（植物学专业论文）贵州春兰的离体培养及野生资源遗传多样性的分子评价.pdf

贵州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 重型墨兰塑塑堡等至丝墅兰塑塑望堡量壁堡塑坌王堡堕 缩略词表 4 贵卅f 大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 贵州春兰的离体培养及野生资源遗传多样性的分子评价 附：学位论文原创性声明和关于学位论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究曾做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者虢逊日期：龇 关子学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 幽血锄签毛塑垒肭： 2q qz 生墨旦 贵州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 贵州春兰的离体培养及野生资源遗传多样眭的分子评价 摘要 春兰( c y m b i d i u mg o e t 砌，r c h b f ) 是一种具有很高观赏性价值的兰科兰属 植物，传统上采用分株繁殖。随着现代生物技术的发展，以组织培养为主要手段的生 物技术逐步应用到春兰的繁殖过程中，大幅度的提高了春兰的繁殖系数。而对春兰种 质资源的遗传多样性研究，则有利于春兰种质资源的收集、保存、鉴定、创新和合理 利用。本研究在春兰的离体培养和遗传多样性等领域开展了工作，以期为遗传改良和 资源的开发利用提供理论指导和构筑技术平台。取得的结果如下： l 建立和优化了春兰种子培养技术体系 对春兰种子进行了非共生萌发研究，结果发现：果龄、灭菌方式、赤霉素预处理、 基本培养基、碳源及添加植物生长调节剂等因子对种子的萌发率有很大的影响。适合 春兰种子萌发的最佳培养基为：m s + n a a ( 1 0r a g l ) + 6 一b a ( 1 0r a g l ) + g a ( 1 5 m g l ) + 蔗糖( 3 0 9 6 ) + 琼脂( o 7 ) 。首次较为全面对影响种子萌发的多个因素进行 探讨，完善了春兰组织培养体系。 2 建立和优化了兰属植物r h o d - p e r 实验体系 对影响r a p d - p c r 的m 9 2 + 、d n t p s 、t a q 酶及引物浓度等因子进行了优化。确 定优化的反应体系为：7 5n g 模板d n a ，2 5m m o l lm 9 2 + ，0 1 5m m o l ld n t p s ， 0 7 5ut a q 酶，0 4g a n o l l 引物浓度，反应总体积为2 5 此。 3 春兰及其近缘种的形态学、r p d 分析 采用3 5 个形态学性状分析表明，1 2 种类型兰属植物可聚为3 类，其中墨兰和寒 兰组成l 类，珍珠矮和兔耳兰组合为另1 类，而包括春兰在内的其他兰属近缘种为第 3 类：以筛选出的2 3 个随机引物扩增的r a p d 标记，可将供试样品聚为5 类，其中春 兰、建兰、莎叶兰、莲瓣兰、菅草兰及春剑为第1 类，墨兰和寒兰聚为第2 类，珍珠 矮和兔耳兰为第3 类，惠兰与落叶兰单独各成一类。 4 春兰不同自然分布区遗传多样性的r a p d 评价 用筛选出的多态性表现较好的4 8 个引物进行r a p d 扩增，共产生了3 2 4 条 6 0 0 3 ，0 0 0b p 条带，平均每个引物可产生6 8 条，其中2 0 1 条( 6 2 0 4 ) 显示多态性； 样品的遗传差异性大小与地理距离的远近表现出很大的相关性，样品之间亲缘关系的 远近有着定程度的地域趋势。 贵州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文贵州春兰的离体培养及野生资源遗传多样性的分子评价 关键词：春兰，离体培养，遗传多样性，r a p d ，分子标记 nv i t r oc u l t u r ea n dg e n e t i cd i v e r s i t ye v a l u a t i o no f c h u n l a n ( c y m b i d i u mg o e r i n g i ir c h b ) i ng u i z h o u a b s t r a c t c h u n l a n ( c y m b i d i u mg o e r i n g i ir c h b 工1i s ak i n do fh i g h l yo r n a m e n t a lo r c h i d a c e a e p l a n t c o n v e n t i o n a l l y , i tw a sp r o p a g a t e db ys e p a r a t i o no fb u l b s w i t ht h ed e v e l o p m e n to f m o d e mb i o t e c h n o l o g y , t i s s u ec u l t u r em a yb ee f f e c t i v e l ye m p l o y e dt ot h ep r o p a g a t i o n t h e e l u c i d a t i o no ft h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fw i l dc h u n l a ng e r m p l a s mc a l lp r o v i d ee s s e n t i a l i n f o r m a t i o nf o rt h ec o n s e r v a t i o n ，p h y l o g e n y , i d e n t i f i c a t i o n ，g e n e t i ci m p r o v e m e n ta n d r e a s o n a b l ee x p l o i t a t i o no ft h i so r c h i d t os a t i s f yt h ei n c r e a s i n gd e m a n do fi t sg e r m p l a s m u t i l i z a t i o n ，nv i t r oc u l t u r ea n dg e n e t i cd i v e r s i t ye v a l u a t i o nw e r ec a r r i e do u ti nt h ep r e s e n t s t u d y t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1e s t a b l i s h m e n ta n d o p t i m i z a t i o no fa s e p t i cc u l t u r e s t h es e e d so fc y m b i d i u mg o e r i n g i ir c h bw e r eg e r m i n a t e di na s y m b i o t i cc u l t u r e c o l l e c t i n g t i m e ，s t e r i l i z a t i o nm e t h o d s ，g i b b e r e l l i np r e t r e a t m e n t ，b a s a lm e d i a , c a r b o ns o u r c e a n dr e g u l a t o r ss i g n i f i c a n t l ya f f e c t e dt h eg e r m i n a t i o nr a t e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e s t m e d i u mt oi n d u c e g e r m i n a t i o nw a sm s + n a a ( 1 0m g l ) + 6 - b a ( 1 0m g l ) + g a ( 1 5 m g l ) + s u c r o s e ( 3 o ) + a g a r ( 0 7 ) w i t ht h ed i s c u s s i o no ft h ef a c t o r sw h i c h a f f e c t e dt h eg e r m i n a t i o nr a t e ，t h eo p t i m i z e d nv i t r og e r m i n a t i o ns y s t e mw a se s t a b l i s h e d 2t h eo p t i m i z a t i o no fr a p d - p c rp r o t o c o li nc y m b i d i u m t oe s t a b l i s ht h er e p r o d u c i b l er a p d r a p dp r o t o c o li nc y m b i d i u m ，t h ec o n c e n t r a t i o n s o fm 9 2 + ，d n t p s ，t a qd n a p o l y m e r a s e ，a n dp r i m e r sw e r ea l s oo p t i m i z e di nt h ep r e s e n t w o r k w i t ht h et o t a lv o l u m eo f r e a c t i o nw a s2 5 此，t h eo p t i m a ls y s t e mu s i n g7 5n gg e n o m i c d n a ，2 5m m o l lm g ”，0 1 5m m o l ld n t p s ，0 7 5ut a qd n ap o l y m e r a s e ，a n d0 4 2 贵州丈学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文贵州备兰的离体培养及野生资潭遗传多样性的分子评价 i _ t m m o l lp r i m e r s w e r ee m p l o y e dt oc a r r yo u tp c ri n2 0a c c e s s i o n sf r o m11s p e c i e so f c y m b i d i u m 3g e n e t i cd i v e r s i t ye v a l u a t i o na m o n gc y m b i d i u mg o e r i n 鲥a n di t sr e l a t i v e s m o r p h o l o g i c a lt r a i t sa n dr a p dm a r k e r sw e r eu s e dt oe v a l u a t et h er e l a t i o n s h i po f c y m b i d i u mg o e r i n g i ir c h ba n di t sr e l a t i v e s w i t h3 5m o r p h o l o g i c a lt r a i t s ，c o n s i d e r a b l y c l o s er e l a t i o n s h i p sw e r ef o u n db e t w e e nc y m b i d i u ms i n e n s ew i l l da n dc y m b i d i u mk a n r a n m a k i n o i na d d i t i o n ，as i g n i f i c a n tr e l a t e d n e s sw a sa l s oo b t a i n e db e t w e e nc y m b i d i u m n a n u l u my s w ua n dc y m b i d i u ml a n c i f o l i u mh o o k b a s e do nt h er a p dd a t ay i e l d e df r o m t h e2 3s c r e e n e dp r i m e r s ，f i v es u b c l u s t e r sw e r eo b t a i n e df r o mt h e # y e na c c e s s i o n s 4g e n e t i cd i v e r s i t yi nw i l da c c e s s i o n sa sr e v e a l e db yr a p da r i a t y s i s t os a r i s f yi t sg e n e t i ci m p r o v e m e n ta n dp h y l o g e n e t i ci n f o r m a t i o n ，g e n e t i cv a r i a t i o no f 6 5w i l da c c e s s i o n so fc y m b i d i u mg o e r i n g i ir c h bf r o mn i n ep m v i n c e so fc h i n aw a s i n v e s t i g a t e da tt h ed n a l e v e lu s i n gt h e4 8s c r e e n e da r b i t r a r yp r i m e r s w i t ht h e s ep r i m e r s ， 3 2 4d i s c e r n i b l er a p db a n d sw e r es c o r e d ，a n d2 0 1 ( 6 2 0 4 ) w e r ep o l y m o r p h i c t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti th a sc o n s i d e r a b l ec o r r e l a t i o nb e t w e e ng e n e t i cd i s t a n c ea n d g e o g r a p h i c a ld i s t a n c e k e yw o r d s ：c y m b i d i u mg o e r i n g i ir c h b ，n v i t r oc u l t u r e ，g e n e t i cd i v e r s i t y , r a p d ， p h y l o g e n y 3 贵州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文贵州春兰的离体培养及野生资源遗传多样性的分子评价 刚舌 兰花为我国传统名花，它以奇特的花形、绚丽多变的花色、素雅的芳香、优美的 叶形，深受各国人民的喜爱，具有很高的观赏价值和经济价值。据粗略估计，在中国 大陆兰花的年交易额达3 5 - 5 0 亿元，仅国兰的年出口额约2 0 0 0 万美元以上。贵州地 貌类型复杂，气候类型多样，这为兰科( o r c h i d a c e a e ) 植物的生长繁衍提供了有利条 件，野生资源十分丰富( 卢思聪，1 9 9 4 ) 。在全国已知的兰科植物1 7 1 属、1 2 5 0 种中， 贵州省就分布有7 4 属，2 4 6 种( 变种) ，是我国兰科植物的分布中心之一( 陈谦海， 2 0 0 4 ) 。尤其是贵州春兰( c y m b i d i u mg o e r i n g i ir c h b f ) ，以其花品好，色彩艳、花 香幽、变异多，即有资源优势又有资源特色而享誉国内外，对其开发利用方兴未艾。 遗传多样性是种质资源研究的重要内容，它决定了种质资源在今后研究方向和生 产实践中的开发利用，也是遗传育种的物质基础。遗传多样性研究对( 1 ) 查明种质 资源遗传多样性最高的地区；( 2 ) 制订优先采集和取样的策略；( 3 ) 核心种质资源的 筛选；( 4 ) 监测遗传流失；( 5 ) 定义改良品种的方向和其它遗传资源的特征等工作具 有重要的意义( 黄宏文，1 9 9 8 ) 。分子标记技术自诞生起就广泛应用于植物种质资源 研究上( 贾继增，1 9 9 6 ) ，主要体现在对资源遗传多样性评价，资源的起源、演化，重 要种质d n a 指纹图谱的构建，以及重要基因的克隆等方面。 植物中常见的d n a 分子标记可分为p c r 途径和非p c r 途径两类，前者包括随机 扩增多态性( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 、简单序列重复多态性( s i m p l e s e q u e n c er e p e a t ，s s r ) 、扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 等；后者包括限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m , r f l p ) 等。其中r a p d 技术操作简单、多态性检出率高、花费 少，自其问世以来，迅速成为最常用的分子标记之一( 郝玉金，2 0 0 0 ) ，并且在某些 领域，如对种质资源遗传多样性的评价上，仍被广泛采用( h u a n ge ta l ，2 0 0 2 , b e l a j e ta l ，2 0 0 2 ；w e ne ta l ，2 0 0 4 ) ：但r a p d 技术的重复性较差，目前在种质资源研究许 多领域，特别是在种质鉴别上已开始广泛采用稳定性好、多态性检出率高、星共显性 表达且操作相对简便的a f l p 技术。a f l p 最适的应用范围，也是其申请专利的关键， 在于利用a f l p 技术构建种质的d n a 指纹图谱( f i n g e r p r i n t i n gp a t t e r n s ) ，在检测 品种质量、纯度及重要种质的知识产权保护上有其独特的灵敏性( b r o o t h a e r t se ta l 贵州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 贵州春兰的离体培养及野生资源遗传多样性的分子评价 2 0 0 0 ；w e ne ta l ，2 0 0 4 ) ，因而被认为是迄今为止最有效的分子标记之一( 王和勇，1 9 9 9 ： g o u l a oe ta t ，2 0 0 1 ) 。 纵观国内外对兰科植物的研究，尽管有的学者利用r a p d 标记进行分析部分兰科植 物亲缘关系的尝试( 文李等，2 0 0 1 ；w o n ge ta l ，1 9 9 9 ) ，但目前国内外尚未见利用分 子标记对国兰资源遗传多样性评价、d n a 指纹图谱构建及遗传变异等方面的报道。本 研究拟采用r a p d 技术，对贵州春兰资源的遗传多样性开展研究工作，为国内外该领域 的首创研究，将会为贵州省春兰资源的保护及合理开发利用奠定理论和技术基础。 第一章研究综述 1 兰科植物离体培养及其应用的研究进展 1 1 兰科植物离体培养 1 1 1 外植体来源 作为兰科植物组织培养的外植体，主要有茎尖、种子、叶片、花瓣、萼片、子房、 花梗、茎段、侧芽、根尖等( 表1 ) 。其中，侧芽、茎尖作为外植体能诱导产生大量的 类原球茎，类原球茎发育成根状茎后进一步长成幼苗( 徐程，2 0 0 2 ) ；过小的外植体 不但活力弱，而且分裂增殖的部位少，因为除了生长点外，在生长点与叶原基之间的 分裂增殖能力也较强；而过大的外植体则诱导困难，容易褐化死亡( 贾勇炯，1 9 9 8 ) 。 所以在培养时如何防止褐化是关键。 1 。1 1 1 胚培养 兰花种子细小，在自然条件下虽多( 一个荚果约能产生1 0 4 1 0 8 粒种子) ，但由于其 胚发育不完全，很难萌发。l i n k 早在1 8 2 4 年就观察到在自然条件下兰花种子萌发伴 随着真菌感染的现象。随后，n o e lb e r n a r e d ( 1 8 9 9 ) 首次认识到真菌的作用，认为真 菌对种子的侵染是种子正常萌发所必需的，种子与真菌之间是一种共生关系，由此创 立了共生萌发法。随着对共生萌发机制的研究人们发现大部分兰花种子可以通过无 6 贵州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文贵州春兰的离体培莽及野生资源遗传多样性的分子评价 菌萌发的方式进行，即非共生萌发。b e r n a r e d ( 1 9 0 9 ) 第一次使卡德丽亚兰与蕾丽亚 兰杂交种子成功萌发，开创了菲共生萌发的先例( 范成明，2 0 0 3 ) 。随后，研究者用 非共生萌发也对其他兰花的种子进行萌发研究，如四季兰( 田梅生，1 9 8 5 ) 、蝴蝶兰 ( 曾宋君，2 0 0 0 ) 、春兰( 黄磊，2 0 0 3 ) 、文心兰( a r d i t t ij ，1 9 6 7 ) 等。之后，非共 生萌发便成为兰花组织培养的热点，并逐步代替了共生萌发。 表i 部分兰科植物离体快繁一览表 t a b l e1t h ei nv i t r oc u l t u r eo fo r c h i dp l a n t s 相关资料显示，有些兰花的未成熟或接近成熟的种子比成熟的种子更容易萌发 ( a r d i t t ij ，1 9 8 1 ) 。y o n g q i nc h e n 等( 2 0 0 5 ) 研究大花蕙兰( c y m b i d i u mf a b e r l ) 不 完全发育的种子的离体再生培养，并成功的获得了再生植株。 兰花种子在自然条件下萌发困难，除了胚发育不完全外，与种皮致密、透性差和 种皮中含有抑制物有关。段金玉等( 1 9 8 2 ) 对兰属1 0 种植物的种子离体萌发研究时 发现，用0 1m o l l 氢氧化钠浸泡多花兰、朵朵香、双飞燕、豆瓣绿、寒兰、套叶兰 等1 0 3 0r a i n ，萌发率可提高1 0 倍以上。田梅生等( 1 9 8 5 ) 用剪刀将四季兰种皮剪破 后种子的萌发率大大提高；风兰的成熟种子用肥皂水洗净后，用7 0 的酒精浸泡3 0s ， 利于萌发( 杨柏云。1 9 9 7 ) 。 这些预处理效果的生理机制还有待进一步研究。大部分兰花的种子，可以通过无 7 贵州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文贵州春兰的离体培养及野生资源遗传多样性的分子评价 菌萌发的方式进行萌发，其中附生或半附生兰和气生兰及杂交后代的种子萌发较易， 而地生兰种子的萌发较难( 范成明，2 0 0 3 ) 。 1 1 1 2 茎尖及侧芽培养 茎尖是最早用于兰花快速繁殖的外植体，侧芽应用也相当广泛。茎尖作为外植体 较适于复茎性兰花，如大花蕙兰、卡特丽亚兰、石斛兰、文心兰等，但对一些单茎性 兰花，如蝴蝶兰、仙指甲兰等用茎尖作为外植体有可能丧失母株，人们倾向于寻找其 他可能的外植体。另外，学者们对茎尖及侧芽的取材时间、最适取材部位及大小进行 了深入的研究，一般认为带1 - 2 个叶原基的茎圆锥成活率高，中间部位侧芽的成活率 及生长率较高( 范成明，2 0 0 3 ) 。由于以茎尖和侧芽作为外植体进行组织培养易于其 他外植体，墨兰( 项艳，2 0 0 3 ) ，金芯丝兰( 李登中，2 0 0 4 ) ，虎头兰( 罗林会，2 0 0 4 ) ， 卡特丽亚兰( 丁兰，2 0 0 1 ) 等多数兰科植物均成功的获得了再生植株。 1 1 1 3 叶片培养 叶片作为外植体既可减少对母株的伤害，取材又不受季节的限制，且数量多，是 比较理想的外植体材料来源。但是，成熟幼叶对诱导反应极弱( 王怀宇，1 9 8 9 ) ，所以 对叶片的培养宜采用试管苗中的幼叶。这可能是由于成熟植物组织向培养基中释放高 浓度抑制生长的物质，严重影响兰花的存活( c o m p t o n ，1 9 8 6 ) 。 但肾药兰成熟植株最上面3 片幼叶在培养中却显示出较强的增殖能力，在l o 一1 2 周内基部分化出芽，但不产生原球茎。c h e n 等( 1 9 9 9 ) 从幼叶的叶尖表皮细胞和叶肉细 胞直接培养出体细胞胚，但在1 个月之内无愈伤组织产生，在经过下一级的培养后分 化出幼苗( 范成明，2 0 0 3 ) 。胡国富( 2 0 0 4 ) 用北青兰叶片作为实验材料，用0 1 升 汞对叶片消毒3m i n ，使污染率降低为2 6 7 0 ，并且使萌发率达到9 0 以上。杨银萍 等( 2 0 0 4 ) 以虎耳兰幼嫩叶片为外植体，接种于添加不同激素浓度配比的培养基上， 结果得到了再生植株，且成活率很高。柴向华等( 2 0 0 4 ) 以金边蝴蝶兰花梗诱导产生 的花梗芽的叶片为外植体，不经过原球茎途径，由叶片直接诱导不定芽进行快速繁殖， 也得到了成活的植株。 1 1 1 4 其他外植体培养 虽然茎尖、侧芽是极好的外植体，但对于母体的伤害较大，且茎尖的来源也有限 ( 吕永杰，2 0 0 3 ) ，而种子培养的难度又较大，因此有些学者使用其它器官作为外植 体。 贵州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 贵州春兰的离体培养及野生资源遗传多样性的分子评价 如蝴蝶兰的组织培养中有以花梗腋芽( 彭立新，1 9 9 9 ) 、根段( 李进进，2 0 0 0 ) 等 为外植体的报道。利用胚培养会产生性状分离，难以获得整齐一致的试管苗，有些后 代甚至会失去观赏价值，因此以繁殖优良品种为目的时，也应以其它器官为外植体( 曾 宋君，2 0 0 0 ) 。大花蕙兰的快繁中有以茎段作为外植体的报道( 吴晓霞，2 0 0 2 ) 。茎段 包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段，是组培快繁中常用的材料，且容易成功，变 异较小，性状均，繁殖速度快( 熊丽，2 0 0 3 ) 。 从前，植物学家认为根分生组织转化为芽体的可能性极小，但s t e w a r t 等( 1 9 7 8 ) 用树兰等的根开创性地培养出了原球茎和从愈伤组织分化出l 株苗。此后，根的培养 相继在不同兰花中获得了成功( s a n c h e z ，1 9 8 8 ) 。徐宏英等( 2 0 0 2 ) 用大花慧兰的幼 根成功地进行组织培养，来检测其快速繁殖的影响因素。在诱导原球茎研究中，曾宋 君( 2 0 0 0 ) 发现，用蝴蝶兰的根尖为外植体，以m s 培养基的效果最佳，6 一b a 浓度以 5 0m g l 时较好，低浓度( o 5m g l ) 的2 ，4 一d 明显地能促进原球茎的形成，而n a a 对根尖原球茎的诱导无明显的促进作用。 另外也有学者报道了蝴蝶兰花梗离体培养，通过原球茎发生途径形成再生植株的 过程( 刘福林，2 0 0 1 ) 。但不论以何种器官为外植体，兰花组织培养基本都通过这样 的再生途径：外植体一原球茎一丛生原球茎一分化成菌( 吕永杰，2 0 0 3 ) 。 1 。1 2 培养基及外界条件的研究 1 1 2 1 培养基 在兰花的组织培养中，最常用的培养基为m s 、k n u d s o nc 、k y o t o 、w h i t e 、b 5 和 它们的改良型( 范成明，2 0 0 3 ) 。但针对具体的兰花品种，应采取不同的成分配比。 如在春兰的组培中，常用m s 培养基，但其培养基成分中无机盐成分要为少量( 陈 丽，1 9 9 9 ) ，如果长期继代，则应用1 2m s 培养基为宜。而蕙兰、墨兰则要求无机 盐含量高的培养基( 张菊野，1 9 9 3 ) 。春兰、建兰原球茎在补加椰乳的培养基培养时， 均可促进原球茎生长，使其顶部伸长而有利于分化形成芽。但与建兰不同的是，春兰 原球茎在补加椰乳的培养基中长期培养时，增殖反而不如不加椰乳的显著( 徐程， 2 0 0 2 ) 。 常用的外源激素主要有生长素类和细胞分裂素类。生长素主要包括i a a ，2 , 4 d 和 n a a ，而细胞分裂素主要有b a 、z t 、k t 等。培养基中添加的植物生长调节剂的浓 度、种类和配比对外植体诱导和原球茎增殖与分化起主导作用。在种子萌发及芽的诱 9 贵州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文贵州春兰的离体培养及野生资源遗传多洋| 生的分子评价 导培养中，生长素浓度使用范围较大( o 卜5 0m g l ) ，其浓度一般高于细胞分裂素， n a a 诱导效果好于2 ，4 一d 和i b a ( 丁兰，2 0 0 0 ) 。 陈丽等( 1 9 9 9 ) 在对墨兰的研究中发现0 5m g l n a a + 1 0m g l b a 有利于墨 兰根状茎的增殖。p a e k ( 1 9 8 3 ) 发现n a a 和k t 能促进兰属原球茎的生长。兰芹英 等( 2 0 0 1 ) 以鹤顶兰的种子为外植体进行离体培养时发现2 0m g l b a + 0 4m g l 2 , 4 一d 有利于原球茎的诱导，( 2 0 3 0m g l ) b a + ( o 2 - 0 3m g l ) n a a 对于丛芽 分化、继代效果较好。钟士传( 2 0 0 5 ) 就植物细胞分裂素( b a ) 和生长素( n a a ，i a a ， i b a ) 对石斛兰组织培养的影响进行了研究，结果表明，石斛兰继代培养适宜的b a 和n a a 浓度都为0 5m g l ，而石斛兰试管苗的根诱导以生长素i a a 为好，i a a 适 宣的浓度为1 0 2 0m g l 。熊英等( 2 0 0 3 ) 以虎头兰杂交种“黄色热带”为材料进行 快繁研究，发现0 5r a g l 6 一b a + 0 ；2m g l n a a 利于继代增殖，适宜生根的培养基为 m s + i 0 m g l n a a + 0 5 a c ，生根率达9 5 。项艳( 2 0 0 3 ) 采用墨兰的茎尖和芽为 外植体，研究墨兰的组织培养要点时发现，4 0m g l 6 - b a + 1 0m g l n a a 适合于 快速出芽，而生根的最佳培养基为：1 2m s + 3 0m g l n a a 。 对不同的兰花来说，在不同的生长发育阶段所需激素的量和种类都不尽相同。 k u s u m o t o ( 1 9 8 0 ) 报道2 ，4 d 、k t 、g a 3 + n a a 有助于兰属杂交种原球茎的生长，2 ， 4 d + g a 3 有利于芽的生长，o a 3 + n a a 有利根的形成。 1 1 2 2 外界条件 一般认为，低浓度的活性炭可吸附培养过程中外植体所分泌的酚、醌类等有害物 质，有利于原球茎、根状茎及苗的生长，而明显抑制芽的分化( b 学贤，1 9 8 8 ) 。有 人认为这是由于活性炭吸附了培养基中的生长调节物质，使培养基中的外源激素含量 低至不足以启动和引发芽分化的水平( 傅雪琳，2 0 0 0 ) 。有关机理仍有待进一步探讨。 切割方式对于组织培养也有一定的影响。试验表明，在横切法( 将一条原球茎切成 前、中、后两段或三段) 、纵切法( 将原球茎一劈为二或一劈为四) 和掰开法( 将大丛原 球茎顺势掰散成小丛或单个) 、横切加纵切等方法中，以掰开法对原球茎的损伤最小， 增殖效果也最佳( 张菊野，1 9 9 3 ) 。这与级切后的杂种兰原球茎可促进其形成苗的结 果不同( a m a k i ，1 9 8 9 ) 。 蔗糖作为培养基的能源物质和渗透调节剂，对原球茎的生长影响较大，不同浓度 对兰花组培的作用不同。2 的蔗糖有利于兰属原球茎的生长( k u s u m o t om ，1 9 8 0 ) ； 1 0 贵州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文贵州舂兰的离体培养及野生资源遗传多样性的分子评价 2 一3 的蔗糖促进芽的形成，而根的分化和生长则以5 蔗糖最适合( p a e kky ，1 9 8 3 ) ； 1 0 - i 5 的蔗糖利于墨兰原球茎的快速生长，长期培养可适当加大蔗糖的浓度( 陈 丽，1 9 9 9 ) 。 此外，培养基的p h 值、光照时间、光质、培养温度、原球茎大小及接种密度对 原球茎、根状茎的生长与分化都有一定程度的影响( 徐程，2 0 0 2 ) 。 1 2 离体培养在兰科植物遗传改良上的应用 1 2 1 杂交育种 长期以来，兰花的育种以自然选种为主。种子无菌发芽育苗的成功，使兰花品种 间、种问及属问的杂交育种成为可能。如著名的蕾丽卡特兰( l a e l i o c a t t l e y a ) 就是卡 特兰( c a t t l o y a ) 和蕾丽兰( l a e l i aa n c e p c ) 的属问杂交种。采用人工授粉杂交技术进 行种胚培养，已获得了大量兰花杂种( 陈振光，1 9 9 6 ) ，在已经育成的兰花杂交品种 中，8 0 9 6 8 5 是利用胚培养技术培育成功的。 1 2 2 离体诱变 离体培养与诱变相结合是很有应用价值的兰花育种手段。离体培养诱变育种可选 用原生质体和单细胞系、悬浮培养细胞、愈伤组织、花药或孢予以及再生植株，进行 突变筛选。物理诱变和化学诱变方法已被广泛地应用于兰花育种。辐射诱变结合组织 培养，能加速花卉新品种的育成与变异性的稳定( 丁慧清，1 9 9 1 ) 。 徐卫辉等( 1 9 9 5 ) 认为，在适当剂量的紫外光照射下，细胞无丝分裂染色体不出 现复杂变化，也不发生纺锤体的聚合和解聚等过程。无丝分裂直接造成培养细胞的核 物质部分减少，并使同一个体不同细胞间的倍性出现差异，从而导致非整倍体的产生。 较高剂量的紫外光照射则可导致细胞核变形、皱缩，线粒体液泡化。在一定照射剂量 条件下，紫外光照射可提高细胞无丝分裂频率。 化学诱变剂能诱发离体培养细胞产生较多的点突变，获得较高的突变率。常用的 化学诱变剂有亚硝基乙基脲、甲基磺酸乙酯、硫酸- - 7 , 酯、乙烯亚胺及叠氮化钠等( 陈 发兴，2 0 0 2 ) 。 贵州大学2 0 0 7 届硕研究生学位论文 贵州春兰的离体培养及野生资源遗传多样性的分子评价 1 2 3 遗传工程 1 2 3 1 转基因研究 兰科植物转基因研究的报道不多，仍停留在建立基因转化体系的水平，尚未达到 应用阶段。采用的方法有基因枪法和农杆菌法。研究的兰花种类包括蝴蝶兰属( a n z a i e ta l ，1 9 9 6 ：b e l a r m i n o a n d m i i ，2 0 0 0 ；詹渊理等，2 0 0 3 ) 、大花蕙兰( y a n ge ta l ，1 9 9 9 ) 、 石斛兰属( k u e h n l ea n ds u g i i ，1 9 9 2 ；c h i ae ta l ，1 9 9 4 ：y ua n dg o h ，2 0 0 0 ) 、文心 兰属( b g 寒霜等，2 0 0 0 ) 、万代兰属( c h i ae ta l ，1 9 9 0 ) 和五唇兰属( g r i e s b a c ha n d h a m m o n d ，1 9 9 3 ) 。 y a n g 等( 1 9 9 9 ) 将带有n p ti i 和g u s 标记基因的p k h 2 0 0 质粒，通过基因枪 对大花蕙兰原球茎进行了基因转化研究，获得了抗卡那霉素的原球茎和转基因植株， 通过p c r 分析，证明n p t i i 基因存在于转基因植株中。陈志俊等( 2 0 0 0 ) 利用花椰 菜花叶病毒( c a m v ) 3 5 s 启动子引导的g u s 基因检测基因枪法转化a r a n d a 原球茎 的瞬间表达效率，发现在基因枪轰击时在d n a 金粉悬液中加入0 1m o l l 的n a a ， 轰击前预培养时用0 1m o i l 甘露醇处理，每个培养皿轰击两次和轰击压力为1 1 0 0p s i 下，g u s 基因在兰花原球茎组织中的瞬间表达效率最高。邵寒霜等( 2 0 0 0 ) 将l f y 基 因( 从拟南芥中克隆出的具有促进植物提早开花的基因) 与单子叶植物的u b i 启动子 构建了一个适合在单子叶植物中高效表达的含有l f yc d n a 的表达载体( p b i l 1 ) ， 应用基因枪转化法将其导入文心兰的原球茎中，获得了一些卡那霉素抗性克隆。 1 2 3 2 原生质体的培养与融合 兰花原生质体培养及融合对于日益发达的兰花产业有着举足轻重的作用，通过这 种技术能够培养远缘杂交产生的新品种，不论对植物生物工程研究还是对兰花产业的 发展都有不可估量的价值。这项研究还给细胞壁及细胞膜相关的基础性课题提供了良 好的材料，开辟了新的研究途径。 目前，已从卡德丽亚兰、石斛兰、蕙兰、蝴蝶兰等十几种兰花分离得到原生质体。 外植体的来源有根、叶、原球茎、花瓣等，不同的外植体难度各有不同( 丁兰，2 0 0 0 ) 。 台湾的c h e n 等( 1 9 9 0 ) 从几种蝴蝶兰的根、叶、花瓣、原球茎得到了大量的原生质体。 大花蕙兰就是利用原生质体培养而获得的一系列品种，以叶片为材料的原生质体培 养，在1 纤维素酶+ o 3 果胶酶+ 0 2 半纤维素酶+ 1 1 甘露醇分离原生质体的产 量最高( 赵九洲，2 0 0 5 ) 。 贵州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文贵州鲁兰的离体培养及野生资源遗传多样性的分子评价 作为单子叶植物，兰花原生质体的融合比起双子叶植物来说是比较困难的。以蝴 蝶兰、石斛兰、肾药万代兰为材料，仅得到3 一5 的融合原生质体。对试管苗幼叶游 离得到的高质量原生质体进行电融合，融合率可达1 0 ( c h e n ，1 9 9 0 ) 。陈发兴( 2 0 0 2 ) 认为，通过改变酶液、培养方式及培养基的配方等也许可以获得更好的结果。 1 3 人工种子 近年来，人工种子的研究逐渐受到的人们的重视。研究人工种子生产的材料主要 是组织培养产生的原球茎( p r o t o c o r m - ii k eb o d i e s ) ，以褐藻酸钠盐或藻酸钙与氯化 钙、m s 培养基以及2 0m g l b a 、1 0m g l n a a 等激素制成胶体状，作为包衣材料。 贝母兰( c o e o g y n eo d o r a t i s s i m av s i a n g u s t i f o l i al i n d l e ) 原球茎用褐藻酸钠制 成的人工种子已表现出很好的效果( k a m a l a k a n n ar ，1 9 9 9 ) 。郭顺星等( 1 9 9 6 ) 和 s a i p r a s a d 等( 2 0 0 3 ) 先后探讨了以褐藻酸钠凝胶包埋系统制作铁皮石斛人工种子的 技术。张铭等( 2 0 0 1 ) 应用粘土、蛭石粉等固形基质包埋制作人工种子，并达到与凝 胶包埋系统相近的萌发率和成苗率。 s u s h m i t a 等( 1 9 9 8 ) 对m c h e n r y 和a b r a t e 杂交所得的杂种进行组织培养，诱导其原 球茎制作人工种子，以1 0 0m m o l l 氯化钙和质量分数为3 的褐藻酸钠盐作为包衣材料 的造料效果最好；人工种子置于4 2 5 c 的条件下，贮藏8 周后，均可发芽生长成小苗， 但贮藏时间越长，萌芽速度越慢；在4 c 条件下，人工种子萌芽速度比2 5 c 下的快。 1 4 种质资源的离体保存 植物种质资源的保存研究对于生物多样性保护和植物生物技术均具有十分重要 的意义。王君晖等( 1 9 9 9 ) 采用快速和慢速脱水干冻法分别对铁皮石斛种子、类原球 茎体进行液氮超低温保存。陈勇等( 2 0 0 1 ) 对玻璃化法超低温保存铁皮石斛原生质体 和初生原球茎进行了研究，其存活率分别达4 8 和8 8 。史永忠等( 2 0 0 0 ) 研究发现铁 皮石斛试管苗在4 c 年i 黑暗条件下连续保存1 2 个月，成活率可达到1 0 0 。 2 遗传标记在遗传多样性研究中的应用 2 1 遗传多样性研究的意义 生物的遗传多样性是大自然最珍贵的自然资源，是人类社会赖以生存和发展的物 质基础。了解物种的遗传多样性水平，对解析物种遗传与进化，遗传与变异的历史事 件，及理解人为或生态变迁的影响力，具有极大的参考价值，也是未来遗传变异的起 贵州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 贵州春兰的离体培养及野生资源遗传多样性的分子评价 点和遗传改良的前提( f i s c h e re ta l ，2 0 0 0 ) 。各国政府都不惜花费大量人力和财力 加强资源的争夺、保存、评价、开发利用及知识产权保护( 贾继增，1 9 9 6 ) 。 遗传多样性( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 是生物多样性的重要组成部分，从广义上讲， 遗传多样性是指种内或种间表现在分子、细胞、个体三个水平的遗传变异度，也就是 生物所携带的遗传信息的总和；狭义上讲，就是指种内不同个体和群体间遗传多态性 的程度，或称遗传变异( 季维智，1 9 9 9 ) 。遗传多样性是物种进化的基础和本质，也 是人类社会生存和发展的物质基础。因此，深入的利用各种方法特别是现代分子生物 学技术来研究生物的遗传多样性，具有重要的理论意义和实际意义。 2 2 遗传多样性的研究方法 遗传多样性的检测最初是从形态学开始的。随着染色体的发现及其结构和功能的 澄清，人们又把研究的重点转向细胞水平。同工酶也一度被用来检测生物型之间的遗 传差异和亲缘关系的远近，现在有实验室仍将其作为检测手段( 暴朝霞和黄宏文， 2 0 0 2 ) 。但由于同工酶的多态性检出率低，尤其对表现型相似的品种缺乏鉴别力，而 且分析结果受发育