（微生物学专业论文）一株产肌酐水解酶菌株的分离及酶特性研究.pdf

致谢 谨以此文献给关心我的老师、同学、朋友和家人! 首先，感谢我的导师马晓航副研究员和贾小明副教授，感谢他们多年来对 我学业上的悉心指导和生活上的热心帮助。马老师学识渊博、治学严谨、为人随 和，他的正确引导为我今后的科研和学习打下了良好的基础，本论文的研究、定 稿都凝聚着他的心血。贾老师严谨的科研作风和耐心细致的工作态度，深深地感 染着我、教育着我；本论文的顺利完成也离不开她的悉心指导和亲切关怀。导师 们严谨的治学作风和对事业的不懈追求让我终身受益并时刻鞭策着我。值此论文 完成之际，我要对导师们多年的关心乖教诲表示最真挚的感谢! 此外，还要感谢闵航教授、陈声明教授、赵宇华教授、昊伟祥副教授、陈 中云老师、吕琴老师和林小清老师和郭桂娟阿姨，他们都给予了热心指导并提供 了诸多的方便。 我们实验室是一个和谐、学术气氛浓厚的集体平常，我们常在一起讨论 实验、电脑及其它各种各样的问题。已经毕业的王园园、韩如阳、吴坤、梅建风、 吴小伦、张光亚对本论文的研究提出了很多很好的建议。实验室的孙桂芹、周学 来、张桂山、程天凡、郑华宝、赵祥伟、朱亚伟、杨丽、周德平，段学军、夏颖、 叶央芳、吕镇梅、阮爱东、姚晓华、潘克侠、徐晓宇、刘击、刘静等同学也提供 了热心帮助与支持。另外，本论文还得到顿玉慧、金波、陈虹、田锦、刘育红、 陈雪燕、张桂芝等同学和朋友的热心帮助。丈印室的刘红兵对本论文进行了打印 和装订。在此一并表示深深的谢意! 感谢各位专家、教授对本论丈的悉心评阅! 感谢答辩委员会各位专家、教授在百忙之中抽时问参加我的论文答辩! 特别感谢我的先生熊国如，感谢他多年来对我的支持和鼓励! 最后我还要深深地感谢我的家人，感谢他们多年来给我的关怀和支持! 赵更峰 2 0 03 年5 月于华家池 微生物学硕士论文摘要 摘要 肌酐是人体代谢的一种重要产物，一般通过肾脏的代谢排出体外。在临床 测定中，血清中的肌酐浓度是一项判断肾功能的重要指标。目前肌酐的测定一般 是用j a 虢法进行测定，该方法是基于化学反应基础上的，特异性差，血清中许 多化学物质都能干扰测定结果，给疾病的正确诊断造成了困难。而酶促的催化反 应比一般化学反应具有更高的专一性，因而近年来人们寄希望于研究开发出酶促 肌酐的测定方法，以提高测定结果的可靠性。 本文分离筛选到一株产肌酐水解酶的菌株4 2 1 ，经鉴定为节杆菌属，研究 了菌株的产酶发酵条件、酶的提取纯化方法及酶的性质。试验结果分述如下： 1 菌株的分离筛选及鉴定：经过富集培养和划线分离纯化后，得到7 株产肌酐 水解酶的菌，分别为菌株4 2 1 、4 2 2 、3 0 - l 、a l l 、s a o - c 、s a o - i 、s a o s 。 通过产酶活性及酶热稳定性测定，菌株4 2 1 表现较高的酶活性且所产的肌酐 水解酶具有较好的热稳定性，因此确定菌株4 2 1 为最佳产肌酐水解酶菌株。 菌株4 2 1 的形态学、生理生化及1 6 sr r n a 序列比对结果表明该菌为节杆菌 口，肪阳6 日c 招rs p ) 。 2 菌株产酶条件：菌株4 2 1 的最适产酶培养基为：肌酸，4 9 ；酵母膏，7 2 9 ； 玉米浆，4 8 9 ；葡萄糖，1 0 9 ；k 2 h p 0 43 h 2 0 ，2 9 ；k h 2 p 0 4 ，0 5 9 ；m g s 0 4 7 h 2 0 ， o 1 9 ；k c l ，o 0 0 0 5 9 ；m 1 1 c 1 2 ，o 1 9 ：水，1 0 0 0 m l ：p h7 5 。最适产酶条件为： 培养温度2 0 ，1 0 0 m l 三角瓶装1 5 m l 培养基，于1 2 0 甲m 转速下培养3 6 h 。 3 酶的提取纯化：肌酐水解酶经5 5 水浴保温3 0 r n i n 去除热不稳定蛋白后，在 硫酸铵饱和度为3 0 5 0 之间大部分沉淀下来，经过d e a e - c e l l u l o s e 离子交 换、1 0 y o p e a r lh w 6 5 c 疏水层析后，酶提纯了1 4 5 倍，比活力达2 0 9 u i n g 。 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) 显示为一条带，s d s p a g e 测定亚基分子量为 3 l0 0 0 d a 。 4 酶的性质：酶的最适p h 为7 5 ，最适作用温度为6 0 ；在p h 6 0 9 0 、6 0 以下稳定；对肌酐和肌酸的k m 值分别为2 1 1 4 m m o l 几，4 0 8 m 0 1 l ；a r 、 h g n 和邻菲罗啉能使酶完全丧失活性，c u 2 、l i + 对酶活性有明显的抑制作用， c 0 2 + 、m n 2 + 对酶活性有明显促进作用，表面活性剂r r w e e n2 0 和t w e e n 8 0 对酶 微生物学硕士论文 摘要 活性没有影响。 关键词：肌酐、肌酐水解酶、节杆菌属 微生物学硕士论文摘要 a b s t r a c t c r e a t i l l i n ei sa i li m p o r t a n t p r o d u c t o fh u m a i l i n e t a b o l i s m ，w l l i c hi se x c r e t e db y f e n a lm e t a b o l i s m i nc l i n j c a ld i a g n o s i s ，也ec o n c e n t r a t i o no f c r e a t i l l 血ei ns e r u n li sa 1 1 i n l p o 咖tp a r a m e t e rf o r 1 ee v a l u a t i o no f k i d i l e yf u n c t i o n a tp r e s e m t 1 1 em o s tc o m m o n l y u s e da s s a yo f c r c a t i n i n ei st h ej a f 佟r e a c t i o n ，w h i c hi sb a s e do n 也ec h e m i c a i r e a c t i o n h o w e v e r ，山i sr e a c t i o ni ss u b j e c tt oal o to f i n t e r f e r e n c e sa n dl a c k ss p e c i f - i c i t y ，s ot h a ti ti se x p e c t e dt od e v e i o pm ee n 明n a t i cd e t e m i n a t i o nm e t l l o d st or e p l a c e t h ej a f r er e a c t i o ni no r d e rt oi n c r e a s et 1 1 es p e c m c i 吼 i nt l i ss t l l d mas 仃a i l lo f b a c t e r i a c 印a b l eo f p r o d u c i n g c r e a t i n i m s ew a si s o l a t e d a 1 1 di d e m i f i e d 船m r 0 施c 招rs p n l ec o n d i t i o n sf o rp r o d u c i n gc r e a t i i l i n a s e ，恤 m e 1 0 d so f p u r i f l c a t i o na n dt l l ec h a r a c t e r i s t i c so f c r e a t i n i n a s ew e r es t u d i e d t h e r e s u l t sw e r e r 印。哟da sf o l l o w s ： 1 t h ei s o l a t i o na n di d 吼t i 行c a t i o no ft h ec r e a t i n i i i a s e - p r o d u c i n gs t r a i n ：s e v e n s 竹a i n so f b a c 钯r i a c 印a b i eo f p m d l l c i n g c r e a t i i l i n 越ew e r ei s o i a t e d 疗o ms o i l ， w h i c h 、v e r es a i n4 2 1 ，4 2 - 2 ，3 0 l ，a l l ，s a o c ，s a o - i ，s a o - s t h ec r e a t i n i n a s e p m d u c t i v i t i e s 仃0 mm e s e s e v e ns n _ a i n sw e r es t i l d i e da 1 1 d 也ee n 巧m ea s s a y s h o w e dt h a tm a i l l4 2 1p r o d u c e d l i 曲c ry j e l do f c r e a t i n i n a s et l l a tw a sm o r eh e a t - r e s i s t a n t 出a i lt h a to f o t l e r s c o n s i d e 矗n go f 也e s e 蠡c t s ，s 拄a i l l4 2 - 1w a ss e 】e c t e d a sm eb e s tc r e a t i n i n a s e - p r o d u c i n gs t r a i nf o rf h r t l l e rs t i l d 矿b a s e do nt 1 1 em o r p h o l o g i c a i ，p h y s i o i o g i c a i a n db i o c h e m i c a ic k 瑕l c t e r i s t i c ss t u d i e sa n dt h er e s u l to f s e q u e n c e sa l i g 蛐e m o f1 6 sr 砌町a ，s 仃_ a i n4 2 1w 勰i d e n t i n e d 弘一r 捕，d 幻c 膪，s p 一 2 t h ef e 咖e n t a 6 0 nc o n d i t i o n s ：b a s e do nm es t u d i e so f c o n d i t i o n sf o rp r o d u c i n g c r e a t i n i n a s e ，t h eb e s tf e 1 1 e n t a t i o nc o i l d i t i o r l sw e r ee s t a b i i s h e d t h ec o m p o s “i o n o ff e n n e n t a t i o nm e d i u r nw a s ：c r e a t i n e 4 岛y e a s t e x 拓a c t7 2 舀c o m s t e 印】i q u o r 4 8 舀g l u c o s e1 0 岛k 2 h p 0 42 9 ，k h 2 p 0 43 h 2 00 5 9 ，m g s 0 47 h 2 0o 1 9 ，k c l o 0 0 5 9 ，m n c l 20 1 9 ， 1 2 01 0 0 0 m l ，p h 7 5 w h i c hw a sa d d e d1 5m li n t oa1 0 0m l n a s k a r l d i n c u b a t e d o na s h a k e r o f l 2 0r p ma t2 0 f o r3 6 h 3 。t h e p u r i 矗姐t i 明o f c r e a t i n i n a s e ：t h es p e c i n ca c t i v 时o f ac r u d e ，c e l l 一行e e e x 衄a c to f c r e a t i n i n a s ew a si n c r e a s e d1 4 5 f 0 1 db yas e r i e so f p 血f i c a t i o ns t e p s 3 嫩兰塑堂堡主丝塞i ! 里 i r l c l u d i n gh e a tt r e a t m e n t a t5 5 ，狮m o n i u m8 u l f 矗t ep r e c i p i t a t i o n ，d e a e - e e l k l o s ci o n e x e h 毽n 鲸脚e 斌礤静贷e 秘盘。露o k ce 酝o m 粕鳓强e 弘嫩6 e de n 琊强ew 勰h o m o g e n e o u s a s j u d g c db yp o l y r y l a m d eg c ie k c t r o p h 。 o r c s i s ( p a o e ) t h es u b u n j t m o l e c u i a rm a s sw a se s t i m a t e dt ob e31o o o d ab y s d s p a g 嚣。 4 。t h ec h a 豫c t e r i s t l 姻o fc r e a t i n 抵a s e ：t h eo p t p f o r c 揩a 缸i n a s ew a s7 - 5 a i l dt h eo p t i m a lt e f n p e r a t u r ew a s6 0 + c r e a t i n i n a s ew a ss t a b l eb e t v m e np h 6 。瓢9 ga 瓣毹t h et e m d e 瑚哦b 程o w6 。髓ek 越v 寰l 毡e s 硒fc f e 鑫t i 矬i n e 黼d c r ；e a t i n e w e r e 2 1 1 4 m m o 儿a n d 4 0 8 m m o l 几，m s p e c 娃v e l y t h ee r 吗7 m e w a s m a r k e d l yi n a c t i v “t e db yi n c u b a t i o n 谢m1 m m 0 1 lo f h 尹，a 矿，l r ，c u 2 + a 1 1 d 2 0 黼o l 凡o f l ，1 1 p h a n a 觳磕l 赫e a a l 耋v 鑫t i o n o f e f e a l 撅趣a s 霉t i v i 专y w 蠡s o b s 蝌。dw i t h1 m 擞o l ，lo f c 0 2 + n dm 舻+ 。2 0 臻髓o l ，lo f n a 烈3 ，a n do 。l o f t w e 龃2 0a n dt w o e n8 0a l m o s th a dn 0e 髓c to nc r e a t m m 船ea c t i v 吼 k g yw o 砖s ：。辩a t i n i n 蛾c r e a t i n i 船s e ，彳确抛刍骝耙r 印 4 微生物学硕士论文刚舌 i 前言 肌酐是人体代谢的一种重要产物。为了维持肌酐在血液中有较低的水平，机 体主要是通过肾脏的代谢活动将所产生的肌酐排出体外。如果肾脏发生病变，将 不能有效地清除所形成的肌酐而造成肌酐在血液中的积累。血清中肌酐含量的正 常范围在3 5 1 4 0 “m o l 几( t e t z ，1 9 8 6 ) ，在一定的病理状态下，肌酐的含量会上升 到1 0 0 0 肛m 0 1 l ( s e n a “以，1 9 8 8 ) ，肌酐浓度 5 3 0 m o l 几表明肾脏严重损伤。 因此血液和尿液的肌酐含量可反映肾脏的排泄功能，在临床测定中，血清中的肌 酐浓度是一项判断肾功能的重要指标。 l 肌酐的检测方法 目前肌酐的测定方法主要有化学方法、酶促方法以及建立在酶促反应基础 上的电气化学方法。 1 1 化学方法 1 1 1j a 雎反应方法 肌酐浓度的化学检测方法主要是建立在j a 髓反应的基础上( j a 脯，1 8 8 6 ； f 0 1 i n “以，1 9 0 4 ) ，即肌酐的亚甲基与苦味酸在碱性条件下反应产生红色的复合 物。这种测定方法专一性不强、敏感性差，直接测定受样品中蛋白质沉淀的影 响，需要对样品进行预处理，且很难排除其中许多物质的干扰( c o o k1 9 7 5 ；s 、v a i n “以，1 9 7 7 ；d a u g h e n y1 9 7 8 ；s o l d i n 吖越，1 9 7 8 ；n 盯a y a n a n 酣以，1 9 8 0 ；w e b e r 甜 以，1 9 9 1 ) 。这些干扰物包括人体的代谢产物和治疗用的药物，如肌酐的同系物 和衍生物，以及丙酮、葡萄糖、丙酮酸、抗坏血酸、脂类、胆红素等，它们的 存在会对测定产生或正或负的影响。在小儿的恶性肿瘤疾病中，肌酐的含量很 低，受干扰的程度相对更大。 1 1 2j a 脆反应的修改方法 后来一些研究者对j a 圩6 反应进行了改进，如用l i o y d s 试剂( e d w a r d 甜以 1 9 5 8 ；h a e c k e l ，1 9 8 1 ) 对样品进行预处理。l 1 0 y d s 试剂可以特异地吸附样品中的 肌酐，然而样品中的酮类化合物、吲哚、胍基乙酸内酰胺、类固醇及色素也被 吸附，从而造成干扰。1 a u s s k y ( 1 9 5 6 ) 提出了用碘氧化一乙醚抽提处理样品 的方法，可以降低丙酮、乙酰乙酸、果糖、葡萄糖这些物质对测定的干扰，但 微生物学硕士论文 h u 舌 s l o t ( 1 9 6 5 ) 对这种方法的特异性及优点提出质疑。 还有一些研究者( p o l a r1 9 6 5 ：r d c k e r b i e “以，1 9 6 7 ；m i t c h e l l ，1 9 7 3 ) 用阳离 子交换树脂来分离肌酐及其它干扰物，这种方法在肌酐的正常范围值内测定灵 敏度还比较满意，但在测定较高浓度的肌酐时。灵敏度就比较差( g r a t t e r 甜 以，1 9 6 7 ) ，且这种离子交换树脂的回收率比较低。研究者( l i m 甜以，1 9 7 8 ；x u e 1 9 8 8 ；j o h n s “口，2 0 0 1 ) 还尝试用高效液相色谱法和毛细管电泳( b u r k e 吖口， 1 9 9 9 ) 来分离样品中的肌酐。这些对j a 偷反应所作的修改都比较繁琐、费时且 特异性与灵敏度也比较差。 1 2 酶促方法 酶促方法就是通过不同的酶系将肌酐降解测定其代谢产物的方法，目前已 经报道的酶促方法主要有以下几种： l - 2 1 肌酐转化为甲基乙内酰脲和n h 4 + 的酶促方法 这种酶促方法是用肌酐亚氨基脱水酶( c r e a t m i n ei i n i n o h y d r o l 鹤eo rc r e a t i m n e d e i l i l i n a s ee c3 5 4 2 1 ) 将肌酐转化为甲基乙内酰腮和n h 4 + ，n h 4 + 和酮戊二酸在 谷氨酸脱氢酶( g l m 锄a t ed e h y d m l 够ee c1 4 1 3 ) 的作用下生成l - 谷氨酸，伴随 着催化n a d p h 成n a d p + ，通过测定n a d p + 的含量来确定样品中肌酐的含量 ( t h o m p s o n “以，1 9 7 4 ；g a n e l l ie f 以，1 9 8 2 ；t o 腑1 e n i 甜以，1 9 8 3 ) 。这种酶促反 应体系由肌酐亚氨基脱水酶和谷氨酸脱氢酶组成，其工作原理是： 肌酐+ h 2 0 竺! ! ! 竺竺；甲基乙内酰脲+ n h 4 + n h 4 + + 酮戊二酸! ! ! ! 竺l 谷氨酸+ h 2 0 、。 n a d p hn a d p + 这种测定方法受样品中内源性n h 4 + 的干扰，样品要经过预处理来降低n h 4 + 的含量，从而使这种方法的推广受到限制( g o r 甜以，1 9 8 6 ) 。 1 2 2 肌酐转化为肌酸一以n a d h 为指示剂的酶促方法 这种酶促方法是将肌酐降解为肌酸、丙酮酸、乳酸和n a d + ，通过测定n a d + 的量来确定样品中肌酐的含量。由以下几个酶组成：肌酐水解酶( c r e a t i n i n e 黝i d o h y d m l 私e o r c r e a t i n i i l a s e e c3 5 2 1 0 ) 、肌酸激酶( c r e a t i n e l 【i i l a s e e c2 7 3 2 ) 、 丙酮酸激酶( p y m v a _ c ek i n a s ee c2 7 1 4 0 ) 、乳酸激酶( 1 a c t a t el 【i n a s ee c1 1 1 2 7 ) ( m o s s 吖以，1 9 7 5 ；y 抽g 吖口f ，1 9 7 9 ；j a y n e s 甜越，1 9 8 2 ；p e r a l 【i sp f 口t ，1 9 8 4 ) 。其工 6 微生物学硕士论文 作原理如下： 肌酐+ h 2 0 上! 兰竺 肌酸 肌酸+ a t p ! ! 竺! 与磷酸肌酸+ a d p a d p + 磷酸烯醇式丙酮酸盐! ! ! 竺与丙酮酸+ a t p 丙酮酸+ n a d h + h +兰! ! ! ；乳酸+ n a d + 这种方法提高了测定的特异性，克服了许多化学物质的干扰，但相对来说 灵敏度不高，且试剂不稳定( g o r e n “以，1 9 8 6 ) 。 1 2 t 3 降解肌酐为肌酸、肌氨酸、甘氨酸的酶促方法 许多研究者( k 血o s h “a “，1 9 8 0 ；f o s s a i i “口，1 9 8 3 ；g o r e n “以，1 9 8 6 ； l i n d b a c k “以，1 9 8 9 ；b a c o n 甜以，1 9 9 1 ) 报道了通过肌酐水解酶、肌酸水解酶 ( c r e a t i n ea m i d i n o h y d r 0 1 a s eo rc r e a t 血a s ee c 3 5 - 3 3 ) 、肌氨酸氧化酶( s a r c o s i n e o x i d a s ee c1 5 3 1 ) 或肌氨酸脱氢酶( s a r c o s i n ed e h y d r o g e n a s ee c1 5 9 9 ) 降解 肌酐，测定其代谢产物h 2 0 2 或甲醛的酶法测定系统。这种方法的工作原理是： 肌酐- 咀2 0 竺竺竺与肌酸 肌酸+ h 2 0 竺! 竺! 尿素+ 肌氨酸 肌氨酸+ h 2 0 + 0 21 1 竺! ! 竺竺甘氨酸+ 甲醛+ h 2 0 2 这种测定方法具有酶反应的专一性强和灵敏度高等特点( s i e d e l “， 1 9 8 4 ) 已将酶促反应中的各种酶制成试剂盒并商品化。 1 3 电气化学方法 这种测定方法是建立在肌酐酶促催化反应基础上的，通过检测电位和电流的 变化来确定样品中肌酐的含量。 1 3 1 电位计法生物传感器 这种方法是由m e y e r h o f r 和r e c 垃( 1 9 7 6 ) 发明的n h 4 + 敏感电极发展而来 的，是将肌酐亚氨基脱水酶固定在n h 4 + 敏感电极表面，催化肌酐生成可被气敏 感电极检测到的n 心+ 。g u i l b a u l t ( 1 9 8 3 ) 和m a s c i n i ( 1 9 8 5 ) 的研究对这种操作 系统进行改进，实用性和稳定性得到提高。s h i n ( 1 9 9 8 ) 和0 s a k a ( 1 9 9 8 ) 报道 了新的不同的电位计法。这些测定系统有许多优点，如：只需要一种酶且以稳固 的气敏感电极技术为基础，相对来说测定比较简单；可以避免来自样品中肌酸的 干扰。但这种方法存在一个比较严重的问题，受内源性n h 。+ 的干扰。虽然可以 微生物学硕士论文前言 用加热分解的方法处理碱性尿液样品且对肌酐测定没有影响( s l l i h “以，1 9 9 9 ) 。 但这种处理又使测定复杂化，违背了生物传感器的发展原理即测定简便化。 1 3 2 电流计生物传感器法 这种方法是将肌酐水解酶、肌酸水解酶、肌氨酸氧化酶吸附在电极的醋酸 纤维素薄膜上，用电流计检测产生的h 2 0 2 或消耗的0 2 的量( t s u c l l i d a “口f ， 1 9 8 3 ) 。以此为基础，许多研究者改进了这种测定方法，把肌酐降解酶系的三种 酶通过不同的方法固定在电极上。m a d a r a s 等( 1 9 9 6 ) 用戊二醛把肌酐降解酶系 交叉结合；k h a i l 等( 1 9 9 7 ) 将肌酐降解酶系吸附在铂黑电极上；k i m 等( 1 9 9 9 ) 介绍了通过聚乙二醇将酶吸附在碳电极上制成可携带的肌酐传感器；还可以用电 聚合的方法把酶固定在聚吡咯膜上( y a m a t op ，口f ，1 9 9 5 ) 或亲水的聚氨基甲酸酯 上( s c l l i l e i d e r 甜觚，1 9 9 6 ) 。这些系统操作稳定性好，且保存期较长。德国成功 建立了第一个商业化电流计肌酐测定装置一n o v ab i o m e d i c a l r ( ) d e r n l a r k ( 1 l a r d 吖以，2 0 0 0 ) ，另外a b b o t c 公司还把这种肌酐测定方法同他们的i s 玑虹 p o i m - o f - c a r es 娜e m 测定系统相结合( m o c k 甜以，1 9 9 5 ) 。 1 4 各种肌酐测定方法的评估 肌酐的测定方法从一开始建立的j a 雎反应体系，到目前为止己提出了多种 测定方法。j a 脆化学方法由于它的种种缺陷，正在被发展起来的酶促方法所代 替。在各种酶促肌酐测定方法中，以肌酐水解酶、肌酸水解酶、肌氨酸氧化酶酶 促催化反应为基础的测定方法日渐成熟并得到广泛使用。在这种反应体系中，肌 酐水解酶处于反应的第一步，它催化肌酐转化为肌酸，在该测定方法中占有重要 的位置。 2 微生物降解肌酐的途径 有多种微生物可以降解肌酐并产生各种代谢产物，目前已经报道的微生物 降解肌酐的途径主要有三种。 2 1 经由肌酸、肌氨酸、甘氨酸的降解途径 这种途径是由几种酶把肌酐降解为肌酸、肌氨酸、甘氨酸等代谢产物。参 与降解途径的酶系为：肌酐水解酶、肌酸水解酶、肌氨酸氧化酶或肌氨酸脱氢酶。 这种代谢途径己在许多微生物中发现，如：产脲节杆菌( 一州踟6 甜泖柳咖c f p 船) ( k a p l a l l “以，1 9 7 4 ) 、丁香假单胞菌奈良氏变种c 8 3 ( n p “如m d h 珊p “f 胁v 越 微生物学硕士论文 前言 开口阳p 瑚括c 8 3 ) ( t s u m “以1 9 7 6 ) 、黄杆菌u 1 8 8 ( f 孙z d 6 叩把r f “州u 1 8 8 ) ( s u z u k i p r 以，1 9 7 8 ) 、产碱菌( 爿，c 础驴订p js p ) ( i n o u y e 盯以，1 9 8 6 ；k i m “以，1 9 8 6 a ) a 2 2 经由甲基胍、乙酸的降解途径 本代谢途径是将肌酐降解为甲基胍和乙酸，甲基胍在甲基胍水解酶的作用 下生成甲胺和脲。报道的只有施氏假单胞菌( 脚“如小彻傩j m 脚f ) ( v m 吖以， 1 9 6 8 ) 可以通过这种途径降解肌酐。 2 _ 3 经由甲基乙内酰脲、n h 4 + 的降解途径 一些微生物仅通过肌酐亚氨基脱水酶将肌酐降解为甲基乙内酰脲和n h 4 + ， 存在这种代谢方式的微生物有：类腐败梭菌b s ( c f 护磁“坍脚印“仃护钯“mb s ) ( s z u l m 旬s t e r ，1 9 5 8a i b ) 、百合棒杆菌( c o ，) 埘p 施c 耙r 如删，f 打“聊) ( u w 勾i m a 吖越， 1 9 7 7 ) 、丝状黄杆菌( 胁v o 施c 把r f “研口肌p 珊口j “珊) ( e s d e r p ，越，1 9 8 5 ) 。 而一些微生物则通过一系列酶将肌酐降解为甲基乙内酰脲、氨基甲酰肌氨 酸、肌氨酸等。参与降解途径的酶系为：肌酐亚氨基脱水酶、n 甲基乙内酰脲水 解酶、氨甲酰基肌氨酸水解酶。存在这种代谢方式的微生物有：丁香假单胞菌 7 7 ( p 船“幽o ”傩p “， 妇7 7 ) ( k i i n 甜甜，1 9 8 6b ；1 9 8 7 ；) 、梭菌f s 2 3 、f s 4 1 ( c f o 册肼册s p f s 2 3 、f s 4 1 ) ( h e 衄枷吖以，1 9 9 2 ) 。 对于不同的微生物来说，可能通过某一种或几种代谢途径来降解肌酐。 s h i m i z u 等( 1 9 8 6 ) 报道了分离到的几株假单胞菌以不同的途径降解肌酐， n e “如m d h 珊口“删h7 7 只通过甲基乙内酰脲途径快速降解肌酐，而胁“面m d ”船 s p h 2 l 可通过肌酸和甲基乙内酰脲两种途径降解肌酐，n e “如m d ”船s p 叭1 4 则 主要通过肌酸降解途径，但也可以通过甲基乙内酰脲途径降解肌酐。 3 肌酐水解酶的研究现状 3 1 产肌酐水解酶的微生物 已经报道了有多种微生物可毗降解肌酐并产生肌酐水解酶。最早发现产肌 酐水解酶的微生物是产脲节杆菌( 一m 阳施m r “胛q 向西f 脚) ( k 印1 a j l 吖面，1 9 7 4 ) ， 后来丁香假单胞菌奈良氏变种c 8 3 ( n p 砌坍d h 船p “r f 出v 牡阳m e 瑚妇c 8 3 ) ( t s u m “以，1 9 7 6 ) 、黄杆菌u 1 8 8 ( 胁v 0 6 口c 细m u 一1 8 8 ) ( s l l z l l k i 吖以，1 9 7 8 ) 、 产碱菌( 一f c 口，船h p js p n o v ) ( i n o u y e 甜d ，1 9 8 6 ) 相继被发现产生肌酐水解酶。 它们都可以降解肌酐并产生肌酐水解酶系。 微生物学硕士论文 前言 3 2 肌酐水解酶的生物学特性 k a p l a i l 等( 1 9 7 4 ) 发现产脲节杆菌能以肌酐或肌酸为唯一碳源，并能诱导 产生肌酐水解酶和肌酸水解酶。经过热处理、硫酸铵分级沉淀、s e p h a d e xg 一2 0 0 凝胶过滤和d e a e c e l l u l o s e 层析，将肌酐水解酶提纯了1 l o 多倍。用s e p l l a d e x g 2 0 0 凝胶过滤测得提纯的肌酐水解酶分子量大约为2 4 00 0 0d a 。酶作用的最适 p h 为8 3 ，对肌酐的k m 值为1 2 5 m m o l 几。1 n n o l ，l c u s 0 4 和0 1 r m o l l h g c l 2 能完全抑制肌酐水解酶的活性，e d t a 和巯基化合物则部分抑制酶的活性。 t s u m 等( 1 9 7 6 ) 研究了丁香假单胞菌奈良氏变种c 8 3 发现该菌株可以产 生肌酐降解酶系。肌酐、肌酸、肌氨酸、二甲基甘氨酸、甜菜碱可以促进肌酐水 解酶的产生，而葡萄糖则抑制酶的产生。经过硫酸铵沉淀、肌氨酸一h m s e p l m m s e 层析、d e a e c e l l u l o s e 层析、s e p h a d c xg 2 0 0 凝胶过滤，肌酐水解酶提纯了4 4 4 倍，酶蛋白在圆盘凝胶电泳显示为一条带。酶的等电点为4 7 ，酶反应的最适p h 为7 9 ，酶在p h6 1 2 、7 0 以下稳定。l m m o l 几的n 澳代丁二酰亚胺、h g ”、 f e 、c u 2 + 和1 0 r m o 儿的乙氧基甲酸酐对酶活性有强烈抑制作用，邻菲哕啉可 以部分抑制酶活性。没有活性的脱金属酶可以在添加m n 2 + 、c o “、m 9 2 + 、f e 2 + 、 n i 2 + 、z n 2 + 的情况下被激活，表明肌酐水解酶需要金属离子维持酶的活性。酶对 肌酐和肌酸的k m 值分别为2 6m m o 】几和1 3 0 m m o 儿。通过超速离心分析，酶的 分子量为l7 50 0 0 d a ：s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 测得酶亚基的分 子量为2 30 0 0 d a 表明酶由8 个相同的亚基组成。 s l l z l l k i 等( 1 9 7 8 ) 分离到一株产肌酐水解酶的黄杆菌u 1 8 8 ( 胁”6 日c 耙r m m u 1 8 8 ) ，经过d e a e c e l l l l l o s e 层析和s e p h a d e xg - 2 0 0 凝胶过滤将酶提纯。 s e p h a d e xg 2 0 0 凝胶过滤测得酶的分子量为1 5 00 0 0 d a 。酶的最适反应p h 为6 5 ， 最适反应温度为4 5 ，在p h 7 0 9 5 之间稳定，酶在6 7 处理1 0 m i l l 丧失活性。 对氯高汞苯甲酸( p c m b ) 和重金属离子对酶活生有强烈抑制作用。酶对肌酐和 肌酸的k m 分别为3 4 5 和4 3 5 m m o l l 。 i n o u y e 等( 1 9 8 6 ) 报道了产生肌酐水解酶的产碱菌( 彳z f 啦”p ss p n o v ) 。 经过d e a e - c e l l l l l o s e 层析、c r e a t i n y l a h s e p h 趾o s e 亲和层析、s e p h a d e xg - 2 0 0 凝胶过滤、羟基磷灰石层析，肌酐水解酶提纯了2 5 倍，酶蛋白经s d s p a g e 测 定显示一条带。酶反应的最适p h 为7 8 ，酶在p h 8 1 1 5 稳定。l m m o l 几的 1 0 微生物学硕士论文 e d t a 、n 溴丁二酰亚胺( n b s ) 和金属离子z n ”、c 0 2 + 、c u 2 + 、n i 2 + 对酶活性强 烈抑制，m n 2 + 对酶有激活作用。没有活性的脱金属酶只有在添加m n ”的情况下 被激活。s d s p a g e 测得酶亚基的分子量为8 00 0 0 d a ，s e p h a d e xg 一2 0 0 凝胶过滤 测得分子量为1 6 00 0 0 d a ，表明酶由2 个相同的亚基组成。 m 1 锄o t o 等( 1 9 9 5 ) 将假单胞菌p s 7 ( n p z “? 0 聊。船s p p s 一7 ) 的肌酐水 解酶基因克隆并在e ，fc 6 0 0 中表达。肌酐水解酶的基因序列中含有一个7 8 0 b p 的开放阅读框，推导出的肌酐水解酶是一个由2 5 9 个氨基酸残基组成的多肽链， 分子量为2 84 3 7d a 。这与从假单胞菌p s 7 提纯得到的酶的分子量相近( 经 s d s p a g e 测定酶的分子量为2 90 0 0 d a ) 。在氨基酸组成上，推导出的结果也与 用提纯的酶得到的结果相符。分析肌酐水解酶和肌酸水解酶的核苷酸序列，虽然 它们作用于同一底物( 肌酐) ，但它们的同源性比较低。并且研究表明肌酐水解 酶可能与典型水解酶的结构有所不同。由假单胞菌p s 7 提纯得到的肌酐水解酶 是一含z n 离子的金属酶，像其它含z n 离子的金属酶一样，在添加m n ”、z n 2 + 的情况下被激活。核苷酸序列分析表明，它与氨肽酶( 一含z n 离子的金属酶) 没有明显的相似之处。一些金属酶结合z n 离子的部位为：h i s ，h i s ，g l u 或c y s ，h i s ， c y s 。而肌酐水解酶有8 个h i s 残基，因此认为其中一些残基与z n 离子结合。由 且c o f jc 6 0 0 表达的肌酐水解酶的性质与假单胞菌p s - 7 提取得到的酶相同。 n i s l i y a 等( 1 9 9 7 ) 报道了粪产碱菌( 一k 口f 船n e s 知p 胁) 中编码肌酐水解 酶的基因被克隆并测序。肌酐水解酶基因长度为7 7 7 b p 由2 5 8 个氨基酸残基组 成，提纯的肌酐水解酶经s d s p a g e 测定亚基分子量为3 l5 0 0d a ，凝胶过滤测 定其分子量为1 2 00 0 0 d a ，对肌酐的k m 值为4 2 i n i n o l 几。 n i s i l i v a 等( 1 9 9 8 2 0 0 1 ) 将节杆菌t e l 8 2 6 中编码肌酐水解酶基因克隆并测 序。肌酐水解酶基因长度为7 7 4b p ，由2 5 8 个氨基酸残基组成。参与肌酐降解途 径中的肌酐水解酶、肌酸水解酶、肌氨酸氧化酶的基因在染色体上构成一个基因 簇。用s d s p a g e 测定肌酐水解酶的亚基分子量为3 05 0 0 d a ，对肌酐的k m 值 为6 6 m m o l l 。 目前已经测序的肌酐水解酶基因：c m a ，来自节杆菌t e l 8 2 6 ( n i s h i y a “以， 1 9 9 8 ：2 0 叭) ：c m p 来自假单胞菌p s 一7 ( y 狐锄o t 0 “以，1 9 9 5 ) ： c m l ，来自 粪产碱菌( n i s l l i y a “d ，1 9 9 7 ) 。它们的氨基酸序列对比( 图1 ) 表明：c m p 与 微生物学硕士论文 c m l 有较高的同源性为6 5 ；c m a 与c m p 、c m l 的同源性比较低，分别为 3 6 2 和3 6 4 。 图1 肌酐水解酶的氨基酸序列对比 t 出l e 2a l 培n m e n to f a m i n oa c i ds e q u e n c 髓o f c r e a 士i n i n 船e s 4 研究目的 目前国外对酶法肌酐检测开展了广泛的研究，酶法肌酐测定试剂盒已研制 成功并广泛应用于临床诊断。我国是个人口大国，据报道我国仅尿毒症患者就有 1 0 0 万之多，因而及早地、准确地诊断肾病对肾病患者的治疗非常重要。此外， 肌酐检测还是人体血液的常规检查项目，临床需酶量很大，我国目前还没有肌酐 检测用酶的生产，少量临床试验检测用酶均为进口，且价格昂贵，因而目前临床 上主要采用化学方法进行测定。为了降低检测成本，推广酶法肌酐检测，为临床 诊断提供可靠的依据需要开发出我们国家自己的肌酐检测用酶。 肌酐水解酶是酶法肌酐检测的关键酶之一，本研究旨在分离产肌酐水解酶 的菌株，确定菌株的最优产酶条件，将酶提取纯化并研究酶的性质，为酶法肌酐 检测试剂盒的制各奠定基础。 2 微生物学硕士论文 材料与方法 i i 材料与方法 1 材料 1 1 分离源 浙江大学华家池校区牧场土壤 杭州郊区的菜园土壤 1 2 主要仪器 恒温培养箱、电热恒温水浴锅( 医疗器械五厂) 、s c 1 5 型数控超级恒温槽 ( 宁波海曙天恒仪器厂) 、l g r l 6 w 型高速台式离心机( 北京医用离心机厂) 、 i e cb 一2 0 a 型离心机、p h s 3 c 型精密p h 计( 上海精科雷磁) 、7 5 4 型分光光度 计( 上海第三分析仪器厂) 、0 删p u sb h 一2 型万能显微镜、j y 9 2 一型超声波 细胞粉碎机( 宁波新芝科器研究所) 、电泳仪及d y y _ i i i 型垂直电泳槽( 北京市 六一仪器厂) 、p c rs 四n tt e m p e m t u r ec y c n gs y s t e m ( 英国m a i dl i m i t e d ) 。 l - 3 培养基 1 3 1 细菌富集培养基 肌酐，l g ；酵母膏，o 1 9 ；k 2 h p 0 43 h 2 0 ，2 9 ；k h 2 p 0 4 ，o 5 9 ；m g s 0 4 。7 h 2 0 ， o 1 9 ；k c l ，o 0 0 0 5 9 ；水，1 0 0 0 n ：l l ：p h 7 0 。 1 3 2 细菌分离培养基 肌酐，1 0 9 ；酵母，8 9 ；k 2 h p 0 43 h 2 0 - 2 9 ：k h 2 p 0 4 ，o 5 9 ；m g s 0 4 7 h 2 0 ， o 1 9 ；k c l ，o 0 0 0 5 9 ：水，1 0 0 0 m l ；p h 7 0 。 1 3 3 基础培养基 肌酸，1 0 9 ，蛋白胨，8 9 ，k 2 h p 0 4 3 h 2 0 ，2 9 ：k h 2 p 0 4 ，0 5 9 ；m g s 0 47 h 2 0 ， 0 1 9 ；k c l ，o 0 0 0 5 9 ；水，1 0 0 0 m l ；p h 7 o 。 2 试验方法 菌株的分离纯化技术路线如下： 摇瓶富集恒化培养富集平板划线分离争液体发 酵鉴定 2 1 产肌酐水解酶微生物的分离纯化 2 1 1 富集 微生物学硕士论文材料与方浩 将1 5 份土样混合，取1 0 9 加入到富集培养基中于4 2 振荡培养，每天测定 肌酐的降解情况。待肌酐完全降解后，取出培养液上清1 0 m l ，接种于一小型恒 化培养器( 恒化器容积为5 0 m