（微生物学专业论文）基因组改组选育米曲霉α淀粉酶高产菌株.pdf

摘要 摘要 从土壤中筛选获得一株高产旷淀粉酶真菌菌株f s 5 2 8 ，产酶水平为2 0 1 7 3 u m l 。对该 菌株进行形态学初步鉴定，为典型的曲霉属菌种。提取f s 5 2 8 的1 8 sr d n a ，并进行测序， 将测序结果与曲霉属已知菌种1 8 sr d n a 序列进行比对，构建进化树，最终确定该菌株为 米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 。 研究米曲霉原生质体制备与再生的最佳条件为：菌丝培养时间为1 4 h ，采用1 溶菌酶 + 0 5 蜗牛酶+ 1 纤维素酶的复合酶解液，选用0 6 m o f l 的n a c l 为渗透压稳定剂，在p h 5 0 ( 磷酸盐缓冲液) ，3 0 c 的条件下，酶解处理2 5 h 。采用p d a 为基础再生培养基，o 6 m o f l 的n a c l 做为高渗稳定剂，能够使原生质体的再生率达到3 0 。 选用出发菌株a s p e r g i l l u so r y z a ef s 5 2 8 ，f s l 7 9 ，利用基因组改组技术选育米曲霉q 一 淀粉酶高产菌株。分别制备f s 5 2 8 ，f s l 7 9 原生质体，利用双亲灭活标记法，原生质体融 合条件为：p h6 0 、p e g3 0 、c a 2 + 0 0 2 m o l l 、融合处理2 0 m i n 。采用平板透明圈法，液 体发酵对两轮基因组改组得到的6 0 0 个融合子进行筛选，获得产菌水平最高的4 菌株 f 2 1 0 ，f 2 1 4 ，f 2 1 5 ，f 2 1 6 。其中f 2 1 4 产酶水平达到4 2 3 3 4 u m l ，比出发菌株提高了 5 2 3 4 ，连续传代培养与发酵结果表明该菌株具备较好的遗传稳定性，初步实现了选育目 的。 通过对改组前后的菌株的形态学观察，改组后菌株在生长速度，产孢数量上都比出发 菌株有了较大的改善。r a p d 分析表明：改组菌株的遗传组成与原始菌株相比较存在差异。 关键词基因组改组，米曲霉，a 淀粉酶，育种 中文文摘 中文文摘 基因组改组技术是建立在原生质体融合技术基础之上的一种菌种选育技术。它通过多 个亲株的融合，使其全基因组进行随机重组，获得第一代融合株；再从中选择获得进一步 提高的菌株作为下一轮融合的直接亲本，依此类推进行多轮的多亲株融合，最终从获得的 突变体库中筛选出性状提升的目的菌株。利用基因组改组技术可以在较短时间内获得性状 优良的重组体，同时剔除负突变，这在很大程度上弥补了传统诱变法的不足。 淀粉酶做为工业生产中最为重要的酶之一，有各种不同的用途。目前a 淀粉酶已经广 泛用于食品、发酵、谷物加工、纺织、造纸、医药等各个方面。在淀粉酶制剂工业化生产 上，主要以微生物发酵生产为主，也可从植物和动物中提取。 本研究从土样中筛选真菌q 一淀粉酶，通过液体发酵选出高产菌株f s 5 2 8 做为出发菌株， 通过形态学鉴定和分子生物学鉴定，将分离得到的菌株命名为a s p e r g i l l u so r y z a ef s 5 2 8 ， 再利用基因组改组选育米曲霉高产0 【一淀粉酶的菌株。 一、真菌旷淀粉酶产生菌筛选与鉴定 从土壤中筛选获得一株高产a 一淀粉酶真菌菌株f s 5 2 8 ，产酶水平为2 0 1 7 3 u m l 。对该 菌株进行形态学初步鉴定，为典型的曲霉属菌种。提取f s 5 2 8 的1 8 sr d n a ，进行测序， 并将测序结果与曲霉属已知菌种1 8 sr d n a 序列进行比对，构建进化树，最终确定该菌株 为米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 。 二、米曲霉原生质体制备与再生 对米曲霉原生质体制备与再生条件进行了研究。实验结果表明原生质制各的最佳条件 为：菌丝培养时间为1 4 h ，采用1 溶菌酶+ 0 5 蜗牛酶+ 1 纤维素酶的复合酶解液，选用 o 6 m o l l 的n a c l 为渗透压稳定剂，在p h5 0 ( 磷酸盐缓冲液) ，3 0 c 的条件下，酶解处理 2 5 h 。采用p d a 为基础再生培养基，o 6 m o l l 的n a c l 做为高渗稳定剂，能够使原生质体的 再生率达到3 0 。 三、基因组改组选育米曲霉高产0 【淀粉酶菌株 选用出发菌株a s p e r g i l l u so r y z a ef s 5 2 8 ，f s l 7 9 ，利用基因组改组技术选育米曲霉a 一 淀粉酶高产菌株。分别制备f s 5 2 8 ，f s l 7 9 原生质体，利用双亲灭活标记法，原生质体融 合条件为：p h 6 0 、p e g 3 0 、c a 2 + 0 0 2 m o l l 、融合处理2 0 m i n 。采用透明圈法，从第一轮 改组获得的3 0 0 个融合子中初筛获得2 0 个菌株，经过液体发酵复筛，选出产酶水平最高 的两株菌f 1 3 ，f 1 5 进行第二轮基因组改组，从3 0 0 个融合子中进行了初筛与复筛，获得 产菌水平最高的4 个菌株f 2 1 0 ，f 2 。1 4 ，f 2 一1 5 ，f 2 1 6 。其中f 2 1 4 产酶水平达到4 2 3 3 4 u m l ， 比出发菌株提高了5 2 3 4 。连续几代培养与发酵结果表明该菌株具备较好的遗传稳定性。 i i i 中文文摘 四、改组前后菌株形态学观察与r a p d 分子鉴定 通过形态学观察，发现改组后菌株在生长速度，产孢数量上与出发菌株相比，有了较 大的改善；通过r a p d 扩增检测，亲缘关系聚类分析结果表明：原始菌株与第一轮改组得 到的两个菌株亲缘关系最近，与第二轮改组菌株的亲缘关系较远，而第二轮改组得到的四 个菌株之间亲缘关系很近。这反映了通过基因组改组，菌株之间的亲缘关系会逐渐增大， 通过基因组改组可以有效提高菌株的遗传多样性，这为进一步改良菌株提供了丰富的资 源。 i v a b s t r a c t a b s t r a c t t h es t r a i nf s 5 2 8w i t hh i g hp r o d u c t i o na - a m y l a s ew a ss c r e e n e df r o mt h es o i l i t si n i t i a l f e r m e m t a t i o nl e v e lp r o d u c i n g0 【一a m y l a s er e a c h e d2 0 1 7 3 u m l t h r o u g ht h ei n i t i a lm o r p h o l o g y i d e n t i f i c a t i o n ，i tw a sat y p i c a ls p e c i e so ft h ea s p e r g i l l u s t h e18 sr d n ao ft h ef s 5 2 8w a s e x t r a c t e da n ds e q u e n c e d t h es e q u e n c er e s u l tw a sa l i g n e dw i t ht h e s e q u e n c e so ft h ek n o w n a s p e r g i l l u ss p e c i e s ，f s 5 2 8 w a su l t i m a t e l yc o n f i r m e dt ob eo n ea s p e r g i l l u so r y z a e b yt h e p h y l o g e n e t i ct r e e t h eh i 曲l ye f f e c t i v ep r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o nc o n d i t i o n so fa s p e r g i l l u s o r y z a ew e r es t u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u mo s m s t i cp r e s s u r es t a b i l i z e rw a s 0 6 m o l l n a c l o nt h ec o n d i t i o n so ft e m p e r a t u r e 3 0 。ca n dp h 5 0t h eh y p h a ec u l t u r e df o r2 0 h w e r ee n z y m e df o r2 5 hw i t h1 l y s o z y m e ，o 5 s n a i l a s ea n d1 c e l l u l o s e w h e nu s i n gp d a a s b a s e dc u l t u r em e d i u mi nw h i c hc o n t a i n6m o l ln a c la si n f i l t r a t i o n b u f f e r , t h er a t i oo f r e g e n e r a t i o nr e a c h e d3 0 t h eb r e e d i n go ft h ea s p e r g i l l u so r y z a es t r a i nw i t hh i g hp r o d u c t i o na - a m y l a s eb yg e n o m e s h u f f l i n gw a sc a r r i e do nt w oo r i g i n a ls t r a i na s p e r g i l l u so r y z a ef s 5 2 8a n df s17 9 t h e p r o t o p l a s t so ft h e mw e r er e s p e c t i v e l yp r e p a r e da n db i p a r e n t a li n a c t i v a t i o nw a su s e dt os e l e c t f u s a n t s t h ef u s i o nw a su n d e r g o n ei nt h ef u s i o ns y s t e mo f3 0 p e gc o n t a i n i n g0 0 2 m o l lc a + a n d p r o c e s s e df o r2 0m i na t3 7 c a f t e rt w or o u n d so fr e c u r s i v e p r o t o p l a s tf u s i o n ，f o u rs t r a i n sf 2 1 0 ，f 2 1 4 ，f 2 1 5 ，f 2 1 6 w i t hh i g hp r o c u c t i o n a a m y l a s ew e r es e l e c t e df r o m6 0 0f u s a n t sb yt h ew a yo ft h ec l e a rz o n e sa n d l i q u i df e r m e n t a t i o n t h ep r o d u c t i o na - a m y l a s ea c t i v i t yo ff 2 14w a su pt o4 2 3 3 4 u r n l , o f w h i c hw a si n c r e a s e d5 2 3 4 m o r et h a nt h a to ff s 5 2 8 t h er e s u l t so fc o n t i n u e sc u l t u r ea n d l i q u i d f e r m e n t a t i o ns h o w e dt h es t r a i n sh a ds t a b l eh e r e d i t a r yp r o p e r t y o nt h ew h o l et h eb r e e d i n gp u r p o s e w a sa c h i e v e ds u c c e s s f u l l y t h em o r p h o l o g yo b s e r v a t i o no ft h eo r i g i n a la n dt h es h u f f l e ds t r a i n ss h o w e dt h a tt h e r e c o m b i n e ds t r a i nh a d i m p r o v e m e n ti nt h eg r o w t hr a t ea n dt h eq u a n t i t yo fs p o r e t h ea n a l y s i sb y r a p di n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r es o m ee x i s t e n c eo fg e n e t i cd i f f e r e n c e sb e t w e e nt h es h u f f l e d s t r a i n sa n dt h eo r i g i n a ls t r a i n k e y w o r d s g e n o m es h u f f i i n g , a s p e r g i l l u so r y z a e ，a - a m y l a s e ，b r e e d i n g i i 福建师范大学学位论文授权使用声明 福建师范大学学位论文使用授权声明 本人( 姓名)韭壹国学号 2 q q 鱼q 窆墨2 专业 微生物学所呈交的论文( 论文题目：基因组改组选育米曲霉 0 【一淀粉酶高产菌株) 是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。本人了解福建师 范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交的学 位论文并允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容；学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名 签名日期_ 气，6 、夕 j 指导教师签 。卜 j 绪论 1 仅淀粉酶研究概况 绪论 1 1 淀粉酶概述 淀粉酶是指用于水解可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等a 一1 ，4 葡聚糖，水解a 一1 ， 4 糖苷键的酶类的统称，广泛存在于动、植物和微生物。它是酶制剂当中最早实现工业化 生产，并且是用途最为广泛、产量最大的一个酶制剂品种【1 1 。 早在数千年前，人类就已利用淀粉酶来酿酒、制造饴糖等。诗经上记载：“若作酒醴， 尔惟曲蘖”。曲是长霉的谷子，蘖是发芽的谷粒，二者都含有淀粉酶【1 1 。埃及人在公元前 六千已经能够使用麦芽来酿造啤酒，但是酶分离制备技术则是到了十九世纪才开始广泛使 用。1 8 9 6 年日本人高峰让吉使用麸皮作为培养基培养米曲霉，然后用水提取，最后又加入 酒精沉淀，得到淀粉酶作为消化剂。1 9 2 6 ，法国人b o i d i n 和e f f i - o n t 等人在德国开设工厂用 于生产淀粉酶，这为微生物酶的工业化生产奠定了基础【。 对于淀粉酶的具体作用方式，到了五十年代搞清了淀粉的分子结构之后才逐渐阐明， 按照水解淀粉方式的不同，主要的淀粉酶可分为四大类【l ，2 】( 如表1 ) 。 表1 一i 常用淀粉酶的分类n 1 t a b l e l is p e c i e so fa m y l a s e 福建师范大学张志国硕士学位论文 1 2 伍一淀粉酶概述 a 一淀粉酶是- 4 中内切酶，作用于淀粉时，以无规则的方式切开淀粉分子内部的a - 1 ，4 糖苷键，而使淀粉分子降解，生成糊精、麦芽糖及少量葡萄糖等，同时淀粉由于降解而失 去粘性以及不能与碘发生显色反应，并通过降解淀粉得到的水解产物具有较强的还原性【3 1 。 因为产物当中葡萄糖残基c 1 碳原子为0 【一构型，因此称之为a 一淀粉酶。a 一淀粉酶的这种降 解作用在工业上被形象的称为淀粉的液化，所以q 一淀粉酶也叫液化酶。 0 【淀粉酶对于直链淀粉的作用，第一步是将直链淀粉任意地迅速降解成小分子糊精、 麦芽糖和麦芽三糖；第二步是缓慢地将第一步生成的低聚糖水解成葡萄糖和麦芽糖。由于 0 【一淀粉酶不能切开支链淀粉分支点的u 1 ，6 键，也不能切开o 【1 ，6 键附近的q 1 ，4 键， 但能越过分支点而切开内部的伍1 ，4 键，因此水解产物中除了含有葡萄糖、麦芽糖以外， 还残留一系列具有q 1 ，6 键的极限糊精和含四个或更多葡萄糖残基的带0 l 一1 ，6 键的低聚 糖【1 1 。 由于0 【淀粉酶分布十分广泛，存在于动物、植物、微生物，因而来源不同的0 t 淀粉酶 各有不同的用途，已经广泛用于食品、发酵、谷物加工、纺织、造纸、医药等各方面。 1 作为保鲜剂，用于面包烘烤业 2 利用a 淀粉酶的液化和糖化作用，生产葡萄糖等 3 造纸工业 4 临床化学分析 随着生物工程的不断发展，淀粉酶的应用涉及到许多其他领域，比如临床，制药和分 析化学。已有报道，基于c 【淀粉酶的液体稳定试剂已应用于全自动生化分析仪( c i b ac o m i n g e x p r e s s ) 临床化学系统，已经建立起一种利用淀粉酶探测更高低聚糖含量的方法。 目前a 一淀粉酶在整个工业霉制剂生产中占很大的比例，基本上都以微生物发酵法来大 规模生产a 一淀粉酶。菌种主要来源【4 】包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、 黑曲霉和米曲霉等。 表卜2a 一淀粉酶的主要微生物来源 t a b l e l - 2t h em a i nm i c r o o r g a n i s m ss o u r c e so fa a m y l a s e 细菌真菌 a e r o m o n a sc a v i a e ( 豚鼠气单胞菌) b m e g a t e r i u m ( 大芽孢杆菌) b s u b t i l i s ( 枯草杆菌) e u b a c t e r i u ms p ( 真细菌) h a l o b a c t e r i u mh a l o b i u m ( 盐生盐杆菌) m i c r o c o c c u sl u t e u s ( 藤黄微球菌) a s p e r g i l l u so r y z a e ( 米曲霉) aa w a m o r e i ( 泡盛曲霉) a f u m i g a t u s ( 烟熏曲霉) a n i g e r ( 黑曲霉1 a f l a w s ( 黄曲霉) h u m i c o l ai n s o l e n s ( 嗜热真菌1 绪论 m i c r o m o n o s p o r ay “f 弘，j 括( 普通小单孢菌) n o c a r d i aa s t e r o i d e s ( 星形诺卡菌、) p s e u d o m o n s as t u t z e r i ( 假单孢菌) p y r o c o c c u sw o e s e i ( 火热球菌属) t h e r m o n o s p o r ac u r v a t a ( 弯曲高温单孢菌) t h e r m o a c t i n o m y c e ss p ( 高温放线菌属) b 1 i c h e n i f o r m i s ( 地衣芽孢杆菌) b s t e a r o t h e r m o p h i l u s ( 嗜热脂肪芽孢杆菌) c h l o r o f l e x u sa u r a n t i a c u s ( 橙色绿屈挠菌) t h e r m o m o n o s p o r av i r i d i s ( 绿色热单孢菌) t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u s ( 疏棉状嗜热丝孢 菌) p y c n o p o r u ss a n g u i n e u s ( r 血t _ e r 2 密孔菌) p e n i c i l l i u mb r u n n e n m ( 青霉菌) r h i z o p u ss p ( 根霉菌属) f i l o b a s i d i u mc a p s u l i g e n u m ( 酵母菌) m u c o r p u s i l l u s ( 微小毛霉菌) l a c t o b a c i l l u sb r e v i s ( 短乳酸杆菌) a l i c y c l o b a c i l l u sa c i d o c a l d a r i u s ( 酸热脂孥醒堑菌) 1 2 1n 淀粉酶的氨基酸组成 仅，淀粉酶的分子量约为5 0 ，0 0 0 左右。0 【淀粉酶中各种氨基酸的组成都不一样，但大部 分酶都含有天冬氨酸和谷氨酸，而含硫氨基酸在淀粉酶中含量则相对比较低。酶蛋白的肽 链是通过h 键、疏水键等化学键折叠成为紧密的分子结构。霉菌的伍淀粉酶的一个显著特 征是含有碳水化合物。米曲霉他卡淀粉酶中含有3 的糖类，主要是甘露糖、葡萄糖、n 乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖，分子比为1 ：1 ：2 ：1 6 ：o 8 ：0 5 ，n - 乙酰 氨基葡萄糖与酶蛋白中的天冬酰胺相结合。由于不同糖类上的残基的不同，从而使n 乙酰 氨基葡萄糖具有各自不同的生物性状【5 】。动物a 淀粉酶当中含有不同含量的糖，实验研究 表明糖的存在有助于保持酶构象及活性的稳定1 6 】。 组氨酸及氨基是a 淀粉酶表现其活性所必需的。酪氨酸对米曲霉与枯草杆菌0 【淀粉酶 的活性极为重要，它的酚基中的o h 与酶稳定性有关。 1 2 2 温度对n 淀粉酶的影响 纯化的a 一淀粉酶在5 0 以上容易失活，但是有大量c a 2 + 存在的情况下，酶的热稳定性 得到了较大的提高。芽孢杆菌的值一淀粉酶耐热性较强，而嗜热脂肪芽孢杆菌和凝结芽杆菌 的0 【一淀粉酶的热稳定性更强，前者经8 5 c 处理2 0 m i n ，尚残存酶活7 0 ；后者在c a 2 + 存在的 情况下，能够在9 0 c 的环境中存活9 0 m i n 。霉菌的旷淀粉酶的耐热性较低，黑曲霉酸性a 一 淀粉酶在p h 4 0 ，5 5 加热2 4 h 也不失活【5 】。 1 2 3p h 对a 淀粉酶的影响 一般0 【淀粉酶在p h 5 5 8 酶活较稳定，p h 4 0 以下容易失活，酶活性的最适p h 为5 0 6 。 曲霉的伍淀粉酶有耐酸性和非耐酸两种，黑曲霉产生的a 淀粉酶耐酸性比较高的，而米曲 霉产生的a 淀粉酶不耐酸，在酸性条件下容易失活。黑曲霉n r r l 3 0 c t 淀粉酶的最适p h 为 p h 2 5 ，4 0 。c 处理3 0 m i n 仍然不失活，然而在p h 7 0 时，5 5 c 处理1 5 m i n 几乎完全失活。米曲 福建师范大学张志国硕士学位论文 霉则相反，其c 【淀粉酶经过p h 7 0 ，5 5 处理1 5 m i n ，酶活几乎没有损失，而在p h 2 5 ，5 5 的环境中处理时则完全失活。【1 】 1 2 4c a 2 + 与a 淀粉酶活性的关系 每个q 淀粉酶分子中均含有一个c a 2 + ，c a 2 + 的存在能够使酶分子维持稳定的构象，从 而表现出其最大的活性与稳定性。酶蛋白与c a 2 + 的结合程度因不同的来源，略有不同，霉 菌的结合度最高，植物的结合度最差。研究表明，除了c a 2 + 外，其他二价的碱土金属s p ， b a 2 + ，m 孑+ 也有类似的作用，能够使无c a 2 + 的a 淀粉酶恢复活性【1 1 。 1 3a 淀粉酶的研究 2 0 0 6 年中国酶制剂总产量约5 3 万吨，目前作为食品添加剂的酶制剂品种已有2 6 种， 包括脂肪酶、乳糖酶、纤维素酶、蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡萄糖异构酶、p 葡聚糖酶、葡 萄糖氧化酶、糖化酶、a 淀粉酶、真菌淀粉酶、果胶酶、木聚糖酶等，已被广泛应用于食 品加工工业，在提高产品质量、降低成本、节约原料和能源、保护环境等方面发挥着重要 作用。我国酶制剂生产主要采用微生物发酵法，少量酶的生产采用生物提取法【7 1 。 1 9 5 6 年，首次报道成功分离淀粉酶，到今天已经有超过1 2 0 种的酶得到了分离并加以 鉴定，旷淀粉酶的主要来源是微生物，能够生产旷淀粉酶的菌种主要有芽孢杆菌属、曲霉 属、链霉菌属、酵母等近9 0 种微生物。o 【一淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于 发酵、酿造、纺织品工业、医药行业、粮食加工和食品工业等，这在整个酶制剂市场份额 中占了2 5 左右。 淀粉酶广泛用于洗涤产品、食品制造和环境工程等领域，是一种有较大应用价值的工 业用酶。韩丰敏，赵庆新【8 】等从高盐的环境中筛选到的一个菌株所产的淀粉酶，在反应液 中n a c l 终浓度为2 6 5 m o f l 时淀粉酶活力能保持最高酶活的6 1 ，显示了该酶强耐盐性。 该酶能在广泛的p h 范围内作用，在p h 值1 3 o n ，活性为最高酶活的7 6 ，但是其最佳p h 值 7 0 时的酶活反应最好，显示了其耐碱性及对p h 条件非依赖性；8 0 c 时的酶活为最高酶活 的6 9 ，显示其耐高温性。王淑军【9 】等人从江苏连云港海域筛选和分离至= t j l 株产低温淀粉酶 的海洋细菌p s e u d o a l t e r o m o n a ss p g 2 3 ，该菌株的最适产酶温度为1 5 ，较一般的菌种3 0 - 3 7 的产酶温度低了一半，因而有利于在一些低温环境中生产淀粉酶。 郑州大学的袁明雪等人采用平板筛选法从长期高温堆放的富含淀粉的土壤里筛选高 产a 一淀粉酶的菌株b a c i l l u ss p 1 1 5 ，该菌在初始p h 6 o ，4 0 。c 培养时间3 6 h 产生的a 一淀粉酶最 适反应温度为7 0 c ，且具强耐热性，1 0 0 c 下相对酶活性仍保持在7 8 以上；热稳定性高， 且无c a 2 + 依赖性，1 0 0 。c 温育l h ，酶活仍能保持6 6 ；最适反应p h 为7 0 ，且具有广谱耐酸性， 在p h 3 0 7 o 之间相对酶活性均能保持在到6 7 以上【1 0 】。赵铭钦等人以烟叶表面筛选得到 绪论 的巨大芽孢杆菌b 。( b a c i l l u sm e g a 砌e h u m ) 为出发菌株，通过紫外诱变和化学诱变处理，筛 选得到的菌株b 。的a 一淀粉酶活性较原始菌株提高了1 9 6 4 倍t 1 1 1 。 真菌旷淀粉酶在淀粉酶制剂当中占有很重要的地位。真菌c 【一淀粉酶来源于曲霉属微 生物( 米曲霉、黑曲霉等) ，与细菌d 一淀粉酶不同的是，真菌旷淀粉酶的最适作用温度低， 在5 5 左右，超过6 0 即很快失活，其对淀粉水解后可生成高含量麦芽糖和少量的低聚 糖、葡萄糖等。目前，世界上仅有诺维信、丹尼斯克、杰能科等几家大型酶制剂公司拥有 真菌a 一淀粉酶的生产技术，而国内真菌仅一淀粉酶的生产还是空白。虽然有一些高校和科 研机构有进行了研究，但基本上仍处于实验室阶段，尚不能进行大量的工业化生产。就生 产技术水平来讲，世界上处于领先地位的几家大型酶制剂公司真菌q 一淀粉酶的发酵单位为 1 5 0 0 2 0 0 0 u g 。而国内报道的发酵单位仅为2 0 0 , - - - , 6 0 0 u g 。 由于真菌仪一淀粉酶作为一种新型酶制剂在食品与发酵工业中具有广泛的应用和广阔 的市场前景，其产量和销售额逐年增加，据报道，2 0 0 1 年世界上仅用于烘焙食品的真菌0 【一 淀粉酶的销售额就达4 0 0 0 多万美元。对于我国来讲，一方面食品与发酵工业的发展对真 菌旷淀粉酶的需求不断增加；另一方面我国目前不能生产真菌0 【一淀粉酶，每年都要大量 进口，且价格昂贵，市场售价一般在3 5 0 , - - - , 4 0 0 元k g ( 9 0 0 0 u g ) 。因此，研制开发真菌仅一 淀粉酶，尽快实现国产化生产，对于满足国内市场需求、调整酶制剂工业的产业结构，带 动相关食品行业发展、节约外汇支出等都具有重要的作用与意义 在菌株选育方面，我国大多数科研机构采用的是离子束、6 0 c o y - 射线、微波、紫外线、 亚硝酸、硫酸二乙酯等物理与化学诱变剂交替诱变法【1 2 】。在目前微生物的常规诱变育种中， 经常存在着突变株对单一诱变剂钝化的情形，即所谓平顶效应，而且存在的另一问题是常 规诱变育种的高产菌的筛选工作量大，筛选时间相对比较长【1 2 1 。 河南省科学院生物研究所和郑州海韦力食品工业有限公司合作，采用了物理与化学诱 变剂交替对出发菌株进行诱变处理，选育出的编号为z l f - 1 3 米曲霉生产菌株小试发酵平 均酶活力为9 4 6 u g ，最高达1 0 4 0 u g ：中试及批量生产平均酶活力为1 2 8 3 u g ，最高达 1 3 9 8 u g ；为国内文献报道的最高产酶水平( 6 0 0 u g ) 的2 3 3 倍，但与世界先进水平( 1 5 0 0 - - , 2 0 0 0 u g ) 尚存在一定差距【1 2 1 。 随着生物工程的迅猛发展，我们已经初步搞清了产生q 一淀粉酶的基因，掌握了有关转 导、转化和基因克隆等遗传工程方法，产酶水平得到了大幅度的提高。基因工程在酶工程 领域的应用，可以改善原有酶的各种性能，如增加稳定性，提高产量，提高反应效率等。 l i n a r d i 【13 】等通过对芬尼克假丝酵母的淀粉酶产生菌株的种内融合的研究，经过融合改造后 得到的一株应用缺陷型酵母突变菌株的0 【淀粉酶产生能力提高了3 2 。 近些年对q 淀粉酶的研究已经深入到分子水平，在c 【淀粉酶的氨基酸序列分析、基因 福建师范大学张志国硕士学位论文 编码及核苷酸序列分析、基因克隆和基因性状表达等方面都取得较大的进展，基因工程技 术已广泛应用到了淀粉酶生产菌株的克隆上，并且在不同微生物的旺一淀粉酶基因克隆方面 已经作了大量的工作。k i m 克隆地衣芽孢杆菌中一种编码q 淀粉酶的基因并在大肠杆菌中 表达。将地衣芽孢杆菌的基因组d n a 酶切消化后连接到质粒载体p b r 3 2 2 上，转化e c o l i 携带了含有3 5 k b 碎片的地衣芽孢杆菌d n a 的重组质粒p l j 3 2 2 。该质粒编码的纯化蛋白能 够水解支链淀粉和环化糊精【1 4 】。s u g a n u m a 研究了发现字佐美曲霉的a 淀粉酶的n 一端氨基 酸的部分序列与黑曲霉a 一淀粉酶的前2 0 个氨基酸序列相刚15 1 。s t e y n 【1 6 1 等人将编码q 淀粉 酶基因( a m 和糖化酵母编码赤霉素a 的基因( s a t 2 ) 转入一个酵母菌的整合载体( y i p 5 ) ， 再将二者重组，获得质粒p s p 3 。接着把编码抗遗传霉素4 1 8 显性标记的a p h l 克隆到p s p 3 中得蛩 p s p 4 。再将p s p 4 连接上启动子和终止子，从而得到质粒p s p 5 。p s p 5 通过增加a r s l h 和c e n 4 序列，将其修改成环形微染色体p s p 6 ，转入了p s p l p s p 6 的实验室酿酒酵母重组 菌株能稳定生产a 淀粉酶和赤霉素a 。 2 米曲霉 1 7 】 米曲霉a s p e r g i l l u so r y z a e 属半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科，曲霉属真菌中 的一个常见种。 米曲霉菌落生长快，1 0 d 直径达5 6 c m ，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡 绿褐色。背面无色。分生孢子头呈放射状，也有少数为疏松柱状，直径1 5 0 3 0 0um 。分 生孢子梗2 m m 左右。近顶囊处直径可达1 2 2 5l am ，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形， 通常4 0 5 0l am 。小梗一般为单层，1 2 1 5l am ，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在 于一个顶囊上。分生孢子幼时呈洋梨形或卵圆形，老后大多变为球形或近球形，一般4 5 l am ，粗糙或近于光滑。分生孢子梗长约2 m m ，近顶囊处直径达1 2 - - - 2 51 tm ，壁薄而粗糙。 顶囊近球形或烧瓶形，直径4 0 - 5 0um ，上覆单层小梗。米曲霉分布甚广，主要在粮食、 发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种【1 7 】。 米曲霉生长的最适温度是3 2 , 3 5 。c ，低于2 8 。c 或高于4 0 ( 2 生长缓慢，4 2 以上停止生 长。酶的积累与培养温度和培养时间有关。在一定的温度下，随米曲霉培养时间的延续， 酶活力提高，到某一时间达到高峰，随后活力下降。培养温度低时产酶高峰较迟到达，当 温度在2 5 * ( 2 以上时，温度越高，蛋白酶、谷氨酞胺酶生成越少，淀粉酶生成越多。所以， 培养时应控制前期温度3 2 - 3 5 。c ，以利于长菌：后期温度为3 0 - 3 5 。c ，有利于淀粉酶的生成。 3 基因组改组技术原理及技术路线 3 1 基因组改组的产生及原理 3 1 1g e n o m es h u f f l i n g 技术及具体方法 绪论 1 9 9 4 年，s t e m m e r 首先提出了在体外定向进化分子的方法d n as h u f f l i n g 技术。其 基本原理是在实验室条件下模拟自然界进化的机制，通过对具有一定多样性的基因库在体 外进行重组来获得不同的嵌合基因，并从中定向筛选出具有预期性状的突变体。这种方法 已被广泛应用于酶的改性、蛋白的改良、疫苗的优化等方面【1 8 】。 1 9 9 8 年，s t e m m e r 等又提出了g e n o m es h u f f l i n g ( 全基因组改组) ，该种方法首先选择一 个原始亲株，通过经典的诱变育种方法获得多个表型得到提高的菌株，构建突变候选株文 库，以这些表型提高的菌株作为首轮多亲本融合的直接亲株，然后进行多亲株融合，使其 全基因组进行随机重组，获得第一代融合株；再从中选择表型获得进一步提高的菌株作为 下一轮融合的直接亲本，依此类推进行多轮的多亲株融合，最终从获得的突变体库中筛选 出性状被提升的目的菌株【1 9 】。这种技术在蛋白质、酶和单克隆抗体等的定向进化方面得到 了广泛的应用，并极大地促进了生物催化工程的发展。由于酶在生物反应途径中的特殊重 要性，因此通过定向进化方法改进酶的特性( 包括活力、稳定性和专一性) 、甚至创造出新 酶成为对代谢途径进行改造的一种非常有用的策略【2 0 1 。 9 0 年代，美国加州的m a x g e n 公司c a r d a y r 6 1 6 】等人提出t g e n o m es h u f f l i n g 技术的概念， 它把传统微生物诱变育种技术与细胞融合技术结合，在微生物菌株诱变的基础上，通过细 胞融合，使多个亲本杂交，产生新的复合子代。其具体操作过程是通过对出发菌株进行诱 变，然后在模拟d n a 重组的条件下对原生质体进行递推式多轮融合( r e c u r s i v e p r o t o p l a s t ) ， 最后筛选出具有多重正向进化标记的目标菌株【2 1 2 6 1 a s e x u a ls e x t j a l 镑 a 5 匿 c y c l e s ( e v o l u t i o n a r yt i m e ) 图卜1 诱变育种与基因组改组育种方法比较示意图 f ig 1 一la s e x u a lm u t a g e n e s i sv e r s u ss e x u a lr e c o m b i n a t i o n 福建师范大学张志国硕士学位论文 3 1 2 基因组改组技术的技术优势 目前工业生产的微生物高产菌株大多是采用传统诱变育种得来的突变株，在诱变育种 时往往是从单一的原始菌株出发，经过多代的物理化学诱变，然后再通过诱变后产生形态 学或者是生化特性的变化对诱变株的进行筛选与鉴定。由于在传统的诱变育种中，都只是 选择单个优良菌株连续诱变，降低了群体的遗传多样性。另外在诱变育种时，由于正向的 突变率很低，仅为1 0 4 左右，从而使得筛选高产目标产物的几率降低了，同时加大了时间 与工作量，浪费了大量的人力物力。由于菌株在经过多次的诱变之后，会对相应的诱变剂 产生抗性，出现对诱变剂的“钝化”反应，即所谓的“饱和现象【2 7 1 ，在诱变的过程中还 可能积累一些与生产性能无关或者有害的的诱变效应，会导致诱变效率的下降。 基因组改组技术在进行原生质体融合之前，可以利用诱变得到原始出发菌株的诱变 体，然后将带有正性突变的菌株做为第一轮融合的出发菌株，然后再经过多轮的递推式融 合，从而使具有不同正向突变的不同基因重组体到同一个细胞中。 与传统的诱变法相比，利用基因组改组技术还可以较快较高效的获得性状优良的重组 体，同时剔除负突变，这在很大程度上弥补了传统诱变法的不足。而与代谢控制育种相比， 基因组改组技术的一大优点在于不必了解整个基因组的序列数据和代谢网的信息【1 9 】【2 8 】。 3 1 3 基因组改组技术的应用 目前基因组改组技术在微生物育种中已经得到了广泛的应用，主要的应用包括以下几 个方面： 1 、提高微生物代谢产量或改善质量，高产菌株的选育 通过原生基因组改组，使两个亲本菌株的遗传物质得到重组，并能够使正向突变集中 到一个个体上，因而对于提高微生物代谢产物的产量具有有明显的作用。李立风，潘力等 通过对多亲株原生质体灭活，进行了两轮的电融合，在第一轮1 2 7 株融合株中得到酶活高 的4 株菌，在第二轮4 0 株菌中就得到酶活高的5 株菌，初步证明了基因组改组技术在酱油曲 霉育种上的可行性【2 9 1 。贺敏霞【3 0 】等人利用原生质体融合技术对诺卡氏菌进行基因重组，得 到的融合子能够产生亲本所没有代谢产物，而且对抗体转化活力有了较为明显的提高。陈 五岭等利用h c - n e 激光和聚乙二醇( p e g ) 不同的助融手段，使红霉素链霉菌和龟裂链霉菌两 种不同的原生质体得到融合，经过筛选得到的融合子产抗生素能力比亲本提高了 2 8 1 0 4 3 1 1 。朱昌雄等【3 2 】对比了低温和紫外线复合处理、紫外线处理等2 种常规诱变育种和 原生质体加紫外线复合处理及原生质体融合育种方法对菌株的不同作用效果，通过筛选， 得到的实验结果表明这通过四种方法处理菌种所产中生菌素的效价得到较大的提高，而且 相比较而言，原生质体处理方法的提高效果更为明显。 2 、改良菌种遗传特性，从而增加对环境的适应性 3 0 】 绪论 天津大学的陈涛、王靖宇等以b s u b t i l i sd b l 0 4 和b s u b t i l i s2 4 为出发菌株，通过两轮基 因组改组筛选到一株产核黄素菌株b s u b t i l i sr h 3 3 p m x 4 5 ，该株核黄素产量约为核黄素工 业生产菌b s u b t i l i s2 4 p m x 4 5 i 拘2 倍，同时改进了对葡萄糖的同化利用速率、菌体生长、感 受态形成等其他表型。由此可见，通过基因组改组，不仅使重组体在代谢物产量上有了较 大的提高，而且使重组体具有两个亲本的优良特性，从而改良了菌种的遗传特性【3 3 1 。王灏、 王航等利用基因组改组技术，大大改善了酿酒酵母菌株对高温和高乙醇环境的适应能力。 在他们的研究中最初的出发菌株在摇瓶发酵过程中最高乙醇浓度仅为8 1 1 8 ( 聊功，经过 诱变的方法得到的突变株，发酵液中乙醇最高浓度比出发菌株的最高浓度一般都高出2 3 左右，而经过g e n o m es h u f f l i n g 技术最终获得的菌株，其发酵液中乙醇最高浓度又比其 出发菌株的最高浓度一般都高出2 左右，相比最初的出发菌株f 4 r 2 4 菌株最高浓度约提高 了5 ，达到1 2 1 9 3 ( w p r o t 3 4 】。在国外，就有人利用原生质体融合技术将具有纤维素分解 能力的t r i c h o d e n m ar e e s e iq m 9 4 1 4 和能够利用葡萄糖生产酒精的s c e r e v i s i a en c i m 3 2 8 8 两 个菌株进行原生质体融合，从而得到一个能将纤维素转化为酒精的融合子菌株，这对于利 用纤维素提供了更好的技术支剖”】。 3 、利用基因组改组技术转移质粒，实现原生质体与细胞核融合 微生物可以通过转化、转导、接合和转染等多种方式转移遗传信息，但有些微生物则 不能，因此我们可以通过原生质体融合的方式，实现种内、种间甚至更为远缘的菌种之间 转移遗传信息。利用原生质体融合的方法，还可以实现原生质体与细胞核的融合，应用这 一新技术便于我们研究核与核，以及核与胞质之间的相互关系，并为育种工作提供一种新 的途径。 4 、改进菌种的遗传多样性，进行遗传分析 在传统的诱变育种，以单一出发菌株为亲本，经连续多代诱变，筛选优良菌株，这种 育种方式往往导致后代菌株间遗传多样性降低，导致进一步提高目标产物出现困难【3 6 1 。但 通过基因组改组能有效提高子代菌株的遗传多样性，这为进一步改良菌株提供丰富的资 源。林峻，施碧红【3 7 】等提高扩展青霉碱性脂肪酶产量的