（老年医学专业论文）hsp2760和p53在胃癌中的表达及临床意义.pdf

h s p 2 7 6 。和p 5 3 在胃二中的表达及临床：笺渤 中文摘要 p 5 3 与h s p 2 7 、h s p 6 0 在胃癌中表达无相关性，它们的相关系数及p 值分别 为r = 0 ，l5 9p = 0 2 8 2 和r = 0 2 5 2p = 0 0 8 4 结论 1 h s p2 7 6 0 和p 5 3 蛋白在胃癌中表达明显高于正常胃组织，它们的高 表达与胃癌的临床病理特征有关。 2 h s p2 7 在胃癌中表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移和临床分期有 关，h s p 2 7 的高表达提示胃癌的恶性程度高，预后不良。 3 p 5 3 在胃癌中阳性表达与肿瘤的大小、部位、浸润深度、淋巴结转移 个数和肿瘤增殖能力有关，p 5 3 的高表达提示胃癌的恶性程度高，预后不良。 p 5 3 表达与肿瘤部位有关，提示贲门和胃窦的肿瘤发病机制可能不同。 4 h s p6 0 与肿瘤的分化程度和增殖能力有关，而与胃癌的其他临床病理 参数无关，单独检测h s p6 0 对评估胃癌生物学行为意义不大。 5 h s p 2 7 和h s p 6 0 在胃癌中表达呈正相关，提示二者在胃癌发展中可能 起相互促进作用。p 5 3 与h s p 6 0 、h s p 2 7 无相关性。联合检测h s p 2 7 、h s p 6 0 和p 5 3 在胃癌中的表达可能有助于评估病情，预测预后。 关键词胃癌h s p 2 7 h s p 6 0 p 5 3免疫组织化学临床病理特征 2 c l i n i c a ls i g n i f i c a n c ea n de x p r e s s l 0 no f h s p 2 7 6 0a n dp 5 3i ng a s t r i cc a n c e r p o s t g r a d u a t e ：l ig u i q i n g s p e c i a l t y 、： g e r i a t o l o g y s u p e r v i s o r ：l is e n l i np r o f e s s o r a bs t r a c t o b j e c t i v e t os t u d yt h ee x p r e s s i o no fh s p 2 7 6 0a n d p 5 3 ，e x p l o r et h er e l a t i o n s h i p b e t w e e nh s p 2 7 6 0 ，p 5 3e x p r e s s i o n a n dc l i n i c o p a t h o l o g i c a lf e a t u r e si nh u m a n g a s t r i cc a n c e r ；t h ea i mo ft h i ss t u d yw a st oi n v e s t i g a t et h ei m p a c to fh s p 2 7 6 0 a n dp 5 3o nt h ed e v e l o p m e n to fg a s t r i cc a n c e r ，a n di t sr o l ef o rt h ej u d g e m e n to f t h ep r o g n o s i so fg a s t r i cc a n c e r m e t h o d t h ep a r a f f i n e m b e d d e dt i s s u e so f4 8s u r g i c a l l yr e s e c t e d g a s t r i cc a n c e r v e r i f i e db yp a t h o l o g ya n d14a d j a c e n tn o r m a lt i s s u e sw e r eo b t a i n e df r o mt h e d e p a r t m e n to fp a t h o l o g yo fl i a o c h e n gp e o p l e sh o s p i t a l a l lp a t i e n t sw e r en o t g i v e np r e o p e r a t i v ec h e m o t h e r a p y ，r a d i o t h e r a p yo rb i o t h e r a p y u s i n gs a b c i m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n gt oe x a m i n et h ee x p r e s s i o no fh s p 2 7 ，h s p 6 0a n d p 5 3 i n g a s t r i cc a n c e rt i s s u e sa n di na d j a c e n tn o r m a lg a s t r i ct i s s u e s t h e e x p r e s s i o n s o ft h e m w e r e s t a t i s t i c a l l ya n a l y z e d i nr e l a t i o nt ov a r i o u s c l i n i c o p a t h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，t u m o rp r o l i f e r a t i v ec a p a c i t y r e s u l t s 1 i nh u m a ng a s t r i cc a n c e rt i s s u e s ，t h eh s p 2 7e x p r e s s i o n ，t h eh s p 6 0 e x p r e s s i o na n dt h ep 5 3p r o t e i ne x p r e s s i o nw e r ep o s i t i v ei n3io f4 8c a s e s ( 6 4 6 ) ，3 3o f 4 8c a s e s ( 81 3 ) a n d3 3o f 4 8c a s e s ( 6 8 9 ) r e s p e c t i v e l y t h eh s p 2 7 6 0e x p r e s s i o nw e r ep o s i t i v ei n1o f14c a s e s ( 7 1 ) ，a n dp 5 3w a s n e g a t i v ei nh u m a nn o r m a lg a s t r i ct i s s u e s 2 t h ee x p r e s s i o no fh s p 2 7w a sr e l a t e dt ot h ed e p t ho ft u m o ri n v a s i o n ， l y m p hn o d em e t a s t a s i sa n dt n ms t a g e ( p 0 0 5 ) t h ee x p r e s s i o no fh s p 6 0w a sr e l a t e dt od i f f e r e n t i a t i o ng r a d ea n dt u m o r s t 3 p r o l i f e r a t i v ec a p a c i t y ( p o 0 5 ) t h ee x p r e s s i o no fp 5 3p r o t e i nw a sr e l a t e dt ot u m o rs i z e ，l o c a t i o n ，t h ed e p t h o ft u m o ri n v a s i o n ，l y m p hn o d em e t a s t a s i sa n dt u m o r s p r o l i f e r a t i v ec a p a c i t y ( p 0 0 5 ) 3 s t a t i s t i c a la n a l y s i ss u g g e s t e das i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o nb e t w e e nh s p 2 7 a n dh s p 6 0 ( r = 0 314p 2 0 0 3 2 ) p 5 3w a sn o tc o r r e l a t e dw i t hh s p 2 7o rh s p 6 0 ( h s p 6 0p 5 3r = 0 2 5 2p = 0 0 8 4 ，p 5 3h s p2 7r = 0 15 9p = 0 2 8 2 ) c o n c l u s i o n 1 h s p 2 7 6 0a n dp 5 3p r o t e i np o s i t i v ee x p r e s s i o nr a t ew a s h i g h e ri ng a s t r i c c a n c e rt h a nn o r m a lg a s t r i ct i s s u e s 2 t h ee x p r e s s i o no fh s p 2 7w a sr e l a t e dt ot h ed e p t ho ft u m o ri n v a s i o n ， l y m p hn o d em e t a s t a s i sa n dt n ms t a g e ( p 0 0 5 ) t h eh i g he x p r e s s i o no fh s p 2 7 i n d i c a t e dh i g hm a l i g n a n tg a s t r i cc a n c e ra n da p o o rp r o g n o s i sf o rag a s t r i cc a n c e r p a t i e n t 3 t h ee x p r e s s i o no fp 5 3p r o t e i nw a sr e l a t e dt ot u m o rs i z e ，l o c a t i o n ，t h e d e p t ho ft u m o ri n v a s i o n ，l y m p hn o d em e t a s t a s i sa n dt u m o r s p r o l i f e r a t i v e c a p a c i t y ( p 0 0 5 ) t h e yi n d i c a t e dh i g hm a l i g n a n tg a s t r i c c a n c e ra n dap o o r p r o g n o s i sf o rag a s t r i cc a n c e rp a t i e n t t h ee x p r e s s i o no fp 5 3c o r r e l a t e dw e l lw i t h g a s t r i cl o c a t i o n t h i sr e s u l tm a ys h o wt h a tt h ec a n c e r so fc a r d i ah a v ed i s t i n c t p a t h o g e n e s i sa n dm o l e c u l a rc h a r a c t e r i s t i c sf r o mt h a to b s e r v e di nc a n c e r so f a n t r u m 4 t h ee x p r e s s i o no fh s p 6 0w a sr e l a t e dt od i f f e r e n t i a t i o ng r a d ea n dt u m o r s p r o l i f e r a t i v ec a p a c i t y ( p 0 0 5 ) ，t h e r ew a sn oa v a i l a b l ed a t ac o n c e r n i n gt h e c l i n i c a l s i g n i f i c a n c eo fh s p 6 0e x p r e s s i o ni n r e l a t i o nt o c l i n i c o p a t h o l o g i c a l p a r a m e t e r si ng a s t r i cc a n c e r 5 t h e e x p r e s s i o n o fh s p 2 7a n dh s p 6 0i n g a s t r i cc a n c e ri sp o s i t i v e c o r r e l a t i o n t h i si n d i c a t e dt h a tt h e yc o u l dp r o m p tm u t a l l yi ng a s t r i cc a r c i n o m a p r o g r e s s i o n t h ee x p r e s s i o no fp 5 3p r o t e i ni ng a s t r i cc a n c e rd i d n tc o r r e l a t et o t h a to fh s p 2 7o rh s p 6 0 c o m b i n e dd e t e c t i o no fh s p 2 7 6 0a n dp 5 3p r o t e i ni n g a s t r i cc a r c i n a o m am a y b eh e l p f u lf o re v a l u a t i o no fp a t i e n t sc o n d i t i o na n d 4 p r e d i c t i o no fp r o g n o s i s k e yw o r d sg a s t r i cc a n c e r h s p 2 7h s p 6 0 p 5 3 i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y c l i n i c o p a t h o l o g i cf e a t u r e s 5 英文缩写英文全称 h s p s h s p 2 7 h s p 6 0 s p s p s s p b s u i c c i h c g c h e a ts h o c kp r o t e i n s 符号说明 h e a ts h o c kp r o t e i n 2 7 h e a ts h o c kp r o t e i n 6 0 s t r e s sp r o t e i n 中文全称 热休克蛋白 热休克蛋白2 7 热休克蛋白6 0 应激蛋白 s t a t i s t i c a lp a c k a g ef o rs o i a ls c i e n c e 社会科学统计程序包 p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n u n i o ni n t e r n a t i o n a l e c o n t r a lac a n c r u m i m m u n o h i s t o c h e m i c a l g a s t r i cc a n c e r 6 磷酸哉缓冲液 国际抗癌联盟 免疫组织化学 胃癌 前言 胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，居肿瘤相关死亡率的第二位 1 1 - 3 】。其发生与演变是一个渐进的过程，与环境变化和遗传因子有关，另外， 饮食方面如食盐的过多摄入和食用被亚硝酸盐污染的食物、吸烟、幽门螺杆 菌感染等有助于胃癌的发生。近年来研究发现胃癌的发生和发展涉及多基因 改变的结果，包括多种癌基因的激活和抑癌基因的失活、抑制细胞凋亡和刺 激细胞分化、增殖等。致病因素作用于某基因并引起其结构的改变和表达水 平的变化，并在不同的细胞功能中发挥重要作用，如细胞粘附、信号传导、 细胞分化、细胞增殖及转移等，导致胃癌的发生和发展，但具体机制仍不十 分清楚，更好的了解胃癌发生发展中的分子机制将有利于胃癌的诊治和预 防。由于早期胃癌的临床表现缺乏特异性，而且胃癌缺乏敏感度高、特异性 强的早期诊断指标，多数患者就诊时已处于中晚期，目前其治疗仍以手术为 主，辅以化疗、放疗及免疫治疗等，尽管经积极综合治疗，患者预后仍不理 想，五年生存率为2 0 3 0 不等。寻找判断胃癌生物学行为的指标，对阐明 胃癌发生、发展机制、诊断、病情评估及治疗方案的选择有重要的意义。 热休克蛋白( h e a ts h o c kp r o t e i n s ，h s p s ) 是r i t o s s a 在1 9 6 2 年首先发现 的，当时在研究果蝇唾液腺染色体时发现一种在细胞高温应激时能产生细胞 有保护作用的蛋白质，因而命名为“热休克蛋白”。是一组广泛存在于原核和 真核生物中高度保守的蛋白质，在应激状态下，如低氧、重金属、亚砷酸盐、 肿瘤、炎症、病毒感染、d n a 损伤、氨基酸类似物、化疗药物等，可被诱导 表达，因此又称应激蛋白( s t r e s sp r o t e i ns p ) ，使细胞对再次受到应激损伤时 具有耐受性，从而使机体能够应对反复变化的环境刺激，具有提高细胞应激 的耐受性及维护细胞自稳等重要生物功能。根据其同源性和分子量大小，同 本学者森本将主要的h s p 分为4 个家族：h s p 9 0 家族( 分子量约8 3 1 10 k d a ) 、h s p7 0 家族( 分子量约6 6 7 8 k d a ) 、h s p 6 0 家族及小分子量h s p 家族 ( 分子量约1 2 4 3 k d a ) 。因本身不构成被介导蛋白质的组成成分所以被称为 “分子伴侣”。所有的h s p 家族都具有分子伴侣功能，参与新生蛋白质的折叠、 新合成蛋白质的转运、活化特异的调控蛋白以及蛋白质的降解和蛋白信号与 抗原信号的呈递，同时h s p 还能抑制变性蛋白质的不可逆性聚集，降低蛋白 质的错误折叠和聚集，稳定蛋白质和多肽，在某些条件下尚可以使变性的蛋 7 白质再折叠，具有抑制细胞凋亡和保护细胞的作用【4j 。除了作为分子伴侣行 使功能，h s p s 还可以作为直接的感受器，感受细胞静息、凋亡、坏死等信号。 近年来研究发现热休克蛋白在许多肿瘤中高表达，如乳腺、卵巢、子宫内膜 和前列腺癌等，并显示与肿瘤细胞增殖和分化有关【5 】。 近年来研究证实热休克蛋白可能与胃癌的发生有密切关系。在胃癌的发 生、发展中起重要作用【6 。h s p 2 7 是h s p s 家族中小分子量h s p s 中的一员， 对维持机体的自身稳定性起重要作用，使细胞维持正常的生理功能，增加细 胞对损伤的防御和适应能力i g 】。s h s p 家族至今已发现有9 种蛋白：h s p 2 7 ， p 2 0 ，h s p b 3 ，m k b p h s p b 2 ，h s p b 8 ，h s p b 9 ，c v h s p ，a ac r y s t a l l i n 和q b c r y s t a l l i n 。他们的c 末端都有一个由5 0 1o o 个氨基酸组成的核心区，即晶 状体蛋白盒，这一区域的空间构象与i g g 相似；相比较而言，s h s p s 的n 末 端在长度和序列上都更加多变，但都含有w d p f 基序，这一结构域是s h s p s 多聚化的基础。在正常细胞中，h s p 2 7 主要以6 个四聚体组合的复合物形式 存在：在应激条件下，首先h s p 2 7 的第15 、7 8 和8 2 位的丝氨酸发生磷酸化， 使大的多聚体解聚为四聚体，随之细胞内h s p 2 7 的转录、翻译上调，使h s p 2 7 表达水平增高。张红艳1 9 】等报道h s p 2 7 能有效减少消炎痛等药物对胃黏膜的 损伤，说明在胃黏膜损伤修复过程中可能起重要作用。随着研究的不断深入， 它与肿瘤的关系日益受到重视。研究发现h s p 2 7 在多种肿瘤中高表达，而且 在不同组织的肿瘤的表达和作用不同。被认为与肿瘤的发生、发展、预后、 肿瘤免疫以及化疗耐药的发生有密切的关系。 h s p 6 0 是生物组织中最保守的蛋白之一，主要定位于细胞的线粒体，小 部分位于胞浆。线粒体h s p 6 0 的前体蛋白n 端含有线粒体定位序列，引导 其进入线粒体，同时该序列被切除，使h s p 6 0 驻留于线粒体内。当受到各种 应激时，h s p 6 0 会从线粒体中释放出来。其作用主要包括：1 分子伴侣功能。 真核生物中的h s p 6 0 在依赖a t p 的反应中促进错误折叠和变性蛋白的降解。 2 抗感染功能。机体在受到感染等刺激下，h s p 6 0 会从线粒体释放至细胞膜 的表面，呈现高表达。3 参与自身免疫。在应激状态下，机体释放的自身h s p 6 0 能以分子模拟宿主自身抗原，从而逃避宿主免疫和或诱发自身免疫，同时 其具有抗原特异性，可引起抗感染免疫。研究发现在人类许多自身免疫性疾 病中h s p 6 0 呈高表达，如类风湿关节炎、糖尿病等。h s p 6 0 从多个环节影响 8 细胞的凋亡，既能作用于抗凋亡因子，维持其功能，抑制促凋亡因子的激活， 有时在某些条件下对促凋亡因子产生保护作用而使细胞凋亡。表现出对细胞 凋亡调节的双重性。近年来的研究发现h s p 6 0 在多种恶性肿瘤中高表达，与 肿瘤的发生和发展有密切联系。因其对细胞的凋亡有促进凋亡和抑制凋亡双 重作用而致在不同类型、不同组织的肿瘤中表达及作用有很大的差异。 人类p 5 3 基因定位于染色体l7 b 13 ，全长l6 - 2 0 k b ，含有1 1 个外显子和 10 个内含子。编码的蛋白为分子量为5 3k d a 的核结合蛋白，含有3 个主要 功能区：n 末端转录激活区，可激活转录，这一区域还可与p 5 3 的负调控因子结 合；中央d n a 核结合区，一区域具有特异性结合d n a 的功能，并是肿瘤细胞 突变热点区域；c 末端非专一d n a 结合区，包括核定位信号区和核输出信号 l l o 】 o 研究发现p 5 3 是人类肿瘤中最易突变的基因，先前的研究发现它的突变 率从4 5 7 歹1 q 等 9 - 11 】。分为野生型( w i l dt y p ep 5 3 ，w tp 5 3 ) 蛋白和突变型 p 5 3 ( m u t a n tp 5 3 ，m u t p 5 3 ) 蛋白，野生型具有抑癌作用，而突变型具有抑制细 胞凋亡作用，是一种肿瘤促进因子，因其半衰期长，稳定性强而易被检测。 研究发现突变型p 5 3 在多种恶性肿瘤中高表达，与肿瘤的发生、发展、浸润、 转移及预后有关。一般认为p 5 3 蛋白过度表达被认为是多种肿瘤预后不良的 征兆。p 5 3 参与肿瘤的形成过程，但是野生型抑制肿瘤发生和突变型促进肿 瘤发生的机体机制尚不明确。近年来的研究还发现p 5 3 基因的表达也影响肿 瘤对放化疗的敏感性。p 5 3 基因可通过促进凋亡基因b a x 和抑制凋亡基因 b c l 2 的转录，以增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性l i 引。研究发现p 5 3 在胃癌中 突变率最高【l3 1 ，它的失活在胃癌的发生、发展中起着重要作用。被认为p 5 3 基因的变异是胃癌形成中的遗传事件，但仍需要更进一步的研究去证实。先 前的研究已证实p 5 3 蛋白在胃癌中高表达与胃癌的不良预后有关，但其表达 与胃癌临床病理特征的关系各学者报道不一。 由于胃癌的发生发展是多基因以多种形式变异积累的结果，涉及癌基 因、抑癌基因、生长因子及受体、转录调节基因等多种基因的改变，任何单 一基因都不能从基因水平阐明肿瘤发生的分子机制，也不能比较准确地判断 胃癌的预后。有必要对胃癌进行多种基因的检测以用于f 确评估胃癌的生物 学行为，预测预后，并为胃癌的个体化治疗提供依据。有关h s p 2 7 6 0 在胃癌 9 能力，并和野生型p 5 3 蛋白结合成寡聚复合物，使内源野生型p 5 3 蛋白失活， 导致细胞转化和过度增殖而产生肿瘤细胞生长优势，这一过程可能是细胞生 物学行为改变的标志之一【h 1 5 】，但具体机制不十分清楚。还发现h s p 在肿 瘤细胞中因p 5 3 功能的丧失而转录增加l 晒l 。在胃癌中同时检测h s p 2 7 、h s p 6 0 和p 5 3 蛋白的表达水平，并分析在胃癌中表达是否具有相关性，国内外文献 尚未见报道。 k i 一6 7 是一类与细胞周期相关的细胞核非组蛋白，广泛表达于增殖期细 胞，而不表达于静止期细胞，k i 6 7 半衰期短，细胞脱离增殖周期后迅速降解， 与其它反映细胞增殖的指标如细胞增殖核抗原( p c n a ) 、d n a 聚合酶、溴脱 氧嘧啶相比，更能反映肿瘤的恶性程度及患者的预后i i7 1 。因此在研究中常用 来作为评估细胞增殖的指标。研究发现在多种肿瘤及癌前病变中均有k i 6 7 的异常表达，与肿瘤的种植、浸润、转移潜能有关。 本实验利用免疫组化s a b c 法检测4 8 例胃癌组织及14 例癌旁组织中 h s p 2 7 、h s p 6 0 和p 5 3 蛋白的表达水平，利用免疫组化法检测k i 6 7 在胃癌 中的表达，以评估肿瘤的增殖能力与h s p 2 7 、h s p 6 0 和p 5 3 蛋白的表达的关 系。分析h s p 2 7 、h s p 6 0 和p 5 3 蛋白在胃癌中的表达与胃癌临床病理参数的 关系，并分析它们的相关性。以探讨在胃癌发生和发展中的作用，有助于阐 明胃癌的发生机制、病情评估和指导治疗。 l o 材料与方法 1 材料 1 1 研究对象 选取聊城市人民医院2 0 0 8 年1 月lr 至2 0 0 9 年2 月lr 手术切除的病 理科胃腺癌存档蜡块4 8 例，其中男性3 7 例( 7 7 1 ) ，女性l l 例( 2 2 9 ) ， 年龄范围3 0 7 5 岁，中位年龄5 9 岁。术前未经任何抗肿瘤治疗。分化程度分 为3 等级：高分化( n = 2 例，4 2 ) 、中分化( n = l0 例，2 0 8 ) 、低分化( n = 3 6 例，7 5 ) ，t n m 依照国际抗癌联盟1 9 9 7 年( u n i o ni n t e r n a t i o n a l ec o n t r a l a c a n c r u mu i c c ) 标准分类，其中浸润深度：t l - 2 ( n = l0 ，2 0 8 ) ，t 3 ( n = 2 8 ， 5 8 4 ) ，t 4 ( n = 10 ，2 0 8 ) ；淋巴结转移：n 0 ( n = 9 ，18 8 ) ，nl ( n = 18 ， 3 7 5 ) ，n 2 ( n = 9 ，18 8 ) ，n 3 ( n = 1 2 ，2 5 ) ；远处转移：m 0 ( n = 4 2 ，8 7 5 ) ， m 1 ( n = 6 ，1 2 5 ) 。临床分期：i ( n = 4 ，8 3 ) ，i i ( n = 9 ，18 8 ) ，i i l ( n = 1 2 ，2 5 ) ， i v ( n = 2 3 ，4 7 9 ) 。正常胃黏膜组织1 4 例作为对照组，取自相应胃癌手术切 除标本的边缘正常组织。 1 2 实验分组 本实验主要从下述病理参数的角度描述h s p 2 7 6 0 、p 5 3 蛋白的表达特征。 1 2 1 病人性别：分为男、女两组。 1 2 2 病人年龄：分为三6 0 岁和 6 0 岁两组。 1 2 3 肿瘤部位：分为贲门、胃体和胃窦三组。 1 2 4 肿瘤大小：根据肿瘤的直径大小分为_ 5 c m 两组。 1 2 5 肿瘤分化程度：分为高分化、中分化、低分化三组。 1 2 6 肿瘤浸润深度：分为侵及黏膜层、肌层、侵及浆膜层和胃壁全层 三组。 1 2 7 淋巴结转移：根据淋巴结转移个数分为无淋巴结转移、少于7 个 淋巴结、7 15 个淋巴结、多于15 个淋巴结四组。 1 2 8 有无远处转移：分为无转移和有转移二组。 1 2 9 临床病理分期：根据国际抗癌联盟公布的t n m 分期，分为i 、i i 、 i i i 、i v 四组。 1 3 主要试剂 即用型兔抗人h s p 2 7 多克隆抗体武汉博士德生物工程有限公司 ( b a 0 3 6 1 ) 即用型兔抗人h s p 6 0 多克隆抗体武汉博士德生物工程有限公司 ( b a l 5 11 ) 即用型鼠抗人p 5 3 单克隆抗体武汉博士德生物工程有限公司 ( b m 0 1 0 1 ) 即用型兔抗人k i 6 7 多克隆抗体武汉博士德生物工程有限公司 ( b a l 5 0 8 ) 即用型s a b c 免疫组化试剂盒武汉博士德生物工程有限公司 d a b 显色试剂盒( a r l0 2 2 )武汉博士德生物工程有限公司 各抗体阳性对照片武汉博士德生物工程有限公司 粘附载玻片江苏世泰实验器材有限公司 p b s 缓冲液自行配制 枸椽酸缓冲液自行配制 1 4 主要仪器 石蜡切片机( l e i c a r m 2 13 5 )德国l e i c a 公司 高压锅( c y s b 5 0 f c 3 10 )苏泊尔集团有限公司 电热恒温干燥箱( y y 0 0 2 7 9 0 )山东潍坊医药集团 h a i e r 冰箱( 型号：b c d 一215 k )青岛海尔冰箱厂 o l y m p u su s b x 5 1 光学显微镜日本o l y m p u so p t i c a l 公司 尼康数码照相机日本尼康公司 ( 型号：c o o l p i x 4 5 0 0 ) 2 实验方法 2 1 选择符合要求的胃癌石蜡标本 2 2s a b c 法检测h s p 2 7 、h s p 6 0 、p 5 3 及k i 6 7 的表达 石蜡包埋标本做4 u m 的连续切片，连续切片6 张，用于检测h s p 2 7 、 h s p 6 0 、p 5 3 、k i 6 7 ，l 片阴性对照，l 片备用。并置于防脱玻片上，6 0 。c 烤 箱放置3 0 分钟。 2 3 免疫组织化学染色：采用s a b c 法。 免疫组织化学染色法具体步骤如下 1 2 ( 1 ) 切片常规脱蜡至水：石蜡切片常规经二甲苯脱蜡；梯度酒精i ( 9 5 ) 、 i i ( 9 0 ) 、i i i ( 8 0 ) 、i v ( 7 0 ) 水化；自来水冲洗，用p b s ( 0 0 1 m o l ，p h 7 3 ) 冲洗3 次，每次5 分钟( 5 m i n x 3 ) ，下同。 ( 2 ) 将切片浸入o 0 1m 枸橼酸盐缓冲液( p h 6 0 ) ，微波炉加热至沸腾 后断电，冷却后p b s ( p h 7 3 ) 沈涤3 次。 ( 3 ) 3 0 h 2 0 2 1 份+ 蒸馏水1o 份混合，室温10 分钟以灭活内源性过氧 化物酶。蒸馏水洗3 次。 ( 4 ) 滴加5 b s a 封闭液，室温2 0 分钟后，甩去多余液体，不洗。 ( 5 ) 滴加即用型一抗( h s p 2 7 6 0 、p 5 3 、k i 6 7 ) ，4 过夜。 ( 6 ) p b s 洗2 分钟x 3 次。 ( 7 ) 滴加生物素化山羊抗兔i g g ，室温2 0 分钟。p b s 沈2 分钟x 3 次。 ( 8 ) 滴加试剂s a b c ，室温下2 0 分钟。p b s 洗5 分钟x 4 次。 ( 9 ) d a b 显色：使用d a b 显色试剂盒( a r l0 2 2 ) 。取1m l 蒸馏水，加 试剂盒中a ，b ，c 试剂各1 滴混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应 时问，一般3 5 分钟。蒸馏水洗涤。 ( 1o ) 苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。 ( 1 1 ) 显微镜下观察。 阴性对照以p b s 代替一抗；阳性对照为公司提供己知阳性切片。每一批 实验均设阴性、阳性对照。 2 4 结果判定 由病理科两位资深医师在不知临床资料的情况下独立观察每张切片后 作出判断，阳性表达为细胞中出现黄色或棕黄色颗粒。计数2 0 个高倍视野 ( * 4 0 0 ) 的阳性细胞，根据阳性细胞百分率分为阴性( ) ：阳性细胞 6 0 。以中等强度阳性和强阳性为过表达病例。肿瘤增 殖能力以k i 一6 7 标记的肿瘤细胞胞核呈棕黄色为阳性表示。高倍镜下每张切 片随机选择5 个视野，每个视野计数2 0 0 个肿瘤细胞，共10 0 0 个。计算阳 性肿瘤细胞所占的百分比，以均数为界值分为低表达及高表达组。 2 5 统计学处理 所有数据都采用s p s s l 3 0 统计软件包进行统计学分析。卡方和f i s h e r s 确切概率法用来评估h s p2 7 6 0 和p 5 3 在胃癌中的表达与胃癌各临床病理参 数的关系；s p e a r m a n 秩相关分析三种蛋白表达的相关性。p 0 0 5 ) ，而与肿瘤的浸润 深度、淋巴结转移和临床分期有关( p 0 0 5 ) ( 见表2 ) 。 h s p 6 0 在胃癌中的表达与病人性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、浸涧 深度、淋巴结转移、有无器官转移和临床分期无相关性( p 0 0 5 ) ，而与肿 瘤的分化程度和肿瘤增殖能力有关( p 0 0 5 ) ，分化程度愈差，阳性表达率 愈高，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) ，而与肿瘤的大小、部位、浸润深度、 淋巴结转移个数和肿瘤增殖能力有关( p 5 c m 的p 5 3 蛋 白阳性表达率高于肿瘤直径 6 0 y 2 217 ( 7 7 3 ) 5 ( 2 2 7 ) 4 1 2 618 ( 6 9 2 ) 8 ( 3 0 8 ) 2 0 2 8 5 9 0 0 9 1 o 2 3 0 0 6 3 2 0 9 2 9 0 6 2 8 1 4 8 80 4 7 5 7 7 1 6 0 0 2 l 1 0 9 6 00 0 1 2 1 0 5 4 0 3 0 5 8 2 5 1