（微生物学专业论文）枯草杆菌b1⑥菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究.pdf

童州大学 2 0 0 8 届硕士学位论文枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 摘要 本文依据微生物培养基选择和配制的工业发酵生产原则，对b a c i l l u ss u b t i l i s b l 菌 株工业化产多糖发酵条件做了系统研究。通过单因素实验、正交实验以及不同发酵条件 实验对b a c i l l u ss u b t i l i sb l 产多糖量进行比较，发现在微生物生长发育过程和生物合成 过程中，培养基中碳氮的比例( c n ) 在发酵工业中非常重要，同时还需要添加大量元 素和微量元素，如镁、硫、磷、钾、锰等来促进微生物的生长。结果表明：b a c i l l u ss u b t i l i s b l 菌株工业化产多糖发酵过程中，培养基组成对多糖发酵有重要影响；实验确定了该菌 株多糖发酵的最佳培养基配方及发酵条件。 从发酵液中提取b a c i l l u ss u b t i l i s b l 胞外多糖，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和纤维素 阴离子交换色谱发现：多糖纯度较高。用纸层析和g c 对多糖进行组分分析，结果表明： 含量较高的组分为葡萄糖和阿拉伯糖。g c 结果还表明：多糖具有标样中出现的7 种单 糖成份鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、岩藻糖，但由于含量较少， 纸层析只有两个显色斑，无法显色其他成分。说明多糖可能由一种高含量的葡萄糖、阿 拉伯糖和其他成分组成。 在b a c i l l u ss u b t i l i sb i 胞外多糖功能活性研究方面，通过小鼠游泳实验，发现该 菌胞外多糖对抗疲劳能力有一定增强作用；其次，多糖浓度为1 0 0 p g m l 的溶液能够有 效地抑制肿瘤细胞生长，引起其凋亡；通过抗肿瘤实验进一步验证：该菌胞外多糖具有 一定的抗肿瘤能力。 关键词：枯草芽孢杆菌； 胞外多糖；发酵；组分；免疫活性； 名州大学 2 0 0 8 届硕士学位论文枯草杆菌b i 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 a b s t r a c t a c c o r d i n gt ot h ep r o d u c t i o np r i n c i p l eo ft h es e l e c t i o na n dc o m p o u n do fm i c r o b i o l o g i c o p t i m u mm e d i u m ，t h ep o l y s a c c h a r i d ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o ni nt h ep r o d u c t i o no fb a c i l l u s s u b t i l i sb i s y s t e m a t i c a l l y t h r o u g ht h eq u a n t i t a t i v ec o m p a r i s o no ft h ee p s ，p r o d u c e di n b a c i l l u ss u b t i l i sb j u n d e rt h ec o n d i t i o n so ft h es i n g l ee l e m e n t , o r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n d v a r i e df e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n t , c ni sv e r yi m p o r t a n ti ni n d u s t r yp r o d u c t i o nd u r i n gt h e g r o w t ho f t h em i c r o b i o l o g ya n dc o m p o u n d i n go ft h eb i o l o g y m e a n w h i l e ，i th a sf o u n dt h a ta l o to fd e m e n t , b o t hm a c r oa n dm i c r o ，s h o u l db ea d d e d ，s u c ha sm g , s ，只ka n dm n , t o p r o m o t et h eg r o w t ho fm i c r o b i o l o g y t h ec o n c l u s i o ns h o w st h a tt h ec o m p o n e n t sh a v eg r e a t i m p a c to np o l y s a c c h a r i d of e r m e n t a t i o ni nb a c i l l u ss u b t i l i sb i p r o d u c t i o n t h ee x p e r i m e n t i se x r t a i no ft h eo p t i m u mm e d i u ma n di t sf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no ft h ep o l y s a c c h a r i d e f e r m e n t a t i o n t h ep u r i t yo fb a c i l l u ss u b t i l i sb l p o l y s a c c h a r i d ei sr e l a t i v e l yh i g l lt h r o u g ht h e d e - 5 2o ft h ep a g ea n df i b r i na n i o nd u r i n gt h ep r o c e s so fe x t r a c t i n gt h e e x o p o l y s a c c h a r i d e i nt h ef e r m e n t a t i o nl i q u i d a n a l y z i n gt h ep o l y s a c c h a r i d eb yp a p e rc h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i s a n dg c ，i ts h o w st h a tt h eg r o u po fh i g h e rp u r i t yc a nb ed i v i d e di n t og l u c o s ea n da r a b i n o s e i ta l s os h o w st h a tt h e ma r e 骶：v 髓c o m p o n e n t s ，w h i c ha p p e a r si nt h es p e c i m e n , r a f f i n o s e , g a l a c t o s ea n da r a b i n o s e ，x y l o s e , m a n n o s ea n df u e o s e b u tt h e r ea r eo n l yt w os p o tb e c a m eo f l o wq u a n t i t y t h a ts h o w st h a tp o l y s a c c h a r i d ep r o b a b l yc o n s i s t so fg l u c o s eo fh i g h e rp u r i t y , a r a b i n o s ea n ds o m eo t h e rc o m p o n e n t s f r o mt h ef u n c t i o n a ls t u d yo fb a c i l l u ss u b t i l i sb s ，e x o p o l y s a c c h a r i d e ，i th a sf o u n d t h a ti no n eh a n d ，i th a ss o m ee f f e c t so i la n t i - f a t i g u e ；i nt h eo t h e rh a n d ，t h ep o l y s a c c h a r i d e c o n c e n t r a t i o no flo o l t g m lc a nr e s t r a i nt h eg r o w t ho fc e i l se f f e c t i v e l ya n dc a u s et h ed e a t ho f t h e m e x p e r i m e n t si n d i c a t et h a tt h ep o l y s a c c h a r i d eh a ss o m ee f f e c to na n t i t u m o r k e y w o r d ：b a c i l l u ss u b t i l i s ，e x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e ( e p s ) ，f e r m e n t a t i o n ，c o m p o n e n t s , i m m u n ef u n c t i o n 2 奄纠大学 2 0 0 8 届硕士学位论文 枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 附：学位论文原创性声明和关于学位论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究在做出重要 贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：型篷幺必 日 期：2 q q 监乏月 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保 存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：之幽导师签名： 埠l 日 期： 凿州大学 2 0 0 8 届硕士学位论文枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 刚吾 多糖是一类具有储藏能量、结构支持和抗原决定性等多种生物功能的有机化合 物，是除核酸和蛋白质之外另一类重要的生命物质。在自然界高等植物、藻类、细菌 及动物体内均有存在，分布极广。 1 1 多糖的介绍 多糖( p o l y s a c c h a r i d c s ) hl o 个以上单糖分子聚合而成，通常由几百甚至几千个单 糖分子组成。由一种单糖组成的多糖，称为均多糖( h o m o s a c c h a r i d e ) ，通式为 ( c 1 1 h 2 0 - 2 0 d - 1 ) x ，x 可至数千。由二种以上不同的单糖组成的多糖，称杂多糖 ( h e t e r o s a c c h a r i d e ) 。在多糖结构中除单糖外，还含有糖醛酸、去氧糖、氨基糖与糖醇等， 且可有别的取代基。 多糖按功能可分为两类，一类是不溶于水的动植物的支持组织，如植物中的纤维 素，甲壳类动物中的甲壳素等，另一类为动植物的储藏养料，可溶于热水形成胶状溶 液。随着科学技术的发展，不少多糖的生物活性被发掘并用于临床，如刺五加多糖、 灵芝多糖、黄精多糖、黄芪多糖都可促进人体的免疫功能，香菇多糖( 1 饥t i n a n ) 具抗癌 活性，鹿茸多糖可抗溃疡等。 多糖性质已大大不同于单糖，大多为无定形化合物，无甜味和还原性，难溶于水， 在水中溶解度随分子量增大而降低，多糖被酶或酸水解，可产生代聚糖或单糖。 常见的多糖化合物有以下几种： 1 淀粉( s t a r c h ) 为d 葡萄糖的高聚物，通式为( c 6 h l 0 0 5 ) n 。淀粉是植物体内贮藏的 营养物质，具有一定的形态，通常为白色颗粒状粉末，不溶于冷水、乙醇及有机溶剂， 在热水中形成胶体溶液，可被稀酸水解成葡萄糖，也可被淀粉酶水解成麦芽糖。 按淀粉的结构可分为两类：类是胶淀粉( a m y l o p e c t i n ) ，又称淀粉精，位于淀粉 粒外周，约占淀粉的8 0 。胶淀粉为支链淀粉，由1 0 0 0 个以上d 葡萄吡喃糖以a 1 , 4 连接，并带有a 1 , 6 连接的支链，分子量5 万一- l o 万，在热水中膨胀成粘胶状，遇碘 液呈紫色或红紫色。另一类为糖淀粉( a m y l o s o ，又称淀粉糖，位于淀粉粒中央，约占 淀粉的2 0 。糖淀粉为直链淀粉，由约3 0 0 个d 一葡萄吡喃糖以a 1 , 4 连接而成，分子 量l 万 - - - 5 万，可溶于热水，遇碘液显深蓝色。淀粉通常无明显的药理作用，大量用 作制取葡萄糖的原料，在制剂中常作为赋形剂、润滑剂或保护剂。淀粉粒的形态结构 是生药显微鉴定的特征之一。 腐州大学 2 0 0 8 届硕士学位论文 枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 淀粉常用碘液反应来鉴定，即淀粉遇碘液呈蓝紫色，加热后蓝色消失，冷却后蓝 紫色复现。 2 菊糖( i n u l i n ) 为约3 5 个d 果糖以b - 2 ，l 连接而成，最后接d 一葡萄糖。这种果 聚糖广泛分布于菊科和桔梗科植物中。菊糖溶解于细胞液中。遇乙醇可形成球状结晶 析出。能溶于热水，微溶或不溶于冷水，不溶于有机溶剂，遇碘液不显色。常用于肾 功能检查。菊糖的形态结构可作为生药显微鉴定的特征之一。 3 树胶( g u m ) 为高等植物干枝受伤或受菌类侵袭后自伤口渗出的分泌物，在空气 中干燥后形成半透明的无定形固体。树胶的形成是由于细胞壁、细胞内含物质受酶的 作用分解变质( 树胶化) 所致。主要分布于蔷薇科、豆科、芸香科与梧桐科等多种植 物。 树胶是一种有分支结构的杂多糖，水解后产生l - 阿拉伯糖、l 鼠李糖、d 葡萄糖 醛酸等。糖醛酸常与钙、镁、钾结合成盐。 树胶在水中膨胀成胶体溶液，不溶于有机溶剂，与醋酸铅或碱式醋酸铅溶液产生 沉淀。 常见的树胶有阿拉伯胶( a c a c i a ) 、西黄芪胶( t r a g a c a n t h ) 、杏胶、桃胶等，主要用作 制剂的赋形剂、混悬剂、粘合剂和乳化剂。 4 粘液质( m u c i l a g e ) 为存在于种子、果实、根、茎的粘液细胞和海藻中的一类粘 多糖，是保持植物水分的基本物质，是植物正常的生理产物。如车前子胶( p l a n t o s a n ) 是车前种子中的粘液质。 粘液质的组成与树胶相似，多为无定形固体。在热水中形成胶体溶液，冷后成冻 状j 不溶于有机溶剂，可与醋酸铅溶液产生沉淀。 5 粘胶质( p e c t i cs u b s t a n c e ) 为高等植物细胞间质的构成物质。如果胶( p e c t i n ) 是由d 半乳糖醛酸a 1 ，4 连接而 成的直链化合物，具止泻作用。 6 纤维素( c e l l u l o s e ) 与半纤维素( s e m i c e l l u l o s e ) 纤维素为b 1 , 4 相连的直链葡聚 糖，半纤维素为酸性多糖，它们与木质素共同组成细胞壁。 7 动物多糖 ( 1 ) 肝糖元；( g l y c o g a n ) ：是动物的贮藏养料，存在于肌肉与肝脏中。其结构与胶淀 粉相似，遇碘液呈红褐色。 庸纠丈学 2 0 0 8 届硕士学位论文枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 ( 2 ) 甲壳素( c h i t i n ) ：是组成甲壳类昆虫外壳的多糖。其结构与纤维素类似，不溶 于水，对稀酸和碱都很稳定。甲壳素的水解产物葡萄糖胺是重要的合成原料。 ( 3 ) 肝素( h c p a r i n ) = 主要存在于肝与肺中，为高度硫酸酯化的左旋多糖。有很强的 抗凝血作用，用于防治血栓形成。 ( 4 ) 硫酸软骨素( c h o n d r o i t i ns l l l g a t e ) - 为动物组织的基础物质，用以保持组织的水 分和弹性，也是软骨的主成分。它与肝素相似，在动物体内与蛋白质结合而存在。具 有降低血脂活性。 ( 5 ) 透明质酸( h y a l u r o n i ca d d ) ：为酸性粘多糖，存在于眼球玻璃体、关节液、皮 肤等组织中作为润滑剂，并能阻止微生物的入侵。 1 2 多糖的研究概况 对多糖的研究，最早要追溯到1 9 世纪末。1 8 9 1 年，德国著名科学家e m i lf i s c h e r 发现了d 型葡萄糖的结构，标志着现代糖类化学的开始【4 5 】。随着科学技术的不断发 展，人们对糖类的研究也不断取得进步，但由于糖类的结构比核酸和蛋白质复杂得多， 且早年发现糖类的功能比较单调，不易深入，致使糖类的发展远远落后于蛋白质和核 酸，直到m a r g a n 、k a b a t 等人确定了a b o 血型抗原的决定因素是寡糖链上非还原末端 的糖基。在2 0 世纪4 0 年代，其中研究得最多的是从细菌中得到的各种荚膜多糖，它 在医药上主要用于疫苗。但多糖作为广谱免疫促进剂而引起人们的极大重视则是在2 0 世纪6 0 年代。7 0 年代开始糖领域的第一次革命，建立了多种用高精密仪器的化学测 定法以及巧妙简便而精确的用内切和外切糖音酶类测定糖结构的技术，揭示出糖链惊 人的多样性、复杂性和微不均一性。8 0 年代末的第二次革命是将合成糖链的糖基转移 酶克隆成功，可以解释糖链多样性的由来【4 】。1 9 8 4 年，苏联人在荷兰召开的第十二次 国际碳水化合物讨论会上报道两全合成特定结构的荚膜多糖做疫苗，受到与会者的极 大兴趣。尔后，有关真菌多糖的研究更为深入和广泛，如酵母菌多糖、食用菌多糖， 特别是食用菌多糖的研究，报道数量高，其中以香菇多糖研究得较清楚。1 9 8 8 年，牛 津大学生化系的d w e k 教授在当年的a n n u a lr e v i e wo fb i o c h e m i s t r y 上，发表了题为 g l y c o b i o l o g y 的综述，提出了糖生物学这一名称，标志着- - f l 新的分支学科的诞生【2 】。 1 9 9 0 年1 1 月，三个实验室同时发现了血管内皮细胞白细胞粘附分子1 ( e e a m 1 ) ， 后改称e 选择蛋白( e s e l e c t i o n ) ，并首次阐明了炎症的过程有糖类和相关的糖结合蛋白 参与，这一重大事件将糖生物学推向了生命科学的前沿 1 9 】，1 9 9 3 年5 月，在首届国 绩纠大学 2 0 0 8 届硕士学位论文 枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 际“糖工程”年会上，著名的糖生物学家、会议主席h a r t 宣称：生物化学中最后一个“巨 大前沿”糖生物学的时代正在加速到来! 这些事件标志着生命科学中又一门新的前沿分 支学科一糖生物学的兴起【1 9 】。1 9 9 5 年，c u r r e n to p i n i o no ns t r u c t u r eb i o l o g y 的主编 f e i z i 为当年的“糖类和糖复合物专题加上了副标题“寡糖配体和糖结构数据库时代 己经来临。同年3 月，亚洲分子生物学组织( a m b o ) 在日本举办了“糖生物学和糖 工程 的培训班。这预示了糖生物学的时代已经来临。 目前，多糖类物质的研究已成为继蛋白质、核酸之后的另一个分子生物学、医学 以及食品科学等领域的研究热点【4 9 】。近1 0 年来由于多糖以及糖缀合物的分离纯化、 组分测定和结构分析有了长足进步。发现糖类化合物特别是糖缀合物上的糖链参与了 各种生命现象的调节，如细胞识别、粘连与融合、信号传导、免疫与应答、细胞转化 和分化都离不开糖链的参与【3 7 】。糖蛋白中的糖链部分常会影响其分子构型以及生物活 性，具有不可取代的重要作用【3 】。发达国家纷纷成立以糖( g l y c o - - ) 命名的公司，集 中人力物力致力于糖类物质的研究。作为肿瘤、糖尿病、抗病毒等的治疗药物，或手 术辅助药物，多种多糖产品已进入临床试验阶段。但是由于多糖结构十分复杂，所携 带的信息量大大超过肽链和核苷酸，人们对其功能还未认识清楚。 1 3 多糖的生物活性 多糖广泛存在于动物、高等植物、微生物( 细菌和真菌) 及海藻等机体中。近几十 年来，人们从提取的多糖发现其具有非常重要与特殊的生理活性，也具有免疫调节功 能，如多糖能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗a i d s 病毒【2 0 】：还具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂作用；促进核酸与蛋白质 的生物合成作用；能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老，而且多糖作为药 物其毒性极小，因而多糖的研究已引起人们的极大兴趣。目前人们已成功地从近百种 植物中提取出了多糖并广泛地用于医药和保健食品的研究和开发中。植物多糖研究得 比较深入的是稻草多糖、麦秸多糖、竹多糖、黄芪多糖、刺五加多糖【l 】。 1 3 1 免疫调节、抗肿瘤功能 就多糖的抗肿瘤作用而言，可将抗肿瘤多糖分为两大类：一类是具有细胞毒性的 多糖直接杀死了肿瘤细胞，这类多糖有牛膝多糖、茯苓多糖、刺五加多糖、银耳多糖、 香菇多糖、芸芝多糖等；第二类抗肿瘤活性多糖是作为生物免疫反应调节剂通过增强 机体的免疫功能而间接抑制或杀死肿瘤细胞的，如能促进l a k 、自然杀伤细胞( n k ) 境，i 大学 2 0 0 8 届硕士学位论文 枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 活性、诱导巨噬细胞产生肿瘤坏死因子的多糖，具有抗肿瘤活性的多糖大多是通过这 种途径起作用的，即具有宿主介导抗肿瘤活性。如柴胡多糖、淫羊藿多糖、紫松果菊 多糖等能激活体内的巨噬细胞功能，进而抗肿瘤；女贞子多糖、商陆多糖等能增强细 胞免疫功能；波叶大黄多糖、板蓝根多糖等对体液免疫有促进作用。人参多糖有显著 增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能，激活网状内皮系统( r e s ) 。人参多糖对实验性小鼠肿 瘤有明显的抑制作用。枸杞多糖能增强正常小鼠的t 细胞介导的免疫反应及自然杀伤 细胞( n k 细胞) 活性，还能提高小鼠白细胞介导素2 ( i l - 2 ) 的产生，而使老龄小鼠 产生i l - 2 的能力提高到正常水平。另外，海带及藻类多糖也具有增强免疫、抗肿瘤作 用 5 ，3 2 。 1 3 2 降血糖功能 近几年许多人对多糖降血糖的功能有很多的研究。薛惟建等人研究了昆布多糖及 褐藻淀粉对小鼠实验性高血糖的防治作用，注射后小鼠血糖水平明显降低。日本k o n n o 等人从朝鲜白参、中国红参和日本白参分离到2 1 种人参多糖，均有降血糖作用。黄芪 多糖对血糖及肝糖原含量影响的研究发现黄芪多糖具有双向调节血糖的作用。彭红等 人研究发现南瓜多糖能提高动物对高糖的耐受力；且与胰岛素有很好的协同作用；它对 正常动物血糖的影响不明显。百合多糖降血糖能修复b 胰岛细胞、增强分泌胰岛素功 能和降低肾上皮质激素分泌，以及促进肝脏中血糖转化为糖原的联合作用，从而使血 糖降低，对治疗糖尿病有显著的效果。枸杞多糖对实验性糖尿病兔有明显的降血糖作 用，有效率达1 0 0 ，且对正常小鼠血糖无影响 3 33 。 1 3 3 清除自由基、抗衰老功能 自由基被认为是人体衰老和某些慢性病发生的原因之一。当人体内的自由基产生 过多或清除过慢，就会攻击各种细胞、器官并使之受到损伤，加速机体的衰老过程并 诱发各种疾病。在众多自由基中，羟基自由基是最活泼的，其反应速度快，是对机体 危害最大的自由基，超过了0 2 和0 2 两种活泼性氧自由基。陈群等人研究发现人参多 糖具有抗衰老作用；在黄芪多糖抗衰老的实验中发现，黄芪多糖可明显降低大鼠血浆 中过氧化脂质的含量，并可使脾脂褐素颗粒分布和凝集力随黄芪多糖的剂量增加而减 少，显示黄芪多糖具有抗衰老作用；枸杞多糖能显著缩短果蝇从卵到蛹以及卵到成虫 的发育期，并能显著提高小鼠和果蝇的平均寿命。它能有效对抗自由基过氧化，使受 损膜电学功能发生逆转，是其抗衰老的原因之一。莲子多糖提取液具有较好的清除羟 凿州大学 2 0 0 8 届硕士学位论文 枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 基自由基( o h ) 的功效，最高清除率可达2 9 1 。提取液体积在0 5 - 4 5 m l 之间时， 其清除o h 能力随体积增加而增加，即呈正相关关系。芦荟多糖有清除体内0 2 。、o h 及h2 0 2 的自由基功能，间接地达到抗衰老作用。枸杞多糖可以提高小鼠心、肝、肺组 织超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a = r ) 、总抗氧化能力( t - a o c ) 活性，进 而具有延缓衰老活性 6 。 1 3 4 抗氧化、抗疲劳功能 丙二醛( m d a ) 是反映机体脂质过氧化损伤的重要指标，具有很强的生物毒性， 极易与磷脂蛋白发生反应改变细胞膜的通透性，而造成组织细胞的氧化损伤。许多资 料表明，宁夏枸杞多糖具有清除自由基作用，而阻断脂质过氧化反应，使m d a 生成 减少，同时它也可以提高机体抗氧化酶活性，抑制自由基引发的脂质过氧化损伤。刘 晓莉等人研究发现，枸杞人参、银杏叶、天麻水提液均可降低小白鼠体内m d a 的含 量。人参对脑和心肌中m d a 含量的抑制率最高，分别为2 0 6 和2 1 3 ；天麻对肝和 肾组织中m d a 含量的抑制率最高，分别为1 4 5 和1 3 6 。魏文树等对云芝多糖生理 活性研究证明其对活性氧有清除作用。另有实验结果显示：以生理盐水为对照，0 3 2 0 的沙棘多糖溶液就已有明显的抗氧化作用( p b d c 。理论优化方案为：a 2 b l c 3 d 2 。即玉米粉3 、豆粕粉3 、k h 2 p 0 40 15 、n a h 2 p 0 4 庸州文学 2 0 0 8 届硕士学位论文枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 0 1 。 2 4 3 不同金属离子对多糖发酵的影响 在发酵培养基中分别添加o 1 的不同金属离子，以不加任何金属离子的发酵培 养基的原液做为空白对照比较多糖产量，确定金属离子对产多糖的影响，结果如图4 ： 盘0 为 考。嫩 o 1 o 0 5 o 。、。原液，执，溉， c 惫 ，飙，f ei n j 图4 不同金属离子对多糖发酵的影响 f i g 4 e f f e c to f d i f f e r e n tm e t a li o nf o re x o - - p o l y s a h a r i d ep r o d u c t i o n 从图4 可知，与原液相比较，只有m n 2 + 和c a 2 + 离子对多糖发酵有一定促进作用。 其他金属离子对多糖发酵有不同程度的抑制作用，其中以m 矿抑制作用最强。 2 4 4 不同c a 2 + 浓度对多糖发酵的影响 由于c a ? 对多糖发酵有促进作用，而c a 又是形成芽孢的重要元素，所以研究了 不同c a 2 + 浓度对多糖发酵的作用。在培养基添加不同浓度的c a 2 + ，在3 0 ( 2 、2 0 0 r p m 条件下培养5 d ，测定其多糖含量，结果如下： o 2 鐾0 。1 9 舍0 。1 8 v 0 1 7 o 。1 6 o 1 s oo 0 5o 18 1 5o 。2o 2 5o 3o 。3 5 图5 不同c a 2 + 对多糖发酵的影响 f i g 5 e f f e c to f d i f f e r e n tc a 2 d e n s i t yf o re x o - - - p o l y s a c c h a r i d ep r o d u c 6 0 n 由图5 发现，c a 2 + 在o 2 时，多糖的产量是最高的，超过这一浓度，随着c a 2 + 浓度继续增加，不仅不能促进多糖发酵，反而对多糖发酵有抑制作用。说明该菌芽孢 的形成与c a 2 + 浓度的大小不存在直接关系。 2 4 5 装液量对多糖发酵的影响 在3 0 0 r a l 三角瓶中，分别装入2 5 m l 、5 0 m l 、7 5 m l 、l o o m l 、1 2 5 m l 发酵液， 摇床培养5 d 后其多糖含量测定结果。如图6 。 堵州火学 2 0 0 8 届硕士学位论文 枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 磊0 2 5 i l l , a o0 2 o 。1 5 o 1 2 5 s o 7 51 0 01 2 51 5 01 7 5 m l s o o m l 图6 装液量对多梧发酵的影响 f i g 6 e f f e c to f a m o u n tf o rc x o - - p o l y s a m 谢d ew o d u a i o n 从图6 可以看出，b a c i l l u ss u b t i l i sb l 对氧的需求比较严格，当摇瓶装量为l o o m l 3 0 0 m l 时，多糖发酵量最高，其o d s 2 0 值为0 2 0 7 。当装液继续增加时，多糖产量显 著下降。 2 4 6 起始p h 对发酵多糖的影响 将发酵培养基起始p h 分别调至6 0 、6 5 、7 0 、7 5 、8 0 、8 5 、9 0 ，摇床培养5 d 后其多糖含量测定结果如图7 。 o 2 5 蠡 会0 。2 v o 1 5 0 i 5 。566 577 588 599 5 图7 不同起始p h 对多糖发酵的影响 f i g 7 e f f e c to f i n i t i a lp hf b r 懿州y 僦c i l 撕d e 妒妣c t i 在液体发酵过程中，p h 的变化会影响菌的代谢速度，改变菌的代谢途径及细胞 结构，若发酵液p h 偏离合适范围很远，则菌代谢差，甚至死亡【1 8 】。并且，p h 也是 影响多糖合成的基本因素之一。研究表明，起始p h 对b a c i l l u ss u b t i l i sb l 多糖发酵影 响比较显著，其中当p h 为8 0 时多糖产量最多。因此，最适多糖发酵的起始p 8 为8 o 。 2 4 7 温度对多糖发酵的影响 将接种后的培养基分别放置2 5 、3 0 、3 5 、4 0 、4 5 的温度，摇床培养 5 d 后其多糖含量测定结果如图8 。 凿州大学 2 0 0 8 届硕士学位论文 枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 o 2 s 砉o 2 o 1 s o i ) 约巧 3 s叼 4 s卯 图8 装液量对多糖发酵的影响 f i g 8 e f f e c to f t e m p e r a t u r ef o rc x o - - l l o l y s a l 油a t i d el x o d u a i 伽 结果如下：从图8 可以看出，温度对发酵多糖的影响较大，在3 0 时多糖含量最 大。低于3 0 不利于多糖发酵，高于4 0 后多糖含量也明显下降，引起这种结果的原 因目前还不清楚，可能是由于高温导致部分酶失活或者高温引起微生物代谢途径的改 变，从而使得多糖发酵产量降低。 2 4 8 菌龄对多糖发酵的影响 分别接种活化8 h 、1 2 h 、1 6 h 、2 0 h 、2 4 h 、3 2 h 、4 0 h 、4 8 h 的菌种，摇床培养5 d 后其多糖含量测定结果如图9 。确定发酵最佳的菌龄。 o 2 5 a 髫0 2 o 1 5 o 1 5l o1 52 0 2 53 0 3 54 0t 5 图9 不同菌龄对多糖发酵的影响 f i f r 9 e f f e c to f s e e da g el 研a o l y 鞠0 c c i l 撕d ep r o d u c t i o n 从图9 看出，随着菌龄的增加，多糖的产量也不断增加，但当超过2 4 h 后，多糖 产量呈下降趋势。因此，当菌龄活化2 4 h 的时候对发酵多糖最为有利。2 4 h 菌种生长 即将进入稳定期，此时接种，能够让菌种在活力最旺盛的时候获得充足的营养，增强 代谢能力【3 6 】。 2 4 9 接种量对发酵多糖的影响 将活化2 4 小时的菌种分别以1 1 0 的接种量接种到发酵培养基中，摇床培养后 5 d 后其多糖含量测定结果如图1 0 。 责州火学 2 0 0 8 届硕士学位论文枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 0 2 5 营o 2 o 0 1 5 o 1 0 0 5 012345678 91 0l 王( ) 图1 0 不同接种量对多糖发酵的影响 f i g 1 0 e f f e c t o f a m o u n t i n o c u l a b i l i t y f o r e x o - - - - p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n 从图1 0 看出，接种量在大于5 时，多糖产量都在4 9 l ，但增加量不多，考虑到 资源和效益问题，故应采用的接种量最佳为5 。然而，有研究认为：过低的接种量容 易导致发酵液染菌，工业生产中比较适宜的接种量为1 0 。因此，该菌5 的接种量是 否会染菌，有待于实际工业化生产的验证。 2 4 1 0 不同摇床速度对多糖发酵的影响 将接种后的培养基分别放置l o o r p m 、15 0 r p m 、2 0 0 r p m 、2 5 0 r p m 的转速条件下培 养5 d 后，其多糖含量测定结果见表2 ： 表2 不同转速对多糖发酵的影响 t a b l e2 e f f e c to f t u m i n gf o re x o - - - p o l y s a c , c h a r i d cp r o d u c t i o n 转速( 印m ) 1 0 01 5 02 0 02 5 03 0 0 o d s 2 0 o 1 8 70 1 9 50 2 0 10 1 9 1o 1 8 4 从表2 可知，转速对多糖发酵影响不明显，工业发酵中为减少机械磨损可采取 1 5 0 r p m 的转速进行多糖发酵。 2 5 结论与分析 2 4 1 本研究通过对b a c i l l u ss u b t i l i sb l 产多糖发酵条件的研究，发现培养基组 成对多糖发酵有极大的相关性。同时，研究确定了b a c i l l u ss u b t i l i sb 。多糖发酵的最 佳培养基配方及发酵条件。配方为：玉米粉3 、豆粕粉3 、麸皮3 、n a h 2 p 0 40 1 、 k h 2 p 0 40 15 、c a c l 20 2 、m n s 0 40 1 。在发酵过程中，b a c i l l u as u b t i l i sb i 多 糖发酵最适装液量为l o o m l 3 0 0 r a l 。发酵接种以2 4 h 菌龄、接种量为5 最适宜，培 养温度为3 0 ，摇床速度在2 0 0 r p m 的发酵条件下对发酵多糖最为有利，其最佳发酵起 始p h 是8 0 。在探讨金属离子对b a c i l l u ss u b t i l i sb i 产多糖的影响中发现：m n 2 + 、c a 2 + 对多糖发酵有定促进作用，而m 矿、z n 2 + 、f 矿、c u 2 + 对多糖发酵有不同程度的抑制 作用，其中以m 矿抑制作用最强。 2 4 2 微生物产胞外多糖属次级代谢，因此多糖发酵生产周期长。鉴于芽孢是特 凿，l 大学 2 0 0 8 届硕士学位论文枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 有的休眠状态的细胞，如果能通过芽孢的形成有效得延长细胞生长周期，并且在适宜 条件下萌发形成新个体，在理论上将有助于多糖产量的提高。然而在对c a 2 + 进行研究 后发现，尽管c a 2 + 作为芽孢形成的重要元素，但是c a 2 + 浓度的大小并没有对该菌芽孢 的形成数量产生直接影响；相反，c a 2 + 浓度的不断增加反而会导致多糖产量的下降。 2 4 3 张明等 1 3 1 研究指出：假单胞菌产多糖是在菌体基本停止生长的时期，这 说明可通过调控发酵条件使细菌尽快进入稳定期来达到缩短发酵周期，提高多糖产量 的目的。因此，如何利用芽孢的特性提高芽孢杆菌的生长周期进而提高多糖产率将是 一个值得研究的问题。 责州大尊 2 0 0 8 届硕士学位论文枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 第三章枯草芽孢杆菌b l 胞外多糖分离鉴定和组分分析 3 1 简述 多糖分离一般是利用多糖难溶于有机溶剂的特性，用乙醇或丙酮进行反复沉淀洗 涤，除去一部分醇溶性杂质，然后用三氟三氯乙烷法将微生物多糖脱游离蛋白质除去。 小分子杂质的除去可以用透析法。除去这些杂质之后，大多数采用d e a e 纤维素、 d e a e 凝胶及其它凝胶柱层析法进行纯化，国外采用l k b 柱层析系统。多糖的检测可 用比旋度、示差折射及紫外检测等方法，也可以用苯酚一硫酸法测定多糖。纯度的鉴定 可以用超离心法、高压电泳法、凝胶过滤法、高效液相法、示差折射法、紫外检测法 等【2 3 】。单糖组分检测方法有纸层析、h p l c 、h p t c 和h r c c 等，g c 测定糖组分时 须在进样前进行化学衍生，如硅烷化和还原、乙酰化等，以提高样品的挥发度。 3 2 实验器材和试剂 3 2 1 实验仪器和设备 ph计phg662x成都瑞驰分析控制仪器有限公司 烘箱 g z x - g f 1 0 1 2上海跃进医疗仪器械厂 恒温水浴锅h h 系列江苏金坛中大仪器厂 离心机l x i 1 ib上海精密仪器仪表有限公司 紫外分光光度计7 5 2 型上海第三分析制造厂 旋转蒸发器 r e 5 2上海亚荣生化仪器厂 层析柱 2 6 c r u x l 3 c m 上海同兴化工有限公司 气相色谱仪 g c 1 6 a 日本岛津 电泳仪d y y - 4 c 型北京市六一仪器厂 振荡器 s 1 0 1江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 3 2 2 实验材料和试剂 透析袋天津市科密欧化学试剂开发中心 d e a e 5 2天津市科密欧化学试剂有限公司 葡萄糖分析纯沈阳化学试剂厂 麦芽糖分析纯沈阳化学试剂厂 蔗糖 分析纯中国医药( 集团) 上海海化学试剂公司 d 木糖化学纯 中国医药( 集团) 上海海化学试剂公司 童纠大学 2 0 0 8 届硕士学位论文枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 d 半乳糖 d - 甘露糖 l 阿拉伯糖 鼠李糖 山梨糖 正丁醇 苯胺 二苯胺 邻苯二甲酸 乙酸 9 5 乙醇 9 8 浓硫酸 溴百里酚蓝 醋酸 b a c 0 3 三氯乙酸 i r i s 甘氨酸 过硫酸铵 s d s 丙烯酰胺 t e m e d 3 3 实验方法 化学纯 化学纯 化学纯 化学纯 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生化试剂 生化试剂 分析纯 生化试剂 分析纯 生化试剂 上海恒信化学试剂有限公司 北京化学试剂公司( 比利时进口分装) 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 广州新港化工厂 重庆化学试剂总厂 中国上海试剂工厂， 北京化工厂 天津市化学试剂一厂 广东西陇化工厂 贵阳高新技术开发区华通化学试剂厂 重庆川江化学试剂厂 北京化学试剂三厂 上海云岭化工厂 成都化学试剂厂 重庆化学试剂总厂 北京鼎国生物技术发展中心 中国曹杨第二中学化工厂 昆明杰辉生物技术有限公司 昆明杰辉生物技术有限公司 成都科龙化工试剂厂 生工生物工程( 上海) 有限公司 3 3 1 胞外多糖提取分离及鉴定 将所得到的枯草芽孢杆菌b l 菌株胞外粗多糖溶液再加入3 倍体积的9 5 乙醇， 4 c 过夜，沉淀经无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，真空干燥。加入1 0 0 r a l 蒸馏水，加 热搅拌使其溶解，抽滤，去杂质，9 5 乙醇重新沉淀多糖。重新沉淀的多糖干粉溶于 适量水中，用三氯乙酸法去杂蛋白。再9 5 乙醇重新沉淀多糖，4 0 0 0 r p m i n 离心，低温 烘干。加水溶解多糖后，流水透析2 d ，蒸馏水透析l d ( 中间换水4 次) ，1 2 0 0 0 r p m i n 离 瑶纠文学 2 0 0 8 届硕士学位论文枯草杆菌b l 菌株胞外多糖发酵条件及免疫活性研究 心后，即可得到枯草芽孢杆菌b l 菌株胞外多糖。用该提取多糖进行多糖纯度鉴定和 组分分析。 透析袋的处理方法如下： 在大体积的2 ( m v ) n a i - i c 0 3 和i n u n o f le d t a ( p h = 8 0 ) 将透析袋煮沸1 0 m i n ； 将透析袋用蒸馏水彻底漂洗； 将透析袋置1 m m o l le d t a ( p h = 8 0 ) 中煮沸l o m i m 待透析袋冷却，存4 c 冰箱确保透析袋始终浸没在液体中； 3 3 1 1 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 分离胶浓度为l o ，浓缩胶浓度为3 ，点样量为3 0pg ，缓冲液p h 8 3 t r i 洲氨酸 缓冲液1 0 m a 预电泳约3 0 m i n ，待样品进入分离胶后，调电流至2 0 - - 2 5 m a ，待溴酚蓝 j 至凝胶底部边沿l c m 时停止电泳。取出凝胶，于1 2 5 三氯乙酸中固定3 0m i n ，用蒸 馏水充分漂洗，然后放于含3 0 冰醋酸溶液中氧化l h ，再用蒸馏水充分漂洗，最