（动物学专业论文）红褐林蚁（ica+rufa+linnaeus）活性多肽蛋白质的研究.pdf

红褐林! 瞍( 而删把仃，咖l i n n a e u s ) 活性多肽蛋白质白臼研究 摘要 l 蚂蚁是一种具有很高食用、药用价值的昆虫，其食用和药用在我 国已有悠久的历史。据报道，蚂蚁体内含有蛋白质，氨基酸和多种维 生素，还有很多微量元素等多种营养成分，其中研究的焦点大多集中 在拟黑多刺蚁( p o l y r h a c h i sv i c i n ar o g e r ) 、血红林蚁( f o r m i c as a n g u i n e a l a t r ) 和红褐林蚁( f o r m i c ar u f al i n n a e u s ) 。伪进一步探明蚂蚁体内的活 性成分以开发和利用其药用价值，本文对红褐林蚁的提取物中的多肽 进行了分离、纯化并对其生物活性和药用活性进行了研究，通过电泳 测定了多肽的分子量，从而为进一步研究开发蚂蚁提供科学的依据。 本论文共包括以下5 个部分： 1 红褐林蚁样品的凝胶过滤层析分离本部分旨在通过葡聚糖凝 胶g 一5 0 过滤层析初步分离红褐林蚁样品，根据分子量大小不同而达到 分离目的。利用紫外检测对分离的物质进行检测，检测出蛋白峰，并 用分部收集器对所分离的样品进行分部收集，结果共得到两个组分。 2 红褐林蚁样品的反相高效液相色谱分离、制备本部分利用反 相高效液相色谱把前面所得的两个组分继续进一步分离，每个组分分 别分离、制备各得到了三个组分，共六个组分；经紫外检测方法检测， 结论为所得组分为多肽蛋白质。 3 红褐林蚁多肽蛋白质的生物活性测定本部分用体外实验的方 法淋巴细胞转化实验对分离、纯化所得含量较高的多肽蛋白质的 生物活性进行测定，结论为所得到的多肽具有抑制淋巴细胞转化的免 疫活性。 4 红褐林蚁多肽蛋白质的分子量测定本部分旨在通过s d s 一聚 丙烯酰胺凝胶电泳测出所得多肽蛋白质的相对分子量，测得其中一组 分的相对分子量为1 70 0 0 d a 左右，结论为所分离、纯化的物质是小分 i i 子的多肽。 5 红褐林蚁多肽蛋白质的药用实验研究本部分旨在用动物模型 实验的方法，研究所得红褐林蚁多肽的药用活性，结论为红褐林蚁多 肽具有抗炎、镇痛的作用。 通过以上实验研究证明红褐林蚁体内多肽蛋白质的存在，而且还 具有免疫活性和抗炎、镇痛的药用作用，从而为进一步研究开发和利 用蚂蚁提供了科学的参考。木 关键词： 红褐林蚁多肽1 淋巴细胞转化；s d s 电泳、抗炎p 镇痛 t h es t u d i e so l la c t l v op c i y p e p t i d e so ff o r m i c a r u f al i n n a e u s a b s t r a c t a n t sa r eas o r to fi n s e c t sw h i c hh a v et h e g r e a t e d i b l e n e s sa n d o f f i c i n a lv a l u e t h e i ru s e sh a v eb e e nal o n gh i s t o r yi nc h i n a i ti sr e p o r t e d t h a tt h ea n t sh a v ep r o t e i n ，a m i n oa c i d s ，m a n yv i t a m i n e sa n dp l e n t yo f m i c r o e l e m e n t si nt h e i rb o d i e s b yn o wt h es t u d i e so nc o m p o n e n t so fa n t s a r ea l m o s ta b o u tp o l y r h a c h i sv i c i n ar o g e r , f o r m i c as a n g u i n e al a t r a n d f o r m i c ar u f al i n n a e u s t op r o v eu pu l t e r i o r l yt h ec o m p o n e n t so fa n t s ，t h e a u t h o rh a s s e p a r a t e d a n d p u r i f i e d t h e p o l y p e p t i d e s o ff o r m i c a r u f a l i n n a e u sa n ds t u d i e dt h e i rb i o l o g i ca n do f f i c i n a la c t i v i t i e s a tt h es a i t l e t i m e ，t h ea u t h o rh a sm e n s u r a t e dt h em o l e c u l a rw e i g h to fp o l y p e p t i d e sb y s d s p o l y a c r y l a m i d ee l e c t r o p h o r e s i s t oa n a l y z et h e p o l y p e p t i d e sq u a n t i f i c a t i o n a l l y i n o r d e rt o p r o v i d e t h es c i e n t i f i cb a s i sf o r s t u d y i n g a n d e m p o l d e r i n g t h ea n t s ，w eh a v ed o n et h e s es t u d i e s t h i sa r t i c l ei sc o n s i s t e do ff i v ep a r t s ： 1 t h es e p a r a t i o no ft h ef o r m i c ar t l f al i n n s e u ss a m p i e sb y p e ifi it r a tio nc h r o m a t o g r a p h y i nt h i s p a r t ，t h ea u t h o rh a sp r i m a r i l ys e p a r a t e dt h ef o r m i c ar u f a l i n n a e u s s a m p l e sb yg l u c o s a ng e l g 5 0f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y t h ep r i n c i p l ei st h ed i f f e r e n c eo ft h em o l e c u l a r w e i g h t o fd i f f e r e n t c o m p o n e n t s t h eu l t r a v i o l e ta b s o r p t i o nd e t e c t o ri sa l s oa p p l i e dt o d e t e c t t h ep r o t e i na p e x e s t h ec o m p o n e n t sa r er e s p e c t i v e l yc o l l e c t e db yf r a c t i o n c o l l e c t i o n w eh a v e g o t t e nt w o a b s o l u t ec o m p o n e n t s 2 ，t h e s e p a r a t i o n a n d p r e p a r a t i 0 1 1o ft h ef o r m i c ar u f a l i n n a e u s s a m p l e sb yr e v e r s e d - p h a s eh i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d i ” c h r o m a t o g r a p h y i nt h i s p a r t ，t h e a u t h o rh a s s e q u e n t i a l l ys e p e r a t e d t h ea b o v e m e n t i o n e d c o m p o n e n t s b yr e v e r s e d p h a s eh i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y a st h er e s u l t ，e a c hc o m p o n e n t i ss e p a r a t e da n dp r e p a r e d t o g e tt h r e ec o m p o n e n t sb yt h i se x p e r i m e n t a t i o n w e h a v eg o t t e ns i x c o m p o n e n t si na 1 1 t h eu l t r a v i o l e ta b s o r p t i o nh a s d e t e c t e dt h ec o m p o n e n t s a n d p r o v e d t h a tt h e ya r ea l lp o l y p e p t i d e s 3 t h em a n s u r s t i o no ft h eb j 0 i o g i oa c t i v i t yo ft h ef o r m i c a r l j f al i n n a e u sp c i y p e p t i d e s i nt h ep a r t ，w eu s e dt h ee x p e r i m e n t si nv i t r os t u d i e s ，t h el y m p h o c y t e t r a n s f o r m a t i o n ，t om e n s u r a t et h eb i o l o g i c a c t i v i t i e so ft h ep o l y p e p t i d e s w h o s ec o n t e n t sa r eh i g h e rt h a no t h e r s t h ec o n c l u s i o ni st h ep o l y p e p t i d e s h a v et h ei m m u n o l o g i c a la c t i v i t y 4 t h em e n s u r a t i o no ft h ei n o l e o u i a rw e i g h to ff o r m i c ar l j f a l i n n a e u sp c i y p e p t i d e s i nt h ep a r t ，t h ea u t h o r si n t e n t i o ni sm e n s u r a t i n gt h em o l e c u l a rw e i g h t o ft h ep o l y p e p t i d e sb ys o d i u m d o d e c y ls u l f a t ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o - p h o r e s i s t h er e s u l t s h o w st h a to n eo ft h ep o l y p e p t i d e sw h i c hw eh a v e m e n s u r a t e di sa b o u t1 7 ，0 0 0 d a t h ec o n c l u s i o ni st h a tt h e c o m p o n e n t s w h i c hw eh a v es e p a r a t e da n d p u r i f i e da r es m a l lm o l e c u l ep o l y p e p t i d e s 5 t h ep h a r m s c e u tic ai s t u d y o ff o r m i o ar u f alin n a e u s p c i y p e p t i d e s i n l i sp a r t w eu s e dt h ee x p e r i m e n t so nt h ea n i m a lm o d e l st os t u d y t h ep h a r m a c e u t i c a la c t i v i t i e so ff o r m i c ar 咖l i n n a e u s p o l y p e p t i d e s t h e c o n c l u s i o ni s f o r m i c a ，咖l i n n a e u sp o l y p e p t i d e s w h i c hh a v et h e a n t i p h l o g i s t i ca n da n t a l g i ce f f e c t i nc o n c l u s i o n ，w eh a v ep r o v e dt h ee x i s to ff o r m i c at u f al i n n a e u s p o l y p e p t i d e s t h e y h a v ei m m u n o l o g i c a l a c t i v i t y , t h ea n t i p h l o g i s t i c a n d a n t a l g i ce f f e c t c o n s e q u e n t l yw ec a l lp r o v i d et h es c i e n t i f i cr e f e r e n c ef o r r e s e a r c h i n g ，e m p l o d e r i n ga n du s i n g t h e p h a r m a c e u t i c a lv a l u e o f t h ea n t s k e y w o r d s ：f o r m i c at u f al i n n a e u s l y m p h o c y t e t r a n s f o r m a t i o n p o l y p e p t i d e s d s p o l y a c r y l a m i d ee l e c t r o p h o r e s i s a n t i p h l o g o s i sa n a l g e s i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：i 塑笙 日期： 学位论文版权使用授权书 ) 棚专r 、0 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文 的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范 大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 剿蹴测徽：立燃 e t 舰趔i ! 工。塑 学位论文作者毕业后去向： 工作单位； 通讯地址： 电话： 邮编： 第一章前言 蚂蚁在分类学上隶属膜翅目( h y m e n o p t e r a ) 、细腰亚目( a p o c f i t a ) 、 针尾类( a c u l e a t a ) 、蚁总科( f o r m i c o i d e a ) 的独一科即蚁科( f o r m i c i d a e ) ( 唐觉等，1 9 9 5 ) 。蚂蚁是地球上数量最多、分布最广、营群体生活的 昆虫。据b b o l t o n 统计，全世界描述的现存种类共1 6 亚科，2 9 6 属， 9 5 3 8 种( 未含种下名称) 。估计该科全世界的种类在1 50 0 0 种以上( 周 善义等，1 9 9 7 ) 。本论文所研究的红褐林蚁( f o r m i c a ，咖l i n n a e u s ) 隶属 于蚁亚科( f o r m i e i n a e ( l e p e l e t i e r ) f o r e le m e n d ) 、蚁属( f o r m i c a l i n n a e u s ) ( 唐觉等，1 9 9 5 ) 。 一、国外蚂蚁生物化学及化学成分的研究概况 国外蚂蚁生物化学的研究开始较晚。h e i n z e ( 1 9 8 8 ) 首先报道了细胸 族蚂蚁酯酶的电泳变异性，1 9 8 9 年他又发表了“北美l e p t o t h o r a x m u s c o r u m 类群的生物化学系统分类”。d o u w e s 和s t i l l e ( 1 9 8 7 ) 发表 了“在l e p t o t h o r a x 属分类中酶电泳的应用”。1 9 8 7 1 9 8 8 年b l u m 等研 究了蚂蚁颚腺的化学性质，并于1 9 9 0 年提出了应用蚂蚁的自然分泌物 对蚂蚁进行化学分类的可能性。1 9 9 4 年k i n 应用电泳方法对毛蚁属 l a s i u s 和蚁属f o r m i c a 进行了分类研究。 有关蚂蚁化学成分的报道出现较早，h a n s e n t ( 1 9 8 1 ) 报道了北方蚁 ( f o r m i c a a q u i l o n i ay a r r o w ) 的储存、抗寒物质的季节性变化， s a m w a y s ，m j ( 1 9 8 2 ) 报道了南非蚂蚁的可溶性蛋白褐酯酶的电泳比较， s c h m i d t ，g e r h a r dh ( 1 9 8 3 ) 研究了多栉蚁( f o r m i c ap o l y c t e n af o e r s t e r ) 在胚胎后期发育阶段经十二烷基硫酸钠处理后的蛋白质电泳带型， t e g e l s t r o e m ，h a a k a n ( 1 9 8 3 ) 对红褐林蚁的等电聚焦蛋白质进行了分析研 究，l e c o m t e ，j ( 1 9 8 5 ) 研究了4 p 捃m e l l i f e r al i n n e 和红褐林蚁体内自由 肾上腺素和结合肾上腺素的分布比较，f r a n c k e ，w ；b o r c h e r t ，j ( 1 9 8 5 ) 对红褐林蚁体的挥发油组成成分作了分析研究，g e h r i n g ，w a l t e rj ； w e h n e r , r u d i g e l ( 1 9 9 5 ) 报道了撒哈拉沙漠箭蚁热休克蛋白的合成及耐 热性，w h e e l e r , d i a n ae a n dt e r e s am a r t i n e z ( 1 9 9 5 ) 对蚂蚁贮存蛋白质进 行了研究，发现红褐林蚁体内一种新的防卫素，即内源性抗菌肽等等。 二、中国蚂蚁化学成分及药用的研究概况 1 古代的研究 我国是世界上最早记载蚂蚁的国家之一。夏朝( 公元前2 0 0 0 年) 的古籍夏小正中已有“五月浮游出现，十二月蚂蚁进窝”的记述。 比古希腊亚里士多德的记载早了1 6 0 0 年。晋朝( 公元2 6 5 - 4 2 0 年) 稽 含在南方草木状记载了广东果农利用黄獠蚁o e c o p h y l l a s m a r a g d i n a ( f a b r i c i u s ) 防治柑橘害虫的例子，并成为世界上生物防治的 先例。明朝李时珍( 公元1 5 1 8 1 5 9 3 ) 在本草纲目中记载：“蚁处 处有之，有大、小、黑、白、黄、赤数种，穴居卵生。其居有等，其 行有对。能知雨候，春出冬蛰”。但是近代我国对蚂蚁的科学研究远远 落后了。 2 药用蚂蚁的化学成分及其提取分离的研究现状 目前国内药用蚂蚁研究最多的为拟黑多刺蚁( p o l y r h a c h i s v i c i n a r o g e r ) 和血红林蚁( f o r m i c as a n g u i n e al a t r ) 。药用蚂蚁体内含丰富的蛋 白质( 5 1 2 3 5 9 5 9 ) ，并已检出2 6 种游离氨基酸及1 7 种蛋白质水解 氨基酸。其中苏氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨 酸和蛋氨酸七种为人体必需氨基酸。并含有微量元素2 8 种，其中人体 必需的微量元素c u 、z n 、m n 、f e 含量较高，分别为普通食品的1 0 b 2 0 倍。另外还含有维生素a 、d 、e 、b 2 、b 1 2 等( 陈即惠1 9 8 3 ；甘绍 虞1 9 8 4 ：容碧娴1 9 8 7 ) 。陈即惠( 1 9 8 5 ) 报道了拟黑多刺蚁的石油醚( 3 0 6 0 c ) 提取部分油酸占6 2 4 0 ，棕榈油酸占1 1 0 3 ，棕榈酸占2 1 1 4 ， 硬脂酸占2 2 9 ，亚油酸占1 3 9 ，亚麻酸占1 2 1 ，豆蔻酸占o 5 3 。 此外，蚂蚁体内含有高能含磷化合物三磷酸腺苷( a t p ) 及氧化呼吸 链中必需的递氢体f a d 、f m n ，可直接提供人体能量。还有甾族类化 合物、三萜类化合物和草体蚁醛、蚁酸等( 李伟，1 9 9 4 ) 。李松林等( 1 9 9 5 ) 对血红林蚁、鼎突多刺蚁挥发油进行分析，分别分离出4 8 个峰、3 5 个峰，解析鉴定出1 7 和1 8 个成分，其化学组成主要是链烷、链烯、 链炔及多种衍生物。姚玉霞等( 1 9 9 6 ) 对长自山几种可食用蚂蚁即拟黑多 刺蚁、北方蚁、红褐林蚁的身体不同部位的粗蛋白、粗脂肪含量进行 了分析测试，发现由于种的不同，即使是同一部位的粗蛋白、粗脂肪 含量也不尽相同，其粗蛋白含量在蚂蚁体内的沉积规律为胸部 足部 头部 腹部，粗脂肪的沉积规律呈腹部 头部 胸部 足部。两种物质的 含量呈负相关。王忠等( 1 9 9 7 ) 用气相色谱一质谱一计算机系统( g s m s d s ) 对大黑蚂蚁的氯仿提取物的化学成分进行了分离鉴定，得到 多种饱和脂肪烃、不饱和脂肪烃、脂肪酸及脂类，它们的含量分别为 2 0 7 0 、0 6 8 、7 6 8 6 和1 2 5 。胡耀辉等( 1 9 9 7 ) 对北方蚁( f o r m i c a a q u i l o n i ay a r r o w ) 进行微量生物活性物质分析，证明蚂蚁体内还含 有心纳素、睾酮、生长激素、精氨酸加压索、脑内a v p 、铁蛋白、s o d 等物质。李典忠等在1 9 9 8 1 9 9 9 年作了有关蚂蚁的系列研究，分别在 拟黑多刺蚁中提取分离得到甲壳质，去乙酰化得壳聚糖；在红褐林蚁 ( f o r m i c a r u f a l ) 中初步提取分离得到小分子多肽，并对它们的药理 活性进行了研究。 3 药用蚂蚁的药理研究现状 3 1 抗炎、镇静和镇痛作用 赵一等( 1 9 8 3 ) 以6 0 t 2 0 9 l ( g 给小鼠灌胃拟黑多刺蚁的醇提膏剂， 对小鼠耳部二甲苯所致炎症有明显抑制作用。4 9 k g 可明显对抗大鼠甲 醛性关节炎( ， 0 0 2 ) ，但对大鼠蛋清性关节炎无明显对抗作用。小鼠 一次灌胃给药6 9 k g ，光电计数仪测定，给药组可明显抑制小鼠自发活 动，说明蚁膏有一定镇静作用。王忠等( 1 9 8 7 ) 实验表明，蚂蚁水提液灌 胃给药可提高小鼠电刺激的痛阈，减少化学致痛剂引起的扭体反应次 数：李典忠等( 1 9 9 8 ) 从红褐林蚁提出的小分子多肽能明显提高小鼠热板 法的痛闽值；从拟黑多刺蚁体内提取的几丁质制成的壳聚糖对小白鼠 醋酸所致的扭伤反应有显著的镇痛作用，对二甲苯所致的小白鼠耳廓 肿胀有明显抑制作用，对小白鼠有显著的抗疲劳的作用。 3 2 对免疫功能的影响 王忠等( 1 9 8 7 ) 给老龄小鼠i p 2 5 拟黑多刺蚁水提液o 5 m l ，每天一 次，连续四周，结果能使老龄鼠白细胞和溶菌酶增加，提高巨噬细胞 吞噬功能，促进了非特异性免疫功能；提高抗原触发后特异性抗体生 成细胞的数量和血清抗体水平，即增强了老龄小鼠特异性体液免疫功 能；能使e a r f c ，e t r f c 和a n a e 阳性细胞及淋巴细胞绝对值升高， 促进周围淋巴细胞分裂，增加细胞内d n a 、r n a 的含量，使免疫活 性细胞数增多。蚁液还能使老龄鼠已趋于退化的胸腺增生，增加重量， 皮质区淋巴细胞增多。徐庆等( 1 9 8 9 ) 在各组动物体重差异无显著性的情 况下，按4 9 k g 和2 9 k g 的剂量给w i s t a r 大鼠灌胃山蚁精( 一种蚂蚁醇 制剂) ，3 周后，均表现出免疫器官的增重( p ( o 0 2 ) ，证明山蚁精具有 增强免疫的作用。 3 3 补肾壮阳作用 山蚁精口服液给药明显增加大鼠精囊、睾丸重量：蚂蚁提取液口 服可使未成年大鼠睾丸、卵巢、子宫等性器官重量及其与体重的比值 增加；蚂蚁醇浸膏口服能显著增加棉油性大鼠血浆t 与e 2 的含量：对 抗棉子油所致大鼠的精虫数减少及异形产生率；能显著增加正常大鼠 的精虫数；能明显增加大鼠睾丸、包皮腺的重量；复方蚂蚁口服液能 明显提高大鼠睾丸组织r n a 、d n a 含量：蚂蚁水提液口服可明显增 强牙周膜稳固性，有固齿作用并对牙周病肾虚模型有明显抑制作用( 李 松林，1 9 9 6 ) 。 3 4 保肝护肝作用 赵- - ( 1 9 8 3 ) 等给c c h 肝损伤的大鼠每天按2 4 9 k g 灌胃蚁膏一次， 连续6 天后，血清谷丙转氨酶活性分别为：正常对照组1 5 2 8 1 9 3 单 位m l ，肝损伤对照组6 0 5 3 8 3 2 单位m 1 ，给药组3 0 2 6 5 8 l 单位m l 与肝损伤对照比( p 0 0 1 ) 。说明蚁膏有一定的降低谷丙转 氨酶活性的作用，经病理切片检查，正常对照组肝细胞脂肪变程度平 均为2 2 ，肝损伤对照组平均为8 1 2 ，蚁膏组平均为5 6 6 7 与肝损 伤对照组比( p 0 0 5 ) 。说明蚁膏有一定防治肝细胞脂肪变的作用。 3 5 健体延年的作用 4 邹氏报道，蚁液有明显的抗疲劳，耐低温、耐高温、耐缺氧的作 用。王氏指出，蚂蚁具有明显的提高红细胞s o d 活性，降低血清过氧 化脂质及心肌自由基水平的作用，且与中药配伍有叠加的作用。窦氏 实验表明，蚁粉可明显地延长果蝇的平均寿命、最高寿命和飞翔能力 ( 蔡毅，1 9 9 6 ) 。因此，在民间有食蚂蚁可健身之说。李典忠( 1 9 9 3 ) 等 用拟黑多刺蚁给药，发现实验组小白鼠免疫器官增重，脂褐素含量降 低，说明蚂蚁有增强免疫力，延缓衰老的作用。 3 6平喘和解痊的作用 按1 6 9 k g 给豚鼠i p 一次，能对抗乙酰胆碱所致的支气管哮喘 和肠管痉挛，并能对抗氯化钡收缩肠管的效应。此作用强度随蚁膏浓 度增加而增强。其平喘和解痉作用可能与其抗胆碱及其直接抑制平滑 肌有关( 赵一，1 9 8 3 ) 。 3 7 抑瘤的作用 陈静( 2 0 0 0 ) 等通过拟黑多刺蚁对s 。腹水肉瘤鼠存活时间及s w i s s 和b a l c 小鼠荷瘤生长的影响，研究其体内抑瘤作用。随机将小鼠分 为对照组和5 0 0 ，l0 0 0 ，15 0 0 m g k g 蚂蚁剂量实验组，用s 。腹水肉 瘤鼠建立动物肿瘤模型，对照组以蒸馏水灌胃，实验组以蚂蚁液灌胃， 连续2 5 天。结果实验组小鼠平均存活时间均高于对照组，而腹水量、 瘤细胞数及荷瘤重均低于对照组，差异显著( p o 0 5 ) 。以10 0 0 m g k g 剂量实验组抑瘤效果最明显。说明拟黑多刺蚁具有抑制肿瘤细胞生长 和延长荷瘤小鼠平均存活时间的作用。 此外，蚂蚁醇浸膏口服给药可明显对抗大鼠动脉、静脉旁路线性 血栓形成；可明显延长小鼠出血时间，说明蚂蚁有活血化瘀的作用： 对蚂蚁进行急性、亚急性及长期毒性实验，均未见明显毒副反应，证 明药用蚂蚁制剂是一种安全有效的制剂。 4 药用蚂蚁的临床应用研究现状 4 1 治疗类风湿性关节炎 吴志成等选用拟黑多刺蚁为“君”药( 占5 0 - 7 0 ) ，佐以活血、 祛风、除湿和补肝肾、健脾胃的中药，治疗类风湿性关节炎1 0 0 0 0 例， 结果临床治愈1 1 0 0 例( 1 1 ) ，显效5 0 0 0 例( 5 0 ) ，有效3 9 0 0 例( 3 9 ) ， 朱发现无效戚恶化的病例。昃志成在另一项临床研究中，以蚂蚁为主， 中草药加减辨证施治及穴位封闭等治疗法观察类风湿性关节炎和强直 性脊柱炎4 1 0 0 例，也取得了近似的疗效，3 个疗程后亦未发现无效或 怒他者。郭氏报道用“蜗蚊丸”治疗慢性类风湿性关节炎2 0 例，完全 缓解i 6 例，基本缓解2 倒，无效2 例。蚂蚁制剂在治疗类风湿性关节 炎的远期疗效中亦取得满意豹效果，吴恚成治疗了6 0 0 例患者，经6 个旁以上观察，无效者仪占0 7 锸( 潘红平，1 9 9 4 ) 。 4 2 治疗乙型翳炎 吴惑成( 1 9 9 5 ) 等以蚂蚁必“君”药( 占5 0 ) 佐淡菡豫、囊芪、 三七务5 ，聂喙子、让灵肄、鳖甲、疯鼓各5 篙醚巷戏粉裁，治疗乙挺 翳炎表匿抗原( h b e a g ) 阳性者4 9 铡，2 令疗程居，h b e a g 蕊转1 8 例( 3 5 。4 ) ，h b e a g 阴转2 7 例( 6 4 2 ) ，抗l b c 赡转1 3 铡( 3 0 2 ) 。 慢性迁延性脬炎1 8 例，用药个疗稷屡有的翳功能均转正常；慢性活 动性肝炎3 例，疗程后有2 例肝功明显好转，褥氨酸转氨酶( a h ) 降至正常。吴志成的另一项临床资料表明，蚂蚁“乙肝宁”对乙型孵 炎病毒血清标志物( h b v m ) 阳性者4 8 0 例取褥满意的疗效。用药 组检测的5 项h b v m 转化率均履著高予免疫制荆对照组( 尸均 o 0 1 ) ，其中尤以h b s a g 、h b e a g 、抗一h b e 转化显著，h b e a g 阴转 率高运3 9 7 2 。对临床瘟状改善和肝功恢复也取得了好的效果。 4 。3早衰和虚损往疾病 癸恚成( 1 9 9 5 ) 等戳蚂蚁为“君”药研制成“蚊正口服液”，经1 0 0 0 0 恻早衰襄缝攒性痰病患者酌稿床藏用，证讶本品其有扶正固本、补肾 健肄、僳翳护翳、抗老跨褒、益气通络、养盘安神等作用，其中衰老 痘状改善袭达9 7 。作者铁戈“蚁王麓鼹液”的燕著抗衰老作甭与其 含寅多秘人体骞蕊蟾溅性戏分，双矮谖节极俸免疫功筑，提高s o d 滔 力，降低l p o 水乎，减少脂揭素的生成等规璎密切檑关。 4 4 治疗棒经衰弱 容磐娴( 1 9 8 9 ) 用蚂蚁制剂治疗神经衰弱患赣2 4 8 例，每尽般3 次， 每次2 9 ( - t 蚁覆) ，疗程4 8 闶，结粜痊愈l o 倒( 4 ) ，显效1 4 8 铡 ( 5 9 7 ) ，有效7 8 例( 3 1 5 ) ，无效1 2 例( 4 ，8 ) ，总有效率为9 5 t 2 。 6 4 5 其它治疗作用 周惠耕等0 9 9 3 ) 应用蚂蚁干粉制剂治疗男性不育症6 2 例，其中1 0 例女方受孕，其它例中精子活力、密度显著增加：蚂蚁对于阳痿也有 显著疗效；此外，对于神经性皮炎、红斑狼疮、支气管哮喘、老年性 痴呆、中风偏瘫、手足麻木、症瘕积聚症等，蚂蚁均有一定程度的疗 效，而且蚂蚁能使白发老人再生黑发( 李松林，1 9 9 6 ) 。 长春中医学院的李典忠等( 1 9 9 8 ) 用蚂蚁、穿龙薯蓣、三七等七味 中药制成的“玄驹痹可宁”胶囊治疗痹症1 2 0 例患者，每次5 粒，每 日3 次，一个月为一疗程。显效4 2 例( 3 5 ) ，有效6 8 例( 5 6 6 7 ) ， 无效( 8 3 3 ) ，总有效率为9 1 6 7 。 综上所述，蚂蚁成分复杂，作用多样，尤其突出在调节免疫，抗 衰老功能及抗瘤等方面。蚂蚁无论在资源开发，还是在食用、药用及 临床应用等方面都存在着巨大的潜力。由于我国研究蚂蚁起步较晚， 研究还不够深入，因此，进一步深入开发利用蚂蚁资源，研究其作用 机制，将对人类产生更大的益处。 三、本研究的意义 蚂蚁体内含有多种营养成分，资源丰富，分布极广。国内外对蚂 蚁化学成分，特别是活性成分研究较少，仅限于粗提物中的维生素、 氨基酸、微量元素的种类等的测定，或是蛋白、脂肪粗品的含量对比 等，而对其体内所含活性多肽蛋白成分的化学研究则很少见报道。仅 有对红褐林蚁小分子多肽提取分离的研究，但都是粗提物。 本研究旨在分离纯化红褐林蚁的具有药用活性的多肽蛋白质，得 到具有生物活性及药用价值的纯品蛋白质。 作者利用了现代的生物化学、分子生物学实验手段，如葡聚糖凝 胶层析、高效液相色谱、s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳、冷冻干燥等实验 技术及淋巴细胞转化实验、药理实验等，力图从红褐林蚁中分离、纯 化具有药用价值的活性多肽蛋白质，阐明此种物质的药用价值，为进 一步研究开发研制新药提供科学的参考。 第二章红褐林蚁样品的初步分离 红褐林蚁样品的初步分离在本研究中选用的方法是：凝胶过滤层 析分离法。凝胶过滤层析是根据所分析的物质的分子量的差异来分离 不同组成成分的一种有效的分离方法，也是蛋白质纯化常用的技术。 凝胶过滤层析是一项重要的蛋白质纯化技术，又称为大小排阻、 凝胶排阻、分子筛或凝胶过滤层析。这种方法利用分级分离，而不需 要蛋白质的化学结合，这就明显降低了因不可逆结合所致的蛋白质损 失和失活( 汪家政，2 0 0 0 ) 。 1 凝胶过滤的原理 凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝 胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液及小分子量蛋白质通过， 而大分子蛋白质及一些蛋白复合物则被阻挡在外。因此，高分子量的 蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比低分子量蛋白更早地被洗脱下来( 见 图2 1 ) 。最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经 过的体积最小。中等大小的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内， 因此它们晚一些达到柱底，而小蛋白质可以进入所有填料的孔内，有 最大的通过体积，故最后到达柱底。 圈2 1凝胶过滤层析的框架示意图。其中空心圆圈 代表凝胶。实心圆圈表示蛋白质( 引自汪家政等) 2 凝胶过滤的设备 凝胶过滤层析的主要设备( 见图2 2 ) ，只需要一根凝胶柱经一根 导管与分部收集器相连。一个向层析柱加缓冲液的自动存贮器，一台 通过加压调节缓冲液流速的蠕动泵，还有一台紫外检测器和一台记录 仪，以解决所有含蛋白质收集液的检测和记录之需。 2 1 层析柱 凝胶过滤柱带有一个多孔支撑滤片，滤片下的“死体积”大时， 被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果会影响洗脱峰形，出 现脱尾现象，降低分辨力。精确分离时的“死体积”不能超过总柱床 体积的0 1 ，可用玻璃珠填满支撑滤片下的空间或尽可能缩短接头以 减少“死体积”。 9 2 2 连接导管 连接凝胶过滤层析各部分的导管应该有一定柔韧度，一般常用 t e f l o n 、t y g o n 和硅橡胶管。 2 3 分部收集器 插有收集管的自动分部收集器对准层析柱的出口处，洗脱液经分 部收集器分管收集，若按分部性质来分，有记时、记滴、记重和固定 体积等。 2 4 缓冲液存贮器 存贮器中存放着洗脱缓冲液，并经导管与层析柱相连。它可以是 一个烧杯，或一个瓶子。 2 5 蠕动泵 蠕动泵用来调节缓冲液经流层析柱时的速度，因为凝胶可以承受 一定的压力，所以用蠕动泵来加快流速。 2 6 紫外检测仪 紫外检测仪直接连在层析柱出口处，当波长为2 8 0 n m 时，洗脱液 经过检测仪时，可以直接检出蛋白质峰，而峰的形状被记录仪描绘出， 节省了手工检测每管收集液的蛋白含量所需的时间和人力。 2 7 记录仪 记录仪打印出紫外检测仪测出的吸收峰。 1 0 璎忻蠢 琦方向 图2 2凝胶过滤层析设备示意图( 引自汪家政等) 3 材料与方法 供试样品来源：红褐林蚁干品，已去除杂质，3 0 0 克，由吉林农 业大学提供。 药品与试剂：葡聚糖凝胶g - 5 0 ( s e p h a d e xg - 5 0 ，p h a r m a c i a 进口 分装) ，n a c l ( 信阳市化学试剂厂提供) ，k c l ( 北京化工厂提供) ， n a z h p 0 4 7 h 。0 ( 上海试剂厂提供) ，n a h ：p o 。( 上海试剂厂提供) 。 主要仪器：l k b 2 2 3 8 型紫外监测器，l k b 2 2 1 l 型自动部分收集器， l k b 2 2 1 0 型自动记录仪，德国m a r t i nc h r i s ta l p h a1 - 2 型冷冻干燥 机，g s 自控高速组织捣碎机，l d z 5 - 2 型离心机。 4 实验过程 4 1 样品的抽提 将红褐林蚁样品3 0 0 克，倒入组织捣碎机中搅碎，用9 5 的l 醇 脱脂，挥干乙醇，用蒸馏水于4 度低温浸泡2 4 小时，共3 次合并浸出 液，取上清液。 4 2 样品的浓缩 将所得的上清液用冷冻干燥机干燥浓缩，得到冻干粉。 4 3 样品的凝胶层析分离 4 3 1 凝胶溶胀 称取9 5 克s e p h a d e xg - 5 0 加入到1 0 0 0 毫升蒸馏水内，沸水溶胀 2 小时。沸水溶胀不但节约时间，而且可以消毒，除去凝胶中污染的 细菌和排除凝胶内的气泡。用倾泌法除去凝胶上层水及细小颗粒，反 复以蒸馏水洗涤至无细小颗粒止( 细小颗粒的存在会影响层析的流 速) ，凝胶以洗脱液p b s ( 磷酸盐缓冲溶液) ( p h 7 3 ) 洗涤几次后放在 灯泡瓶内，真空泵对凝胶浆抽气1 0 分钟。 4 3 2 装柱 洗净的层析柱保持垂直位置，柱内装放洗脱液，排除层析柱滤板 下的空气，关闭出口，柱内留下约1 0 毫升洗脱液。加入搅拌均匀的葡 聚糖凝胶g 一5 0 的浆液，打开柱底部出口，调节流速1 0 毫升分。凝 胶柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，不断补入凝胶浆直到 凝胶床表面露出液面，并防止层析床内出现“纹路”。关闭出口。 4 3 3 加样 上样前，样品须在3 0 0 0 x g 离心3 0 分钟，以出去干扰层析的残渣。 称取样品8 0 0 毫克，溶于2 0 毫升洗脱液中。 用滴管吸去凝胶床顶部大部分液体，打开出口使洗脱液恰流到床 表面止，关闭出口。小心地把上述样品加于柱内成一薄层，切勿搅动 床表面。打开出口使样品溶液渗入凝胶内并开始收集流出液计量体积。 样品的体积不可超过柱床体积的四分之一。用少量洗脱液洗凝胶床表 面两次，在尽量不稀释样品溶液同时使样品完全进入凝胶柱内，当液 面降至床表面时，小心加入洗脱液保持不让凝胶床面露出液面。 4 3 4 洗脱与收集 将柱的出口处与自动部分收集器相连接。用蠕动泵控制层析柱的 1 2 流速0 5 m l m i n 开始层析，流出液分管收集( i 0 毫升管) 和检出， 收集液可分别在l k b 2 2 3 8 紫外监测器2 8 0 m n 测出洗脱液吸收峰。 5 结论 样品经过洗脱，分别收集红褐林蚁样品经s e p h a d e xg - 5 0 凝胶过 滤后得到纯化的样品的蛋白峰，得到两个独立的峰。第一个峰记为组 分i ，第二个峰记为组分i i 。从紫外检测结果可以看出，所得的组分 初步鉴定为蛋白。所收集的组分都要冻干浓缩，以备下步实验使用。 6 讨论 6 i 缓冲液的选择和配制 缓冲液的选择，要根据所选用的分离方法。本文所采用的凝胶过 滤方法，大多数缓冲液均可适用，但考虑到磷酸盐缓冲液的p h 值、离 子强度等性质要有利于蛋白质的稳定，有利于蛋白质活性的保持并可 防止蛋白质与凝胶之间的相互作用，所以，选择磷酸盐缓冲液较理想。 通常将缓冲液配制成i 0 和i 0 0 的储存液，以使储存液的体积变小， 并允许加入抑菌剂。本实验采用的是1 0 x p b s 配制1 0 0 0 m l 的储存液， p h 7 3 。n a c l ：8 0 9 ，1 3 7 m m o l ：k c l ：2 9 ，2 7 r e t o o l ；n a 2 h p 0 4 7 h 2 0 ：1 1 5 9 ， 4 3 r e t o o l ；n a h 2 p o ：2 9 ，1 4 m m o i 。 6 2 凝胶过滤层析柱的选择 在蛋白质纯化方法中选择凝胶过滤分离的指标必须明确，这些指 标应该是对蛋白质的高分辨率，最短的层析时间，低样品的损耗或高 回收率。根据这些目的应选择适当的层析装置。本实验的主要目的是 达到不同大小蛋白质的最大限度的分离，所以凝胶层析柱必须细而长。 为了得到一个好的分离效果，本实验采用的是6 0 c m x5 0 m m 的层析柱。 6 3 凝胶过滤层析的填料 凝胶过滤填料的选择主要根据被分离蛋白质的分子量，目的蛋白 分子量应该