（微生物学专业论文）冰岛硫化叶菌反螺旋酶基因遗传学分析.pdf

华中农业人学2 0 0 8 届顾i ：论文 摘要 反螺旋酶( r g ) 首先发现于嗜热硫化叶菌，目前在所有超嗜热古菌中都发 现有r g 存在。通过基因组序列分析，证实它是唯一一个超嗜热生物中的特异蛋 白，所以很可能r g 在维持高温下基因组结构的稳定性方面发挥重要的作用。由 于超嗜热古菌遗传体系的缺乏，目前对于r g 的研究限于其在体外的生理生化功 能方面。 本课题是以本实验室分离到的一株冰岛硫化叶菌p y r e f 基因自发突变株 s u l f o l o b u si s l a n d i c u se 2 3 3 为原始出发菌株，以尿嘧啶合成酶基因p y r e f 作为筛 选标记，构建r g 基因的敲除质粒，并转化si s l a n d i c u se 2 3 3 ，利用同源重组的 原理对r g 基因进行敲除。这是第一次采用遗传学方法研究泉古生菌的r g 基因。 通过一系列实验证实，在本实验条件下，反螺旋酶基因是si s l a n d i c u s 的必需功 能基因，不能被敲除。 本实验的研究，主要采用两种质粒构建策略进行r g 基因敲除： 1 首先构建基因敲除载体p r g l ，转化si s l a n d i c u se 2 3 3 之后，在不含尿嘧 啶的选择性平板上长出了转化子。对转化子进行p c r 验证，证实质粒是通过单 交换的方式整合到宿主染色体上，r g 基因没有被敲除。 将转化子分别在非选择性培养基的平板( p v y s u 双层平板) 和选择性平板 ( p w s u 5 f o a 双层平板) 上培养。从理论上讲，整合质粒能分别在两个臂基 因处发生再次重组，进而脱离下来，分别产生回复突变( 回复为i s l a n d i c u s e 2 3 3 ) 和r g 基因缺失突变，这两者频率一致。通过平板计数，计算出回复频 率为o 8 9 ，这证实重组能够发生。p c r 验证r g 等位基因，发现所有重组子都 是回复突变，没有r g 基因缺失株。 2 构建另外一个基因敲除质粒p r gp o pi n - p o po u t 。该质粒能通过一次双交 换整合，然后以环出的方式剪切掉。先将质粒线性化以避免任何可能通过单交 换方式发生的重组。转化& i s l a n d i c u se 2 3 3 之后，获得了一些转化子。通过p c r 的方法分析这些转化子，发现线性化的质粒并没有通过双交换的方式取代r g 基 因，因为r g 基因仍然完整的保留在突变株中，因此p y r e f 基因一定在宿主的其 他位点发生整合。为了分析这些转化子究竟发生了什么变化，以转化子的总d n a 为模板，利用p y r e 基因内的一对特异性引物进行反向p c r ( i p c r ) 实验。用5 种不同的限制性内切酶s m ii 、s c ai 、s p ei 、a fi 、和s n a bi 对转化子总d n a 进行酶切，之后分别连接酶切之后的片段，从而形成i p c r 的d n a 模板。实验 发现5 种酶切后i p c r 的产物大小一致。这一结果表明，在转化子中，一定存在 一个包括p y r e f 基因在内的环状分子。将p c r 产物进行测序分析，发现环状d n a 包括p y r e f 基因和右臂基因的分子。出现这一结果是因为，在缺失质粒p r g p o p 牛中农业人学2 0 0 8 届顾j ：论文 i n - p o po u t 中，存在两个重复的右臂基因。这两个同源臂基因之间发生同源重组， 将质粒环出而产生这种环状分子。所以，包括p y r e f 基因和右臂基因的环状分 子可能通过“整合脱离的方式存在于宿主中。从而能够在缺乏尿嘧啶的培养 基上形成菌落。 本课题的研究结果表明，采用同源重组的方法构建的两种类型的质粒，均 不能实现r g 基因的敲除，说明在该实验条件下，r g 基因是si s l a n d i c u s 的一 个非常重要的功能基因，不能被敲除。这一研究结果也为研究其它类型超嗜热 古菌体内的反螺旋酶的功能提供了一定理论依据。 关键词：冰岛硫化叶菌；反螺旋酶；同源重组；单交换；必需基因 2 华中农业人学2 0 0 8 扁硕1 ：论文 a b s t r a c t r e v e r s eg y r a s ew a sf i r s ti d e n t i f i e di nh y p e r t h e r m o p h i l e s - - - s u f o l o b u s t h e ni t w a sf o u n dt h a tt h i se n z y m ei sw i s d e s p r e a di nh y p e r t h e r m o p h i l e sa n di ti st h eo n l y p r o t e i nt h a t i sc o n s e r v e di na l lh y p e r t h e r m o p h i l i ca r c h a e aa n db a c t e r i a r e v e r s e g y r a s e ( r g ) p r o b a b l yf u n c t i o n si nt h es t a b i l i z a t i o no ft h eg e n o m es n l l c t u 】r eu n d e r h i 曲t e m p e r a t u r e b e c a u s eo ft h el a c ko ft h eg e n e t i cs y s t e m ，t h er e s e a r c ho fr e v e r s e g y r a s ei sl i m i t e dt ot h ep h y s i o l o g i c a ls t u d yo ft h eh y p e r t h e r m o p h i l i co r g a n i s m sa n d b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o no ft h er e v e r s eg y r a s ee n z y m e s f u n c t i o n a la n a l y s i so f r gi nv i v ow a sn o tc o n d u c t e di nc r e n a r c h a e ad u et ot h el a c ko fap r o p e rg e n e t i c s y s t e m t l l i sr e s e a r c hi sb a s e do nas p o n t a n e o u sp y r e fm u t a n to fs u ! f o l o b u si s l a n d i c u s e 2 3 3i s o l a t e di no u rl a b t h ep y r e fg e n e sw e r et h e nu s e da st h es e l e c t i o nm a r k e rf o r t r a n s f o r m t i o n g e n e t i cs y s t e mw a su s e dt os t u d yw h e t h e rt h er gg e n ei se s s e n t i a li n s u l f o l o b u si s l a n d i c u s i no r d e rt od ot h a t ，t i l eg e n e 虹o c k o u tp l a s m i dp r gi sc o n s t r u c t e d a f t e r t r a n s f o r m e di n t osi s l a n d i c u se 2 3 3 t h ep l a s m i dw a si n t e g r a t e di n t ot h el l o s t c h r o m o s o m et h r o u g hs i n g l ec r o s s o v e r , y i e l d i n gu r a c i l p r o f i c i e n tt r a n s f o r m a n t st h a t f o r m e dc o l o n i e so nt h es e l e c t i v ep l a t e s 1 1 1 er gg e n ew a sn o ty e td e l e t e di nt h e t r a n s f o r m a n t s t h et r a n s f o r m a n t sw e r ep u r i f i e da n dp r o p a g a t e di nt h en o n s e l e c t i v em e d i u m ( p v y s ud o u b l el a y e rp l a t e s ) a sw e l la st h es e l e c t i v ep l a t e s ( p v y s u 一5 一f o ad o u b l e l a y e rp l a t e s ) i nt h e o r y , t h ei n t e g r a t e dp l a s m i di nt h et r a n s f o r m a n t ss h o u l db ee x c i s e d f r o me a c ha l t na ta ne q u a le 街c i e n c y a f t e re n r i c h i n gt h e5 f o a r e s i s t a n tc o l o n i e st o 0 8 9 ，p c ra n a l y s i so ft h er gg e n ea l l e l e si sc o n d u c t e d ，a n da 1 1t h e s e 5 - f o a r e s i s t a n tc o l o n i e sm u s th a v ed e r i v a t e df r o mt h eh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n f r o mt h es a m eh o m o l o g o u sa r m , n o n eo ft h e mw e r er gd e l e t i o nm u t a n t t h e na n o t h e rg e n ed e l e t i o np l a s m i dp r g p o pi n p o po u ti sc o n s t r u c t e d t 1 1 i s p l a s m i ds h o u l df u n c t i o nb yi n t e g r a t i o nv i ad o u b l ec r o s s o v e ra n dt h e ne x c i s i o nv i a l o o p i n go u t t h ep l a s m i dw a sl i n e a r i z e di no r d e rt oa v o i da n yp o s s i b l ei n t e g r a t i o nv i a s i n g l ec r o s s o v e r a f t e rt r a n s f o r m i n g i s l a n d i c u se 2 3 3 s e v e r a lt r a n s f o r m a n t sw e r e o b t a i n e d s o m eo ft h e s et r a n s f o t r u a n t sw e r ea n a l y z e db yp c r t h er e s u l ts h o w e dt h a t t h el i n e a r i z e dp l a s m i dd i dn o tr e p l a c et h er gg e n ev i aar e c o m b i n a t i o ne v e n to f d o u b l ec r o s s o v e rs i n c et h er gg e n ew a ss t i l li n t a c ti nt h em u t a n t s 1 1 l em a r k e rg e n e m u s th a v ei n t e g r a t e di n t oa na l t e r n a t i v es i t ei nt h e s et r a n s f o r m a n t s t oi n v e s t i g a t ew h a th a p p e n e di nt h e s et r a n s f o r m a n t s ，i n v e r s ep c r ( i p c r ) w a s d o n ew i t ht h et o t a ld n a sp r e p a r e df r o mt h e s et r a n s f o r m a n sw i t ht h ep r i m e r st h a t s h o u l ds p e c i f i c a l l ya l i g nt h ep y r fg e n e t l l i sw a sd o n ew i t hd i g e s t i o no ft h e i rt o t a l d n a sw i t hf o l l o w i n gf i v er e s t r i c t i o ne n z y m e s i e s m ii 、s c ai 、s mi 、a fi 、a n ds n a b i ，a n dt h er e s u l t i n gd n af r a g m e n t sw e r el i g a t e d ，p r o d u c i n gc i r c u l a rd n at e m p l a t e s 3 华中农业人学2 0 0 8 届硕l ：论义 f o ri p c r i tw a sf o u n dt h a ti p c rd i dg i v ep c rp r o d u c t sf 0 ra l le x p e r i m e n t sa n d s u r p r i s i n g l y , t h es i z e so ft h ep c rp r o d u c ta p p e a r e dt ob et h es a l n e i ns i z e t h e s e r e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h e r em u s te x i s tac i r c u l a rd n am o l e c u l ec o n t a i n i n gt h em a r k e r g e n ei n t h et r a n s f o r m a n t s ，t h e nt h ep c rp r o d u c tw a ss e q u e n c e d a n a l y z i n gt h e o b t a i n e ds e q u e n c ei n d i c a t e dt h a tt h ec i r c u l a rd n aw a sc o m p o s e do fp y r e fa n dt h e r a l t n s i n c er a n nw a sr e p e a t e di nt h ek n o c k o u tp l a s m i d 1 0 0 p i n go u tf r o mt h e l i n e a rp l a s m i dw o u l dy i e l dt h ec i r c u l a rp y r e fa n dr a r mc a s s e t t e t h u s ，i tw a s p o s t u l a t e dt h a tt h ec o n s i s t e n ti n t e g r a t i o na n de x c i s i o no ft h eg e n ec a s s e t t eo f p y r e f a n dr a r mr e s u l t si nt h ep e r s i s t e n c eo fp y r e fg e n ei nt h ep o p u l a t i o n , r e n d e r i n gt h e f o r m a t i o no fc o l o n i e so nu r a c i l f r e ep l a t e s c o n s e q u e n t l y , t h i sg e n ek n o c k o u tm e t h o d i sn o ts u i t a b l ef o rs t u d y i n ge s s e n t i a lg e n e s h o w e v e r , if a i l e dt od e m o n s t r a t ew h e t h e r t h er gg e n ei se s s e n t i a lf r o mt h i se x p e r i m e n t t h er e s e a r c hi n d i c a t e dt h a tt h ed e l e t i o no fr gg e n ed e p e n d i n go nt w om e t h o d s o fh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nw e r ef a i l e d t h e s er e s u l t ss t r o n g l ys u g g e s tt h a tt h i sr g g e n ei se s s e n t i a lu n d e rt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，i ti sav e r yi m p o r t a n tf u n c t i o n a l g e n eo fsi s l a n d i c u s w h i c hi sc a n tb ed e l e t c d n i sr e s e a r c hg i v e ss o m et h e o r e t i c a l 舀s tf o rs t u d y i n gr g o fo t h e rt y p e so fh y p e r t h e r m o p h i l e s k e yw o r d s ：s u l f o l o b u si s l a n d i c u s ；r e v e r s eg y r a s e ；h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ： s i n g l ec r o s s o v e r ； e s s e n t i a lg e n e 4 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 参1 致 时间：卅r 年乡月i ) 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传 播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者签名：剀教导师签名：乡雾三彳事 签名日期：y 内8 年月f 多日 签名日期：刀捌年多月哆日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业人学2 0 0 8 届硕i ：论文 j - - - l 刖吾 1 1 古菌概述 在地球上的极端环境中存在着旺盛的生命，在极端盐、酸、碱浓度或压力、 温度的环境中都可以发现微生物。而通常最能耐受极端环境的这些微生物都是 古细菌。1 9 7 7 年w o e s e 等人根据2 0 0 多种原核生物和真核生物的核糖体小亚基 r n a ( s s ur r n a ) 的部分序列进行相似性分析，结果发现产甲烷菌、极端嗜盐 菌和硫依赖嗜热菌与其它细菌、真核生物不同，于是他们提出将古细菌 ( a r c h a e o b a c t e r i a ) 单列为一界。因为典型代表一产甲烷菌的生存环境与想象中 原始地球的厌氧环境类似，故称为古细菌，其余细菌称为真细菌。从而把地球 上的生物分为真细菌( e u b a e t e r i a ) 、古细菌( a r c h a e o b a c t e r i a ) 和真核生物 ( e u e a r y a ) 三界，代替目前普遍接受的生物的五界系统，提出了三界学说。在 此基础上，w o e s e 等人( w o e s ec re ta 1 ，1 9 8 7 ) 于1 9 9 0 年提出了生命三域( t h r e e d o m a i n s ) 进化系统，即古生菌域( a r c h a e ad o m a i n ) 、细菌域( b a c t e r i ad o m a i n ) 和真核生物域( e u c a r y ad o m a i n ) ，认为现代生物都是从一个共同的祖先一前细 胞( p r e c e l l s ) 分三条线进化形成的，并构建了系统进化树( 图1 1 ) ( a d a m sm w ，1 9 9 3 ) 。 古细菌( a r c h a e a ) 具有区别于细菌、真菌独特的生理、生化特性。在目前 国际广泛采用的以1 6 1 8 sr r n a 序列为基础的进化树分析中，古细菌代表了所 有最原始生物形态的分枝，即在目前所有的生命形态中，古细菌最接近生命的 最原始形态。对古细菌r n a 的进一步研究发现它与真核生物的关系要比与真 细菌的关系更为密切。研究表明，古细菌在d n a 复制、转录、翻译等方面与真 核生物相似，而在代谢方面则与细菌接近( w o e s ec 1 9 8 7 ) 。因此，研究古 细菌不仅在阐明生命运动的基本规律、物种进化等方面具有重大意义，而且有 助于了解较为复杂的真核生物的一些重要生物学过程。 古菌最初发现于一些极端环境下。但是分子生态学研究发现，嗜温古菌也 广泛分布于自然环境中。最近，分离出一株嗜温古菌，对这株嗜温古菌的研究 将有助于我们对古菌生物学有一个更全面的认识。 华中农业人学2 0 0 8 届硕i ：论文 图1 - 1 系统进化树 f i g1 - 1p h y l o g e n e t i ct r e e 古菌的生长环境虽然差异很大，但在细胞学、生物化学及遗传学上有一些 共有的特征。如，在形态上类似细菌，但细胞壁不含肽聚糖，而是由蛋白、糖 蛋白、多糖等构成( k a n d l e r , 1 9 9 8 ) ：古菌的细胞壁含有由分枝脂肪酸与d 型 磷酸甘油以醚键相连而成的脂类，而细菌及真核生物的细胞膜的脂类则由不分 枝脂肪酸与l 型磷酸甘油以酯键相连而成；与细菌相似，古菌染色体d n a 呈闭 合环状( b a u m a n ne ta 1 ，1 9 9 8 ) ，基因也组织成操纵子，但在d n a 复制、转录、 翻译等方面，古菌与真核生物类似，如采用非甲酰化的甲硫氨酸t r n a 作为起始 t r n a ，启动子、转录因子、d n a 聚合酶、r n a 聚合酶等均与真核生物类似( 1 w a b e e ta t ，19 8 9 ；g o g a r t e ne ta 1 ，19 8 9 ；z i l l i ge ta 1 ，19 8 9 ；b r o w ne ta 1 ，19 9 5 ) 。 古菌的研究工作相对困难，主要受以下两方面因素的影响。首先，大多数 古菌为极端微生物，要求有很特殊的生长条件，必须先解决培养古菌的困难； 其次，由于古菌和细菌在细胞结构上的差别，很多为细菌研究而发展起来的有 效方法和工具不适合于古菌的研究。尽管如此，古菌的研究工作还是取得了一 些重要进展，在嗜盐古菌中，已经构建了几种带有嗜盐菌复制起点以及抗性基 因的穿梭载体。古菌的遗传机制如复制、转录等过程也有一定程度的了解。到 目前为止，共完成了5 3 个古菌的全基因组测序工作，与本研究的对象s u l f o l o b u s i s l a n d i c u se 2 3 3 亲缘关系非常近的硫磺矿硫化叶菌( s u l f o l o b u ss o l f a t a r i c u s p 2 ) 的 全序列测定也已经完成( s h ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。古菌的基因组学已经并且还将继续 为进化学家、遗传学家、生化学家提供大量的信息。 6 华中农业人学2 0 0 8 扁硕i ：论文 表1 - 1 古菌的不同类型 t a b l e1 - 1d i f f e r e n tt y p e so fa r c h a e a 占菌( a r c h a e a ) 类型最适生k = 条件 嗜热卤( t h e r m o p h i l e s ) 超嗜热菌( h y p e r t h e r m o p h i l e s ) 嗜冷茵( p s y c h r o p h i l e s ) 嗜盐菌( h a l o p h i l e s ) 产甲烷菌( m e t h a n o g e n s ) 嗜酸菌( a c i d o p h i l e s ) 嗜碱菌( a l k a l i p h i l e s ) 嗜压菌( b a r o p h i l e s ) 5 5 8 0 8 0 _ 一1 1 0 2 0 盐浓度儿乎饱和，内外浓度相等 严格厌氧，可产甲烷，包括中温、嗜热、嗜盐类型 最适生长p h 9 最适生长压力达到5 0 m p a 近年来，随着人们对生物进化机制与极端环境微生物的深入研究，古细菌 同益引起了世界科学工作者的广泛关注。利用不断发展与更新的技术，人们发 现了越来越多的古细菌，特别是使用新的基因工程技术，部分古细菌的基因全 序列被测定并公布。每一次对古细菌基因组成、结构和功能的深度探索都推动 了科学工作者对生命的最原始形态特性及其生活环境更进一步的认识( d a m o n e ta 1 1 9 9 8 ) 。 1 2 嗜热古菌 嗜热菌的研究热潮始于上世纪的六七十年代。自从1 9 6 9 年t h o m a s 及其同 事从美国黄石国家公园的温泉中分离到最适生长温度为7 0 的水生栖热菌 ( t h e r m u sa q u a t i c u s ) ( r o t h s c h i l d ，2 0 0 1 ) ，近3 0 年来，嗜热菌的研究取得了重 要的进展。从陆地到海洋温泉以及许多其它高温生态环境发现了约7 0 个属1 4 0 种嗜热菌，并采用最先进的研究手段对这些高温菌的分类、生理、生化、生态、 遗传、生物工程等进行了广泛深入的研究。在w o e s e 的系统进化树中，超嗜热 菌只限于在古菌域和细菌域中发现，且绝大多数属于古菌。在9 5 以上生长的 则全部属于超嗜热的古菌。在进化树中( 图1 1 ) ，短的分支表示生物进化非常 缓慢。所有的超嗜热微生物都处于进化树的最底部，进化关系密切，似乎表明 超嗜热微生物非常原始，是生命的共同祖先( s t e t t e r , 1 9 9 6 ) 。考虑到由于最原 始的地球环境条件对普通生命来说太过苛刻，而超嗜热菌的生存环境与地球的 原始状态颇为接近，因此提出超嗜热菌是最原始的生命形式的假说似乎是合情 合理的( f o r t e r r ep ，1 9 9 6 ) 。 已知的大多数嗜热微生物是中度嗜热菌。目前发现的中度嗜热微生物分属 于许多不同的真核和原核的分类群，如原生动物、真菌、藻类、蓝细菌、梭菌 7 华中农业人学2 0 0 8 届硕i ：论文 和杆菌( 曹军卫等。2 0 0 4 ) 。生命最高上限温度的代表是超嗜热微生物和古生 菌( w o e s ec 凡1 9 7 7 ) 。迄今从陆地和海洋的高温环境中，已经分离出许多超 嗜热微生物，在这些地方它们形成了生物群落( j a m e s ，1 9 9 8 ) 。最普通的高温生 物区域有火山和地热的高温体系，例如硫磺温泉、中度热泉和海底含盐的热火 山口。通常硫磺温泉地区土壤由不同的两层组成，上面的酸性层含有大量的氧， 由于三价铁离子的存在，它是呈赭色。从这一层分离得到许多好氧的超嗜热嗜 酸菌，如硫化叶菌属( s u l f o l o b u s ) 和酸双面菌属( a c i d i a n s ) 的细菌。这个区域 以下由于亚铁离子的存在，表现为淡黑蓝色，p h 值是中性的，氧化还原状态明 显降低了。从这一层中可以分离出热变形目( t h e r m o p r o t e a s e ) 和甲烷嗜热菌 ( m e t h a n o t h e r m u s ) 的细菌。海底高温体系位于浅滩和深海处，由温度大约在 4 0 0 以上的热的喷气口、热泉、热的沉积物和深海火山口组成。这些高温体系 中栖息的菌类有热球菌目( t h e r m o c o c c u $ ) 、甲烷球菌目( m e t h a n o c o c c u s ) 、 古生球菌目( a r c h a e o g l o b a l e s ) 和栖热袍菌目( t h e r m o t o g a l e s ) 。但至今仅在深 海区分离得到了甲烷嗜高热菌属( m e t h a n o p y r u s ) 的细菌，在浅海区广泛分离到 的是产液菌属( a q u i f e x ) 的细菌。有证据表明，在冷的海水中有超嗜热微生物 存在，尽管它们不能生长，但能以一种休眠状态存活许多年。目前发现的超嗜 热的古生菌和细菌有4 0 - 5 0 种，它们差异性很大，分布在2 3 个属和1 0 个目中。 至今为止发现的最耐热的微生物是p y r o l o b u s f u m a r i i ，能够在1 1 3 条件下生长 ( b l o c h l ，1 9 9 7 ) 。 由于嗜热微生物在生命进化树中的特殊位置，它的研究将有助于揭示生命 起源、生命极限、生命本质等生命科学的悬念。嗜热微生物及活性物质可在苛 刻条件下行使功能，达到一般生物技术难以达到的目的，直接实现了基因工程 和蛋白质工程所要达到的愿望；嗜热微生物特有的遗传信息资源，极具发掘新 型功能蛋白及代谢产物的潜力。嗜热菌的利用有助于突破当前生物技术领域中 的一些局限，为提高生物技术能力丌辟了重要途径( k a t oe ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 有研究认为，生命最初是从高温环境进化的，当时地球的温度比现在高， 所有原生菌均生活在9 0 以上的环境中( f o r t e r r ee ta 1 ，1 9 9 6 ) 。嗜热微生物体 内的酶在高温环境中发挥功能，称为嗜热酶。如果生命开始于生存在热环境中 的嗜高温微生物，进化便是使嗜热酶转变为常温和低温的酶。研究引起原始酶 改变的因素，比较同源的嗜热酶、常温酶和嗜低温酶的结构特点，自然对设计 新的嗜热酶有重要的启示( m i c h a e le ta 1 ，1 9 9 8 ) 。嗜热酶具有酶制剂的制备成本 低，动力学反应快，对反应冷却系统要求标准低，减少能耗，提高了产物纯度 等优点( 曹军卫等，2 0 0 4 ) ，因此在众多领域都得到了广泛应用。近年来，嗜 热酶已在食品酿造工业、医药工业、环境保护、遗传工程等领域得到应用，其 良好前景备受关注。例如，从多种嗜热菌如水生栖热菌、海栖热袍菌、 t h e r m o c o c c u sl i t o r a l i s 和激烈热球菌中获得的d n a 聚合酶已有商品出售。这些 华中农业人学2 0 0 8 屈颂l ：论文 d n a 聚合酶大大扩展了p c r 的应用范围。耐热q 淀粉酶( l i ne ta l ，1 9 9 8 ) 、 蛋白酶( h a k ie ta l ，2 0 0 3 ) 、脂肪酶( y a ne ta l ，2 0 0 0 ) 、纤维素酶( m e l v i npa n d t u c k e r , 1 9 8 9 ) 等已广泛应用于食品和医药等工业。如利用a 淀粉酶生产葡萄糖， 利用脂肪酶高度立体选择，进行光学合成手性药物等( z h o ue ta 1 ，2 0 0 1 ) 。由于 嗜热酶具有的诸多优点，可以将它们作为设计和构建工业上具有新特性的蛋白 模型而加以利用。 由此可见，嗜热微生物的研究在探讨生命起源、生物进化以及高温适应机 制方面具有重要的意义。 1 3 拓扑异构酶 1 9 5 3 年，w a t s o n 和c r i c k 年提出了两条d n a 链以碱基互补方式结合的理 论( w a t s o njda n dc r i c kfh ，1 9 5 3 ) ，该理论解释了细胞内大量遗传信息流之间 的相互作用模式。但是同时d n a 双螺旋结构理论引发了一系列重要的问题，在 这一模型中，d n a 双链缠绕在一起，但是当它们要分离的时候它们是如何解链 的? 这个问题引发了一个新的研究领域，d n a 拓扑异构学及研究对象一d n a 拓 扑异构酶。 拓扑异构酶与d n a 形成共价结合的蛋白质d n a 中间体，从而在其骨架的 磷酸二酯键处造成暂时性的缺口，改变d n a 的拓扑学状态。在这一过程中，d n a 的链环数虽然改变了，但其核苷酸序列并无任何变化。最初认为拓扑异构酶只 可以松弛负超螺旋，随着研究工作的深入，发现不同的拓扑异构酶在细胞内可 行使许多功能。拓扑异构酶几乎涉及了所有与d n a 拓扑学状态变化有关的活动 和进程，如复制，转录，重组，染色体的聚合、分配以及d n a 修复等重要环节。 在转录和重组中，双螺旋链必须暂时性的分开，而在复制中双螺旋链要永久性 的分离，这些过程都会导致d n a 拓扑学状态的变化。另外，d n a 的许多活动 都可以形成超螺旋，如转录过程中r n a 合成酶的结合，d n a 与组蛋白或其它 蛋白的结合。在原核细胞中，许多启动子的转录需要一定水平负超螺旋的d n a ， 而在细胞复制中，复制完成的染色体必须依靠d n a 拓扑异构酶松弛后才能分开， 细胞分裂中姊妹染色体的分离也是通过d n a 拓扑异构酶的作用来完成。以上这 些例子说明，由于d n a 的自身结构或者细胞内代谢活动的要求，d n a 的拓扑 学状态需要被拓扑异构酶调整到最佳状态才能完成复杂的遗传活动。 1 9 7 1 年j i m w a n g 在大肠杆菌中发现第一个拓扑异构酶叫蛋白，现在称 之为拓扑异构酶i 。一年后，j a m e s c h a m p o u x 和r o b e r td u l b e c e c o 在鼠细胞的核 酸提取物中发现一种具有切口融合作用的拓扑异构酶i 。但是这些拓扑异构酶不 同于“切口融合酶 ，因为后者能够松弛正、负超螺旋，但是蛋白只能松弛负 超螺旋d n a 。现在这种类型的酶被分为认型和i b 型。 9 华中农业人学2 0 0 8 届顾i ：论文 t o p l a 型拓扑异构酶包括细菌和吉菌的拓扑异构酶i 、细菌的拓扑异构酶、 反螺旋酶以及真核生物拓扑异构酶i i i 。 拓扑异构酶i 催化的链的穿越、连环化、脱连环化等过程，一般认为是酶切 割一条单链，并成为连接切口的两端的“桥”，另一条未被切割的单链通过“桥”穿 越切割链，这种机制称为酶一桥模型。 t o p oi b 家族包括三种酶，真核生物拓扑异构酶i ，痘病毒拓扑异构酶i ， 和坎氏甲烷嗜热菌拓扑异构酶v 。这些拓扑异构酶在结构和功能上与酪氨酸重组 酶包括噬菌体p i 的c r e 蛋白，e c o l i 的x e r d 重组酶以及病毒整合酶有一定的同 源性。 t o p oi b 亚家族中的成员与其它己知拓扑异构酶没有序列和结构上的同源 性，并且与t o p oi a 在功能上有很大差别。与m 型拓扑异构酶不同，t o p oi b 既 可以松弛负超螺旋也可以松弛正超螺旋，并且松弛反应能进行得完全。与这些 特点相一致，t o p oi b 不需要底物d n a 的部分单链。t o p oi b 与d n a 形成共价 复合物时，酶分子共价地连接于切割链的3 末端。这些酶不含结合的金属离子， 催化d n a 松弛反应时不需要m 孑+ 。 7 0 年代术，在真核生物体内发现能水解a t p 但不能产生超螺旋的拓扑异构 酶i i 。所有i i 型拓扑异构酶有以下特点：由二聚体组成的酶分子在d n a 双链上 产生一个四碱基的交错切口；酶与d n a 形成的复合物共价连接于d n a 分子的 5 末端；反应结果是改变两个链环数；活性依赖m f + 存在和a t p 的水解；晶体 结构( 包括结构上相距较远的t o p o v i ) 表明了活性位点都位于螺旋一转角一螺 旋( h t h ) 这样一个基序中。t o pi i 中也存在一个非常保守的与催化活性相关 的精氨酸残基。有几个特征可以区别t o p oi i 亚家族中的各成员，所有的原核生 物的t o p 0 都由有两个不同的亚基形成异源四聚体；而真核生物t o p oi i 都为 同源二聚体。在所有己知的t o p oi i 中，螺旋酶是唯一利用a t p 水解产生的能量 来引入负超螺旋的酶。不同的t o p oi i 成员所行使的细胞内功能也有差别。 1 。4 反螺旋酶 在所有的拓扑异构酶中，反螺旋酶是唯一能利用a t p 水解产生的能量向 d n a 分子中引入正超螺旋的拓扑异构酶。由于其在与d n a 作用时产生单链切 口，反螺旋酶属于队型拓扑异构酶( f o r t e r r e ，1 9 8 5 ) 。然而，它与其它i 型拓扑 异构酶在以下三个方面有很大区别。首先，反螺旋酶可向d n a 分子中引入j 下超 螺旋，而其它i 型拓扑异构酶只能松弛负超螺旋；其次，反螺旋酶需要利用a t p 水解产生的能量向d n a 分子中引入正超螺旋，而其它i 型拓扑异构酶不需要a t p 提供能量，从这一点上讲，反螺旋酶更象i i 型拓扑异构酶；最后，反螺旋酶的 作用结果只能增加d n a 的链环数，而其它i 型拓扑异构酶的作用结果是既可以 l o 华中农业人学2 0 0 8 届顾i ：论文 增加链环数，也可以减少链环数。 反螺旋酶首先发现于嗜酸热硫化叶菌( s u l f o l o b u sa c i d o c a l d a r r i u s ) 中 ( k i k u c h ie ta 1 ，1 9 8 4 ) ，该菌的最适生长温度为7 5 ，后来发现这种酶存在于所 有嗜热的古菌和细菌中，推测它可能也存在于嗜热的真核生物中，但是目前还 没有足够的证据( k o oe ta 1 ，1 9 9 2 ；g a n g o f f , 1 9 9 4 ) 。表1 2 列出了一些古菌和细 菌的反螺旋酶，从表中可以看出，在已测序的嗜热微生物中都存在着反螺旋酶 的基因，有时还还有两个拷贝( d e c c k e r te ta 1 ，1 9 9 8 ) 。同时，在表中列出的嗜热 微生物细胞粗提液中都检测到了反螺旋酶的活性。这种分布使得该酶成为嗜热 微生物的一个很好的标记。 目前已从四种古菌( n a d a le ta 1 ，1 9 8 8 ；b o r g e se ta 1 ，1 9 9 7 ；k o s y a v k i ne ta 1 1 9 9 4 ；n a d a le ta 1 ，1 9 9 4 ) 和两种细菌( b o u t h i e r d el at o u re ta 1 ，1 9 9 8 ；a n d e r ae ta 1 1 9 9 3 ) 中分离纯化得到了天然的反螺旋酶，同时，嗜酸热硫化叶菌，溶淀粉硫 还原球菌( d e s u l f u r o c o c c sa m y l o l y t i c u s ) ，闪烁古生球菌的反螺旋酶基因在大肠杆 菌中都得到了很好的表达。几乎所有已研究过的反螺旋酶都有着非常相似的物 理学特征，而根据s d s p a g e 揭示的分子量大小都在11 5 1 3 5 k d a ，而且这个分 子量通常比序列计算所得的分子量要小，例如，嗜酸热硫化叶菌反螺旋酶由序 列推测所得分子量为1 4 3 k d a ，而根据s d s p a g e 估算的分子量是1 2 8 k d a ( c o n f a l o n i c r