（植物学专业论文）银杏受精作用及胚胎发生.pdf

首都师范大学硕十学位论文 摘要 本文从光镜和电镜水平对银杏( g i n k g o b i l o b al ) 雄配子体发育、受精作用 及胚胎发生进行了研究，主要结果如下： 1 ，银含精原细胞核从球形转变为凸透镜形时，核膜从较为平滑，转变为起伏、 不规则的皱褶状，突起的核膜与液泡状结构相距很近，最近时仅3 1 - tm ；核仁形 态在精原细胞发育期间也发生明显改变：最初由中央弱染色的纤维区域及周围呈 环形分布的电子染色较致密的颗粒区构成，后来为染色深且均一的球形结构。 2 随着精原细胞的发育，生毛体体积逐渐增大，最初生毛体周围细胞器的组成 和数量极其丰富，以质体为主；但生毛体发育成熟后，细胞器明显减少，线粒体 相对增加。液泡状结构周围细胞器丰富，排列较有规律，偏细胞核一侧嗜锇小滴 丰富，与生毛体相邻一侧线粒体和质体相对较多。纤维颗粒体具多形性，在精原 细胞和精细胞内可见“哑铃形”、“球形”、“不规则团块状”三种不同形状。 3 ，受精前的精核直径约4 0um ，而受精时与卵核融合的精核直径约2 0um ，说 明精核在受精前体积浓缩。在受精前的一些精细胞中可观察到其核内出现一个真 径约2 0 3 0um 染色较深的球形区域，我们推测精核凝集前遗传物质先凝集到 一个区域，然后精核凝集。受精时，具鞭毛的成熟精细胞进入颈卵器，鞭毛带及 精细胞质遗留于颈卵器内，仅精核及部分细胞质进入卵细胞。 4 合子的第一次分裂为原位纵向分裂，分裂中期染色体外有两层膜样结构包 被，说明可能有雄性细胞质进入，分裂末期细胞核之间有明显的类似细胞板的结 构，但随后的分裂无此结构出现。游离核细胞化前后，在细胞核周围存在明显的 辐射状排列的类似纺锤丝的结构。 5 对银杏( g i n k g o a c e a e ) 和苏铁( c y c a d a c e a e ) 的形态解剖特征比较表明：银 杏在营养器官、雄配子体发育等方面表现出：大量的进化特征，但在雌配子体发育、 胚胎发生上表现出更多原始特性。另外银杏还具有一些特有结构，如雌配子体中 含叶绿体，具独特的帐篷柱结构，精原细胞和成熟精细胞中具液泡状结构、纤维 性颗粒体等。这表明银杏在进化过程中适应环境时与苏铁类植物可能采取了不同 的策略，两者之间可能没有直接的亲缘关系，而是在各自的演化路线上平行发展。 关键词：银杏；雄配子体；生毛体：液泡状结构；纤维颗粒体；受精作用：胍 胎发育 首都师范大学硪上学位论文 a b s t r a c t 7 9 i r l sd i s s e r t a t i o nm a i n l ys t u d i e dt h em a l eg a m e t o p h y t ed e v e l o p m e n t ，f e r t i l i z a t i o n a n d e m b r y o g e n e s i s i ng i n k g ob i l o b a ( l ) t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h em o r p h o l o g yo ft h en u c l e u sm e m b r a n ec h a n g e df r o ms m o o t h n e s st ow a v e n e s s a st h es p h e r i c a ls h a p e ds p e r m a t o g e n o u sn u c l e u sb e g a nt oe l o n g a t e t h ep r o t u b e r a n t n u c l e a r e n v e l o p ew a s c l o s e dt ot h ev a c u o l e l i k es t r u c t u r ea n dt h ec l o s e s td i s t a n c ew a s o n l y3um b e t w e e nt h e m t h em o r p h o l o g yo fn u c l e o l u sa l s oc h a n g e dd u r i n gt h e d e v e l o p m e n t o ft h es p e r m a t o g e n o u s a tt h ef i r s ts t a g e ，t h en u c l e o l u sc o n s i s t e do fa n o u t e rr i n g e d - e l e c t r o n d e n s eg r a n u l a ra n da l li r m e re l e c t r o n - l u c e n tf i b r o u sc o r e ，t h a ni t b e c a m eah o m o g e n o u s l yd e n s es t a i n e dr o u n ds t r u c t u r e 2 t h eb l e p h a r o p l a s tc o n t i n u e dt o e n l a r g e a st h e s p e r m a t o g e n o u s c e l lf u r t h e r d e v e l o p e d t h eo r g a n e l l e sa r o u n dt h ei n i t i a lb l e p h a r o p l a s tw e r ev e r ya b u n d a n t ，a n d m n o n g t h eo r g a n e l l e s ，t h ep l a s t i d sw e r ep r o m i n e n t a f t e rt h eb l e p h a r o p l a s tm a t u r e d ， t h eo r g a n e l l e sd e c r e a s e ds h a r p l yb u tt h ep r o p o r t i o no ft h em i t o c h o n d r i ai n c r e a s e d t h e o r g a n e l l e s a r o u n dt h ev a c u o l e l i k es t r u c t u r ew e r ea b u n d a n ta n d r e g u l a r l y a r r a n g e d ，t h eo s m i o p h i l i cd r o pw a s c o n s t r a i n e dt ot h ea r e ab e t w e e nt h en u c l e u sa n d t h ev a c u o l e l i k e s t r u c t u r e ，w h i l e t h em i t o c h o n d r i aa n d p l a s t i d s w e r e m a i n l y d i s t r i b u t e dn e a rt h eb l e p h a r o p l a s t t h ef i b r i l l o g r a n u l a rb o d yh a dt h r e ef o r m si n c l u d i n g d u m b e t t e d 一s p h e r i c i t y ”a b n o r m i t yc o n g l o m e r a t i o n ”i nt h es p e n n a t o g e n o u s c e l la n dt h es p e r m 3 a d a r k l ys t a i n e d a r e a o f a b o u t 2 0 一3 0 p n 3 i n s i z ec o u l d b e o b s e r v e do c c a s i o n a l l y i nt h e4 0ums i z e ds p e r mn u c l e u sb e f o r ef e r t i l i z a t i o n a tt h et i m eo ff e r t i l i z a t i o n t h e s p e r m w i t ht h ef l a g e l l u me n t e r e di n t ot h ea r c h e g o n i u m ，o n l yt h em a l em a t t e r2 0um i nd i a m e t e rf u s e dw i t ht h ee g gc e l l ，a n dt h es p e r m c y t o p l a s ma n d t h ef l a g e l l u mw e r e l e f to u t s i d et h e e g gc e l l t h i s i n d i c a t e dt h a tt h e g e n e t i c s u b s t a n c ei nt h e s p e r m c o n d e n s e db e f o r et h es p e r mn u c l e u s u n d e r g o i n g c o n d e n s a t i o nb e f o r ef e r t i l i z a t i o n ，t h e d a r ka r e ai nt h e s p e r m n u c l e u sw a g p r o b a b l y t h em i d d l ef o r mo ft h en u c l e a r c o n d e n s a t i o n 4 t h ef i r s td i v i s i o no f t h ez y g o t ew a sa n t i c l i n ed i v i s i o ni ns i t u a tt h em e t a p h a s eo f 2 首都师范大学硕士学位论文 t h ed i v i s i o n ，t w ol a y e rm e m b r a n e l i k e s t r u c t u r ea p p e a r e do u t s i d et h ec h r o m o s o m e ， i n d i c a t i n gt h a tt h es p e r mc y t o p l a s me n t e r e di n t ot h ee g g c e l l a tt h et e l o p h a s eo f t h e d i v i s i o n ，t h ec e l lp l a t ee m e r g e db e t w e e nt h et w od a u g h t e rn u c l e i ，b u ti td i s a p p e a r e d i n t h e f o l l o w i n gd i v i s i o n d u r i n g t h et i m eo t 、c e l lw a l lf o r m a t i o n ，n u m e r o u sf i b e r s r a d i a t e df r o mt h en u c l e iw e r ec o n s p i c u o u s 5 ，t h ec o m p a r a t i v es t u d i e so nt h ea n a t o r a i c a la n dm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r so f g i n k g o a c e a a n d c y c a d a c e a e s h o w e dt h a t g i n k g o a c e ap o s s e s s m o r ee v o l u f i v e c h a r a c t e r si nt h es t r u c t u r eo ft h ev e g e t a t i v eo r g a n s ，t h em a l eg a m e t o p h y t ea n ds e e d s ； b u tp o s s e s sm o r ep r i m i t i v ec h a r a c t e r si nt h ef e m a l eg a m e t o p h y t e t h eg i n k g o a c e a h a ds o m e s p e c i a lp r o p e r t y ：t h ec h l o r o p l a s t a n dt h et e n t p o l e i nt h ef e m a l e g a m e t o p h y t e ，v a c u o l e - l i k es t r u c t u r ea n df i b f i e o g r a n u t a rb o d yi nt h es p e r m a t o g e n e u s c e l la n ds p e r mc e l la n ds oo n t h o s es h o w e dt h mg i n k g o a c e aa d o p t e dd i f f e r e n t s t r a t e g i e sf r o mc y c a d a c e a e a se n v i r o n m e n tc h a n g e d ，a n dt h e yh a dn o td i r e c t l yr e l a t e d i np h y l o g e n ya n d u n d e r g o n ep a r a l l e ld e v e l o p m e n t i ne v o l u t i o n a r y , k e yw o r d s ：g i n k g ob i l o b al ；m a l eg a m e t o p h y t e ：b l e p h a r o p l a s t ；v a c u o l e l i k e s t r u c t u r e ； f i b r i l l o g r a n u l a rb o a y ；f e r t i l i z a t i o n ；e m b r y o g e n e s i s 3 首都帅范大学硕二 学位论文 1 前言 银杏( g i n k g ob i l o b a l ) 又名白果、公孙树，是我国特有的中生代孑遗裸子 植物( 李正理，1 9 5 9 ；郑万均等，1 9 7 8 ；傅立国，1 9 9 2 ) 。银杏约起源于占生 代的上石炭纪，中生代侏罗纪时，曾广布北半球，种类也相当丰富，包括毛状叶 科( t r i c h o p j t y a c e a e ) 、卡肯果科( k a r k e n i a c e a e ) 、乌马托鳞片科 ( 踟a n o j e p j 击a c e a e ) 、施迈斯内果科( s c h m e w a s s n e r i a c e a e ) 、义马果科 ( y i m a i a c e a e ) 、银杏科( a i n k g o a c e a e ) 六科( 周志炎1 9 9 4 、2 0 0 3 ) ，但从白垩 纪晚期开始，银杏类植物逐渐衰退，最后仅在我国存留下来，目前野生状态的银 杏据称仅分布在我国浙江的西天日山( 李惠林，1 9 5 6 ，1 9 6 1 ；林协，1 9 9 1 ；郑万 均等，1 9 7 8 ) 。因此银杏被许多植物学家称之为“活化石”( c h a m b e r l a i n ，1 9 3 5 ； 李正理，1 9 5 9 ；f a v r e d u c h a r t r e ，1 9 5 6 ：郑万均等，1 9 7 8 ；王伏雄，1 9 8 3 b ：郭 善基，1 9 9 3 等) 。 银杏具有重要的商用和药用价值。银杏是多年生高大落叶乔木，树龄长达数 百年至数千年，是优良的建筑材质，同时银杏抗病力强，叶形美而奇特，对烟尘 和s o ：有特殊抵抗能力，作为观赏和绿化环保树种现在已经广布全球( 郭善基， 1 9 9 3 ) 。银杏的果实俗称白果，在我国又是珍贵的药材和传统的保健食品，明本 草纲目记载：银杏性平味甘苦涩，有小毒入肺。有益肺气、定痰喘、止带浊、 缩小便、通经、杀虫等功效。银杏叶提取物的有效成分是黄酮类化合物及萜类、 酚类，对心血管、脑血管、动脉硬化、高血压等疾病的治疗，都有其它药物不可 替代或不能达到的特殊疗效。此外，银杏叶提取物还能有效抑制亚硝胺等物质的 致癌作用。经常食用银杏加工品有还丰润肌肤、抗皱美容、延年益寿等作用。目 前我国用银杏叶提取物配制的护肤、护发、生发、减肥等方面的系列产品( 如罐 头食品、固体饮料、液体饮料、蜜饯、及银杏茶、银杏保健食品等) 已不下5 0 种。，银杏在学术上也有重要的研究价值，由于银沓具有许多原始性状，故对研 究裸予植物的系统发育、古植物区系、古地理及第四纪冰川气候等都有重要价值。 银杏的生殖过程研究，最早见于s t r a s b u r g e r 对其生活史的描述 ( s t r a s b u r g e r ，1 8 7 2 ，1 8 7 9 ) 。1 8 9 6 年日本东京大学平濑作五郎( h i r a s e ) 发现 银杏精予具鞭毛的结构，这一发现以日文在东京植物学杂志上发表( h i r a s e ， 首都师范大学硕= t 学位论文 18 9 6 ) ，引起了整个欧洲植物学界的轰动。同年池野( i k e n o ) 报道在苏铁( c y c a s r e v o l u t a ) 精子中也观察到鞭毛的结构( i k e n o ，1 8 9 6 ) 。从而确立了银杏与苏铁在 裸予植物中的系统位置，并将裸予植物和蕨类植物在系统演化上联系起来。 2 0 世纪前期，对银杏的生殖过程研究多集中在光镜水平，较重要的有l y o n 对银杏胚胎发育过程的描述( l y o n ，1 9 0 4 ) c a r o t h e r s 对银杏胚胎和雌配子体的 研究( c a r o t h e r s ，1 9 0 7 ) ，h e r z f e l d 对银杏的生殖过程的描述( h e r z f e l d ，1 9 2 9 ) 。 s h i m a m u r a 对银杏精细胞和胚胎发育的研究( s h i m a m u r a ，1 9 2 8 ，1 9 3 3 ，1 9 3 5 ， 1 9 3 7 ) 。c h a m b e r l a i n 在其专著( ( g y m n o s p e r m s ，s t r u c t u r ea n de v o l u t i o n ) ) 的银杏 目一章中对银杏生殖的归纳总结( c h a m b e l l a i n ，1 9 3 5 ) 等。此后，李正理， n e w c o m e r ，f a v r e d u c h a r t r e 等人对该书中配予体细胞染色体数目、颈卵器成熟 颈细胞的数目和受精过程等作了修正和补充( l e e ，1 9 5 4 ，1 9 5 5 ；n e w c o m e r ，1 9 5 3 ： f a v r e d u c h a r t r e ，19 5 6 ) 。 二十世纪六十年代以来，随着电子显微镜等技术的大量应用以及离体培养技 术的成熟，对银杏胚胎发育和离体培养的研究也日益深入。t u l e c k e 等将银含的 花粉在各种不同的培养基中培养，研究了花粉在人工培养下的分化情况 ( t u l e c k e ，1 9 5 3 ，1 9 5 7 ，1 9 6 0 ，1 9 6 4 ) 。f r i e d m a n 等对银杏离体、活体条件下 雄配子体的发育、雌配子体的光合作用及受精作用( f r i e d m a n ，1 9 8 6 ，1 9 8 7 ，1 9 8 8 ， 1 9 9 2 ；r o h r ，1 9 8 0 ) 的研究，g i f f o r d 、王伏雄、翟中和等对银杏雄配子体发育及 精细胞结构的研究( g i f f o r d ，1 9 7 5 ，1 9 8 0 ，1 9 8 9 ；王伏雄，1 9 6 3 、1 9 6 5 ，1 9 8 9 ， 1 9 9 0 ；翟中和，1 9 9 6 ，2 0 0 0 ) ，h o r i 等对银杏精子运动方式的研究( h o r i ，1 9 8 8 ， 1 9 8 9 ，t 9 9 7 ) ，d o g ar 等人对胚胎发育的研究( s i n g h ，1 9 7 8 ；d o g a r ，1 9 9 2 及 李正理等人对受精作用的研究等( 吉成均，1 9 9 9 ；张仲鸣，2 0 0 0 ) ，都取得了较 大的突破，同时，也提出了一些问题，本文从以下五个方面对银杏的雄配子体发 育及受精作用进行阐述： 1 1 银杏生活史 由于银杏的生活史比较复杂，加之以往的文献中名词运用较为混乱( 李正理， 1 9 5 5 ，1 9 5 9 ；福斯特和小吉福德，1 9 8 3 ) 。：勾了描述的方便，首先我们将银杏的 生活史图解如下。在本文中，主要采用s t e r l i n g 建议的一系列名词( s t e r l i n g ， 首都师范大学硕：t 学位论文 1 9 6 3 ) ，在对颈细胞发育的描述中，则采犀j n o r s t o g 使用的术语( n o r s t o g ，1 9 7 2 ) 。 ( 本文采用的术语、英文名称及缩写词见附表1 ) + 第= 原叶细胞 细胞化阶段( 九月中旬) i 管细胞t 毒一j 生殖细胞( 四月底传粉)l f 一不翩胞黼核哗 ( 九日 月底) 4 四月) ( 五月) 雌配子体细胞化阶段( 六月初) l 腹沟细胞一 卜一 ( 六月中旬) ( 六月底) 精细胞( 八月底) 台子( 八月底)卵细胞( 八月底) 蚓解说明银杏的生殖周期( 参照张仲呜，1 9 9 7 ；吉成均，2 0 0 3 ；略有改动) 。 6 lli |_llli 首都师范大学硕1 ：学位论文 1 2 精原细胞的发生、发育 银杏胚珠的贮粉室位于珠孔之下，大孢子囊之上，是一个具有特殊功能的 空腔结构。三月中下旬，具有两个原叶细胞、一个管细胞和一个生殖细胞的四细 胞银杏花粉在受精滴的协助下进入贮粉室( 福斯特、小吉福德，1 9 8 3 ；张仲鸣， 2 0 0 0 ) 。在贮粉室内生殖细胞通过特殊的拟环形分裂( a n t i c l i n a l r i n g 1 i k ed i v i s i o n ) 形成精原细胞和不育细胞( f r i e d m a n ，1 9 8 ；i ，1 9 8 8 ) 。精原细胞位于珠心顶部， 细胞核较大，呈圆球形，不育细胞在基部两侧包围精原细胞。当花粉管进一步向 颈卵器室推进时，精原细胞体积迅速增大，并在精原细胞的近细胞核核膜处，产 生生毛体。随后，精原细胞的细胞核与生毛体之间产生小液泡状结构，该结构体 积不断增大，逐渐将生毛体推向细胞的表匠，细胞核也开始纵向纵向伸长成凸透 镜形。纤维颗粒体产生较晚，形状不规则，紧靠核膜( l e e ，1 9 5 5 ：g i f f o r d “口， 1 9 7 5 ：g i f f o r de t a l ，1 9 8 0 ) 。临近分裂前精原细胞核又回复为圆球形( 张仲鸣， 2 0 0 0 ) 。 银杏的精原细胞中有三种特别的结构，即生毛体( b l e p h a r o p l a s t ) 、液泡状 结构( v a s c u o l e l i k es t m c t u r e ) 、纤维性颗粒体( f i b r i l l o g r a n u l a rb o d y ) ，前者是 具鞭毛精子和原生动物的特征结构( 韩贻仁，1 9 8 8 ) ，后两者是银杏精原细胞和 精细胞中独有的结构( l e e ，1 9 5 5 ；g i f f o r de t a l ，1 9 7 5 ；g i f f o r de t a l ，1 9 8 0 ) 。 银杏的体细胞中无生毛体，因而精原细胞中的生毛体可能是从头组装的( 韩 贻仁，1 9 8 8 ；g i f f o r de t a l ，1 9 7 5 ；g i f f o r de t a t ，1 9 8 0 ) 。已观察到的最早期的 生毛体位于细胞核附近( g i f f o r de t a l ，1 9 7 5 ) ，由一对电子密度较高的半球组成， 两半球之间由电子密度更高的盘状结构连接。在发育的早期，两个半球很快分开， 形成圆形的具外周层( o u t e r l a y e r ) 和内核区( i n n e r p o r t i o n ) 的生毛体( g i f f o r d e t 以，1 9 7 5 ) 。随着精原细胞的发育，生毛体体积也逐渐增大，成熟生毛体直径约 3 5 4 51 tm ，内核区由致密基质区( d e n s em a t r i x ) 和低密区( 1 e s sd e n s e r e g i o n s ) 组成，其中的低密区被认为是致密基质区降解所致。生毛体的外周层由近一千个 前基体( p r o b a s a lb o d y ) 或称为中心粒组成。前基体的形成依次经历了由网状排 列的微管、九组单体微管、二联体微管、三联体微管等阶段，三联体微管呈车轮 状排列( g i 仃b r de ta l ，1 9 7 5 ) 。前基体的结构特点与精细胞中的基体具有相似性 ( g i f f o r de t a l ，1 9 7 5 ：l ie t a l ，1 9 8 9 ) 。 首都师范大学硕士学位论文 人们推测生毛体这样复杂的细胞器内部可能含有d n a 、r n a 或其它特异组 分，但f e u l g e n 反应表明，在z a m a 及一些蕨类生毛体中无d n a ( g i f f o r d e ta l ， 1 9 7 5 ) ，在银杏中或认为有( l e e ，1 9 5 5 ) 或认为无( g i f f o r de t a l ，1 9 7 5 ) ；同 样动物材料生毛体中有无d n a 也仍在争论之中。 生毛体产生后不久，光镜下可观察到在精原细胞的细胞核与生毛体之问产生 小液泡状结构，该结构经番红苏木精一橘红g 三重染色后，呈透明状态，其内似 有物质，故李正理先生称其为液泡状结构( l e e ，1 9 5 5 ) 。f a v r e d u c h a r t r e 发现 它靠近细胞核，认为它是细胞核的分泌物，并命名为球形分泌物( f a v r e d u c h a r t r e ， 1 9 5 6 ) 。电镜下，液泡状结构为看不到膜包被、染色较深的结构，因此，g i f f o r d 称其为嗜锇颗粒( o s m i o p h i l i eg l o b u l e ) ( g i f i b r d e ta l ，19 7 5 ；g i f f o r d ，19 8 0 ) 。 另p | g i f f o r d 等还指出该结构起源于生毛体的近细胞核一侧，并在发育初期一分 为二，认为它可能有提供生毛体营养的功能( g i f i o r de t a l ，1 9 7 5 ；g i f f o r de l a ， 1 9 8 0 ) 。为避免名词混淆，在本文中统一称其为液泡状结构。 成熟的液泡状结构直径l o 一2 0 t l f t - t ( 腾俊琳等，1 9 9 6 ) 。在精原细胞的发阿 早期，f e u l g e n 反应表明液泡状结构呈阴性，细胞核呈明显的阳性反应；而在精 原细胞分裂前，液泡状结构呈f e u l g e n 阳性反应，细胞核则染色较浅( l e e ，1 9 5 5 ； f a v r e d u c h a r t r e ，1 9 5 6 ；g i f f o r d e l a l ，1 9 7 5 ) 。 银杏精原细胞和精细胞中的另一种特殊结构为同样嗜锇的纤维性颗粒体 ( 翟中和，1 9 9 6 ；g i f f o r de t a l ，1 9 8 0 ) ，也有人称其为脂蛋白体( 1 i p o p r o t e i n g r a n u l e ) ( o i f l b r de la l ，1 9 7 5 ) 或颗粒( l e e ，1 9 5 5 ，1 9 5 9 ) 。它位于精原细胞的基部， 与核膜较近，其产生时形态类似于液泡状结构，但产生的时期晚。电镜下其组成 物的外形类似纤维，在整个发育过程中也一致染色较深( g i f f o r d e ta t ，t 9 8 0 ；滕俊 琳等，1 9 9 6 ) 。当精原细胞分裂形成精子时，纤维颗粒体也分裂( l e e ，1 9 5 5 ) 。 尽管在银杏精原细胞的发生和发育方面，前人已经作了很多工作，但由于侧重点 的不同，对精原细胞整个发育过程中细胞器的变化，特别是液泡状结构和生毛体 周围的细胞器变化基本未报道，对精原细胞发育的细节和三种特征性结构的研究 也有待于进一一步深入。 8 首都师范大学硕一l 学位论文 1 3 银杏精细胞的结构 临近受精前，精原细胞纵向分裂形成两个半球形的精细胞，并列地位于花 粉管内。刚形成的精细胞由精原细胞共同的壁包裹，不久壁破裂( l e e ，1 9 5 5 ) 。 液泡状结构和生毛体在银杏精原细胞分裂时不进行分裂，而纤维颗粒体在精原细 胞分裂时同时进行分裂，因而银杳每个精细胞中含有一个小液泡状结构、一个生 毛体和一个纤维性颗粒体( f a v r e d u c h a r t r e ，1 9 5 6 ；s i n g h ，1 9 7 8 ；g i f f o r d e ta l ， 1 9 7 5 ：f r i e d m a n ，1 9 8 7 ；l e e ，1 9 5 5 ) 。银杏成熟的精子直径8 0 一8 5um 、高 4 0 一5 0um ，从花粉管中释放后为陀螺形，长度可达5 0 8 0um ；精子顶部有三 圈鞭毛，相对的一端为液泡状结构( l e e ，1 9 5 5 ) ，纤维颗粒体常位于生毛体和 小液泡状结构的另一端( 腾俊琳等，1 9 9 6 ) 。 银杏的精细胞研究存在一定的困难。首先，一个胚珠中的花粉管数量有限， 一般只有2 3 个，相对花粉管来说，胚珠的体积大得多，目前尚无法采用类似 被子植物中大量分离精子的有效手段( 胡适宜，1 9 8 2 ，2 0 0 2 ) ；其次，精原细胞 分裂形成精子到进行受精的时间很短，很难把握其确切的时间 ( f a v r e d u c h a r t r e ，1 9 5 8 ：f o s t e re t a l ，1 9 8 9 ) ；第三，精原细胞分化期太长， 即使是初春时发育比较一致的花粉和胚珠，也会因外部条件差异的日积月累而使 内部的发育过程出现较大的差异，不仅不同植株的发育不一致，同一植株甚至同 一枝条卜的胚珠间的发育步调也不同( 张仲呜，1 9 9 7 ，1 9 9 9 ) 。因而，银杏精细 胞的报道相对较少，有关精细胞的形态结构特点了解得也较少，值得进一步研究。 1 4 受精作用 关于银杏的受精作用，前人已有一些报道( h i r a s e ，1 8 9 6 ，1 9 1 8 ；i k e n o ，1 9 0 l ： h e r z f e l d ，1 9 2 7 ；s h i m a n u r a ，1 9 2 8 ；l e e ，1 9 5 5 ；f a w e d u c h a r t r e ，1 9 5 8 ；s i n g h ， 1 9 7 8 ：f r i e d m a n ，1 9 9 2 ；h o r e ，1 9 9 7 ) ，但何时发生受精作用一直存在争议。 h i r a s e 认为受精时的受精室有液体物质出现( h i r a s e ，1 8 9 6 ) ，但c h a m b e r l a i n 并 未观察到此特征( c h a m b e r l a i n ，1 9 3 5 ) 。f a r v r e d u c h a r t r e 观察到珠孔端的珠心 组织呈水渍状，称之为受精滴( f e r t i l i z a t i o nd r o p ) ，并把这作为受精时期的重要 外部特征( f a v r ed u c h a r t e r ，1 9 5 8 ) 。由于无法准确把握受精时的物候学特征，获 9 首都师范大学硕，l 学位论文 取受精时期的材料变得相当困难，再加一k k t 它原因，一百年来，对银杏受精作用 的研究进展很小。 精子进入颈卵器非常迅速，有报道称从花粉管释放几分钟后就能完成。 ( f a v r e d u c h a r t r e ，1 9 5 6 ；f r i e d m a n ，1 9 9 2 ) 。在光镜下，颈卵器口的精子常贴 着卵细胞的伸出物，呈染色很深的一团，看不清结构，因而受精时精子是否全部 进入颈卵器存在疑问( s h i m a m u r a ，1 9 3 7 ；l e e ，1 9 5 5 ；f a v r e d u c h a r t r e ，1 9 5 6 ； r i d g e ，1 9 8 9 ；h o r i ，1 9 9 7 ) 。一些学者认：勾整个精子，包括鞭毛带都进入卵细 胞( s h i m a m u r a ，1 9 3 7 ；f a v r e d u c h a r t r e ，1 9 5 6 ) ，李正理则认为仅精子的头部一 个大小类似液泡状结构的球形物进入卵细胞，而其它部分则留在颈卵器外并很快 消失( l e e ，1 9 5 5 ) 。李正理指出：f e u l g e n l i 应染色时，液泡状结构呈阳性反应， 且受精时与卵核结合的核体积远小于受精前精细胞的核而与液泡状结构直径类 似，因而他推测在精子进入颈卵器前，其细胞核中的染色质可能转入液泡状结构 中，在受精时，液泡状结构进入卵细胞与卵核结合( l e e ，1 9 5 5 ) 。由于该推测 多年来一直未获得实验上有说服力的证明，在有关裸子植物生殖生物学的专著或 论文中，仍引用该观点，作为银沓受精过程的说明( m a h e s h w a r i ，1 9 6 7 ；s i n g h ， 1 9 7 8 ；g i f f o r d ，1 9 8 9 ) 。但这与目前普遍接受的细胞核作为雄性主要遗传物质 的载体相矛盾，尚需进一步的实验验证。 由一个精原细胞分裂形成的两个精细胞，一般进入一个颈卵器的只有一个， 另一个精子如果也进入同一个颈卵器，它会被滞留在卵细胞质的外围，并很快退 化，最终被吸收( l e e ，1 9 5 5 ；m a h e s h w a r i ，1 9 6 3 ，1 9 6 7 ) 。 1 5 胚胎发育 裸子植物和被子植物胚胎发育的最明显区别是前者在胚胎发育的早期具游 离核阶段，而在后者合子分裂即伴随着壁的形成( j o h a n s e n ，1 9 5 0 ) 。h i r a s e 和 s h i m a m u r a 分别对银杏合子形成后第一次和第二次分裂进行了详细观察，并认为 游离核分裂至少同步到6 4 个核阶段( h i r a s e ，1 8 9 6 ；s h i m a n u r a ，1 9 2 8 ) 。 f a v r e d u c h a r t r e 认为受精后第一天即可形成有1 2 8 个核的初生胚，这种情况可以 维持1 2 天，8 次连续分裂共形成2 5 6 个游离核( f a v r e d u c h a r t r e ，1 9 5 6 ) 。王伏 雄等进一步证实了h i r a s e 和h e r z f e l d 的观察，并认为受精后两周基本完成原胚游 首都师范大学硕士学位论文 离核分裂阶段，9 月初形成细胞壁( 王伏雄，1 9 8 3 ) 。银沓的一个胚珠巾只有。+ 个魅发育成熟( s i n g h ，1 9 7 8 ) 。但两个胚胎在发育过程中存在哪些差异，这种 差异是由什么原因造成的等等目前仍不清楚。 综上所述，尽管对银杏的生殖生物学研究已有上百年的时间，但由于银杏胚 胎发育的特殊性以及准确取材的困难，在银杏精原细胞和精细胞的发育特点，液 泡状结构和纤维性颗粒体的结构及功能、受精作用、胚胎发育等方面仍存在争论。 本文在围绕这些问题进行探讨的同时，通过对银杏和苏特一些生殖生物学特征的 比较，以期获得有关这些原始种子植物进化和演化的一些资料。 首都师范大学硕士学位论文 2 1 实验材料 2 材料与方法 本实验所用材料选自北京大学校园内生长良好的成年银杏雌株，于2 0 0 4 年 3 月2 0h 一1 0 月3 l 日期间采集胚珠，这段时间恰好是银杏雄配子体发育、受精 作用及胚胎发生的时期。依据发育期的不同，我们对银杏胚珠的采集频率存在着 明显区别。3 月2 0 日一6 月2 0 日每周采集一次；6 月2 0 日一7 月2 0 日每周二次； 以后采集频度逐渐加大，至八月中旬，每天上下午各采集一次，这种情况一直持 续到九月初，尤其是8 月2 0 日一8 月2 5 日期间，大量采集银杏胚珠，筛选有受 精滴的胚珠进行固定；此后采集频度逐渐下降，十月份期间又恢复为每周一次。 2 2 实验方法 2 。2 1 石蜡切片 石蜡切片的材料用c r a f i i i 液固定( 配制见附录2 ) ，系列酒精脱水，二甲 苯透明，石蜡包埋，苏木精一番红一固绿三重染色，加拿大树胶封固，o l y m p u s 显微镜及m o t i c b 5 显微镜观察并照相。 2 2 2 半薄切片 t e e h n o v i t7 1 0 0 塑料半薄切片的制备 取各发育期的材料，直接置于2 5 的戊二二醛中( 配制见附录2 ) ，抽气后室温 固定4 h ，o 0 5 m o l lp b s 缓冲液冲洗，系列酒精脱水，t e c h n o v i t7 1 0 0 无荧光树脂 包埋，切片厚度1um 。0 5 ld a p i 染色1 5 m i n ，o l y m p u s b h - 2 荧光显微镜观察 并照相，激发光滤片u g i ( 4 2 5 r m l ) ，滤激发光片为l 4 2 0 ( 4 2 0 n m ) ，l u c k y 4 0 0 胶卷照相。 e p o n 8 1 2 环氧树脂半薄切片的制备 首都师范大学硕上学位论文 将材料置于2 5 戊二醛中，抽气后室温固定1 2 h ，0 0 5 m o l l p b s 冲洗，l 锇 酸后固定4 h ，0 0 5 m o l l p b s 冲洗，系列丙酮脱水，e p o n 8 1 2 包埋( 配制见附录2 ) ， l k b - v 型超薄切片机切片，切片厚度l 2 u m ，p a s t b o 双重染色，o l y m p u s 显 微镜观察并照相。 2 2 4 透射电子显微镜观察 用于透射电镜观察的材料经2 5 戊二醛室温固定1 2 h ，0 0 5 m o l lp b s 冲洗， l 锇酸后固定4 h 。0 0 5 m o l l p b s 冲沈，系列丙酮脱水，e p o n 8 1 2 包埋，l k b v 型超薄切片机切片，切片厚度5 0 - - 8 0 n m ，置于带方华膜的5 0 目铜网上，醋酸双 氧铀染色3 0 m i n ，重蒸水冲洗，柠檬酸铅染色3 0m i n ，重蒸水冲洗，j e m l 0 0 c x 型透射电镜下观察并照相。 首都师范大学硕士学位论文 3 观察结果 3 1 精原细胞和精细胞的特点 3 1 1 贮粉室的形成及花粉粒的萌发 四月上旬，银杏胚珠中的大孢子母细胞明显可见，其上部的珠心细胞开始出 现分化：偏珠孔端表皮下向内约5 层左右、处于中央部位的一些珠心细胞开始纵 向伸长，细胞质染色变淡；环绕着这些细胞的珠心细胞体积较大，而这些细胞之 f 的珠心细胞相对较小( 图版i ，1 ) 。随着胚珠的发育，伸长的珠心细胞进步 拉长，并首先开始退化、消失，形成一空腔；在空腔周围的珠心细胞纵向傅长但 仍处于完整的状态( 图版i 2 ) ；以后这些伸长的珠心细胞也相继退化，细胞死 亡逐渐向珠心中央和周边扩展，直至形成深陷的花瓶状贮粉室，仅珠心表层存在 ( 图版i ，3 ) ；最后，珠心表层细胞解体，贮粉室形成( 图版i ，4 ) 。 3 1 2 精原细胞的发育 光镜水平研究 六月初，生殖细胞分裂形成精原细胞和不育细胞。刚形成的精原细胞及细胞 核均为圆球形，细胞核体积相对较大，核仁明显( 图版i i i ，1 ) 。随着花粉管进 一步向颈卵器室推进，精原细胞体积迅速增大，细胞核体积也相应增大，但仍呈 圆球形，此时在精原细胞的近细胞核核膜两侧，各产生一个小点状结构，即生毛 体( 图版i i i ，2 a ) ，在精原细胞的整个发育过程中，2 个生毛体始终位于精原 细胞核两侧相对存在( 图版i i i ，3 、7 ) 。此后不久，在精原细胞的细胞核与两 个生毛体之间各产生一个透明的圆球形结构，即液泡状结构( 图版i i i ，3 ) 。伴 随着精原细胞发育的进行，精原细胞的细胞核开始纵向伸长，生毛体体积增大