（农药学专业论文）苦参杀虫活性物质及组织培养研究.pdf

沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 本论文针对目前苦参的研究现状，对苦参进行了系统、全面的研究， 成功地从苦参中提取出了苦参总碱，并用阳离子交换树脂进行了分离、纯 化，通过正交设计得到最佳的上柱工艺条件和洗脱工艺条件，获得了纯度 达8 5 4 8 的苦参总碱，离子交换工艺具有得率高，成本低，操作简便的 特点，适用于工业生产，本试验为未来的离子交换设备放大提供了理论依 据。同时进行了苦参愈伤组织和丛生芽的诱导，检测到愈伤组织和丛生芽 中均含有氧化苦参碱。本研究目前已取得了一定的成果。 1 通过比较不同地区、不同季节、不同部位的苦参中苦参总碱含量的 多少，确定了辽宁省铁岭市西丰县松树村秋季采的苦参根中苦参总碱含量 最高，为下一步的提取工作提供了选择试材的依据。从原料条件、提取条 件和操作条件等3 个方面研究了影响苦参总碱提取效果的各个因素。确定 了苦参根中生物碱最佳提取工艺方法：提取剂浓度0 1 2 m o l l ，每次提取 溶剂用量1 2 m l g ；二次提取，一次提取时间1 9 h ，二次提取时间8 h ；提 取温度4 0 c ，苦参根粉的粉碎度8 0 目。苦参根中生物碱盐酸提取液经薄 层层析分析可知，其生物碱组成以氧化苦参碱和苦参碱为主。同时对使用 最佳提取工艺提得的苦参总碱进行了系虫试验，结果表明：5 0 0 r l g l 的苦 参碱药液杀虫效果最好，其持效期达7 d 之久。 2 首次系统地进行了苦参总碱离子交换工艺的研究。利用静态吸附 法，吸附、分离生物碱提取液，筛选出较适于苦参生物碱吸附的离子交换 树脂一7 3 2 阳离子树脂；分别考察了p h 、温度对离子交换平衡吸附量的 影响，发现p h 小于1 的离子交换树脂对生物碱吸附最有利；温度高于3 0 有利于生物碱的吸附；考察了不同工艺条件( 提取液p h 、固波接触时 间、温度) 对固定床离子交换效果的影响；通过正交设计，得到了最佳离 子交换工艺：上柱液p h0 8 ，上柱温度3 5 c ，流速1 5 b v h ；考察了固定 床洗脱工艺条件、洗脱助溶剂对洗脱效果的影响，发现顺流洗脱效果明显 优于逆流洗脱，洗脱助溶剂浓度为2 0 时洗脱最佳；洗脱最佳工艺条件： 洗脱剂浓度0 3 m o l l ，洗脱流速o 5 b v h 。采用以上工艺条件，进行固定 床单柱操作试验，得出从提取液中分离、纯化生物碱的收率可达9 2 4 。 阳离子交换树脂吸附后的生物碱提取液经薄层层析分析，其中的成分未发 摘要 生变化，仍以苦参碱和氧化苦参碱为主；经g c 分析，两者的丰度值达 8 5 ，4 8 。 3 首次进行了黑暗对苦参愈伤组织诱导影响的研究和苦参丛生芽诱 导的研究，发现黑暗利于苦参愈伤组织的积累。以苦参种子幼胚、幼叶和 嫩茎为外殖体诱导愈伤组织，发现3 者在合适的培养基上均能诱导出愈伤 组织。以嫩茎为外殖体诱导愈伤组织，试材培养容易、诱导率高、出愈早， 是诱导苦参愈伤组织的最佳选择。通过培养基筛选试验，得到幼叶生长的 最适培养基：m s + 2 4 d2 m g l + 6 一b a4 m e d l ；种子幼胚的最适培养基： m s + 2 ，4 dl m l + 6 b a2 m g l ；嫩茎的最适培养基：m s + 2 ，4 - d 0 4 m g l + 6 b a 0 8 m g l ：最适愈伤组织诱导的培养条件为2 4 - 2 6 ，p h 5 8 ， 3 4 蔗糖。通过对丛生芽的诱导，发现嫩茎易诱导出丛生芽，嫩茎诱导 丛生芽的最适培养基是m s + i b a0 1 m g l + 6 b a3 m e d l 。以嫩茎为外殖体 诱导的愈伤组织和丛生芽中均检测到了氧化苦参碱，其含量分别是 o 0 3 4 1 和o 0 4 7 3 ，丛生芽中氧化苦参碱的含量高于愈伤组织中氧化苦 参碱的含量。 关键词：苦参；苦参碱；氧化苦参碱：提取工艺；离子交换；组织培养 沈阳农业大学硕士学位论文 月u舌 苦参( s o p h o r a f l a v e s c e n t s a i t ) 是常用的中草药，用于治疗急慢性痢疾、 肠炎及各种腹泻、肺心病、支气管哮喘等疾病，在农业上也有广泛的用途， 对多种害虫和病菌有抑制作用。苦参的有效成分中研究较为成熟的是生物 碱，主要为喹诺西啶( q u i n o l i z i d i n ) 类生物碱，极少数为双哌啶( d i p i p e r i d i n e ) 类生物碱，共2 7 种：主要有苦参碱( m a t r i n e ) 、氧化苦参碱( o x y m a t r i n e ) 、 槐果碱( s o p h o c a r p i n e ) 、氧化槐果碱( o x y s o p h o c a r p i n e ) 和野靛碱等，是 使用范围广泛、市场需求量较大的畅销天然提取物。目前市场价格：苦参 总碱为每吨3 5 万元，苦参碱为每吨6 4 万元，氧化苦参碱为每吨9 0 万元， 野靛碱为每吨6 0 0 万元，并且苦参碱、野靛碱已经出口外销。 目前国内对苦参资源的开发利用工作，尚处于粗放开发阶段，多数以 有机溶剂法提取苦参生物碱的方式进行，不仅原料的价格昂贵，而且使用 有机溶剂污染环境、损害人体健康。苦参生物碱主要集中在根和种子中( 周 维仁等，2 0 0 1 ) ，其中种子中的生物碱含量最高，其次是根部，根中的生 物碱和种子中的生物碱含量相差较小，与茎、叶中的生物碱含量差别较大； 考虑到原料来源的难易，认为苦参根是很好的生物碱提取源。因此有的放 矢地设计生物碱提取工艺，不仅可以提高苦参的利用价值。还利于简化工 艺流程，降低生产成本：同时本文的研究结果也为开发同类的农药产品提 供了一些理论依据。 组织培养技术近年来在植物源农药研究领域得到了广泛的应用，不仅 可以克服植物源农药资源有限且无法人工合成的缺点，开发了植物源农药 的新途径，而且可以通过组织培养诱导出比植物体本身含量更高的次生代 谢物。本论文以苦参为研究对象，对苦参愈伤组织和从生芽进行了诱导， 获得了愈伤组织和丛生芽的最佳培养基配方，并发现苦参的绿色愈伤组织 和丛生芽中均含有氧化苦参碱，含量分别是0 0 3 4 1 和0 0 4 7 3 ，这在国 内外尚属首次，为苦参的组织培养生产苦参生物碱进行了有益的探索。 第一章苦参杀虫生物活性物质及组织培养生产植物次生代谢物研究进展 第一章苦参杀虫生物活性物质及组织培养 生产植物次生代谢物研究进展 苦参( s o p h o r af l a v e s c e n t sa i t ) 为豆科槐属落叶灌木。英文名称 l i g h i y e l l o ws o p h o r ar o o t 又称苦骨、苦槐、水槐、地槐、野槐、白茎、虎麻、 禄白、陵郎、川参等。苦参喜温暖的气候，耐干旱，偏碱性土壤( 张牢牢等， 1 9 9 7 ) ：生长在山坡平原向阳的草丛和灌木林中；对土壤条件要求不严格， 在平坝、丘陵、低山区都可种植( 王宝律，1 9 9 9 ) ，但以土层深厚、肥沃、 排水良好的砂质土和粘质土为佳。主产山西、河南、河北等省，全国各地均 有分布。苦参的根粉提取物用于防治蔬菜害虫在我国已有相当长的历史。据 记载苦参具有清热、除湿、杀虫、消炎、抗癌、生白细胞、平喘、及抗心律 不齐等功能，常用于治疗急慢性痢疾、肠炎及各种腹泻、肺心病、支气管哮 喘、心律失常及烧烫伤等。苦参还有广泛的用途：对多种农业病虫害有抑制 作用：近年来苦参用于卫生用品，如含苦参等8 种中草药的具有杀菌无副作 用的卫生纸，含苦参等1 4 种中草药具有预防皮肤病功效的香皂；含苦参的 可预防粉刺和可增白的化妆品；同时苦参可以治各种牲畜病害( 吴周水， 2 0 0 1 ) ，也是畜牧业生产中绿色饲料的首选添加剂( 吴毕元，2 0 0 1 ) 。 第一节苦参生物活性物质研究进展 一、苦参杀虫植物研究的简况 在远古时代，人们就知道利用苦参碱来防治害虫。早在公元5 世纪的早 期，古地中海两岸的居民即利用其提取物防止害虫对作物幼芽的危害( s m i t h 等，1 9 2 5 ) 。明朝万历2 4 年( 1 5 9 6 ) 李时珍编写的本草纲目中就记述了 1 8 9 2 种药物，其中具有防治害虫作用的植物就有苦参。上世纪4 0 年代，赵 善欢等便开始了苦参在农业应用的调查研究，报道了苦参对黑足守瓜 叫u l a c o p h o r an i g r i p e n n i s ) 和黄足守瓜似t e m o r a l i s ) 有毒杀作用。上世纪6 0 年 代之后，由于有机合成农药的广泛应用，关于苦参在农业害虫上应用的报道 甚少。上世纪8 0 年代以来，由于有机农药应用中出现的问题。人们又重新 将目光投向了天然源的研究与开发。a b d e l ( 1 9 8 7 ) 从西伯利亚的苦参根中分离 沈阳农业大学硕士学位论文 出生物碱s o f r a n o l ( 羟基苦参碱) ，并发现s o f r a n o l 有镇定、催眠、抗惊厥活性， 无止痛作用。s o p h o r ag r i f f i t h i i 对叶芽的水抽物具有助消化、利尿、退热、止 痛作用和杀虫活性，a t t a u r - r a h m a n ( 2 0 0 0 ) 分离得到一种新的喹啉联叮类 羽扁豆碱s o p h a z i n e 。1 9 8 9 ，1 9 9 1 年k a z u h i k am a t s u d a 报道了苦参甲醇提取 物的杀松毛才线虫( b u r s p h e l e n c h u sx y l o p h i l u s ) 活性的研究，经生物追踪分离 鉴定，认为槐果碱的杀线虫活性最强。k w o n ，0 k ( 1 9 9 4 ) 等研究多种野生 植物提取物对褐飞虱( n i l a p a r v a t al u g e n s ) 的杀虫活性后发现：苦参叶提取物 有良好的杀虫活性，通过分离鉴定，其活性成分为苦参碱。从苦参中分离并 鉴定的黄酮类化合物将苦参酮、苦参酮、苦参醇、5 0 甲基苦参醇c - 、高 丽槐素对茄属丝核菌、禾生腐霉、瓜果腐霉等草坪致病菌有一定的抑制作用， 在这些黄酮类化合物中苦参酮的活性最高。近十年来，我国对苦参杀虫剂的 研究取得重大进展。在我国苦参碱于1 9 9 3 年登记生产后发展平移，并形成 多家专业性生产企业，成功开发了许多苦参碱制剂( 见下表1 1 ) 至今年一 年度全国已有1 2 个省、区、市，2 8 家企业，登记产品3 1 个，其中单剂1 9 个，复配制剂1 2 个。单剂有效含量从0 2 至1 1 ，共有8 种规格，并有水 剂、乳油、可湿性粉剂、粉剂四种剂型，主要登记在瓜果、蔬菜上。以苦参 碱为主要原料开发的植物农药，丰富和优化了生物农药的品种和性能，使我 国生物农药的发展上了一个新的台阶，对打破“绿色壁垒”有重要的意义。 二、苦参生物碱的杀虫效果 据中国土农药杂志) 报道苦参防治农业害虫对象非常广，对橄榄蚜、 棉蚜、红蜘蛛、棉叶跳虫、菜青虫、烟青虫、猿叶虫、桑蟥、野蚕、二化螟、 稻飞虱、黏虫、叶蝉、蛴螬、蝼蛄、地老虎、蚱蜢、软体害虫，各种毛虫等 农业害虫，以及蚊子、家蝇、老鼠等卫生害虫都有效。从1 9 9 5 年至今，在 京、津、晋、冀、豫、辽、黑、浙、闽、粤等十二个省市，经农业科研、高 等院校和推广部门对2 0 多种害虫进行小区和大田试验示范，以及室内毒力 测定均表现很好的杀虫效果，认为是一种高效、广谱的杀虫剂，在不同地区 对蔬菜、果树、菜叶、小麦、水稻、等作物的害虫有良好的防治效果。苦参 碱每公顷用药量大约在3 - 3 0 9 之间。 第一章苦参杀虫生物活性物质及组织培养生产植物次生代谢物研究进展 表卜l 国内登记的苦参碱制剂 t a b 1 1m a t r i n ep r o d u c ta sp e s t i c i d ei nc h i n a 6 沈阳农业大学硕士学位论文 试验证明：o 6 苦参碱呐酯水剂对蚜虫的毒力是氧化乐果的2 5 2 6 1 倍 ( 2 4 h ，以下同) ，对粘虫的毒力是甲基1 6 0 5 乳油的3 6 9 8 倍，对菜青虫的毒 力分别是氰戊菊酯、高渗氰戊菊酯的2 7 6 l 倍和1 2 ，1 8 倍，对棉铃虫的毒力 是辛硫磷的4 1 5 3 倍，对小菜蛾的毒力是敌杀死的6 5 5 倍。3 2 苦参碱氰戊 菊酯乳油对粘虫共毒系数是2 7 0 9 4 ，对棉蚜、菜蚜、苹果蚜、茶尺蠖等药效 良好，该药剂稀释1 0 0 0 倍，防治蚜虫2 4 h 效果达1 0 0 。o 3 6 苦参碱水剂 对桃蚜、萝l 蚜的毒力是氧化乐果的2 3 1 4 倍，对菜青虫的毒力是氰戊菊酯 乳油的2 7 2 倍，是一种高效、广谱杀虫剂( 郑永权，2 0 0 2 ) 。苦参碱若与速效 性农药混用，能显著提高药效。例如用3 2 虫杀净乳油( 苦参氯氰菊酯混 配) 3 0 4 0 m l ，加水5 0 。7 0 l 稀释成1 5 0 0 2 0 0 0 倍，对茶树植株均匀喷雾能有 效杀灭茶树的主要害虫一茶尺蠖( 曾明森等，2 0 0 2 ；l i u g u o h u a 等，2 0 0 1 ) 。 黑龙江省平山林业制药厂经过多年的筛选试验，筛选出来一种既适合做烟雾 剂助剂，又具有环保性能的高效杀虫剂一苦参烟碱烟剂产品( 李贵名等， 2 0 0 2 ) ，该产品的成功开发，可以有效防治森林病虫害，是森林病虫害防治 的一大飞跃。 三、苦参的化学成分及其在植株中的分布 苦参含有多种生物碱和黄酮类化舍物，还有烷基色原酮、醌类、三萜皂 甙、脂肪酸和挥发油等成分。 ( 一) 生物碱 生物碱是含氧态氢原子的存在于生物有机体的环状化合物。 苦参中的生物碱主要为喹诺西啶( q u i n o l i z i d i n ) 类生物碱，极少数为双哌 啶( d i p i p e r i d i n e - t y p e ) 类生物碱，共2 7 种生物碱。主要有苦参碱、氧化苦参碱、 羟基苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱等。其中以苦参碱( c 3 h 2 4 n 2 0 ) 、氧化苦 参碱( c 1 3h 2 4 n 2 0 2 ) ( 崔九成，1 9 9 7 ；赵玉英等。1 9 9 1 ；赵玉英等，1 9 9 4 ： o h m i y a 等1 9 7 8 ) 为主。 ( 二) 黄酮类 从苦参根中分离出的黄酮类化合物已有3 4 种，有二氢黄酮、二氢黄酮 醇、高丽槐素、降苦参酮、已苦参酮，其中以二氢黄酮和二氢黄酮醇为主 ( a b d e l b a k i 等，1 9 8 0 ：张俊华等，2 0 0 0 ) 。 第一章苦参杀虫生物活性物质及组织培养生产植物次生代谢物研究进展 ( 三) 脂肪酸和挥发油 从苦参中已鉴定出2 0 种脂肪酸成分，主要为不饱和脂肪酸，其含量占脂 肪酸总量的7 2 7 9 ，其中亚油酸相对含量4 8 9 5 ，苦参挥发油已鉴定出4 7 个成分( 王秀坤等，1 9 9 4 ) 。 苦参的化学成分较多，其中起杀虫作用的主要是苦参碱和氧化苦参碱。 苦参中苦参总碱的含量大约是0 1 3 o 0 6 ( k i m j u s u n 等，2 0 0 0 ) 而 苦参碱和氧化苦参碱占总碱含量的7 8 左右( r u b e n g a r c i a m 等，1 9 9 5 ) 。 d e v a n d 等( 2 0 0 3 ) 发现苦参碱和氧化苦参碱在2 0 种植物中的分布情况是： 种子) 根) 叶) 茎。 四、苦参研究中存在的问题和不足 ( 一) 速效性差 苦参作为一种植物源农药，因其具有作用效果缓慢，速效性差的缺点， 不易被农民接受；而且这一缺点限制了它的应用范围，不能用于害虫k 发生 的作物、蔬菜、果树上。这也是生物农药无法与化学农药相比的。如果将苦 参与化学农药混配，即可达到既减少合成化合物的用量，又能提高防治效果 的目的，同时又延长了化学农药的寿命，所以应该加强苦参的混配研究。 ( 二) 生物活性以及生物活性与结构的关系值得进一步探讨 苦参是多家企业生产苦参碱使用的原料，化学成分比较复杂，含有苦参 碱型、金雀花碱型、无叶羽扁豆碱和羽扁豆碱型四大类型2 7 种生物碱。但 在农业应用上，大多只停留在苦参碱的粗提物直接作用于病虫害，对苦参碱 的生物活性成分研究的甚少。它们的活性如何? 何种生物碱是主要的农药活 性成分? 若以总碱含量来表示其活性成分是否妥当? 这些都是有待进一步 解决的问题，从化学成分上去研究苦参碱的生物活性以及结构与生物活性的 关系，为苦参碱有效成分的化学合成及结构改造提供理论依据。不同产地的 苦参和不同时期采收的苦参其活性成分有无变化，也值得重视。 ( 三) 杀虫机制有待深入研究 前己所述，苦参具有高效、广谱的杀虫特点。苦参碱对多种蔬菜害虫都 沈阳农业大学硕士学位论文 有很高的毒力，其毒力是一般化学农药的几倍至几十倍。苦参杀虫的主要作 用方式是胃毒和触杀。但对其作用位点、作用机制没有深入研究，目前还不 太清楚，仅是推测而已。而苦参的作用机制是利用苦参杀虫活性成分创制新 农药的一个关键。所以昆虫学家应该对苦参的杀虫作用机制进行一下深入研 究，为化学家刨制新农药奠定基础。 ( 四) 资源问题 苦参作为一种植物资源有着广泛的用途。它不仅可以用作医药、农药， 还可用作兽药，饲料等多个方面，每年苦参的市场需求量在几十万至几百万 吨。苦参的有效成分，作为一种次生代谢产物，其含量很低，且大部分集中 在根上。我们要开发利用这些有效成分，必须大量采挖其地下部分，势必造 成资源短缺。而且苦参的生产还受到产地的限制。因此，野生的苦参往往在 质量和数量上难以满足企业用作生产原料的要求。而人工种植栽培苦参不仅 周期长，对环境条件要求苛刻。所以苦参的组织培养显得非常重要，但在这 方面的研究未曾见有人报道。 五、苦参的开发利用前景 ( 一) 新农药开发创制的先导化合物 众所周知，目前国际上杀虫剂的三大支柱中有两大支柱是从天然植物杀 虫活性物质中找到先导化合物，并以此为模板，经化学模拟创制的。陈万义 ( 2 0 0 2 ) 认为：有4 0 种拟除虫菊酯杀虫荆是以除虫菊酯为模板合成的，6 种新烟碱类似物以烟碱为先导物创制的。以植物源活性成分为先导物不仅可 以研发出一系列类似物，而且它们的活性可以优于先导物，并能克服先导物 某些理化性质的不足，扩大了应用范围。例如多种拟除虫菊酯杀虫剂的活性 超过了除虫菊素，而且克服了先导化合物除虫菊素对光的不稳定性，可广泛 地应用于农作物上。对于苦参的化学成分，我国学者已从中分离得到7 0 多 个天然产物，对害虫表现出不同程度的活性。从苦参中选取活性最佳天然化 合物或毒性基因，作为新农药的先导化合物，也不失为一个有希望的途径。 ( 二) 害虫不易产生抗药性 化学合成的杀虫剂原药，有效成分大多在5 0 以上有些甚至达9 0 ， 9 第一苹苦参杀虫生物活性物质及组织培养生产植物次生代谢物研究进展 有效成分单一，大多数常规化学农药仅作用于害虫的某一生理系统的一个或 少数几个靶标，昆虫在极短的时间内就能找到破译的密码而遗传给下一代， 从而产生了对化学药物的抗性。据不完全统计，国外已有5 0 0 多种害虫产生 抗药性，国内已发现5 0 多种害虫产生抗药性，如赵家勇等( 2 0 0 2 ) 发现小 菜蛾对溴氰菊酯抗性已增至3 倍，菜蚜对杀蚜特效的抗蚜威抗性高达6 0 0 倍。 而植物源农药是几千年来植物与昆虫协同进化中产生的，是自然界长期选择 的结果，且杀虫制剂活性成分复杂，能够作用于昆虫的多个器官，昆虫无法 找出破译的密码，不易对其产生抗药性。 ( 三) 很好的环境相容- 性 有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂含有磷或氮元素，在长期大量的使用之 后，它们和化肥一起导致了河流和湖泊中营养元素的富集，导致水体中藻类 和其它一些水生植物大量迅猛地疯长，甚至覆盖整个水面，水生植物消耗水 体中大量的氧气，使众多水生动物窒息而亡，从而极大的影响水体生态平衡。 而使用苦参植物性杀虫剂，就可避免这种影响。苦参和害虫都是自然界本身 存在的物质，而不是向自然界投放的新化合物，它们会在环境中自然的代谫 ， 参与能量和物质循环。因此，不会发生药害、污染环境的现象，也不会对人 类健康造成隐患，有利于生产绿色食品改善生态环境，特别适用于蔬菜、茶 叶、中草药、花卉生产以及城市绿化防治病虫害。 ( 四) 药效平稳，持效期长 白滨等( 2 0 0 3 ) 经苦参碱农药的大田试验验证：第一天较差，第三天 后好转，七天后最好，防效期最长，这时的效果与化学农药的杀虫效果是一 样的，使害虫的整体虫口明显减退，防效期长。 ( 五) 增产 苦参碱是植物体苦参本身的一种化学成分，有像植物内源激素( a b a ) 的 相似作用，对农作物有刺激生长的作用，也有抑制真菌的作用。赵忠仁等( 1 9 8 8 ) 发现苦参碱能促进小麦早期有效分蘖，苗全苗壮，叶色深绿，次生根较多， 根系发达，具有防病虫增产的作用。， ( 六) 苦参与其它中草药配伍，可用于防治多种害虫 沈阳农业大学硕士学位论文 兰风等( 2 0 0 2 ) 以苦参为主要成分和其他中草药配伍制成水剂和粉剂。 水剂方剂组成如下：苦参、独角莲、草马、天南星、南蛇藤、滕黄、仙鹤草、 地榆、皂角、阿魏、黄花烟草，可防治多种农作物的害虫，如蚜虫、菜青虫、 红蜘蛛、及棉铃虫等。粉剂方剂组成如下：苦参、独角莲、草马、天南星、 南蛇藤、滕黄、仙鹤草、地域、皂角、阿魏、黄花烟草。粉剂主要用于拌种 和土壤、地面处理，可防治地下害虫，如地老虎、蛴螬、蝼蛄等。 ( 七) 苦参的综合利用 苦参的根、种子、茎和叶是天然杀虫剂，又是重要的中草药资源。苦参 除广泛应用于人药外，历来亦为兽医名药，有“人吃人参，牛吃苦参”之说。 因苦参茎叶中含有樨草素一7 葡萄糖苷，是一种较好的野革饲料。成为畜牧 业生产中绿色饲料的添加剂首选。苦参还可治各种牲畜病害，近年来苦参用 于卫生用品以及含苦参等多种植物提取物可治疗脚臭的药业等均已申请了 专利。 同时由于苦参的沙生特异性和深入沙地肥厚长根的吸水性和蓄水性，使 其充分发挥着固沙、抗风、保持水土、改良土壤、恢复植被、绿化荒原的作 用( 白永盛，2 0 0 2 ) 。 苦参是一种重要的中草药。但是苦参事业远不止搞单一，两种药品，应 全面开发，开发苦参系列制品。以苦参为主，与其他中草药配伍的各类杀虫 剂，继承和发扬祖国医药之精华，具有高效、低毒、安全的性能，正受到政 府、科研单位的高度重视。国家科委1 9 9 5 年正式批准将苦参碱、苦参素的 科研开发，列为“十五国家级火炬计划，正式下发文件实施。积极开发研制 苦参碱，到目前产量达5 0 0 多吨，1 9 9 9 年一2 0 0 0 年全国农药市场总需求为 2 5 万吨一3 0 万吨。随着我国绿色农产品的出口需要和绿色种植基地的快速 发展，国家石化局规划司要求，对农业行业实行战略调整，淘汰一批毒性高、 污染大的有机磷品种，增加杀菌剂、除草荆以及高效、低毒、低残留农药， 以增加生物农药的比重，这些均为开发以苦参碱为主的新型农药提供了机遇 和广阔的市场空间。而且以苦参为主要原料制造植物农药，投资较少，工艺 技术比较简单，投入产出比高，产品本身也是农药发展的方向，只要能保证 原料来源，一般小型化工企业或乡镇企业都可以上。 苦参素也是一项方兴未艾的事业，也是一项富有诱惑力和吸引力的事 第一章苦参杀虫生物活性物质及组织士音养生产植物次生代谢物研究进展 业，国际国内许多有远见、有实力的企业集团，都垂青于这项具有广阔前景 的事业，共同致力于这项造福人类健康的“绿色工程”。 第二节植物次生代谢物及其组织培养 一、植物次生代谢物及其抗病虫作用 全球植物种类不下3 0 万$ 十( b e n n e r 等1 9 9 3 ) ，据中国有毒植物一书 中列入的经鉴定的有毒植物有1 3 0 0 余种，其中很多被作为植物性农药使用。 中国土农药杂志记载分布在8 6 个科中的2 2 0 种植物性农药( 刘刚毅， 2 0 0 0 ) 。植物是天然化合物的宝库，在它们的组织中包含着数以万计的化合物。 植物体的活性成分根据其来源可分为两类。第一类是植物本身具有的生化物 质。仞j 如：植物精油、脂肪酸、碳氮化合物等等，这些成分往往集中在种子 和果实等储存器官中，是人类食物的主要来源，有些也是重要的工业原料； 第二类是植物的次生代谢产物，这类物质是植物抵抗和适应逆境的产物。次 生代谢物包括许多种类的小分子化合物，它们是由初生代谢产物经过一些独 特的代谢途径而派生出来的。大多数已知的次生代谢物来源于植物，现在发 现细菌、真菌和水生动物也存在许多次生代谢物。根据s w a n ( 1 9 7 7 ) 的统计， 植物中的次生代谢物已超过4 0 万种，约有1 万种己鉴定了分子结构。次生 代谢物种类繁多，结构各异，主要包括酚类、黄酮类、香豆素类、木质素、 生物碱、有机酸、糖苷、萜类、皂苷和多种炔类等。每类的化合物都有数 百种乃至数千种。 次生代谢物的结构多种多样，在植物体内的分布有时间和空间的差异， 在植物生长过程的各个阶段，次生代谢物的种类和数量是不同的，如一些物 质在种子中含量很高，然而种子萌发后或苗期就不存在了，甚至在某些情况 下，植物体内次生代谢物在1 h 内就会发生变化，次生代谢物可能随着气候、 捕食者等的改变而改变，但次生代谢物的分泌以及变化都是由基因控制的。 次生代谢物在植物体内所行使的生理功能虽并不十分清楚。一度认为它们是 植物在进行各种代谢的途径中所形成的废弃物质。随着科学的发展，人1 i 】逐 渐认识到次生代谢物是植物长期进化的产物，虽然不是植物有机体的最主要 成分，但是在保持植物抗逆性、抗病性和抗虫性以及担当信号分子方面起着 重要作用。 1 2 沈阳农业大学硕十学位论文 ( 一) 植物次生代谢物抗病作用 几乎各类次生代谢物中都有对植物病菌起作用的物质，它们具有多种防 治植物病菌的作用。 各种植物无时无刻不暴露在病菌中，但由于植物自身产生的次生代谢物 的保护作用，使病菌很难在植物表面增殖到可以侵入植物体内的数量，一旦 侵入植物体，植物体就会产生起到防御作用的次生代谢物。 1 植物先天具有的次生代谢物 一些植物分泌一些酚类和酸类物质到植物表面，这些物质对病菌具有抑 制作用。如洋葱表面的原儿茶酚和儿茶酚能抑制洋葱污霉菌病菌分生孢子的 萌发，引起分生孢子破裂。 幼嫩的果实和叶片中存在有多种酚类化合物和丹宁物质，它们能抑制多 种植物病菌的水解酶，包括果胶酶和引起组织浸离的酶。一些其他类型的化 合物，如皂角苷，番茄中的番茄素和燕麦中的燕麦素，都具有抗病菌作用。 此外，植物体内还含有一些水解酶类，它们能降解真菌的细胞壁，如葡聚糖 和几丁质酶。 2 病菌诱导产生的次生代谢物 植物病菌遭到侵染后，分泌一些次生代谢物质，抑制大多数病菌的生长。 这些化合物包括大多数酚类化合物和绿原酸和咖啡酸，以及酚类化合物的氧 化产物，还有植物保卫素，植物保卫素中的多数也是酚类化合物。 3 植物中提取的抑菌次生代谢物 银杏的外种皮提取液含有多种酸类、酚类物质，这些物质都具有抑菌作 用，对苹果炭疽病菌离体抑制率为5 4 4 ，田间防效为8 2 2 ；此外银杏叶 乙醇提取物对玉米小斑病菌、苹果轮纹病菌和苹果烂腐病菌均有较显著的抑 菌作用。 黄连体内含有大量的生物碱，这些生物碱对植物病原真菌的菌丝生长和 孢子萌发有较强的抑制作用，e b e r h o r a 等( 1 9 8 5 ) 用小檗碱防治马铃薯晚疫 病已取得成功，此外这些生物碱对水稻小球菌核病菌、柑橘青霉病菌、小麦 全蚀病菌、贝母茎腐病菌均有很强的抑制作用。 原白头翁乙醇提取液不仅抑制小麦赤霉病菌菌丝的生长，而且使病原菌 菌丝萎缩。此外，从麻黄和细辛中提取的挥发油对植物病原菌也有抑制作用。 第一章苦参杀虫生物活性物质及组织培养生产植物次生代谢物研究进展 ( 二) 植物次生物质抗虫作用 具有抗虫物质的次生代谢物很多，几乎各类次生代谢物种都有抗虫物 质。植物次生代谢物直接防御害虫主要表现在毒杀、行为干扰和生长发育调 解等作用。 1 毒杀作用 植物次生代谢物对害虫的毒杀作用主要表现为胃毒作用，如j | i 楝素混入 黏虫人工饲料中，可以直接杀死黏虫。以浓度为0 0 5 m o l l 的脱氧鬼臼毒素 浸叶饲喂菜青虫，3 d 后死亡率高达1 0 0 。表现出胃毒毒性的还有鱼尼丁、 烟碱、马桑毒素、阉洋花素u i 、苦皮藤根皮提取物等。许多精油表现出熏蒸 作用，a m h e m 等( 1 9 8 6 ) 试验了几种精油对米象、绿豆象、药材甲和家蝇的 熏蒸作用，结果桉叶素、自珠木油、莳罗油、日本薄荷、桉树油和松节油显 示出很强的熏蒸作用。c o r n e l i u s 等( 1 9 9 7 ) 发现丁香酚、香茅醇和柠檬醛对 白蚁具有熏蒸活性，丁香酚活性最高。用丁香酚和香茅醇处理后的沙障至少 5 d 内白蚁不会钻蛀。m w a s h r a 等( 1 9 8 3 ) 测得辣薄荷精油对赤拟古盗l 、2 、 3 和5 龄幼虫的l c s o 分别为o 0 0 7 6 、o 0 2 1 4 、0 1 1 8 和o 2 0 0 4 g c m 3 。具有 触杀作用的杀虫物质不是很多。主要是一些生物碱类，如烟碱、苦参碱、藜 芦碱、番荔枝碱等。 2 干扰昆虫的正常行为 许多植物次生代谢物干扰昆虫的正常行为，表现为拒食、忌避、干扰产 卵行为或使产卵量降低。拒食是柠檬素类化合物的主要作用方式之一。印楝 就是由于在1 9 2 7 年发生的蝗灾中表现出强烈的拒食活性才引起众多研究者 的关注，含有柠檬素的植物精油提取物或纯品都有此活性，如1 0 4 0 m g l 的 印楝素对沙漠蝗s c h w a s t o c e r c ag r e g a r i a ( h s c h m u t t e r e r , 1 9 9 0 ) 口- - i 产生1 0 0 的 拒食作用，印楝素还能减少草地夜蛾、莎草黏虫、烟草夜蛾幼虫的取食 ( m s j s i m m o n d s ，1 9 8 4 等) ，印楝素也可在较低浓度下对三化螟、白脉黏 虫、菜粉蝶、小菜蛾和亚洲玉米螟等表现出较强的拒食活性，柠檬苦素、 o b a c u n o n e 和n o m i l i n 对马铃薯甲虫、草地贪夜蛾有一定的活性。生物碱对 昆虫的作用方式是多种多样的，正如k i n g h o m ( 1 9 8 4 ) 在( a l k a l o i d s ：c h e m i c a l a n db i o l o g i c a lp e r s p e c t i v e ) ) 一书中总结：生物碱依靠其多方面的作用，作为 一种天然杀虫剂防止昆虫的攻击，使植物得到了保护。 1 4 沈阳农业大学硕士学位论文 m o h a m a d 等报道从( h a p l o h y t o nc r o o k s i i ) 中分离得到的三种生物碱： c r o o k s i i n e y o h i m b i n e 和1 3 - y o h i m b i n e 。其中c r o o k s i i n e 对已酰胆碱酯酶有抑 制作用。m i l l e r 等( 19 8 3 ) 研究了6 种苄基异喹喏啉( b e n j y l i s o q u i n o l i n e ) 类生物碱对美国白蛾( h y p h a n t r i ac u n e a ) 、亚热带黏虫( s p o d o p t e r ae r i d a n i a ) 和舞毒蛾( 1 y m a n t r i ad i s p a r ) 的拒食活性。j o h n s o n 等( 1 9 8 8 ) 用含羽扁豆生物 碱和酪蛋白的人工饲料进行研究，发现很低浓度的金雀花碱即影响亚热带黏 虫的生长发育及存活，并发现金雀花碱对该虫的活性比羽扁豆碱高一倍。而 n e a l ( 1 9 9 0 ) 则发现白屈菜碱( c h e l i d o n i n e ) 是微粒体单氧酶的抑制剂。 二、组织培养生产植物次生代谢物的现状及前景 自然界丰富的植物资源蕴藏着数量可观的次生代谢产物，其中包括许多 珍贵的药用植物，为了开发这些宝贵的资源，除了从植物材料进行提取和化 学合成以外。植物组织培养为有用的次生代谢物的生产提供了新途径；另外 植物资源是有限的，由于人类活动的不断扩展，再加上滥砍滥伐破坏资源的 事例时有发生，因而使植物资源不断减少，而且还给人类赖以生存的环境造 成极大的损害。而人工种植又面临着品质退化、农药污染和种子带病等问题， 严重影响了对药材品质的保证和控制。与种植相比，利用植物组织培养方法 生产药用化合物具有以下优点： 第一，药用化合物的生产可以在人为控制条件下进行，通过控制操作培 养条件和培养方式极大的提高生产率。 在一些植物的培养物中。通过改变操作条件，提高次生代谢产物的含量。 如表l - 2 ，诱导的目标产物中活性成分的含量超过了植物体内的含量，说明 通过组织培养生产次生代谢物是可行的。 第二，培养是在无菌条件下进行的，可以排除病菌和虫害的侵扰，便于 控制质量。 第三，可以进行特定的生物转化反应，大量生产所需的药用化合物。 第四，通过对有效成份进行遗传操作，提高所需化合物的产量。 第五，有时会产生原植物不存在的化合物。 第六，对组织培养产生的中间产物进行酶促合成或化学合成，获得所需 的化合物。 因此，利用植物组织培养生产有用的次生代谢产物更具有现实意义。 第一章苦参系虫生物活性物质及组织培养生产植物次生代谢物研究进展 表1 2 组织培养产生次生代谢物超过自然植物体含量的植物 t a b 1 - 2 p l a n to fs e c o n d a r ym e t a b o l i t e sf r o m t i s s u ec u l t u r eo v e r t a k ep l a n t 人参皂苷 g i n s e n g o s i d e 葸醌 a n t h r a q u i n o n e s 薯蓣皂苷 d i o s g e n i n 倒地拱素 b w a s c o c l a u r i n e 咖啡因 c a f f i n 蛇根碱 s e r p e n t i n e p r o t o p i n e n i c o t i n e 人参p a n a xg i n s e n g 决明c a s s i at o r a 三角叶薯蓣 d i o s c o r e a d e n o i d e s 倒地拱 s t e p h a n i a c e p h a r a m t h a 咖啡c o f f e aa r a b i c a 长春花016 c a t h a r a t h u s r o s e u s 博落回 一 m a c l e a y am i c r o a r p a f c o t i a n at a b a c u m一 2 7 0 6 ，0 20 2 3 16 0 5 0 4 0 - 3 l 4 5 0 6 2 0 o 8 1 6 o 5 o 3 2 0 1 p a n i e u l i d eb a n d r o g r a p h w a s p a n i c u l a t e 0 9 0 ( 一) 植物组织培养生产药物 据不完全统计，已经从2 0 0 余种药用中植物获得了愈伤组织培养物，从 中分离的药用物质达数百种之多。目前用组织培养生产药物成分主要包括： 1 苷类 包括( 人参皂苷、三七皂苷、柴胡皂苷、薯蓣皂苷原等) 、强心苷( 强 6 沈阳农业大学硕上学位论文 心苷醇、毛地黄毒配质衍生物等) 、干草甜苷、香豆精苷等。 2 甾醇类 油菜甾醇、豆甾醇、谷甾醇、异岩藻甾醇等。 3 生物碱类 主要有吡啶、喹啉、异奎琳等。 4 醌类 包括蒽配、萘醌、返醌等。 5 蛋白质类 利用组织培养生产的这类物质主要有胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑制剂、 植物病毒抑制剂、植物抗生素等。表1 3 列举了一些主要药用植物通过组织 培养产生的药用物质。 ( 二) 植物组织培养生产植物农药 目前已做过组织培养研究的植物源农药有烟草、印楝、非洲山毛豆、紫 背金盘、鱼藤、除虫菊、万寿菊、雷公藤。 1 印楝 a l l a n 等( 1 9 9 4 ) 对印楝组织培养产生印楝素进行了研究，印楝素含量 可以达到愈伤组织于重的o 0 0 0 7 ，并且含有o 0 4 m g l 印楝素的愈伤组织抽 提物对沙漠蝗具有1 0 0 的拒食活性。 2 鱼藤 曾鑫年等( 1 9 9 8 ) 对毛鱼藤的组织培养发现叶极易诱导出愈伤组织，而 且诱导率为1 0 0 ，愈伤组织对鱼具有一定的活性。r u c h i 等( 1 9 9 4 ) 和s h e e l a 等( 1 9 9 7 ) 对印度毛鱼藤的诱导也都获得了成功。 3 山毛豆 s h a m n 等( 1 9 7 5 ) 对山毛豆和非洲山毛豆进行了离体静止培养和悬浮培 养，结果在非洲山毛豆培养4 周，最大的鱼藤酮类的含量为干重2 8 ，包括 鱼藤素、毛鱼藤酮和灰毛豆素。l a m b e r 等( 1 9 9 3 ) 对非洲山毛豆的培养发 现光混合培养的愈伤组织主要是鱼藤酮及其类似物，异样的细胞系愈伤组织 合成的主要是鱼藤酮素和灰毛豆素。 第一章苦参系虫生物活性物质及组织培养生产植物次生代谢物研究进展 表1 - 3 植物组织培养物产生的药用物质 1 a b l e 1 - 3p h a r m a c e u t i c a l sf r o mp l a n tt i s s u ec u l t u r e 植物名称n a m eo f p l a n t莼用物质m a t e r i a lu s e df o rm e d i c i n e a g a v ew i g h m a m m iv w a s n a g a a r n e b i ae u c h r o m a a t r o p ab e l l a d o n n a b e r b e r w a ss t o l o n 瓣m c a m p t o e a ca c u m i n a t a c a s s i aa n g u s t i f o l i a c s e n n a c t a r a c a t h a r a n t h mr o s e a s c i n c h o n al e d g e r i a n a c o l e l 口b l u m e i c o p t w a s j a p o n i c a c o c b o n l so t i t o r i u s d a t u r ai n n o x i a ds t r a m o n i u m d t a t u l a d a u c a sc a r o t a d i o s c o r i ad e l t o i d e a d ，o k o r o d z i n g i b e r e n s w a s d i g i t a l w a sl a n a t a d ，p u r p u r e a g a f i u mm o l l u g o g l y c y r r h i z ae c h m a 搬 g g l a b r a h y o s c y a m u sn i g r a 皂草苷元 呋哺色酮 紫草素多种衍生物 颠茄碱、东莨菪碱、古柯碱、胆碱莨菪胺 原小檗碱 喜树碱 辣椒素 维生素 葸酮 阿吗碱、长春新碱 吲哚生物碱 迷迭香酸 盐酸小檗碱 甾醇 托平生碱 托平生物碱、莨菪碱 托平生物碱 地奥配质 地奥配质 山萆斛皂苷元 薯蓣皂苷 强心内酯 b 甲基地高辛 蒽醌 海胆啶 甘草甜苷 莨菪胺 沈阳农业大学硕士学位论文 二= 一。一 l i t h o s p e r m u mc r y t h o r o h i z o n 紫草素 m e d i c a g os a t i v a 甜菜碱 m o r i n d ac i t r i f o l i a 葸醌 m o m o r d i c ac h a r a n d i c a 胰岛素 m u c u n a p r u r i e n s m e l i l o t u so f f i c i n a l w a s n i c o t i a n ag i a u c a r i g s t i c a t a b a c u m p a n a x g i n s e n g p n o t o g i n s e n g p q u i n q u e f o l i u m p a p a v e rb r a c t e a t u r a p s o m n i f e r u m p e t r o s e l i n u mh o r t e n s e p h e l l o d e n d r o na m u r e n s e p h y t o l a c c aa m e r i c a n a r a u w o l f i as e r p e n t i a r y u n a n e s w a s r h e u mp a l m a t u m r u t ag r a v e o l e n s s c o p o l i a j a p o n i c a s p a “f l o r a s y m p h t u mo f f i c i n a l e t a x u sc u s p i d a t a t e p h r o s i a p u r p u r e a t h e as p t r i g o n e l l a f o e n u m g r a e c u m y u c c ag l a u c a l 一多巴胺 邻羟基苯丙酸 假木贼碱 烟碱 辅酶q 1 0 人参皂苷 人参皂苷 人参皂苷 蒂巴因 蒂巴因等六钟鸦片碱 氧化补骨脂、补骨脂内酯 盐酸小檗碱、