（植物学专业论文）低温胁迫下不同竹生理生化及分子标记的研究.pdf

独创性声明 l i i iii ii rl uli i iii ii if y 17 7 8 4 2 7 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南科技大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：痒盈 日期： 知椤占。垆 关于论文使用和授权的说明 本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅；学校可以公布该论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 签名：座在 导师签名南。坛乏 同期：知9 罗f 够 本研究以四川成都地区7 个竹种和竹艺城1 2 个竹种为材料，在离体低温 胁迫后，对不同竹种进行生理生化指标的测定，并对其进行r a p d 分子标记， 旨在探讨不同竹种的抗寒性生理机制，为竹的引种、培育和筛选提供理论依据， 并推动抗寒育种的研究。 结果表明：低温处理后两个地区所有1 9 个竹种相对电导率、渗透性物 质、丙二醛和p o d 酶活性都呈上升趋势。成都地区麻竹相对电导率最高，楠 竹和绵竹较低；硬头黄含糖量最高，慈竹最低；麻竹可溶性蛋白含量最高， 慈竹最低；绵竹脯氨酸含量最高，大琴丝竹含量最低；慈竹m d a 含量最高， 撑绿竹最低；楠竹p o d 活性最高，撑绿竹最低。竹艺城地区钓鱼竹相对电导 率较高，苦竹最小；粉单竹含糖量较高，钓鱼竹最低；巨竹可溶性蛋白含量 最高，钓鱼竹最低；巨竹脯氨酸含量最高，大风尾竹最低；小琴丝竹m d a 含 量最高，斑竹最低；苦竹p o d 活性最高，粉单竹最低。 低温处理后不同地区的s o d 酶活性表现出不同的变化趋势，成都地区 s o d 活性整体呈下降趋势，竹艺城除了青单竹和斑竹外，整体呈上升趋势。 低温处理后将各生理指标进行综合分析可知，不同生理指标间呈不显著 的j 下相关或负相关。p o d 活性和脯氨酸含量在两个地区不同竹种抗寒性方面 都起到比较明显的作用。成都地区硬头黄、楠竹和绵竹综合抗寒性质较其他 竹种略强，在竹艺城地区则是巨竹和苦竹抗寒性略强。 低温处理后不同竹种过氧化物同功酶谱带与对照相比变化不明显，而蛋 白质谱带数量比较丰富，变化也更明显。从对照和处理分别聚类的结果来看， 成都地区撑绿竹、大琴丝竹和硬头黄，慈竹和麻竹始终聚为一类，说明这两 组竹种在处理前后叶片的可溶性蛋白质变化趋势比较一致。竹艺城地区斑竹 和大凤尾竹、巨竹和苦竹、青单竹和粉单竹在处理前后蛋白质变化趋势相同， 而且后两组竹种与生理指标聚类结果一致。 低温处理后用不同r a p d 引物扩增所有竹种可以看出，成都地区楠竹、 绵竹和硬头黄，慈竹和麻竹遗传距离较近，与生理指标和蛋白质聚类结果吻 合。竹艺城地区小琴丝竹和大凤尾竹、硬头黄和牛心竹、钓鱼竹和罗汉竹、 苦竹和斑竹遗传距离更近，说明这几组竹种在分子水平上的变化类似。 关键词：竹低温处理分子标记方差分析聚类 a bs trac t s e v e nk i n d so fb a m b o o si n c h e n g d ua n dt w e l v ek i n d so fb a m b o o si n z h u y i c h e n gw e r es t u d i e di nt h i sr e s e a r c h p h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e sw e r e a n a l y z e da n dr a p dm a r k e r sw e r ec a r r i e dt h r o u g ha f t e rl o wt e m p e r a t u r es t r e s s i nv i t r oo n p u r p o s e o f p r o b i n g i n t ot h e p h y s i o l o g i c a l m e c h a n i s mo f c o l d - r e s i s t a n c ei nd i f f e r e n tb a m b o o s ，w h i c hn o to n l yp r o v i d eat h e o r e t i c a l e v i d e n c ef o rt h e i rt r a n s p l a n t 、c u l t i v a t i o na n df i l t r a t i o n ，b u ta l s oa d v a n c et h e r e s e a r c ho fb r e e d i n g t h er e s u l t ss h o wa sf o l l o w s ：t h er p p ，c o n t e n t so f o s m o t i cs u b s t a n c e s ，m d a a n dp o da c t i v i t i e so fa l lt h es p e c i e so fb a m b o oi nt w or e g i o n sa s c e n d e da f t e r l o wt e m p e r a t u r es t r e s s t h eh i g h e s tv a l u eo fr p p , s o l u b l es u g a r ，s o l u b l ep r o t e i n ， p r o l i n ea n dm d aa r ed e n d r o c a l a m u sl a t i f l o r u sm u n r o ，b a m b u s ar i g d a ， d e n d r o c a l a m u s l a t i f l o r u sm u n r o ，d e n d r o c a l a m u s f a r i n o s u s a n d n e o s i n o c a l a m u sa f f i n i s r e s p e c t i v e l y i n c h e n g d u a n d p h y l l o s t a c h y sn i g r a v a r h e n o n i ss t a p f e x r e n d l e ，b a m b u s o i d e a ec e r o s i s s i m am c c l u r e ，d e n d r o c a l a m u s y u n n a n i c u s ，d e n d r o c a l a m u sy u n n a n i c u s ，b a m b u s am u l t i p l e xc v a l p h o n s e k a r r a n dp l e i o b l a s t u sa m a r u sr e s p e c t i v e l yi nz h u y i c h e n g w h i l et h a to ft h el o w e s t o n e sa r ep h y l l o s t a c h y sp u b e s c e n sm a z e le xh d el e h a i e ，n e o s i n o c a l a m u sa f f i n i s ， n e o s i n o c a l a m u s a f f i n i s ，n e o s i n o c a l a m u 8a f f i n i sf l a v i d o r i v e n s ，b a m b u s a p e r v a r i a b i l i sm c c l u r e ，b a m b u s ap e r v a r i a b i l i sm c c l u r er e s p e c t i v e l yi nc h e n g d u a n dp l e i o b l a s t u s a m a r u s ，p h y l l o s t a c h y sn i g r a v a r h e n o n i s s t a p f e x r e n d l e ， p h y l l o s t a c h y sn i g r av a r h e n o n i ss t a p f e x r e n d l e ，b a m b u s am u l t i p l e xc v f e r n l e a f , p h y l l o s t a c h y sb a m b u s o i d e s ，b a m b u s o i d e a ec e r o s i s s i m am c c l u r er e s p e c t i v e l y i nz h u y i c h e n g t h et r e n do fs o da c t i v i t i e sw e r ed i f f e r e n ta f t e rl o wt e m p e r a t u r es t r e s si n t w or e g i o n s ，w h i c hd e c l i n e di nc h e n g d uw h i l ea s c e n d e di nz h u y i c h e n ge x c e p t b a m b u s u r e d e a ec e r o s i s s s i m am c c l u r ea n dp h y l l o s t a c h y sb a m b u s o i d e s f a l lo ft h ep h y s i o l o g i c a li n d e x e sw e r ea n a l y z e d s y n t h e t i c a l l ya f t e rl o w t e m p e r a t u r es t r e s s ，t h er e s u l t si n d i c a t e s t h a tt w oo ft h e mh a di n d i s t i n c t i v e p o s i t i v eo rn e g a t i v er e l a t i o n s p o da c t i v i t ya n dp r o l i n ep l a y e dam o r ei m p o r t a n t r o l ei nc o l d r e s i s t a n c ei nd i f f e r e n t s p e c i e s o fb a m b o o b a m b u s a r i g d a ， d e n d r o c a l a m u sf a r i n o s u sa n dp h y l l o s t a c h y sp u b e s c e n sm a z e le xh d el e h a i ei n d e n d r o c a l a m u sy u n n a n i c u sa r em u c hb e t t e rt h a no t h e rs p e c i e si nz h u y i c h e n g c o m p a r ew i t ht h ec o n t r a s t ，p e r o x i d ee n z y m ev a r i e ds c a r c e l yb u tt h eb a n d s o fp r o t e i nw e r em o r ea b u n d a n ta n dt h ec h a n g ew a sm o r ed is t i n c t i v e l ya f t e rl o w t e m p e r a t u r es t r e s s t h er e s u l t so fc l u s t e r i n gb yc o n t r a s ta n ds e t t l e ds e p a r a t e l y s h o w e dt h a tb a m b u s a p e r v a r i a b i l i sm c c l u r e ， n e o s i n o c a l a m u s a f f i n i s f l a v i d o r i v e n sa n db a m b u s ar i g d a ，n e o s i n o c a l a m u sa f f i n i sa n dd e n d r o c a l a m u s l a t i f l o r u sm u n r ow e r et h es a m ek i n d sr e s p e c t i v e l y , w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h e t r e n do fs o l u b l ep r o t e i no ft h et w og r o u p sw e r eh o m o l o g o u s p h y l l o s t a c h y s b a m b u s o i d e sfa n db a m b u s am u l t i p l e xe v f e r n l e a f , d e n d r o c a l a m u sy u n n a n i c u s a n dp l e i o b l a s t u s a m a r u s ， b a m b u s r e d d e a ec e r o s i s s s i m am c c l u r ea n d b a m b u s o i d e a ec e r o s i s s i m am c c l u r eh a v eas e m b l a b l ec h a n g eo fs o l u b l ep r o t e i n ， w h i c hw e r ec o i n c i d ew i t ht h ec l u s t e r i n go fp h y s i o l o g i c a li n d e x e s d i f f e r e n tr a p dp r i m e r sw e r eu s e dt oa m p l i f yt h ea ns p e c i e sa f t e rl o w t e m p e r a t u r es t r e s s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp h y l l o s t a c h y sp u b e s c e n sm a z e le x h d el e h a i e ，d e n d r o c a l a m u sf a r i n o s u sa n db a m b u s ar i g d ai nc h e n g d uh a dac l o s e r d i s t a n c eo fh e r e d i t y , w h i c hw a sc o n s i s t e n tw i t ht h ec l u s t e r i n go fp h y s i o l o g i c a l i n d e x e sa n d p r o t e i n t h eg e n e t i c d i s t a n c eo fb a m b u s a m u l t i p l e x c v a l p h o n s e k a r ra n db a m b u s am u l t i p l e xc ，f e r n l e a f , b a m b u s ar i g d aa n d f a r g e s i af r a e t i f l e x ay i ，尸h y l l o s t a c h y sn i g r av a r h e n o n i ss t a p f e x r e n d l ea n d p h y l l o s t a c h y sa u r e a c a r r , e x a e t c r i v i e r e ，p h y l l o s t a c h y s b a m b u s o i d e sf a n d p l e i o b l a s t u sa m a r u sw e r em o r ec l o s e rr e s p e c t i v e l y , w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h e i r c h a n g e sw e r es i m i l a ri nm o l e c u l a rl e v e l k e yw o rds ：b a m b o o l o wt e m p e r a t u r es t r e s sm o l e c u l a rm a r k e r t h ev a r i a n c ea n a l y s i s c l u s t e r i n g 页 1 1 植物抗寒机制1 1 2 植物抗寒的研究方法2 1 2 1田间鉴定法2 1 2 2 室内鉴定法3 1 3 竹子的抗寒研究7 1 3 1 竹子抗寒研究的现状8 1 3 2 竹子抗寒研究的方法1 0 1 3 3 竹子抗寒性的分子生物学研究1 1 1 4 本课题研究的目的与意义1 1 1 5 本课题主要研究内容与技术路线1 2 2 低温处理对不同竹种生理指标的效应1 3 2 1 材料与方法1 3 2 1 1 材料1 3 2 1 2 处理方法1 3 2 1 3 仪器设备1 3 2 1 4 主要试剂1 4 2 1 5 测定方法1 4 2 1 6 统计分析方法1 4 2 2 结果与分析1 4 2 2 1低温处理对不同竹种相对电导率变化的影响1 4 2 2 2 低温处理对不同竹种渗透性物质的影响1 7 2 2 3 低温处理对不同竹种膜脂过氧化物含量的影响2 2 3 低温处理对不同竹种保护酶系统的影响2 6 3 1低温处理对不同竹种保护酶活性的影响2 6 3 1 1 材料与方法2 6 3 1 2结果与分析2 8 3 2 低温处理对不同竹种过氧化物同功酶的影响3 2 3 2 1 材料与方法3 2 3 2 2 结果与分析3 3 4 低温处理后各生理指标的综合分析3 6 v 页 3 6 4 2 低温处理后不同竹种的聚类分析及性质相似度3 8 5 低温处理对蛋白质谱带的影响4 0 5 1 材料与方法4 0 5 1 1 材料4 0 5 1 2 处理方法4 0 5 1 3 仪器设备4 0 5 1 4 试剂及溶液配制i 4 0 5 2 结果与分析4 2 5 2 1低温处理对不同竹种蛋白质条带的影响4 2 5 2 2 低温处理后不同竹种蛋白质条带多态性分析4 5 6 低温处理后不同竹种分子水平上的变化5 l 6 1不同竹种r a p d 分子标记分析5 1 6 1 1 材料与方法5 1 6 1 2 试验方法5 l 6 1 3 结果与分析5 4 7 讨论6 4 7 1 细胞膜透性与植株抗寒性的关系6 4 7 2细胞渗透性物质与植株抗寒性的关系6 4 7 3 膜脂过氧化物与植株抗寒性的关系6 5 7 4 保护酶活性与植株抗寒性的关系6 5 7 5过氧化物同功酶谱带与植株抗寒性的关系6 6 7 6蛋白质谱带与植株抗寒性的关系6 6 7 7遗传多样性与植株抗寒性的关系6 7 7 8 生理指标、蛋白质电泳及分子标记聚类的异同6 7 结论6 9 致谢7 1 参考文献7 2 附录1 7 9 附录2 8 1 攻读硕士学位期间发表的学术论文及研究成果8 5 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 1文献综述 温度是植物生长的三大环境条件之一，也是植物自然地理分布的一个主 要限制因素。自然界中温度的变化影响着植物的生长发育，剧烈的温度变化 会形成温度胁迫。当温度降低到植物生长发育所需温度的下限以下就会造成 低温逆境( c o l ds t r e s s ) 。根据植物受害时温度的高低，逆境低温可分为冷 害和冻害。0 以上的低温对植物造成的伤害称为冷害，而o 以下的低温 对植物造成的伤害称为冻害。低温逆境是农业生产中的主要自然灾害之一， 已成为世界许多地区提高农业生产的一个主要限制因素喃1 。 1 1植物抗寒机制 植物对逆境低温的耐受性决定于其本身的遗传基础，是长期的遗传变异 和自然选择的结果。经典遗传学研究表明，植物的抗寒性是一个涉及众多微 效基因控制的数量性状。但对某一种植物而言，它受低温的伤害程度还与降 温速度、降温持续时间以及升温的快慢有关，同时温度还会与其他环境因子 如光照、水分状况等相互作用，协同影响植物的耐冷性发育哺峭1 。一般来说， 温带地区的植物适应低温的能力随着一年之中季节的变换发生巨大变化，在 温暖的生长季节，这些植物几乎不能抵御零度以下的低温，骤冷使植物细胞 间隙甚至细胞内结冰，最终导致细胞死亡；但在经历了一段时间的零度以上 低温后，温带植物耐寒性不断加强，以至于可以抵抗零度以下的严寒，这个 适应过程称为冷驯化( c o l da c c l i m a t i o n ，c a ) 。如黑麦在经过了冷驯化之 后能在一3 0 的低温下存活，而在冷驯化之前黑麦的致死温度为一5 c 。现 在有些学者把冷驯化作为更一般的概念使用，指的是提高植物耐冷性相关的 生理生化过程，并按适应低温的范围将其分为两种类型：寒驯化( c h il l a c c li m a t i o n ) 和冻驯化( f r e e z i n ga c c l i m a t i o n ) 9 。川。 自1 9 0 6 年w i e g a n d n 钉提出研究冷害机制的重要性以来，已经发表了许 多关于植物冷驯化和耐冷性方面的研究结果。早期的研究主要是通过对低温 胁迫下植物的形态结构、细胞超微结构，以及生理生化变化进行观察测定。 l y o n ( 1 9 7 3 ) 、s t e p o n k u s ( 1 9 8 4 ) 和p a l t a ( 1 9 9 6 ) 等提出了有关冷害冻害 机制的各种假说“6 叫引，确立了细胞膜是低温损伤的原初部位的观点。b r i g g s 和s i m i n o v i t c h ( 1 9 4 9 ) 最早发现植物中存在低温诱导蛋白n9 l ，他们在越冬 期黑槐树( s o p h o r aj a p o n ic a ) 树皮中发现了2 3 种新的蛋白质。其后，在 2 0 世纪6 0 年代中期进行了大量不同物种的耐冷品种和冷敏品种的蛋白质比 西南科技大学硕士研究生学位论文第2 页 较研究，逐渐认识到某些蛋白质的出现和低温诱导及耐冷性有关。自8 0 年 代开始，集中对冷驯化过程中的蛋白质代谢，特别是对冷胁迫下新合成的蛋 白一低温诱导蛋白的性质、结构和功能进行了研究。9 0 年代随着研究的深 入，人们应用差异筛选技术( d d - p c r 、s s h 等) 、定点突变、基因转化等分 子生物学手段分离、鉴定了大量在植物冷驯化及耐冷性发育过程中表达发生 变化的基因，对他们的性质、功能和表达调控进行细致研究，从而更加透彻 的阐明了植物耐冷性的分子机制。 1 2植物抗寒的研究方法 对植物资源进行抗寒性鉴定和评价，是抗寒育种的前提和基础。为此进 行抗寒性研究必须建立一套完整可靠的抗寒鉴定方法心0 2 。植物生理学家和 育种学家经过长期不懈的努力，已提出了不少抗寒鉴定方法。这些方法可以 在不同条件下进行，使得不同植物种类的抗寒性鉴定得以迅速有效的完成。 总体看来，这些方法可大体分为三类：田间鉴定法、室内鉴定法和分子生物 学研究法。 1 2 1田间鉴定法 田间鉴定包括田间自然鉴定和田问人工鉴定。 1 2 1 1田间自然鉴定法 田间自然鉴定是在抗寒研究中所采用的最古老的鉴定方法5 2 引。它是将 暴露在自然条件下的植物种类作为研究对象，使其经过冬季低温考验后，从 外部性状上来观察，调查植株的冻害和存活情况，从而估计不同植物的抗寒 性。十七世纪英国著名的植物学家b o b a r t 就是利用该方法，通过观察自然 低温条件下树木的枝条、树干及根部受害留下的伤痕，得出某些植物间的耐 寒力不相同乜引。植物抗寒力概念的提出以及早期人们对植物种类抗寒性差异 的认识都是借助于该方法得出的。由于田间自然鉴定反映了植物在自然冷冻 条件下的受害情况，其鉴定结果比较真实可靠。因此，该方法到现在一直被 人们作为一种重要的鉴定方法，在冻害发生严重的年份，便有许多从事抗寒 性研究和抗寒性育种的学者进行冻害调查，以获得关于植物种类的抗寒信息 n5 2 3 4 1 。但是，田间自然鉴定虽具有真实可靠等许多优点，但它同时也有不 少缺点，主要表现为：自然低温发生频率低。在某一地区，自然低温的发 因此，田间自然鉴定所需时间长，见效慢。浪费植物资源。田间自然鉴定 要求所鉴定植物在自然冻害条件下，不采取任何防护措施，所以，一些植物 资源被冻死，造成大量资源浪费，因此，该鉴定方法代价比较大。鉴定并 非十分准确。自然环境因素非常复杂，植物受伤害的因素是多方面的，干旱、 风沙及病虫害都可能造成植物的伤害，因此，冬季寒冷过后，植物表现出来 的伤害并不一定都是冻害，并且地形、生态条件的差异都会影响鉴定结果。 1 2 1 2田问人工鉴定法 田间人工鉴定主要是指植物经过冬季低温冷冻后，借助于仪器测定植株 的某一指标，从而达到鉴定抗寒性的目的。电阻法是田间人工鉴定的一种典 型方法，该法是六十年代初，加拿大植物生理学家w il n e r 心副创建的。他在 田间对抗寒性不同的苹果品种枝条进行测定时发现：电阻的大小与枝条抗寒 性的强弱有直接关系，并提出冬季在不伤害植物组织的情况下，测定枝条电 阻值能够反映其抗寒力。其原理是：植物遭受冬季寒冷后，细胞膜受到伤害， 原生质体内细胞间隙外渗电解质使电阻变小，并且电阻值越小说明植物细胞 膜受伤害的程度越大。同时，冬季水分含量及水分状态与抗寒力有关，因此， 它也影响着电阻值的大小。这样使得电阻的测定受外界因素的影响较大。因 此，电阻值有时不能真实的反映抗寒力的大小，因而该方法未得到广泛的应 用。在室内鉴定法诞生后，也有人将此法应用于离体枝条人工冷冻后测定抗 寒性的大小，并在苹果和葡萄上得到了成功地应用比6 矧。 1 2 2 室内鉴定法 随着抗寒机理研究的不断深入，为了弥补和解决田间自然鉴定方法不 足，室内鉴定方法应运而生。该方法是借助人工制冷设备，将所鉴定的植物 材料在一定冷冻条件下进行冷冻处理，然后观察和检测其存活和受冻情况， 从而评价其耐寒性。该法具有速度快、重复性强等优点，所以从其诞生之日 受到极大重视并很快被许多学者接受，发展迅速，一跃成为当今抗寒性鉴定 的主要方法心0 2 8 29 。1 9 2 6 年美国学者首次运用人工冷冻的方法研究了不同苹 果品种与抗寒性有关因素之间的关系。从而开创了室内人工鉴定的先河。其 后，诸多研究学家都证实了人工冷冻鉴定和田间自然鉴定效果具有很好的一 致性口引。从此人工室内冷冻方法便不断完善，鉴定方法不断丰富和发展。到 西南科技大学硕士研究生学位论文第4 页 目前为止，人工室内鉴定依据其测定的技术原理，主要分为以下几个方面： 1 2 2 1物理方法 ( 1 )电导法 植物组织细胞受冻后，首先损伤的是细胞膜系统，造成细胞内大量物质 外渗n 6 。1 2 2 3 。植物抗寒力越差，细胞受冻程度愈重，其外渗物质也就越多。 因此测定组织细胞受冻后外渗物质的多少，就可以评价抗寒性强弱。1 9 3 0 年美国植物生理学家d e x t e r 等首次将电导法用于抗寒性鉴定口1 i ，借助于电 导仪测定细胞受冻后外渗物质的多少来判定抗寒力的强弱。自此以后，电导 法受到了人们的极大重视，成为第一个具有避免主观因素干扰，能够客观评 价抗寒性的方法。但当时这种方法受实验干扰因素( 取样量、浸提时间、样 品大小等) 较多。以后又经许多人不断完善，使其成为当今抗寒性鉴定上运 用最广泛的方法之一曲2 j 。在我国，八十年代初就将电导法应用到了果树抗寒 性鉴定，到目前，已在多种果树上得到了成功地应用。但当非生命纤维细胞 组织或木栓细胞组织在溶液中也能释放电解质物质时，电导法就受到了干 扰。 ( 2 )镜鉴法 该法借助于电镜直接观察受冻后原生质体膜的破裂情况、冷驯化过程中 细胞内部结构的动态变化( 如质壁分离现象) 、植物组织( 叶片、枝条、根 系等) 形态解剖结构、枝条内淀粉粒的形态与结构以及植物叶片表面气孔密 度等来鉴定植物的抗寒性3 34 j 。 ( 3 ) 马林契克法 水分含量，特别是自由水和束缚水含量的及二者的比值都与抗寒性有一 定的相关性。植物组织细胞内的自由水未被细胞原生质胶体颗粒吸附而可以 自由移动，可以作为溶剂。而束缚水则被细胞原生质胶体颗粒吸附而不易移 动，不能作为溶剂。基于此特点和水分依据水势差而移动的原理，将植物组 织浸入高浓度( 低水势) 的糖溶液中一定时间后，自由水可全部扩散到糖液 中，组织中便留下束缚水。由于自由水渗到糖液中，使糖浓度降低，可用阿 贝折射仪测定糖溶液浓度的变化，求出自由水的含量，再根据总含水量减 去自由水含量便是束缚水的含量口5 。 ( 4 ) 核磁共振波普法 核磁共振波普法除了用于结构测定外，还可结合差热分析( d t a ) 来研 究木质部组织深度过冷及其过冷与冻害的关系，为植物耐寒选育提供依据 和呼吸作用的改变，可溶性糖、可溶性蛋白、游离氨基酸( 特别是脯氨酸) 和其他有机酸水平升高，激素水平改变，新的同工酶谱带出现及膜质组分改 变等等。而抗寒性不同的植物这些生理生化指标的改变各不相同且与抗寒性 有一定的相关性。因此，通过对这些指标进行测定就可获悉不同植物的抗寒 性。 ( 1 ) 分光光度法 分光光度法包括可见分光光度法和紫外分光光度法。植物在冷驯化和植 物遭受寒害的过程中，会发生一系列复杂的生理生化变化和代谢失调，其主 要表现为许多物质含量或活性的变化与植物的抗寒性存在着一定的相关性 妲2 36 3 7 3 巩4 k4 2 1 。而这些物质本身呈现一定的颜色或者可与特定的化学物质发生 显色反应，因此，可利用分光光度计测定某一特定波长下的吸光度，通过公 式计算出这些物质的含量或活性。目前，分光光度法应用广泛，已成为抗寒 性鉴定的主要方法之一。现主要用于以下物质的测定： 蛋白质与氨基酸含量的测定利用蛋白质分子中的肽键或特定氨基酸 残基的颜色反应，以及其特有的吸光光谱可进行定性和定量测定。目前常用 的用来测定蛋白质含量的方法有l o w r y 法、色素结合法、紫外吸收法和双缩 脲法，而氨基酸的测定通常利用其与水合茚三酮反应，定量的生成二酮茚胺 的取代盐等蓝紫色化合物，在定范围内，其颜色深浅与氨基酸的含量成比 例。 糖类含量的测定用蒸馏水或7 9 的乙醇抽提样品后，还需要沉淀其 中的蛋白质，经过滤或离心后，用上清液进行测定。常用的方法主要有二硝 基水杨酸还原比色法和斐林试剂比色法测定还原性糖，蒽酮比色法或苯酚法 测定可溶性糖。 丙二醛( m d a ) 含量的测定m d a 在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸 ( t b a ) 反应，生成有色三甲基复合物，可通过比色法利用公式计算m d a 的 含量。 酶活力的测定在进行酶活力测定时，常利用酶促反应的底物或产物能 吸收不同波长的光来进行测定。测定适宜波长下的光吸收，可连续追踪反应 西南科技大学硕士研究生学位论文第6 页 的变化，如测定r u b p a s e 的活性，因该酶是以n a d + ( n a d p + ) 为辅酶的脱氢 酶，可根据还原后生成的n a d h ( n a d p h ) 在3 4 0 n m 的吸收峰来追踪，过氧化 氢酶( c a t ) 活性可利用底物h 。0 ：在2 4 0 n m 的吸光值变化来追踪。超氧化物 歧化酶( s o d ) 可用氮蓝四唑( n b t ) 还原比色法测定，过氧化物酶( p o d ) 可用愈创木酚氧化比色法或联苯胺比色法追踪测定，而a t p 酶一般通过硫酸 亚铁一钼酸铵比色法测定无机磷的含量来追踪。其他与抗寒性有关的酶还有 谷胱甘肽过氧化物酶等酶类以及v e 、v a 、v c 、辅酶q 、类胡萝卜素等还原性 物质大都是通过分光光度法来测定。 叶绿素、花青素的测定利用叶绿素和花青素提取液对可见光谱的吸 收，利用分光光度计测定某一特定波长下的吸光度，即可根据公式计算出提 取液中各种色素的含量和比例。 还原类物质含量的测定在植物的冷驯化过程中，产生一些还原性保护 物质，如抗坏血酸( v c ) 、谷胱甘肽等，利用这些物质可使一些颜料还原而 使颜色越来越淡，通过比色法测定颜色的变化可计算出该类还原性物质的含 量。 ( 2 ) 动力学荧光分光光度法 动力学荧光分光光度计法是近年来国际上迅速发展起来的一种简易、快 速、灵敏和非破坏性的植物耐寒测定新技术，当植物的绿色组织由暗处向光 下转移时，植物体内的叶绿素q 分子在室温下随光照进程可发出节律性的 荧光信号，即荧光诱导动力学，它包括可变荧光和固定荧光两部分5 43 1 。当 植物受到低温胁迫时，可变荧光就渐渐下降，如果可变荧光接近零时，就表 明植物体内的叶绿体膜遭到严重伤害，失去了转化光能的能力。整个测定过 程对样品不破坏，而且测定一个样品只需1 - 3 分钟。这种方法在杨树、桉树 等树种的抗寒性测定上取得了较好的效果。本方法的缺点是测定所需仪器比 较昂贵，测定代价高。 ( 3 )原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法，又称为原子吸收光谱法，是近几十年来迅速发展 起来的一种新的分析微量元素的仪器分析技术。由于植物的某些矿质元素含 量与植物的抗寒性有关，如近年来研究的热点c a 2 + 及k + 都与植物的抗寒性 有关。因此，原子吸收分光光度法一出现就被生理研究学者运用到抗寒性的 鉴定钆4 4 3 。该方法具有灵敏性高，选择性强，测定元素范围广，操作简便、 快速，重现性好等优点，已得到广泛的应用。 ( 4 ) 同功酶技术 西南科技大学硕士研究生学位论文第7 页 所谓同工酶是指能催化同一种化学反应( 即功能相同) ，但其分子结构 和带电性质不同的一组酶。植物在冷驯化过程中，不但蛋白质( 包括酶) 的 含量和活性发生变化，而且其种类也有变化。抗寒性不同的植物在抗寒锻炼 中合成不同的酶蛋白。由于这些酶蛋白分子结构、分子大小、分子形状、带 电性质或带电荷数的差异，在电泳时产生不同的泳动速率而相互分离。利用 特异性的颜色反应使待测酶着色，这样就可以在凝胶中展现出不同的酶谱。 目前，用于抗寒性鉴定的同工酶主要有p o d 同工酶、s o d 同工酶、脂酶同工 酶等。现在，同工酶技术己成功用于多种植物抗寒力鉴定h5 4 6 。4 引。 1 2 2 3分子生物学方法 随着分子生物学研究的不断深入和发展，植物抗寒性研究也很快深入到 分子水平，从而衍生出很多抗寒性分子研究方法。 ( 1 ) d n a 分子标记技术 d n a 分子标记技术是在分子水平上对抗寒基因的直接标记，是d n a 序列 变异的直接反映，具有遗传稳定，信息量大，许多标记在非编码区，选择表 现中性，不受环境影响，与基因是否表达无关，检测迅速，操作简便等优点， 因而备受育种者的青睐。目前，d n a 分子标记技术可以用于抗寒性状鉴定和 抗寒分子标记辅助育种n 钆4 p 5 2 1 。 ( 2 ) 基因克隆技术 差异筛选技术( d d - p c r ) 、扣除杂交法、c d n a 文库构建、d n a 序列测定和 同源性分析等基因工程手段可以直接分离到抗寒基因，并通过体外转录及翻 译技术、定位突变及基因转化等手段进行抗寒基因的体内和体外表达，从而 对其功能、性质和表达调控等进行多方面的研究哺3 5 利。 1 3竹子的抗寒研究 竹子属禾本科( g r a m i n e a e ) 竹亚科( b a m b a s o i d e a e ) 的多年生常绿植 物，四季常青，枝叶茂盛，是极其重要的非木材可再生林业资源，是园林绿 化的重要植物。竹子喜温暖怕风寒，喜湿润怕干旱，喜肥，喜酸性怕碱性。 繁殖方式为地下茎繁殖，在地下茎的节间处长出笋，春雨之后，2 4 h 内可拔 节卜2c m ，5 0d 左右就可成竹，4 5a 就可成林，因而它以其速生、产量 高、材质好而倍受人们的青睐；竹子在保持土壤水分、涵养水源方面与其他 树种不同，其有发达的根系，砍掉地上部分，地下茎还会长出新的竹子，因 新材料、包装、运输、家具、食品、医药、保健、环保等方面，具有较高的 经济价值。 我国是世界上最重要的竹子栽培和生产国，有竹类植物3 9 个属5 0 9 种， 面积5 0 0 万h m 2 ，约占全国森林总面积的4 以上；年产鲜竹笋1 7 0 万吨，竹 业年产值可达2 0 0 亿元9 1 。由于受各地气温的影响，大部分竹种在分布上具 有明显的地带性和区域性，其中福建、江西、浙江、湖南4 省为竹林主要产 区。竹子的栽培区域多集中在南方，虽然人们在“南竹北移 引种研究上做 了大量工作，通过引种驯化，些竹种能够在华北、西北等气候比较寒冷、 干燥的地区生长。但温度一直是一些极具经济价值和观赏价值的竹种得不到 进一步推广种植的主要限制因子。因此竹子的抗寒性研究日益为人们所关 注。 1 3 1竹子抗寒研究的现状 1 3 1 1竹子抗寒性引种研究 近年来，全国各地纷纷进行了竹子人工引种栽培试验，取得了较大成就。 年均气温在“以上，一月平均气温为一5 2 一2 2 ，极端最低气温在一2 0 左右，年降水量超过5 0 0 m m ，这样的气候条件下竹子也能生长。2 0 世纪6 0 7 0 年代，大规模的“南竹北移”引种工作使一些抗性较强的散生竹引种到黄河 以北流域，竹子引种工作取得了较大地成功。同时“南竹北移 使毛竹在山 东崂山、文登一带扎根，而刚竹、淡竹、红竹能在北京、大连等地生长，青 皮竹的引种在浙南形成了大片的用材竹林，粉单竹也在浙南、长沙一线适应 们等等。金川等历时十余年，对丛生竹的存活力、冻害情况、出笋成竹能力、 生长量及物候期等引种生长表现指标进行研究测定，从而得出吊丝单、吊丝 球、青皮竹、撑麻2 5 号及本地竹可在浙南地区推广和开发的结论。薛贵 山等在引种甜竹时发现，在年降水量10 0 0m m 以上，最低气温不低于一1 0 ， 土壤立地条件适合的地区发展黄甜竹是可行的阳引；在大型丛生竹从南亚热带 北移的过程中，张进友对黄金间碧玉的引种研究发现，其繁殖容易，适应性 强，在亚热带轻霜地区种植，生长良好，可作观赏和材用3 1 。1 9 9 2 年，从 福建南平引种绿竹2 0 0 株，于赣西中部、浙赣铁路线北侧，n 2 7 。3 8 一 2 8 。1 5 ，年平均温度1 7 2 ，一月平均气温5 1 ，极端最低气温一9 2 ， 第9 页 1 种，2 0 世 寒竹种筛选 方面做了大量的工作，并分析出在北京地区，特别是其山前暖区带和浅区， 相对改善温热条件( 如小气候利用、适时适量灌溉等) 和栽培技术措施是引 种栽培散生与混生型竹类成败的关键，他把所引竹种的越冬表现、存活率作 为评价标准，初选出一批抗性竹种。同时他还对北京栽培的竹林分布情况和 它们的特点进行了研究，并提出筛选、引进新竹种时要注意筛选引进耐寒、 耐旱等竹种哺5 咱7 1 。赵好战等于1 9 9 7 2 0 0 1 年对石家庄友谊公园引种的2 1 个 竹种品种进行了生态适应性观测研究，总结出竹子在北方的栽培技术，如越 冬、春季抗风沙、越夏所需的最佳保护措施