（微生物学专业论文）生物破乳剂研究.pdf

南开大学硕上研究生毕业( 学位) 论文摘要 摘要 本研究利用乳化剂s p a n 8 0 配制出稳定的煤油一水乳状液，作为原油乳 状液的模型。通过此模型，筛选出2 株破乳能力较强的菌株，分别为芽孢杆 菌x 3 ( b a c i l l u ss p x 3 ) 和红球菌r ( r h o d o c o c c u ss p r ) 。它们的发酵液在 5 5 下8 小时左右可以使模型乳状液完全破乳。通过比较，发现它们比化学 破乳剂d g f 0 1 具有更好的破乳能力。p h 值的改变和加入无机盐会加快它 们对乳状液的破乳。冻融和高压灭菌对它们的破乳能力几乎没有影响。而且 发现，乳状液的破乳并不是一个对数增加的过程，而是一个线性增长的过程。 这些研究结果为生物破乳剂对原油乳状液破乳脱水的实际应用提供了可能 性。 对其破乳机理的研究表明，芽孢杆菌x 3 菌株发酵液的破乳能力源于其 代谢产生的脂肽表面活性物质。而红球菌r 发酵液的破乳能力源于其菌体的 疏水性，菌体表面的枝菌酸使其具有疏水性。通过原生质体融合技术获得一 株比亲本芽孢杆菌x 3 和红球菌r 破乳能力更强的菌株c c 2 。它在5 5 下6 小时可以使模型乳状液的完全破乳。融合子c c 2 即具有较强的疏水性，也能 产生与亲本x 3 所产脂肽结构相同的表面活性物质，而且其遗传性状稳定。 关键词：生物破乳，芽孢杆菌，红球菌，脂肽，疏水性，原生质体融合 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文摘要 a b s t r a c t t w os t r a i n sw i t hh i g hc a p a b i l i t yo fd e e m u l s i f i c a t i o nw e r es c r e e n e dt h r o u g ha s t i r f a c t a n t s t a b i l i z e dk e r o s e n e w a t e rm o d e le m u l s i o n ，w h i c ha s s e m b l e dc r u d eo i l e m u l s i o n t h e yw e r e b a c i l l u s s p x 3 a n dr h o d o c o c c u s s prw h i c hc o u l d d e e m u l s i f yt h em o d e le m u l s i o n sc o m p l e t e l yi n8h o u r sa t5 5 ca n dh a v eb e t t e r d e e m u l s i f y i n gc a p a b i l i t yc o m p a r e dw i mc h e m i c a ld e e m u l s i f i e r , d g f - 0 1 t h ep h c h a n g ea n di n o r g a n i cs a l t sa d d i t i o nw o u l de x p e d i t et h ep r o c e s so f d e e m u l s i f i c a t i o n a n dal i n e a rr e l a t i o n s h i p ，n o taf i r s to r d e rr e a c t i o nt h a tw a su s e di ns o m e r e f e r e n c e s ， w a so b s e r v e db e t w e e np e r c e n t a g ed e - e m u l s i f i c a t i o na n d r e a c t i n gt i m e t h e s er e s u l t s w i l lp r o v i d es o l i df o u n d a t i o nf o rb i o l o g i c a ld e e m u l s i f i c a t i o na p p l i c a t i o ni nc r u d eo i l e m u l s i o n s t h ed e - e m u l s i f y i n g c a p a b i l 时o fb a c i l l u ss p x 3 w a sa s s o c i a t e d 谢mt h e l i p o p e p t i d ep r o d u c e db yi t ，w h i l et h ed e - e m u l s i f y i n gc a p a b i l i t yo f r h o d o c o c c u ss p r w a sm a i n l yr e s u l t e df r o mt h eh y d r o p h o b i es u r f a c e so fm i c r o b i a lc e l l s ，w h i c hw e r e c h a r a c t e r i z e db yt h em y c o l i ca c i d s as t r a i nw i mb e t t e rd e - e m u l s i f y i n gc a p a b i l i t yw a s o b t a i n e dt h r o u g hp r o t o p l a s tf u s i o n ，w h i c hc a nd e - e m u l s i f yt h em o d e le m u l s i o n a b s o l u t e l yi n6h o u r s a t5 5 。c i tn o to n l yh a db e t t e rh y d r o p h o b i c i t y , b u ta l s op r o d u c e d t h es - n eb i o s u f f a c t a n ta sb a c i l l u s s px ，d i d ，a n d t h e s ec h a r a c t e r i s t i c sw e r e i n h e r i t a b l e k e yw o r d s ：b i o l o g i c a ld e - e m u l s i f i c a t i o n ；b a c i l l u ss p ；r h o d o c o c c u ss p ；l i p o p e p t i d e ； h y d r o p h o b i c i t y ；p r o t o p l a s t f u s i o n 2 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文刖舌 一、刖吾 1 乳状液的形成机理 乳状液是指一种或多种液体以液珠形式分散在与它不相溶的液体中构成的 分散体系。乳状液的液珠直径一般都大于0 1 l x m ，属粗分散体。由于体系显现乳 白色而被称为乳状液。在乳状液体系中，以珠状形式存在的相称为内相，由于其 不连续性又称为不连续相或分散相。而另一相称为外相，由于其连续性，又称为 连续相或分散介质。通常的乳状液有一相是水或水溶液，被称为水相，另一相是 与水不相溶的有机相被称为油相。 乳状液的类型有以下几种：水包油型( o i li n w a t e r ) ，以o w 表示，其内 相为油，外相为水，如人乳、牛乳等；油包水型( w a t e r i n o i l ) ，以w o 表示， 内相为水，外相为油，原油主要为这种类型的乳状液。还有如一些化妆品。套 圈式，以o w o 或w o w 表示，以水相和油相交替一层一层的包着，这种类型 较少见岍】。 乳状液类型的鉴别方法有：染色法，若将少量油溶性染料油红0 ( o i lr e d o ) 加入乳状液中，若乳状液全染成红色则为w o 型乳状液，若乳状液只有红 点出现则为o w 型。稀释法，因为乳状液能与其外相液体相混溶，所以w o 型乳状液能溶于油，而o w 型乳状液能溶于水。电导法，导电性好的为o w 型乳状液，导电性差的为w o 型i l z j 。 乳化剂是乳状液赖以稳定的关键，它可以吸附在油水界面上形成一单分子 膜，有降低油水界面张力及阻止油珠并聚的作用而使乳状液稳定。乳化剂主要分 为四类：表面活性剂类乳化剂，高分子型乳化剂，天然产物类乳化剂以及固体粉 末乳化剂i ”。影响乳状液稳定的因素有以下几点：界面引力。乳状液是高度分 散且有巨大的油水界面，是热力学上的不稳定体系，为了降低体系的能量，液滴 间有自发并聚的倾向，因此低的油一水界面张力有助于体系的稳定，离子型的表 面活性剂能有效地降低界面张力，稳定体系；界面膜的性质。低界面张力是乳 状液稳定的重要因素，但并非是唯一的，界面膜的机械强度也是决定乳状液稳定 性的主要因素之一。由于加入油水体系中的乳化剂具有既亲水有亲油的双亲分子 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前言 结构，它必然要吸附在油水界面上，以亲水基伸进水中，亲油基伸进油中，定向 排列在油水界面上形成界面膜。膜的机械强度大，不易于破裂，有利于体系的稳 定。高分子的乳化剂多属于此类型；界面电荷，乳状液的液珠上所带电荷主要 源于所使用的离子型乳化剂在水相中电离产生的乳化剂离子在液珠表面吸附所 致。由于双电层的相互排斥，使油珠不易接近，从而阻止了液珠的聚结；分散 介质的粘度，外相的粘度越大，液珠的运动速度越慢，液珠间的碰撞几率越少， 有利于乳状液的稳定邺】。 影响乳化的因素主要包括：内相的分散程度。内相分散度越高，乳化性能 越好：界面膜的强度。强度越大，乳化液越稳定：外相的粘度；两相的相 对体积比：两相的密度。对于一个指定的油水体系制备成性能稳定的乳状液， 最关键的问题是要为这个油水体系选定一个合适的乳化剂，同时还要采用合适的 制备方法。乳化剂的选择方法最常用的是h l b ( h y d r o p h i l e - l i p o p h i l eb a l a n c e ， 亲水亲油平衡) 和p i t ( p h a s ei n v e r s i o nt e m p e r a t u r e ，相转变温度) 方法。乳化 工艺可分为两种：一是物理化学法，一是机械法。这些方法中有：转相乳化法， 自然乳化分散法，瞬间成皂法，混合膜生成法和轮流加液法。制备乳状液的设备 常用的有：搅拌器、胶体磨、均化器和超声波乳化器，其中搅拌器设备简单，操 作方便，最为常用 1 一。 乳状液发生油水分离的现象被称为破乳，此时乳状液完全被破坏了，乳状液 的破坏般经历分油( c r e a m i n g ) 、絮凝、膜排水、聚结( c o a l e s c e n c e ) 、相分离 这五个过程。乳状液体系在重力的作用下，由于两相的密度不同，会使分散液滴 上浮或下沉，形成含液珠密度不同的两层。这就是分油。絮凝是乳状液的液珠通 过范德华力相互吸引，聚集形成松散的絮团。絮凝过程是可逆的，但絮凝现象的 出现意味着乳状液已经开始不稳定，它是破乳的前奏。当两个液滴相互接近时， 界面膜会发生薄化，使得乳化剂在界面上的浓度分布不同，形成负的界面张力梯 度，加入的破乳剂界面活性更高，容易扩散到界面上空缺的地方，形成正的界面 张力梯度，加速膜排水过程，使两液滴的界面更加接近，有利于膜振荡破裂，液 滴聚结( 图1 ) 。另外，由于破乳剂在油水界面上的吸附，因为它本身不能形成 牢固的界面膜，也有利于聚结。小液滴聚结成大液滴，导致液滴数目减少，最后 造成乳状液的破坏孔。另外，通过物理的方法( 加热和高压电场) 也可以使乳状 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前言 液破乳4 1 。 恤 睦排水 减步 蠢，：主 寰面恬性剂 ( b ) 表面悟性剂+ 破乳莉 ( b ) 雎排水 增多 图1 加入破乳剂前后膜排水与油水界面张力o 、乳化剂浓度的关系1 3 1 图a 上图：乳化剂界面浓度对膜排水的影响；下图：乳化剂界面浓度与界面张力的关系 图b 上图：破乳剂分子插入到膜上后的排水作用；下圈：破乳剂分子插入到膜上后的界面张力 2 原油乳状液的形成 世界开采出的原油有近8 0 以原油乳状液形式存在【3 】。在开采之前，油与水 在地下并不发生乳化，原油从地下采出时要经过地层的孔隙与水和气体混合在一 起，又经过泵送的搅动，便形成乳状液。原油乳状液是十分复杂的分散体系，以 油包水( w o ) 为主。原油产地、开采方式等因素使原油乳状液性质千变万化。有 许多因素影响原油乳状液的稳定性，如原油密度、粘度、水含量、水滴直径、水 滴带电性、水相性质、原油中固体颗粒、界面膜强度和粘性及乳状液的老化等等。 这众多的因素增加了原油乳状液复杂性及其破乳的困难性。原油之所以能形成稳 定的乳状液，主要是由于原油含有天然乳化剂，原油乳状液的稳定性在很大程度 上取决于由天然乳化剂形成的界面膜，破乳荆能影响界面膜的稳定性【3 舯】。沥青质 是原油乳状液天然乳化剂中最重要的组分【3 l ，通常是指石油中不溶于小分子正构 烷烃( 如正戊烷、正庚烷等) 而溶于苯的物质，它是石油中分子量最大，极性最强的 非烃组分。它的平均分子结构模型如图( f i g u r e2 ) 。沥青质分子易于通过自缔合 生成的胶束。它的界面活性不很强，但乳化能力较强。由于含有合适聚芳香环平 面结构，多个沥青质分子片会在油水界面堆积成规则的层状结构，如同表面活性 剂在界面上形成的液晶相( m e s o p h a s ec ) ，这种膜具有固体特点和迁移性，可使乳状 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前言 液的稳定性大大增加。沥青质吸附在油水界面并在油水界面取向将产生很高的表 面诱导的粘性。这种表面粘性有时比体相粘度高许多倍。表面活性剂分子的碳氢 部分力图溶于油相，而极性部分力图溶于水相，结果导致界面层压缩而产生阻力， 这个阻力可用界面压来表示。在表面活性剂体系中，界面压可高达3 0 - - 5 0 m n m 。 这是产生界面粘性的主要原因。布朗运动引起界面膜振荡，界面膜的粘性和弹性 抑制振荡，防止界面膜的薄化和排水，阻止液滴聚结。在膜发生薄化的过程中，界面 膜上表面活性剂浓度分布不均，表面活性剂分子从浓度高处向浓度低处扩散，使膜 振荡减弱，液滴的聚结速度降低。原油中天然乳化剂还包括高熔点石蜡、胶质、 粘土等泥质固体颗粒。 f i g u r e2 b i t u m e n sn o r m a l m o l e c u l a rs t r u c t u r em o d e l 吲 原油破乳过程主要包括四个阶段：破乳剂的溶解与扩散；破乳剂插入或 部分替代天然乳化剂，由于破乳剂具有高的界面活性，很容易插入到油水界面上 或将原来在油水界面上的天然乳化剂部分顶替下来：破坏界面膜。原油乳状液 液滴破坏是界面膜破裂( 膜排水) 的结果。膜排水和液滴聚结过程与乳状液界面膜 流变性质有关。界面膜的弹性和粘性在很大程度上决定界面膜的强度，从而决定 乳状液的稳定性。破乳剂破乳作用的关键是吸附或部分取代在界面的天然乳化剂， 降低界面膜的弹性和粘性，从而降低界面膜的强度，有利于界面膜的薄化和排水， 加速液滴的聚结：油水分离。界面膜被破坏后，小水珠聚结成大水珠，由于油 水密度差的原因，水珠下沉从油相中分离出来，乳化原油就被破乳了【l 】。 原油中含有过多的水分，对原油的加工和使用，都会产生一些不良的影响。 在加工过程中不但会增加热能消耗，还会影响催化剂作用效果，而且由于在高温 6 _ m ，讹 ， 甜， 删 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前言 下水和油同时汽化，体积迅速膨胀，会造成冲塔等事故。又由于原油内的水中含 有无机盐类，会对炼油设备造成腐蚀，降低炼油设备的寿命。另外，原油中水含 量的多少直接影响油田储运负荷、输油动力消耗及管线腐蚀，作为燃料时水含量 还会降低其发热值。同时，还会给原油计量带来误差，造成油量计算不准确。因 此，在石油运输和精炼时，必须要求原油的含水量在o 5 以下【1 0 】。所以，原油 乳状液的破乳脱水是石油运输和加工过程中非常重要的环节之一。寻求有效破乳 方法，降低成本是人们普遍关心的问题。 工业上最常用的原油破乳方法是加入化学破乳剂【1 1 。引。原油化学破乳剂一 般按离子的类型分为阴离子型、阳离子型、和非离子型三种类型。其中非离子型 破乳剂品种最多，用量最大，破乳效率最好。它以聚氧丙稀聚氧乙烯嵌段共聚物 为主。复配是开发高效原油破乳剂的有效方法。高的表面活性，足够的絮凝能力， 强的润湿性和高聚结性能，是高效原油破乳剂的必备条件，而单一组分的破乳剂又 不能充分满足要求。人们为了克服高分子破乳剂的专一性，就利用表面活性剂的 协同效应复配出许多新型高效破乳剂1 1 4 】。 3 生物破乳剂及其研究进展 由于原油乳状液的复杂性，虽然化学破乳剂的破乳速度较快，但用量大， 专一性太强，不能普遍适用于各种性质的原油采出液，而且还会造成对环境的污 染。除石油工业外，其他工业中破乳问题也是很重要的。如制药业、化妆品、以 及食品加工，都会产生w o 或o w 型的工业废水。生物破乳是通过加入微生物 发酵全培养液而使乳状液破乳脱水的方法。与这些传统破乳方法相比，生物破乳 具有生产工艺简单，成本低，能耗小，易商品化等优点。更重要的是，生物破乳 剂易被降解，不污染环境，对加工设施无腐蚀作用。因此，它在原油脱水，含油 污水的分离及污水处理等领域的开发和应用前景十分广阔。 3 1 生物破乳作用原理 3 1 1 细菌菌体破乳机理的模型 图3 提出了一种细菌粒子如何破坏( 或稳定) 乳状液的机理【1 5 】。如果细菌 表面能被乳状液的非连续( 液滴) 相充分润湿，但不是完全润湿，则细菌最终总 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 前言 a 乳状液破乳一 b 乳状掖 鱼定一 图3 细菌粒子促进( a ) 或抑制( b ) 乳状液凝聚的示意图j n ，b 为平衡接触角 会在连续相和非连续相的界面占据一个平衡位置。该细菌粒子将有一半以上浸入 非连续相中。如果非连续相的两个单元( 两乳状液液滴，或者一乳状液液滴与一 已分层的非连续相) 在同一个细菌表面接触、润湿并铺展，则两个单元在到达平 衡前就会在细菌表面上相互接触并凝聚( 图3a ) 。然而，如果细胞表面不能被 非连续相明显地润湿，则非连续相的两个单元就会在彼此接触和发生凝聚之前， 达到平衡位置( 图3b ) 。在这种情况下，细菌粒子是作为一种乳状液稳定剂， 而不是破乳剂。非连续相与细胞表面间的平衡接触角的大小( 图3 中的a 和b ) 反映了非连续相对细胞表面的润湿能力，进而表明了这种细菌细胞到底适于作破 乳剂还是作乳状液稳定剂。 细菌的这种固相破乳的首要条件是分散( 液滴) 相能优先润湿细胞表面【l ”。 图4 表示o w 乳状液破乳的详细情况。如果固体被非连续相优先润湿，则平衡 罩辜置一 昌吊量 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 前言 接触角n 较小，因而固体的大部分浸入油相。而瞬间接触角e 起初较大，但随着 油滴在固体上铺展，8 会不断变小到i ：1 值，但在。变小到a 值之前，油滴就已与 凝聚油相相互接触了。 图4 o t w 乳状攫被固相破乳时豹平衡接触角 ( n ) 和瞬时接触角( o ) 生物固体粒子和乳状液液滴的相对大小，生物固体粒子的形状都会影响破 乳效果。图5a 表明，但乳状液液滴小于固体粒子时，在液滴与已凝聚的非连续 相接触之前，就可能达到平衡接触角a 。在a = 4 5 0 时是一典型情况( 图5b ) 。 一般细菌的直径为几个um ，而稳定的乳状液液滴直径也为几个uh i 。所以，细 菌破乳剂的粒子完全可以使乳状液发生凝聚。 a b 圈5 油湔在凝聚翦柏在固体粒子上选到镧屉平衡的示意圈 4 为平街接触角箕中( b ) 为特殊情形，a - 4 5 。禳囊惜在接越点造刊平衡位置 由于细菌不都是球状的，还有棒状等其他形状。当考虑到菌体细胞轴比增 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前言 加时，跗着在细菌两端的两液滴在相互接触前达到平衡的可能性亦增大。但这个 问题不算严重，因为任何附着在棒杆菌中段的液滴都会铺展，给附着于两端的液 滴间架桥【1 5 】。 上述关于细菌破乳机理的模型说明，菌体破乳能力与菌体表面的性质有关 1 15 1 。使w ，o 型乳状液破乳需要亲水细胞表面，这种亲水表面是处于指数生长期 和稳定生长早期的细胞表面。而o w 型乳状液破乳需要憎水细胞表面，这种憎 水表面产生于内源代谢期，它需要经过多糖的酰化，游离的、非共价键合的羧酸 及其它由细胞释放或细胞自溶的生物表面活性剂在细胞外层沉积而产生。具有憎 水性或部分憎水性的胞壁组分可以粗略地分为三类：胞壁自身组分，外被多糖， 及附着于胞壁或外被多糖上的胞外组分。 3 1 2 生物表面活性物质破乳模型 有些微生物在其生长代谢过程中能够产生具有表面活性的物质。这些表面 活性物质被称为生物表面活性剂【1 6 】。它分子量小，具有很好的表面活性，容易渗 透到油水界面，插入油水表面乳化剂的空隙或部分替代乳化剂，从而使界面膜不 稳定。其机理与化学破乳剂相同。另外它还会修饰菌体细胞表面和固体粒子，改 变其润湿性，使其适于破乳【1 7 】。生物表面活性物质的破乳功能至今还没有文献报 道过有直接证据，本文对其进行了探索性研究。 3 2 生物破乳的国内外研究进展 国外最早关于生物破乳的文献报道是在1 9 8 2 年，c a i r n s 等发现对于不同类 型、组成和被不同类型乳化剂构成的乳状液，微生物细胞培养液具有破乳作用。 但它的破乳能力与培养基的组成，培养条件及菌体细胞的菌龄密切相关。通过抽 提等方法，认为细菌的破乳能力与其细胞表面的性质有关。并且认为微生物可作 为一种新的破乳剂来源 1 8 , 1 9 。 1 9 8 4 年，g r a y 等发现n o c a r d i aa m a r a e 菌对于油田的w o 和o w 型乳状 液有破乳作用。并且与商品化学破乳剂t r e t o l i t ee 3 4 5 3 的破乳能力做了比较，发 现n o c a r d i aa m a r a e 的破乳能力强于t r e t o l i t ee 3 4 5 3 。而且。随着菌龄的增加， 菌体细胞对于o w 型乳状液的破乳能力逐渐增强。经研究发现，细胞与乳状液 滴的接触角越大，细胞的憎水性越强，破乳效果越好。说明菌体细胞对于乳状液 1 0 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文刖舌 的破乳能力与细胞表面的憎水性有关1 2 0 - 2 2 1 。 k o s a r i c 等在1 9 8 7 年发现酵母细胞也具有破乳能力，具有破乳能力的这种微 生物可以生长在需要破乳的乳浊液中，可使菌体生长和破乳同时进行。而且，破 乳的菌体细胞可以重复使用。o e r s o n 在1 9 9 3 年的研究也证明了这点i “1 。 1 9 9 6 年，s t e w a r t 等对c o r y n e b a c t e r i u m p e t r o p h i l u m 的破乳能力进行了研究。 同样，c o r y n e b a c t e r i u mp e t r o p h i l u m 也具有使各种复杂的油田乳状液破乳，尤其 是对w o 型乳状液，破乳能力也与它细胞表面的性质有关【2 5 1 。 1 9 9 9 年，m a d h u s w e t ad a s 发现m i c r o c o c c u s 对w o 和o w 的乳状液也具 有破乳能力，用脂溶性的溶剂洗菌体细胞会使破乳能力明显下降，菌体浓度的增 加会增强破乳能力 2 6 , 2 7 。 2 0 0 0 年，s h i nh y ep a r k 等发现s t r e p t o o m y c e ss p 的孢子可以使乳浊液( 如以 煤油和汽油配制的乳状液) 破乳 2 8 】。j a ec h a nl e e 等利用固定化的n o c a r d i a a m a r a e 进行破乳，而且发现利用直流电场与它配合使用，可以使乳状液的油水 分离时间明显缩短【2 9 i 。 2 0 0 2 年，n a l i n an a d a r a j a h 等从被石油污染地点筛选出一混合菌群，并测试 其破乳能力，发现它具有很好的破乳活性，在- d , 时内可以使煤油水模型乳状 液达到破乳率9 6 。冻融和高压灭菌不影响其破乳活性。鉴定出其含有9 种菌 株，其中破乳能力最强的是a c i n e t o b a c t e rs p 。并且也认为是菌体粒子起破乳作 用，但怀疑菌体产生的表面活性剂有一定的破乳作用口。引1 。 国内对生物破乳研究的很少。石油勘探开发研究所郭东红博士选用一种生 物破乳剂，把它与三种聚醚型破乳剂复配进行原油破乳试验，结果表明，生物破 乳剂的引入可以显著提高原油乳状液破乳脱水的速度和效果。通过电化学方法， 发现生物破乳剂的加入使得化学破乳溶液的界面膜电容随时间增加的趋势明显， 界面膜被击穿的时间缩短，而界面膜电阻随时间的下降程度也相应增强，这充分 说明生物破乳剂与化学破乳剂具有“协同效用”【3 2 l 。 河北科技大学的徐远春、崔健升等从自然界中分离到一株具有破乳能力的 菌株，初步鉴定为n o c a r d i aa m a r a e ，主要对含油污水的处理进行了研究。发现 它具有很好的排油除污效果，而且在实验条件下，比商品破乳剂e 一3 4 5 3 和除污 剂聚氯化铝的破乳效果更好1 3 3 1 。 南开大学硕- i = w f 究生毕业( 学位) 论文 前言 3 3 原生质体融合技术用于破乳菌种的改良 早在1 9 3 7 年，m i c h e l 就做过植物细胞原生质体凝集、融合的报道，l9 5 8 年冈山善雄又报道了艾氏腹水瘤细胞的融合。1 9 6 0 年c o c k i n g 用酶法制各大量 有活力的原生质体获得成功。1 9 7 4 年高国楠发现聚乙二醇在钙存在时能促进原 生质体融合，显著提高融合率。这些都促进了原生质体融合技术的重大发展。 1 9 7 6 年s c h a e f f e r 报道了丑s u b t i l i s 间原生质体融合的现象【3 4 】，f o l d e r 则研究 了b m e r g a t e r i u m 的融合【3 5 】；1 9 7 9 年f r e h e l 用投射电镜研究了且s u b t i l & 的融合 现象 3 6 】，发现使用产孢期的细胞制成的原生质体进行p e g 诱导的融合时，用电 镜可以看到融合子有两个芽孢在内，从而在电镜水平上证实了p e g 介导的融合 是细胞间的融合，而在此之前还有人提出意见分为两个步骤，首先是个依赖于 p e g 的短过程，由p e g 激发膜活力，然后是一个慢的、要求细胞代谢机制的融 和过程，用高渗培养基在此时处理融合体系后，f r e h e l 等人得到了较高的融和频 率；s h i n g c h i n g 则报道了一种质粒d n a 在p e g 助融下高频转入且s u b t i l i s 的方 法【3 7 l ，他们报道原生质体有吸收具有转化活性的d n a 的能力，所以在原生质体 制备中加入d n a s e ，防止了无关d n a 对转化的影响：g a b o r 系统研究了影响b s u b t i l i s 原生质体融合后细菌再生与遗传重组的各项参数【3 s l ，他认为培养菌、溶 茵酶处理和p e g 处理的温度对形成率和再生率是很重要的，根据实验结果，他 提出使用3 7 培养菌，酶处理用4 2 ，p e g 处理用2 8 。他还发现在高渗稀释 液中加入1 的小牛血清白蛋白可以显著增加再生率( 可高达上百倍) 。对于p e g 的处理时间，他指出延长该时间会对再生起到不利的影响，最佳时间约为两分钟。 他还比较了p e g 6 0 0 0 、p e g l 5 0 0 和p e g 6 0 0 对形成和再生的不同影响等；1 9 8 1 年m a r t i n 使用b t 进行了质粒d n a 转化入原生质体的研究，发现影响原生质体 形成的因素包括菌龄、培养基、菌株以及菌浓等因烈3 9 1 11 9 8 4 年，日本的t a k a s h i a k a m a t s u 等人得到一种原生质体再生方法的改进，并把这种方法应用于细胞融 和中来，他们首先在再生前使用预备培养基将菌体悬浮一定时间，然后使用 o v e r l a y i n g 这种方法将原生质体直接稀释于再生培养基中，不使用传统的涂布方 法，避免了由于机械挤压造成的原生质体破裂，得到了较好的再生率【4 。7 0 年 代末8 0 年代初是原生质体技术发展最快的时期，此后，原生质体融和技术作为 一种质粒d n a 或其它染色体d n a 转入受体细胞的一种快速手段，得到了广泛 南开人学硕士研究生毕业( 学位) 论文 前言 的应用，这种方法不需要知道目的基因的位置，而能把整个供体的全基因组转入 受体，甚至异种、异属、异科的原生质体间也可融合，并且有方便的检出标记， 因此成了基因工程普遍使用且广泛应用的育种手段。 在国内，1 9 8 1 年江行娟等人研究了b s u b t i l i s 间通过细胞融合的质粒转移1 4 “， 他们使用p u b l1 0 质粒于枯草杆菌g l 菌株原生质体的转化，得到的转化子具有 了两种抗药性，高温消除转化子的质粒后，亲本的性状得以恢复；1 9 9 7 年，冯 清平等人对地衣芽孢杆菌原生质体的最佳形成和再生条件进行了研究【4 2 】，他们在 菌体的对数生长期加入青霉素来一直细胞壁的合成，利于原生质体的形成，对于 他们的菌株所确定的青霉素最佳浓度为1 6 u m l ，最佳作用时间为4 h r 。另外他们 还研究了甘氨酸对原生质体形成的影响，发现在细胞生长的延滞期加入甘氨酸比 不加时的原生质体形成率平均提高3 6 ，这种促进作用的主要原因是因为在细 胞破壁过程中，加入的适量甘氨酸可促使肽聚糖中的丙氨酸被置换，由此干扰细 胞壁的网状结构，引起细胞壁的缺失。同时他们对溶菌酶的最佳作用条件也做了 详细的研究。 本研究发现两株菌b a c i l l u ss p x 3 和r h o d o c o c c u ss p r 都具有很好的破乳能 力，但b a c i l l u ss p x 3 的破乳能力主要与其产生的表面活性剂一脂肽相关，而 r h o d o c o c c u ss p r 的破乳能力主要与其菌体细胞相关，故对它们进行原生质体融 合，以期得到具有更强破乳能力的菌株。 3 4b a c i l l u s 啦产脂肽类表面活性物质的研究概况 1 9 6 8 年，a r i m a 等首次发现b s u b t i l i s 产生一种脂肪多肽类生物表面活性物 质【4 3 】，命名为s u r f a c t i n ，它可以显著降低水的表面张力( 从7 2 降到了2 7 m n m ) ， 临界胶束浓度( c m c ) 值达到1 2 8 1 0 一m o l l ，是迄今报道的最有效的表面活性物 质之一。s u r f a c t i n 是由一个含有7 个a 氨基酸的多肽及一个同源系列( 带有1 3 1 5 个碳原子) 的羟基脂肪酸构成的大内脂环( f i g u r e6 ) 4 4 o 现在发现的脂肽 类表面活性物质主要来自b a c i l l u ss p ，如枯草芽孢杆菌( 丑s u b t i l i s ) 、地衣芽孢 杆菌( bl i c h e n i f o r m i s ) 、环状芽孢杆菌c i r c u l a n s ) 和多粘芽孢杆菌p o l y m y x a ) 等 4 5 】。脂肽类生物表面活性剂具有四种生理功能：通过降低表面张力，使微生 物吸收和代谢水不溶性物质；脂肽使微生物细胞易于粘附在烃介质上；具有 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前言 抗微生物和昆虫活性【4 刨；脂肽还可能起到协助产生菌分辨其它微生物和外源 d n a 的作用【4 ”。由于脂肽类物质的高表面活性，国内外学者给予了极大的关注， 在研究其结构 4 8 - 5 3 1 和生理功能5 4 - 5 7 的同时，也对其生物合成的遗传学机制做了广 泛的研究 5 8 - 6 1 】。本研究证实脂肽是一种新型的生物破乳剂。它的高表面活性使它 容易插入到界面膜的空隙或部分取代乳化剂，从而形成正的界面张力梯度，有利 于膜排水；另外，它的分子量小，不能形成空间位阻效应，使界面膜强度降低， 有利于膜振荡破裂，液滴聚合，从而破乳。 + t g i , j - - l k e o - d l e o 川渺母t 0 l 嘲d i e u _ - l s p 3 5r h o d o c o c c u ss p 菌体表面枝菌酸的研究概况 红球菌属于一个特殊的分类单元( m y c o l a t a ) ，它还包括棒状杆菌 ( c o r y n e b a c t e r i u m ) 分支杆菌属( m y c o b a c t e r i u m ) 和诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) 等。这个属的成员与其他革兰氏阳性菌的最明显的区别在于其细胞被膜组成的复 杂性6 2 6 3 】。红球菌的细胞被膜主要由阿拉伯半乳聚糖和2 一烷基3 一羟基的长疏 水性脂肪酸链一枝菌酸组成 6 4 - 6 6 1 。肽聚糖、阿拉伯半乳聚糖和枝菌酸组成一个复 杂的复合物，这个复合物使细胞表面具有一定的疏水性( f i g u r e7 ) 6 5 6 7 。红球 菌枝菌酸一般包含3 2 5 4 个碳。它的烷基侧链一般包括1 0 一1 4 个碳，并且是饱 和的；主链则较长，并且包括0 - - 4 不饱和的双键( f i g u r e8 ) 6 2 , 6 3 。作为一个分 类的依据，枝菌酸的结构被广泛地研究 6 8 - 7 1 1 。而且由于它的免疫性和致病性，科 学工作者对枝菌酸的生物合成和生理功能也做了深入的研究6 6 , 6 7 , 7 2 , 7 3 。本研究发 现红球菌r 的菌体表面枝菌酸使菌体本身具有一定的疏水性，菌体的这种性质 驱使菌体在乳状液中向油水界面扩散并占据一个位置，通过架桥的作用，使分散 液滴在其表面润湿，接触，最后聚合，从而导致了乳状液的破乳。 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 前言 一c严hrp c r t 严c 0 2 h 一 。譬纠一 f i g 7 t h eg e t m r a lt r u o t t t r e 盯tm y c o l i oa c i d t u erg r o u p s r e p r 目e n t 恤h 灿e e r b m 蛐t h er i sm el o n g e r 蛐l b a t t l s t l a l l yc 口n 岫t h eu n s a t u r a t e dr e , o no ft l mr l m l e c l d e h f i g8 c e l ic u w l o p eo r g j n i s a t i o um p , k c , , o c o , x a v ： ”k m a t i cr c p p e m m t a l i o no c t h e p r o p o s e d m 耐f 1 r 曲e m m o , k l s 南r i k 嘞m 础i o no f r n y 口o l l ea d 出w i t h i n k e e t i t n 坩i o p 镐o f t h e i n y e o l a l ap 聃b e 帅a d a p t e d 州t h t 即础f l e t o e e l le 啊l 叩ec o m p o s i t i o n i i i 置h d “ t h e d e l a m 时t i l 女t u m i s l i c o m p l e xe e l l w - l l i b l e t o nw h e 州n 妇p e p t i d o g 即r t i sq t k b o d 妇l i n k a 社m i l l 怕d * m b i q o 单l 耐n w i m t h e m “i 悃1 1 5o f t h e 】a l t e rc a r r y i n gt h e + b o u 州。l u ) e o l l e 鼬试thp m p e u d i c u a ro r k n l a i o nv i i t hn _ p 嘣i of b ep l o s m 自n x 蛳b r m 鼠t e ，em 4 t o l i c 鹏l 出t h u s f h m i h eb a s i so f a no u l i tu p i dp e t t m e b i l i t y h h 日r ( m d r 吼b y t h eb i i o w a t a ) 由m i im o tj ；k l yo m a p l e t e db y t h ep t e m m eo f m y t o l i e 蕾i d - e o m a i n i n g t i p i ! | ic i r e h a l o s ed i m y c o l a l e s ；m m m l “) r , o l y l l i p l 出) t h i l o u l e r 脚b j l i t y k 耐甘m 吖i z k e t h e f o r m o f 啦a 咖_ 曲 b i l a y 甘i f e * d i t a e ip o r t l o mo f t i t m t l 掰n o d b 拇砌吐j n - ，m c x , d t h i m m l l e r l i p l d 椭p h 硒h l i 阿t 帅t b et 词n h a n d 董出o “k d b z r 目n ( r a a r k e db ) o | h 盯捌r 出俚c a n p a r i 叶u - 埘c j p 砌盯嘲d “w i nd ie f 旆坩i ko 曲r s u r 6 m el a y e r + f i 飞u r e2 ，聃m l 出面c 蜘f o j n p r o t e i n s 啪t w 帅科p v 洲 i d i n g _ p a e , v o y 岫强1 虽h t h eo u t e r l i p i d l a i r 打h y & o p l l i c l u l s sa l t h o u g h 怕p r e s e t x xo f i b r ep r o 城a - 1 i a l t i ob ee o n e t r t n c d l l p o p r o w i r a m | y i o e a l i s e t oe n k r t h ep h j m r m m b n m t0 1 臀o l e rj 唧d l 町l o i i ，薯e t l le n v e l o p ep l l l e i n s ( a n d p l a s m a m e m b r a r ”p 呻b h 曲b d 惮b 髑n o r l l i t t 耐临r d a r i t y , t h e l i p o g l y c a 地a r e i 蚰, v 1 1 w i 咖i b e i rk p ma h o m # a e r c a l a t e dw i t h 血e m n h 蛐i 币i 出 d l h o l l g h i tr e n u a l r hp o s d b t e t l m t $ 0 1 1 t p i t a l lo f t h e ea m l o 叫i n t h eo u t c t - l i # d l a 啦 ! 5 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文前言 4 本项目的研究意义 综上所述，许多工业生产中都需要破乳这一过程，与传统的化学破乳相比， 生物破乳具有成本低、生产简单、无污染等无可替代的优点，必然会在国内外有 着广泛的应用前景。尤其是随着全球能源需求紧张，油田老化，进入三次采油阶 段，原油采出液破乳脱水需求日益强烈，生物破乳剂以其固有的优势必将占据重 要地位。本文从菌种筛选入手，得到两株破乳能力较强的菌株，分别对其破乳机 理进行初步探索。而且，通过优化培养条件、原生质体融合等方法提高破乳效率， 最终作用于原油，检验其破乳效果。 6 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文材料与方法 芽孢杆菌x 3 ( b a c i l l u ss px 3 )本室保藏 红球菌r ( r h o d o c o c c u s s pr ) 本室保藏 3 7 3 0 e m ， e m 3 ， a m p 5 a m p 7 i 2 培养基 n b 液体培养基( l ) 牛肉膏5 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c l5 9 ，p h 7 0 7 _ 2 n b 固体培养基 n b 液体培养基中加入1 2 的琼脂 h n b 再生培养基 n b 固体培养基加入0 5 m o l l 的蔗糖 双抗再生培养基 h n b 再生培养基加入红霉素3 0j _ t g m l ，氨苄青霉素3 0 9 9 m l 糖发酵培养基( l ) 蔗糖1 0 9 ，n i - 1 4 c 16 9 ，m g s 0 40 2 9 ，c a c l 27 0 1 0 6 t o o l ，k - h 2 p 0