（植物学专业论文）花生金属硫蛋白基因的克隆及ahmt2a基因的功能鉴定.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名仓勃艇 导师签字： 学位论文版权使用授权书 衍 本学位论文作者完全了解堂蕉有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权兰 撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：釜笔夕己 导师签字： 签字日期：2 0 07 年, t j 譬日签字日期：2 0 0 ，年j 月牙日 山东师范大学博士学位论文 花生金属硫蛋白基因的克隆黝h m t 2 a 基因的功能鉴定 中文摘要 重金属污染是一个重要的环境问题，研究植物的重金属耐受和脱毒机制、克 隆重金属代谢相关基因并研究其功能、利用植物修复技术清除受污染的土壤和水 体中的重金属是当前的研究热点之一。一般认为，金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n s ， m t s ) 在植物对重金属的耐受和脱毒、金属离子稳态的维持、必需金属离子的贮 藏、胁迫响应、发育调节和活性氧清除等方面发挥着作用。目前，已有多例成功 利用转基因技术过量表达m t 基因提高植物重金属抗性和重金属累积量的报道。 本实验以花生为实验材料，利用r t - p c r 技术分离到3 个编码t y p e2m t 的e d n a 克隆，通过构建花生种子e d n a 文库、大规模测序克隆到1 个t y p e2 、1 个t y p e3 和2 个t y p e 4 m t 编码基因的c d n a 序列，我们选择其中的1 个t y p e2 m t 编码基 因a h m t 2 a ( d q l 7 8 6 1 6 ) 进行了功能分析，比较了在不同重金属和其它多种胁迫处 理条件下基因的表达情况；构建原核表达载体转化大肠杆菌，测定了转化菌和对 照菌的重金属耐受性和重金属累积量；构建植物表达载体转化拟南芥，测定了转 基因拟南芥种子萌发及幼苗生长对重金属的耐受情况，主要结果如下： 1 本实验得到的4 个t y p e2m t 编码基因的e d n a 序列相似性很高，只有几个核 苷酸差异，编码8 0 或8 1 个氨基酸残基，由a h m t 2 a 和彳凇6 的核苷酸序列推 导出的氨基酸序列完全相同。a h m t 3 a 基因编码6 6 个氨基酸残基，与t y p e2m t 一样具有2 个c y s 富含结构域。2 个t y p e2m t 基因a h m t 4 a 和a h m t 4 b 的核苷酸 序列相似性也较高，编码8 2 个氨基酸残基，a h m t 4 a 和a h m t 4 b 只有5 个氨基酸 不同，都含有1 7 个c y s 残基，具有3 个c y s 富含结构域。 2 分别用3 0 0 岬o i lc d c h 、2 0 0l u n o l lz n s 0 4 和5 0 0p m o l lc u s 0 4 处理花生幼苗 1 5d ，测定不同营养器官中重金属的含量，发现镉与铜主要在花生的根部累积，锌 主要在花生叶中累积，其中根中镉的含量分别为茎和叶中的5 倍和8 倍。根中较高 的铜、镉含量与后面进行的分别用这两种金属处理后花生根中a h m t 2 a 的m r n a 含 量增加相一致，表明a h m t 2 a 可能主要与花生根中铜和镉的脱毒有关。 3 我们选择爿h m t 2 a 基因进行n o r t h e m 杂交分析。由于花生基因组中含有多个t y p e 2 仃基因，所以不能排除其它t y p e2 打基因成员参与杂交的可能性。未施加任何 胁迫时，一胁f 丁知在根、茎、叶等营养器官中都有表达，在老叶中的表达量最高， 幼叶中的表达量较低，在成熟根中检测不到一m 疗孙的表达，表明爿 m 龙基因的 表达没有明显的组织特异性。 用5 0 0l u n o l lc u s 0 4 或3 0 0i x r a o l lc d c l 2 处理花生幼苗促j 盘c a h m t 2 a 基因在根 山东师范大学博士学位论文 和叶中的表达，表明a h m t 2 a 可能在花生的根和叶中对镉、铜的代谢或脱毒过程中 发挥作用，加之花生臁因种类较多，可能不同的 4 瑾因会在不同类型的重金 属代谢或脱毒过程中发挥作用。用1 2 0 t m o b q _ 的a b a 或4 2 处理花生幼苗6h ， a h m t 2 a 基因在叶和根中的表达量都有增l j t h 用7m m o l l 的h 2 0 2 处理花生幼苗， a h m t 2 a 基因在根和叶中的表达量随着时间延长依次增加；用2 0 0m m o l l 的n a c i 处理花生幼苗，a h m t 2 a 基因在根中的表达变化不大，1 2h 时表达量略有增加， a h m t 2 a 基因在叶中表达的变化情况是：1 2h 和2 4h 处理时表达量比对照依次下降， 而后又随着时间的延长表达量比对照依次升高。由以上结果分析并结合重金属处 理后花生组织中的金属累积情况推测a h m t 2 a 可能还与活性氧的清除有关。 4 构建了原核表达载体p e t - a h m t 2 a ，并将其转化到大肠杆菌b l 2 1 中。将表达 a h m t 2 a 的大肠杆菌的蛋白提取物用1 5 的s d s p a g e 进行分析，凝胶中出现了预 想的大约l ik d a 的条带。选用p b 2 + 、c d 2 + 和c u 2 + 三种离子研究转化菌的重金属耐受 性和累积量发现，表j 盘a h m t 2 a 基因的转化菌对以上三种离子的耐受性和累积量都 高于转化- j p e t - 2 8 a 的对照菌，其中铜的累积量约为对照的5 7 倍，镉和铅的累积量 约为对照的2 倍，这些结果说n j a h m t 2 a 可能主要在铜的脱毒过程重发挥重要作用。 5 筛选过量表j 盘a h m t 2 a 基因的拟南芥，得到2 6 个纯合子株系。实验发现转基因拟 南芥种子萌发时表现出高于对照的耐受c d 2 + 和p b 2 + 的能力，但耐受c u 2 + 的程度与对 照没有明显差异；转基因拟南芥幼苗在生长过程中都表现出高于对照的耐受c d 2 、 c u 2 + 和p b 2 十的能力。我们测定了用c d 2 + 处理以后的野生型和转基因拟南芥叶片的叶 绿素含量、m d a 和f v f m ，结果发现4 h m t 2 a 基因的转化降低7 c d 2 + 对拟南芥的毒 害。在用不同成熟时期的花生种子构建的e d n a 文库中，a h 胜因的e s t s 约占总 数的0 7 ，表明a h m t 2 a 可能还与种子的发育调节有关。 本论文的主要创新点； 1 首次利用r t - p c r 技术和e d n a 文库构建技术克隆到花生金属硫蛋白基因家族 的3 类共7 个成员的c d n a 。 2 x e i a h m t 2 a 基因进行n o r t h e m 杂交，发现该基因受c u 2 + 、c a 2 + 、a b a 、4 2 热激、 1 2 0 2 和n a c i 处理的诱导，表明彳秘f 7 孙基因可能与金属脱毒和活性氧的清除有关。 3 构建了原核表达载体和植物表达载体分别转化大肠杆菌和拟南芥，转化菌表现 出较高的p b 2 + 、c a 2 + 和c u 2 + 耐受性和累积量，转基因拟南芥种子萌发和幼苗生长也 表现出高于野生型的耐受w + 署n c a 2 + 的能力。 实验结果表明a h m t 2 a 基因可能在花生的重金属脱毒和活性氧的清除中发挥 作用。本工作对于更好地理解植物m t 、更加深入地研究其功能具有一定的意义。 关键词：花生；金属硫蛋白基因：重金属：e s t 库；a h m t 2 a 分类号：q t g 山东师范大学博士学位论文 c l o n i n go fm e t a l l o t h i o n e i ng e n e s f r o ma r a c h i sh y p o g a e al a n dc h a r a c t e r i z a t i o no f a h m t 2 口 a b s t r a c t h e a v ym e t a lt o x i c i t yi so n eo ft h em a j o rp r o b l e m si nm o d e r na g r i c u l t u r e ，a n d m u c ha t t e n t i o nh a sb e e ng i v e nl a t e l yt oh e a v ym e t a lt o l e r a n c ea n dd e t o x i f i c a t i o n m e c h a n i s mo fp l a n t s 。c l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no fh e a v ym e t a lm e t a b o l i s m r e l a t e d g e n e s ，a n dp h y t o r e m e d i a t i o nb yw h i c h t or e p a i rs o i la n dw a t e rp o l l u t e db yh e a v ym e t a l s m e t a l l o t h i o n e i n s ( n i t s ) a r cg e n e r a l l yt h o u g h tt or o l ei nh e a v ym e t a lt o l e r a n c ea n d d e t o x i f i c a t i n n , m e t a lh o m e o s t a s i s ，e s s e n t i a lm e t a ls t o r a g e , p a r t i c i p a t i o ni ns t r e s s r e s p o n s e s ，d e v e l o p m e n t a lr e g u l a t i o n , a n dr o s ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) s c a v e n g i n g a f e we a s e sh a v eb e e nr e p o r t e dt h a tm t - o v e r c x p r e s s i n gp l a n t se x h i b i t e de n h a n c e dm e t a l t o l e r a n c ea n da c c u m u l a f i o mw i t hp e a n u t ( a r a c h i s h y p o g a e al c v l u h u a1 4 ) w e i s o l a t e d3t y p e2m t - e n e o d i n ge d n a s u s i n gr t p c r , a n dc l o n e d1t y p e2 ，lt y p e3 ， a n d2 , t y p e4m r - e n c o d i n ge d n a sb yc o n s t r u c t i o no fe d n al i b r a r ya n dl a r g es c a l e s e q u e n c i n g w es e l e c t e da h m w 2 a ( d q l 7 8 6 1 们t oe h a r a c t a i z ei t sf u b l ：t j o n sp r i m a r i l y b yd e t e c t i n gi t se x p r e s s i o np a t t e r n si nt h ep r e s e n c eo fd i f f e r e n tm e t a l sa n dm a n yo t h e r s t r e s sc o n d i t i o n s d e t e r m i n a t i n gh e a v ym e t a lt o l e r a n c ea n da c c u m u l a t i o no f ec o l ia n d a r a b i d o p s i st h a l i a n ao v e r e x p r e s s i n ga h m t 2 & t h e r e s u l t sw c i es h o w na sf o l l o w s ： 1 f o u rt y p e2m t - c n c o d i n gg e n e sh a v eh i g h e rh o m o l o g yi nt h es e q u e n c e so f n u c l e o t i d e sa n d 也e i rd e d u c 柚a m i n oa c i d sw i t h 8 0o r8 1r e s i d u e s a h m t 2 aa n d a h m t 2 bh a v ea ni d e n t i c a ld e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e ，a n dt h e r ei so n l yo n ea m i n o a c i dr e s i d u es u b s t i t u t i o nb e t w e e l la h m t 2 aa n da h m r 2 c a h m t 3 ac o n t a i n i n g6 6 锄抽l oa c i dr e s i d u e sh a st w oe y s t e i n e - r i e hd o m a i n sa st h o s et y p e2m t s a h m t 4 aa n d a h m t 4 be n c o d e8 2a m i n oa c i d s ，i nw h i e ho ft h e m1 7a r cc y sr e s i d u e s ，a n dt h e i r p r o t e i ns e g l u e n e e sd i f f e rf r o mo t h e rp e a n u tm t sb yh a v i n gt h r e ee y s t e i n e - r i e hd o m a i n s 2 t h er e s u l t so fa t o m i ca b s o r p t i o ns p e c l z o p h o t o m e t r yf o rd e t e r m i n a t i o no fm e t a l c o n _ t e n t si np e a n u tt i s s u e st r e a t e df o r1 5d 、】l r i t h3 0 0p m o 儿c d c l 2 2 0 0t n n o l lz n s 0 4 a n d5 0 0i 皿n o v lc u s 0 4 ，r e s p e c t i v e l y ，s h o wt h a tc 驰l i l i l na n dc o p p e ra c c u m u l a t e d m a i n l yi nr o o t s ，w h i l et h em a x i m u mz i n cc o n t e n tw a sf o u n di nl e a v e s t h ec o n t e n to f c a d m i u mi np e a n u tr o o t si sa b o u tf i v e a n de i g h t f o l do ft h a ti ns t e m sa n dl e a v e s ， r e s p e c t i v e l y t h eh i g h 盯l e v e l so fc o p p e ra n dc a d m i u mi nr o o t sc o r m s p o n d e dw e l lw i t h s i g n i f i c a n te n h a n c e m e n to fa h m t 2 am r n at r a n s c r i p ti nr o o t s ，s u g g e s t i n gt h a t 3 山东师范大学博士学位论文 a h m t 2 ap r o t e i nm i g h td e t o x i 母c o p p e ra n dc a d m i u mi nr o o t sm a i n l y 3 w ed e t e r m i n e dt h es p a t i a ld i s u i b u f i o no fa h m t 2 ae x p r e s s i o na n di t se x p r e s s i o n p a t t e mi nt h ep r e s e n c eo fv a r i o u ss 订o s s e sb yn o r t h e r nb l o t t i n ga n a l y s i s m t sa r e e n c o d e db yas m a l lg e n ef a m i l y ，a n dt h e r ea r ca tl e a s tf o u rt y p e2m tm e m b e r si n p e a n u t , s ow ec a n te x c l u d et h ep o s s i b i l i t yo fc r o s sh y b r i d i z a t i o no fo t h e rt y p e2m t g e n e si nn o r t h e r na n a l y s i s t h ee x p r e s s i o nl e v e li no l dl e a v e sw a sm u c hh i g h e rt h a n t h a ti ny o u n gs t e m s ，av e r yw e a kh y b r i d i z a t i o ns i 粤咖w a sd e t e c t e di ny o u n gl e a v e s ，b u t n oh y b r i d i z a t i o ns i g n a lw 觞d e t e c t e di nm a t u r er o o t s t h ea b o v er e s u l t si n d i c a t el e s s r e g 面c t e dt i s s u e - s p e c i f i c i t y a n di sn o ti na c c o r dw i t hw h a th a sb e e ng e n e r a l l yf o u n df o r t y p e2p l a n tm t s w h i c hs h o wa h i g h 盯e x p r e s s i o ni ns h o o t st h a ni nr o o t s t oi n v e s t i g a t ew h e t h e ra h m t 2 ag e n ee x p r e s s i o nw a sr e g u l a t e db yh e a v ym e t a l s a n do t h e re x o g e n o u sf a c t o r s ，n o r t h e r nb l o ta n a l y s i sw a sp e r f o r m e d _ t r e a n 】a e n t sw i t h 5 0 0i m a o l lc u s 0 4o r3 0 0g m o t lc d c l 2s t i m u l a t e dt h ee x p r e s s i o no f a h m t 2 ai nr o o t s a n dl e a v e s ，i n d i c a t i n gt h a ta h m t 2 a m a yf u n c t i o ni nt h em e t a b o l i s ma n dd e t o x i f i c a t i o n o f c a d m i u ma n dc o p p e r , a n dm a y b ed i f f e r e n tm t sp l a ys p e c i f i cr o l e si nd i f f e r e n tm e t a l s w h e nt r e a t e dw i t h1 2 0g m o l la b a o r4 2 f o r6h ，m r n aa c c u m u l a t i o no f 爿 朋7 z k i nl e a v e sa n dr o o t si n c r e a s e d s e v e nm m o l lh 2 0 2i n d u c e dt h ee x p r e s s i o no f a h m t 2 a g r a d u a n y f u r t h e r m o r e t h ee x p r e s s i o no fa h m t 2 ag e n ei nl e a v e sc a na l s ob ei n d u c e d b y2 0 0m m o l ln a c lw h e nt r e a t e df o r2 4h b u tm r n aa c c u m u l a t i o ni nr o o t se x h i b i t e d d oo b v i o u sc h a n g e o nt h eb a s i so f a b o v er e s u l t s ，w ep r o p o s et h a ta h m t 2 ap r o t e i nn o t o n l yf u n c t i o ni nd e t o x i f y i n gh e a v ym e t a l s ，b u tm i g h ta l s ob ei n v o l v e di ns c a v e n g i n go f r o s 4 i nt h ep r e s e n ts t u d y 虢c o n s u - a c t e dap r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r , p e t - a h m t 2 a , a n du a n s f o r m e di ti n t oec e l l n 他p u r i f i e dp r o t e i na n dt o t a lc e l le x t r a c t sw e r e a n a l y z e db y1 5 s d s p a g e ，a n da h m t 2 a f u s i o np r o t e i ns h o w e da l le x p c c t l x lr e l a t i v e m o l e c u l a rm a s so f - 11k d a ec o l ie x p r e s s i n ga h m t 2 ae x h i b i t e de n h a n c e dt o l e r a n c e t oc a d m i u m , c o p p e ra n dl e a ds i g n i f i c a n t l y , a n dm e t a la c a 哪u k 血i nb a c t e r i aw a sa l s o h i g l l e rt h a nt h ec o n t r 0 1 c o p p e ra c c u m u l a t i o nw a sa p p r o x i m a t e l y5 7 一f o l dg r e a t e rt h a n t h a ti nc e l l sc o n t a i n i n gt h ee m p t yv e c t o rp e t 2 9 a ( + ) ，g a d m i u l l la n dl e a da c c u m u l a t i o n b yec o l ie x p r e s s i n gr e c o m b i n a n ta h m t 2 aw a sa b o u t2 - f o l dg r e a t e rt h a nt h a ti n c o n t r o lc e l l s t h e s er e s u l t si n d i c a t e ( h 砒a 1 1 m t 2 am i g h tp l a ys i g n i f i c a n tr o l e si nc o p p e r d e t o x i f i c a t i o n 5 w ei n t r o d u c e dp r o k - a h m t 2 ai n t oa r a b i d o p s i st h a l i a n aa n do b t a i n e d2 6 t r a n s f o r m a n t s s e e dg e r m i n a t i o no ft r a n s g e n i ep l a n t se x h i b i t e dh i g h e rt o l e r a n c et o 4 山东师范大学博士学位论文 c a d m i u ma n dl e a dt h a nt h ec o n t r o l 。b u ti t st o l e r a n c et oc o p p e rw a sn o to b v i o u s w b e r t r e a t e dw i t hc d 2 + ，c a 2 + a n dp b 2 + ，r e s p e c t i v e l y , s e e d l i n g so ft r a n s g e n i cp l a n t ss h o w e d i n c r e a s e dt o l e r a n c et h a nt h ec o n t r 0 1 f u r t h e r m o r e ，w ed e t e r m i n e dt o t a lc h l o r o p h y l c o n t e n t , m d a ，a n df 们mi nt r a n s g e n i ca n d 、v i d ct y p ea r a b i d o p s i sp l a n t st r e a t e d 、v i t l ： c d 1 1 地r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fa h m t 2 ag e n ei na t h a l i a n ae n h a n c e d t o l e r a n c et oc + ，b e c a u s et h e r ea r em o r et h a n0 7 m t e n c o d i n ge s t sj nt h ec d n a l i b r a r yc o n s t r u c t e dw i t hp e a n u ts e e d sc o l l e c t e df r o md i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s w t s u p p o s et h a ta h m t 2 am a ya l s ob er e l a t e d 诵t ht h er e g u l a t i o no fs e e dd e v e l o p m e n t t h ei n n o v a t i o n so f t h i sd i s s e r t a t i o nc a nb e 翻n m a r i z e d 勰f o l l o w s ： 1 i tw a st h ef i r s tt i m et oi s o l a t e 埘丁g e n e sf r o mp e a n u tu s i n gr t - p c ra n de d n a l i b r a r y w eo b t a i n e d3t y p e s ，7m e m b e r so f p e a n u tm t - e n c o d i n ge d n a 2 w ec h a r a c t e r i z e dt h ef u n c t i o n so f 彳棚4 乃g e n e n o r t h e r na n a l y s i ss h o w e dt h a tt h t e x p r e s s i o no f 4 仍口w a si n d u c e db yc u 2 + ，c d 2 + ，a b a ，b e a ts h o c k , h 2 0 2 ，a n dn a c l i n d i c a t i n gt h a ta h m t 2 am a yb er e l a t e dw i t l lm e t a ld e t o x i f i c a t i o na n ds c a v e n g i n go l r o s b o 3 w ec o n s t r u c t e dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e e r ) r , a n dt r a n s f o r m e di ti n t oec o l i t h e t r a n s f o r m a n t s d i s p l a y e dh i g h e rt o l e r a n c e t op b 2 + 、c d 2 + ，a n dc u 2 + a n dm e t a l a c c u m u l a t i o n sw e r ea l s oh i g h e rt h a nt h a ti nc o n t r 0 1 m o r e o v e r , w ei n t r o d u c e d 彳 仉d g e n ei n t oa t h a l i a n a ，s e e dg e r m i n a t i o na n ds e e d l i n gg r o w t ho ft r a n s g e n i cl i n e so ft 2 s h o w e de n h a n c e dt o l e r a n c et op b 2 + ，c d 2 + ，a n dc t h a nw i d et y p ep l a n t s i 一 a l lr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a ta h m t 2 am a yb e i n v o l v e di n h e a v ym e t a l d e t o x i f i c a t i o na n dr o ss c a v e n g i n g t 1 1 i sw o r kw i l lc o n t r i b u t et oab e t t e ru n d e r s t a n d i n g o f p l a n tm t sa n dh e l pt of u r t h e ra n a l y z et h ef u n c t i o n so f t h e s eg e n e s k e yw o r d s ：p e a n u t ；m e t a l l o t h i o n e i ng e n e ；h e a v ym e t a l ；e s tl i b r a r y ；a m t 2 a c a t e g o r y ：q 7 s 5 山东师范大学博士学位论文 第一部分文献综述 随着工农业生产的发展，三废排放、城市污水及垃圾处理不当、采矿、汽车 尾气排放以及农药和化肥的施用等导致土壤、水体和大气的急剧污染，其中重金 属引起的污染已成为全球性的环境问题。目前，我国受镉、砷、铅等重金属污染 的耕地面积己达2 0 0 0 万公顷，每年因重金属污染导致的粮食减产超过1 0 0 0 万吨， 每年被重金属污染的粮食达1 2 0 0 万吨，由此造成的经济损失至少为2 0 0 亿元f l l 。 近年来，人们在对环境重金属污染的危害、植物耐受重金属污染的细胞及分子机 理、环境重金属污染的生物修复尤其是植物修复方面的研究进行了积极的探索， 取得了许多重要的成果。 1 重金属污染及其危害 重金属是指密度大于4 或5 的金属，共约4 5 种，包括铜、铅、锌、铁、钴、 镍、锰、钛、汞、镉、钼、金、银等，其中锰、铜、锌等元素是生命活动所必需 的，其余都是非必需元素，非必需元素和超过一定浓度的必需元素对生物都是有 毒的。重金属进入土壤或水体底泥后可以不断积累，很难被清除，有些重金属( 如 镉) 不是植物生长的必需元素，但在土壤中具有较强的移动性，容易被植物吸收， 并可能通过富集作用进入食物链，从而影响人类健康和生态系统的功能1 2 1 。重金 属对植物产生毒害的途径有两条，一是大量重金属离子进入植物体后干扰离子间 原有的平衡系统，造成正常离子的吸收、运输、渗透和调节等方面的障碍，从而 使代谢紊乱；二是重金属进入细胞后，不仅与蛋白质、核酸和酶等大分子物质结 合，而且还可能取代这些物质正常行使功能所必需的某些特定的活性金属离子， 使其变性或者活性下降删。重金属对植物的影响包括从种子萌发到其后的各个生 长发育阶段的多个生理过程，导致植物生长受抑制、发育异常甚至中毒死亡，这 种毒性作用可能是由于金属和蛋白中的巯基结合导致活性抑制或结构破坏，也可 能是由于蛋白中的关键元件被取代造成缺陷影响【4 】。还可能是由于金属离子对植 物代谢施加了渗透胁迫、离子胁迫以及由此引发的一系列次级胁迫，如营养失衡 和大量自由基、活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 造成的氧化胁迫等同，这 些作用严重干扰植物体内业已存在的细胞及整株水平上的水分及离子稳态，造成 植物细胞分子的损伤。李伟强等铡定了h g 、c d 、c a 和p b 等单一重金属对拟南芥 种子的发芽和幼苗生长的影响，发现随着重金属浓度的升高，拟南芥种子发芽与 幼苗生长都明显受到抑制，而且重金属对幼苗生长的毒性大于对种子发芽的毒性， 例如1 0m m o l l 的c u 2 + 对种子发芽没有影响，而o 。0 1 m m o f l 的c u 2 + 已经明显抑制 幼苗的生长。以抑制种子发芽的i c 5 0 ( 抑制达5 0 时的浓度，i n h i b i t i o n c o n c e n 血- a f i o n ) 为指标，4 种重金属的毒性顺序为h 9 2 + ： c d 2 + p b 2 + c u 2 + ，以幼苗生 山东师范大学博士学位论文 长为指标，则毒性顺序为c u 2 + h 9 2 + c d 2 + n , b 2 + ，随着胁迫时间延长，种子萌发率 下降。此外，不同重金属在不同发芽时段对种子的毒性也不尽相同，c d 2 + 的毒性在 种子吸水后的o 1 2 h 大于1 2 2 4 h 的，而h 矿的毒性1 2 2 4 h 时的大于0 - 1 2 h 时的， 其中种皮对减轻重金属毒性起着十分重要的作用 6 1 。 各种重金属在植物体内都有一定的自然含量( 背景值) ，由于各地区环境中 重金属背景值不同，不同植物又具有各自的生物学特性，对重金属的吸收能力不 同，所以不同地区的同种植物或同一地区的不同植物中重金属的自然含量往往具 有明显的差别，只有当体内积累的重金属含量超过其最大耐受剂量时，植物才表 现出明显的受害症状或其它效应。但有些植物对某些重金属的忍耐能力很强，其 体内积累的大量重金属一旦通过食物链进入人或畜禽体内，会对人畜造成伤害。 重金属对植物的危害是在植物自身及多种环境因素的综合作用下产生的，即使是 同种金属元素、同样的浓度，在不同的环境条件下，对植物的危害也会表现出明 显的差异。重金属对植物的危害除了与植物种类有关外，还与重金属的性质和形 态、不同重金属间的相互作用以及土壤的理化性质等有关影响重金属对植物危 害的各种因素在环境中往往同时并存，不同元素之间又存在着相互影响、相互制 约的复杂关系，在了解或研究重金属对植物的危害时，需要全面考虑这些因素的 影响。重金属可以直接进入大气、水体和土壤，造成各类环境要素的直接污染， 也可以在大气、水体和土壤中相互迁移，造成各类环境要素的间接污染。由于重 金属不能被微生物降解，在环境中只能发生各种形态之间的相互转化，因此，重 金属污染的消除非常困难。造成环境污染的重金属主要是指汞、镉、铅、铬、具 有重金属特性的类金属砷以及锌、铜、钴、镍等，土壤中的重金属主要来源于冶 金、电镀、制碱、石油、化工、农药和交通运输等行业( 表1 ) 表1 土壤重金属污染的主要来源 t a l b e1t h em a j o rs o l i i c e so f h e a v ym e t a l si ns o i l 8 来源 污染物 矿产开采、冶炼及加工排放的三废 煤和石油燃烧过程中排放的飘尘 电镀工业废永 塑料、电池、电子工业排放的废水 燃料、化工制革工业排放的废水 汽车尾气 农药、化肥 c r 、h g ，a s 、p b 、n i 、m o c r 、h g 、a s 、p b 等 c r 、c d 、n i 、p b 、c u 、z n 等 h g 、c d 、p b 、n i 、z n c r 、c d p b a s 、c u 、c d 山东师范大学博士学位论文 大气、水体和土壤等环境中的重金属均可通过呼吸道、消化道和皮肤等多种 途径被动物吸收，图l 表示的是重金属在农田系统中韵生态循环途径。当重金属 在动物体内积累到一定程度时，即会直接影响动物的生长发育，生理生化机能， 直至引起动物死亡，影响和危害的程度可能因动物的种类、重金属的性质以及环 境条件的不同而不同。动物体内的重金属达到一定剂量时会对动物的各个发育阶 段产生影响，尤其对幼体的影响更为明显，其影响程度与重金属的毒性和剂量、 环境条件及动物种类等有直接关系。动物受到重金属的危害时，多数都是几种元 素同时起作用，当两种或两种以上的元素同时作用于机体时，一种元素对另一种 元素的正常效应会产生干扰。这种干扰作用称为复合作用，复合作用可以表现为 相乘、相加或拮抗效应。 图1 农田系统重金属循环 f i g 1c i r c u l a t i o no f h e a v ym c t a l si i lf a r m l a n de c o s y s t e m 2 高等植物耐受重金属胁迫以及超积累的细胞机制 吕前，研究植物耐受重金属台勺分子机理、利用转基因技术改良植物的重金属 抗性、对重金属污染的水体及土壤进行植物修复是一个热点。很多植物在长期的 进化过程中形成了独特的驱避、吸收和富集重金属的控制和反应机制，可以在对 其它植物而言是有毒的环境中正常生存， 属浓度，正常地生长繁殖并完成生活史， 有些植物不仅能够耐受较高的环境重金 还能够在体内积累远远超过环境重金属 含量的超寻常高浓度的重金属 7 1 。植物对重金属的耐性和积累的物种特异性很强， 根据植物对重金属的吸收、转移和积累机制将植物分为积累型( 超积累型) 、指 示型( 敏感型) 和排斥墅3 类。超积累植物建指对重金属的吸收量超过一般植物1 0 0 倍以上的植物，积累的铬、钴、镍、铜、铅的含量一般在1 0m g 倌( 干重) 以上， 9 山东师范大学博士学位论文 积累的锰、锌含量一般在1 0m g g ( 干重) 以上。多数超积累植物都生长在金属富 集的土壤上，同时具有金属耐性的特征i b l ：但也有一些重金属超积累植物在正常 土壤中也有分布并且具有金属耐性，表明重金属超积累特性与耐性至少在一定程 度上是由不同基因控制的。至今，植物重金属耐性与重金属超积累之间关系的分 子机理还没有完全弄清楚。 对许多非重金属超积累植物在金属胁迫下的生理和分子机理的研究也在进行 中，这些植物的金属耐性基因的克隆和功能鉴定对于污染土壤的植物修复的研究 意