d c o l u m n ( 4 6 m m x 2 0 0 m m ，i d ，5 “m ) w a se s t a b l i s h e dw i t hs i m p l i c i t ya n d g o o dr e p r o d u c i b i l i t y ，b yu s i n gm e t h a n o l h e x a n e - 0 0 5 m o l la m m o n i u m a c e t a t e g l y c e r o l ( 8 4 ：6 ：8 ：0 6 v v ) a sm o b i l ep h a s ea ta f l o wr a t eo f 1 0 m l m i na n d3 5 t h i sa l s oc a nl a yaf o u n d a t i o nf o rt h ea n a l y s i so fp c m o l e c u l e ss t r u c t u r e 4 摘要 t h el a s t ，q u a t t r om i c r ot a n d e mm a s ss p e c t r o m e t e r ( m i c r o m a s s ， w a t e r s ，u s a ) ，f i t t e d w i t ha ne l e c t r o s p r a yi o n s o u r c e o p e r a t e d a t a t m o s p h e r i cp r e s s u r e ，w a su s e df o r t h ei d e n t i f i c a t i o no fc o m p o n e n t s e l u t i n gf r o mt h ec o l u m n n i t r o g e nw a su s e da sn e b u l i z e rg a s ( 0 8 3 l m i n ) a n da sc u r t a i ng a s ( 6 7 l m i n ) t h ec a p i l l a r yv o l t a g ew a ss e tt o3 0k v a n dt h ec o n ev o l t a g et o2 5 v t h em a s ss p e c t r u mw a sf r o m1 0 0t o1 0 0 0 i nc o n c l u s i o n ，t h eh p l cm e t h o dd e s c r i b e dh e r es e p a r a t e saw i d ev a r i e t y o fm o l e c u l a rs p e c i e so fp ci na l li n t a c tf o r mu s i n gs o l v e n t st h a te n a b l e u v d e t e c t i o n f u r t h e r m o r e ，u n e q u i v o c a ls p e c i e si d e n t i f i c a t i o n ，i n c l u d i n g t h e a s s i g n m e n t o f a c y l c h a i np o s i t i o n ，c a nb ea c h i e v e d b yo n l i n e e l e c t r o s p r a ym s t h em e t h o d c a nb e a p p l i e d f o rt h ei s o l a t i o no f i n d i v i d u a lp cs p e c i e si no r d e rt od e t e c tt h e i rb i o l o g i c a la c t i v i t i e s a c c o r d i n g t ot h e m e t h o d ，t h e e x a c tm o l e c u l a r w e i g h t o f p l a s m a n y l c h o l i n e ( p l a s p c ) w a s7 9 4 d a ，a n d i t ss t r u c t u r ec o n t a i n e d s n l - 1 8 ：0 ( a c y lc h a i n ) ，s n 2 2 0 ：4 ( e t h e rc h a i n ) t h ec o n c l u s i o n s ： 1 t h ep u r i t yo ft h ep c ，s e p a r a t e df r o mp h o s p h a t i d ，7 l e t h a n o l a m i n e ( p e ) c o m p l e t e l y r e a c h e dad e g r e eo fm o r et h a n9 0 b yu s i n ga 1 2 0 3 c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y 2 p cd e r i v e df r o ma n i m a ll i v e rm i g h tf u n c t i o na ss p e c i f i ci n h i b i t o rf o r h e p a t o m ac e l l si nc o n c e n t r a t i o nd e p e n d e n tm a n n e r 3 t h ee x a c tm o l e c u l a rw e i g h to fp l a s m a n y l c h o l i n e ( p l a s - p c ) w a s 7 9 4 d a ，a n di t ss t r u c t u r ec o n t a i n e ds n l - 1 8 ：0 ( a c y lc h a i n ) ，s n 2 2 0 ：4 ( e t h e rc h a i n ) k e yw o r d s p h o s p h a t i d y l c h o l i n e p l a s m a n y l c h o l i n e c o l u m nc h r o m a t o g r a p h ym o l e c u l a rs t r u c t u r e b i o l o g i c a la c t i v i t y 5 附录 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论 文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表 过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论 文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日期：。沙7 f 、1 旷 ， 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅 和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：岔秒 指导教师签名： 同期： 肝源性磷脂酰胆碱的分离纯化及其生物学功能的研究 肝源性磷脂酰胆碱的分离纯化及其生物学功能的研究 研究生：王亮 指导教师：邹伟 学科专业：动物学 前言 2 1 世纪初始我国经济取得了极其迅速的发展，人民生活水平的大幅提高，促 使社会对天然保健品、天然表明活性剂以及日用化妆品的需求日益激增。磷脂酰 胆碱( 卵磷脂) 以无毒、易生物降解、无刺激，并且具有独特的生理功效而受到 国内外科技界和工业界的普遍重视，广泛应用于食品、化妆品、医药等领域。早 在7 0 年代，美国就把卵磷脂用于保健食品，总销量次于复合维生素和维生素e 而 名列第三。科学研究表明，卵磷脂参与细胞膜组成，改善脂类代谢；作为抗氧化 剂，延缓机体衰老；作为胆碱、花生四烯酸供应源，促进神经信号传导。此外， 卵磷脂在人体内还可水解为甘油、不饱和脂肪酸、胆碱和磷酸，其中的磷酸基团 是水溶性的，脂肪酸基团是脂溶性的，这两种基团使卵磷脂具有乳化性，从而可 以调节血脂，降低血胆固醇，预防心脑血管疾病；其中的胆碱，进入体内后与体 内的乙酰辅酶a 反应生成乙酰胆碱，而乙酰胆碱是重要的神经递质，当其含量增 加时，大脑活力也明显提高。因此，卵磷脂还具有健脑的功能，卵磷脂已经被认 定为功能因子明确的第三代保健食品。随着科学的不断发展，目前发现卵磷脂除 上述功能外还具有免疫调节及抗肿瘤等功能。相关研究正在展开。 目前研究应用的卵磷脂主要来源于大豆和蛋黄。根据前期的实验基础，我们 发现了肝源性卵磷脂独特的生物活性，为了更好的对其进行研究，本文建立了柱 色谱分离肝脏卵磷脂的简易方法，并初步优化了实验室放大的工艺条件。同时对 肝脏卵磷脂的缩醛分子种结构及其生物学功能进行了研究。为肝脏卵磷脂的开发 利用提供了实验依据和技术支持，也为肝癌的治疗提供了新的思路。 肝源性磷脂酰胆碱的分离纯化及其生物学功能的研究 第一章文献综述 1 9 世纪中期德国人g o b l e y 由卵黄中分离出含氮、磷的脂肪混合物，遂命名 为卵磷脂( l e c i t h i n ) 。1 9 9 6 年9 月在布鲁塞尔召开的第七届卵磷脂国际会议上， 医药学家和营养学专家们研讨证实，卵磷脂是一种功能性的健康食品，虽然不是 立即见效，但有着全面、长远、稳定的效果，同时又没有药物的副作用，而且在 增进健康及预防疾病方面起到了重要作用。 本章在对卵磷脂及其缩醛形式来源、分布以及结构、性质、功能简介的基础 上，综述了二者分析制备的方法及国内外研究的进展情况。 1 1 卵磷脂简介 1 1 1 卵磷脂的来源及分布 卵磷脂( 1 e c i t h i n ) 是生物界一类含磷的特殊脂类，l e c i t h i n 一词源于希腊 文“l e k i t h a s ”，系卵黄之意，但其在不同的领域中却代表不同的含义。在商业 贸易中，卵磷脂表示天然的极性与中性脂的混合物，磷脂酰胆碱 ( p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ，p c ) 作为其中的一种极性脂可占到2 0 9 6 9 0 9 6 ；在生化 研究中，卵磷脂专指表磷脂酰胆碱。由此，可将卵磷脂分为狭义和广义来理解。 本文所研究的卵磷脂( p c ) 即指代磷脂酰胆碱。 卵磷脂是一种天然的营养保健食品，其来源极为广泛，主要存在蛋黄、大豆、 动物体中，是细胞膜的主要组成部分。虽然卵磷脂在自然界中含量丰富，但来源 不同，含量上也有较大的差异。表1 1 列出了于本研究相关的几种重要来源的卵 磷脂含量。 表1 1 卵磷脂的含量 、 组分磷脂酰胆碱磷脂酰乙醇胺 来源 大豆 2 4 0 1 8 1 猪肝 4 2 0 9 62 2 o 蛋黄 7 2 7 1 1 0 牛脑 9 6 1 6 7 从上表可以看出，蛋黄卵磷脂的含量最高，猪肝次之，大豆居中，牛脑最少。 虽然蛋黄卵磷脂的含量比猪肝中卵磷脂的含量高，但就目i ； 的分离技术来看，还 2 肝源性磷脂酰胆碱的分离纯化及其生物学功能的研究 很难在工业上低成本获得高纯度的蛋黄卵磷脂。目前大豆卵磷脂的提纯技术相对 成熟，但从开发的角度来看：首先，大豆中卵磷脂的含量没有肝脏中卵磷脂的含 量高；其次，肝脏中存在特异的卵磷脂合成途径，含有植物源卵磷脂中所没有的 功能分子，这些就是我们选取猪肝脏中卵磷脂为研究对象的重要原因之一。所以 本文的研究重点就在于初步解决肝源性卵磷脂的工业化分离纯化流程，探讨肝脏 卵磷脂及其特异的缩醛卵磷脂分子种的生物学功能。 1 1 2 卵磷脂的结构 卵磷脂在广义上上包括磷脂酰胆碱( p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ，p c ) 、磷脂酰乙 醇( p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ，p e ) 、磷脂酰肌醇( p h o s p h o t i d y l i n o s i t o l ， p i ) 、磷脂酰丝氨酸( p h s p h a t i d y s e r i n e ，p s ) 、鞘磷脂( s p h i n g o m y e l i n ，s m ) 等。它们都是在s n 1 和s n 一2 位含有酰基，在s n - 3 位为一个极性基团的磷酸酯， 所以利用极性差异就可以实现各种磷脂组分的分离。实验表明，p e 几乎为非极 性，p c 为强极性，而p i 和p s 的极性介于两者之间。狭义的卵磷脂就是磷脂酰 胆碱，它不但维持生物膜正常的结构和功能，与细胞的生长、增殖、分化及癌变 密切相关，而且其降解产物还参与细胞的信号转导和代谢调控，具有防衰老、降 血脂、抗肿瘤、健脑、保肝等多种生理作用“。2 1 。其结构简式如下： o o ra n dr l = f a t t ya c i d sr c s i d u e s o 秒o 入n + 【c 嘞 l 1 一。 p c 分子中磷酸胆碱连接的碳位置不同会产生n 、b 两种异构体，连接在甘 油的s n l 位上称a 型，s n 一2 位上则为b 型。不同碳位上连接的脂肪酸也不尽相 同，s n 一1 位上连接的多是饱和脂肪酸，s n - 2 位上连接的常为亚油酸( 1 i n o l e i c ) 、 亚麻酸( 1 i n o l e n i c ) 、花生四烯酸( a r a c h i d o n i c ，a a ) 等不饱和脂肪酸。 1 1 3 卵磷脂的物化性质 纯的卵磷脂为白色蜡状固体，在低温下可结晶。暴露于空气中由于多不饱和 脂肪酸的过氧化作用，其颜色会逐渐变暗，一般为黄褐色。由于卵磷脂属于两亲 3 肝源性磷脂酰胆碱的分离纯化及其生物学功能的研究 脂质，是成膜分子，在水中能形成双份子层的微囊。卵磷脂易溶于大多数含少量 水的非极性溶剂，但难溶于丙酮，易溶于低碳醇和氯仿的混合物。 卵磷脂的化学性质主要表现在酯键、脂肪酸和磷酸胆碱( 即c h ：c h z n ( c b ) ，) 上，可发生水解、氧化、羟基化、氢化等反应。( 1 ) 水解：卵磷脂可以被酸、碱 作用而发生水解，不同的酯键水解得到各自不同的水解产物。( 2 ) 氧化：p c 中的 不饱和脂肪酸易与氧气发生自发的氧化反应，生成过氧化产物。( 3 ) 羟基化：在 乳酸等有机酸的作用下，卵磷脂与过氧化氢反应，使脂肪酸的不饱和键接上羟基。 ( 4 ) 氢化：在镍或钯等催化剂存在下，卵磷脂中不饱和脂肪酸可与氢气等发生加 成反应。( 5 ) 酶解：在生物体内，卵磷脂的酯键和磷酸二酯键还能被磷脂酶 ( p h o s p h 0 1 i p a s e ) 专一的水解。这些磷脂酶根据它们所水解的键分别被命名为 磷脂酶a 1 ，a 2 。c 和d ：磷脂酶a l 广泛存在于生物晃：磷脂酶a 2 主要存在于蛇毒， 蜂毒和哺乳类胰脏( 酶原形式) 之中；磷脂酶c 来源于细菌及其他生物组织；磷 脂酶d 存在于高等植物中。磷脂酶a l ，a 2 也被称为磷脂酶b ，它们分别选择性的水 解s n 一1 与s n 一2 位的脂酰基，生成的仅含一个脂肪酸链的产物称溶血卵磷脂 ( 1 y s o p h o s p h o g l y c e r i d e ) 。它是体内卵磷脂代谢的中问产物，但在细胞或组织 中含量很少，如果浓度过高，则将对细胞的膜系统造成伤害。溶血卵磷脂又是一 种很强的表面活性剂，能使细胞膜( 如，红细胞) 迅速溶解。菱背响尾蛇( c r o t a u s a s a m a n t e u s ) 和印度眼镜蛇( n a j an a j a ) 的蛇毒中含有较高浓度的磷脂酶a 2 ， 造成每年数千入丧命于此。 卵磷脂分子热稳定性可稳定维持至u 3 2 0 c 左右，分子键的最先断裂处位于磷 酰基。而p c 相变温度在5 2 。c ，1 0 0 以上即渐渐氧化变色直至分解，2 8 0 时生成 黑色沉淀。 1 1 4 卵磷脂的生理活性 ( 1 ) 参与细胞膜组成，改善脂类代谢。卵磷脂是构成生物膜的主要成分“，摄 取卵磷脂可改善膜磷脂组分，增加膜流动性和膜酶活性。膜磷脂的脂肪酸部分若 饱和脂肪酸过多，膜就会变硬，但p c 可将膜磷脂的饱和脂肪酸变为不饱和脂肪酸， 因此可以增加细胞膜流动性。另外p c 能促进脂蛋白合成、再生，保护细胞的线粒 体、微粒体膜免受损伤，防止使膜结构稳定化细胞变性并促迸恢复，防止细胞内 酶向细胞外逃逸，同时维持细胞内酶的活性，改善患病时引起的脂质代谢异常， 因而改善糖代谢、蛋白代谢等各种功能。 ( 2 ) 作为抗氧化剂，延缓机体衰老。卵磷脂的抗油脂氧化已应用于油脂生产 中。试验表明卵磷脂在油中含量大于0 2 f l l j 可明显提高菜籽油、葵花籽油、鱼油 等的抗氧化作用，而人造卵磷脂在铜、铁、锰等离子存在的情况下，抗氧化活性 4 肝源性磷脂酰胆碱的分离纯化及其生物学功能的研究 很高。正因为卵磷脂具有抗氧化功能，才能修复损伤的生物膜，延缓机体衰老。 据报道，随着年龄的增长，机体清除自由基的能力下降，过多自由基与游离或结 合状态的不饱和脂肪酸作用，使其以链式或链式支链反应的形式不断的形成脂质 过氧化物丙二醛( m d a ) ，m d a 是极为活泼的交联剂，迅速与磷脂酰乙醇胺交联成 荧光色素，然后与蛋白质、肽类、脂类结合形成板层状脂褐质，它可使细胞核、 细胞器受压变形，影响神经元的正常代谢传递功能。而卵磷脂对维持皮肤角质层 水分含量的稳定和抑制角质细胞脂褐质的形成均有明显的效果。 ( 3 ) 胆碱供应源。胆碱是广泛分布于动植物中的一类铰化合物，具有多种生 物学功能，是人体必需营养素，而卵磷脂中主要成分p c 作为有机胆碱吸收较为适 宜。据试验，摄取p cl h 后，血中胆碱浓度可为摄取前2 7 倍，经1 2h 后血中仍能 保持高浓度胆碱，因此摄取p c 可增高血中胆碱水平。 ( 4 ) 花生四烯酸供应源。从属于6 0 6 系列必需脂肪酸，与维护细胞膜生物学 功能密切相关，同时也是内因性细胞调节因子之前体，具有降低血清胆固醇、保 护肝脏、抑制癌细胞等功能。而某些卵磷脂含有一定量二十二碳六烯酸 ( d o c o s a h e x a e n o i ca c i d ，d h a ：2 2 ：6n 一3 ) 。等不饱和脂肪酸，因此可为肝病患者、 婴幼儿等提供所需的花生四烯酸。 ( 5 ) 促进神经传导，提高大脑活力。食物中的卵磷脂经消化释放出的胆碱，在 胆碱乙酰转移酶作用下与乙酰c o a 反应生成乙酰胆碱，乙酰胆碱含量增加可促进 大脑神经突触迅速发达，从而使大脑中神经细胞间信息传递速度加快，提高记忆 力和学习能力。此外卵磷脂还可治疗各种神经官能症，有助于癫痫和痴呆等病症 的康复。 除上述功能外，卵磷脂还具有免疫调节及抗肿瘤等功能。 1 1 5 卵磷脂的应用与国内外研究进展 1 1 5 1 卵磷脂的实际应用 卵磷脂具有较好的乳化活性，被广泛的应用于食品、医疗、化工、农业、轻 工业等领域。如在医药行业中作为静脉注射乳化剂和脂质体，占医药需求的8 0 下面简要介绍卵磷脂的实际应用。 ( 1 ) 表面活性剂：卵磷脂作为一种天然的两性表面活性剂其结构就已经 决定了它的特点和性质。它无味，无毒，无刺激性，兼有优良的多 价螫合性能和乳化性能，同时能与任何种类的表面活性剂相匹配并 具有明显的增效作用。这些优点无疑使卵磷脂近几年的开发与应用 取得了长足的进步，在国外，其新型产品不断问世。主要表现在医 药卫生业，食品业，化妆品等轻工业领域。 5 肝源性磷脂酰胆碱的分离纯化及其生物学功能的研究 ( 2 ) 保健食品：目前，卵磷脂已经被公认为是保健功能明确的第三代保 健品。 ( 3 ) 临床药品：磷脂中p c 是构成肝细胞膜的主要成分，具有恢复受损肝 细胞的作用并可促进脂蛋白的形成，加速脂肪的转运，防止胆固醇 在肝中的沉积，同时提高肝内酯酰转移酶的活性，防止脂肪肝与肝 硬化。目前，p c 已被临床上用于治疗急性或慢性肝炎、肝中毒、肝 硬化、高脂蛋白血症、动脉粥样硬化、冠脉、脑或周围循环受损、 狭心症、心绞痛以及血管疾病等。 1 1 5 2 卵磷脂的研究进展 据统计，在美国化学文摘( c a ) 所列有的有关磷脂的专题文献：1 9 7 2 1 9 8 6 年是其研究最为活跃的时期，供发表文章1 0 0 0 0 多篇，其中生物学研究找7 0 ，5 ， 分析方法占3 5 ，制备研究