（植物学专业论文）枯草芽孢杆菌ncd2解磷相关基因的克隆及抑菌物质的分离鉴定.pdf

摘要摘要n c d 2 菌株是从棉花根际分离筛选到的一株枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ，对其作用机理研究发现该菌株不仅能够通过分泌抑菌物质对棉花黄萎菌等植物病原真菌起到抑制作用，同时还具有降解有机磷的能力。通过电击转化将含有转座子m i n i t n l o 的质粒p h v l 2 4 9 转入n c d 2 菌株中，并构建了n c d 2 菌株的突变子库。从30 0 0 多个突变子中筛选到3 株丧失解磷能力的突变子，s o u t h e r n 杂交实验证明突变株中转座子均为单拷贝插入，并且具有相同大小的杂交片断，因此认为这三个突变子可能具有相同的遗传背景。对其中一个突变子m 2 1 6 进行了以下研究。运用巢氏p c r 技术对突变株m 2 1 6 中转座子插入位点基因的侧翼序列进行克隆和序列分析，结果表明丧失解磷能力突变株中转座子插入基因与b s u b t i l i s1 6 8 菌株中p h o r 基因的相似率达到9 8 。将p h o r 基因克隆到p h y 3 0 0 p l k 质粒上构建重组载体电击转化m 2 1 6 进行功能互补验证，互补菌株部分恢复了解磷能力，以上结果表明n c d 2菌株中p h o r 基因与其降解卵磷脂能力具有相关性。本试验同时对n c d 2 菌株产生的抑茵物质进行了分离和鉴定。利用盐酸沉淀、甲醇溶解的方法提取n c d 2 菌株的脂肽类抗生素。双层培养基法测定提取物对棉花黄萎病菌、番茄灰霉病菌具有拮抗活性，进一步研究表明，抑菌物质能够影响真菌菌丝生长及孢子萌发。脂肽提取物经h p l c 分析，获得3 组主要的物质峰，其中组分i i 具有抑菌活性。采用m a l d i t o fm s 对组分i i 进行质谱分析，确定组分i i 中含有两组分子量相差1 4 d a ( c h 2 ) 的代谢同系物，一组物质的分子量依次为1 4 4 6 8 0 1 ，1 4 6 0 8 1 3 ，1 4 7 4 8 3 0 ，1 4 8 8 8 5 2 ，与脂肽类抗生素c 1 5 c l s f e n g y c i na 对应分子量相差2 d a ，推测为f e n g y c i na的一种异构体，其脂肪酸碳链上具有一个双键；另一组同系物的分子量依次为1 4 6 2 7 9 8 ，1 4 7 6 8 1 7 ，1 4 9 0 8 3 9 ，1 5 0 4 8 5 5 ，1 5 1 8 。8 6 7 ，鉴定为脂肽类抗生素c 1 4 c i s f e n g y c i nb 。关键词枯草芽孢杆菌降解卵磷脂砌d r 基因f e n g y c i na b s t r a c ta b s t r a c tb a c i l l u ss u b t i l i ss t r a i nn c d 。2w a si s o l a t e df r o mt h er h i z o s p h e r eo fc o t t o n , a n ds h o w e da n t a g o n i s mt ov e r t i c i l l i u md a h l i a eb ys e c r e t i n ga n t i f u n g a la c t i v ec o m p o u n d s t 1 1 i ss t r a i na l s os h o w e dl e c i t h i n s o l u b i l i z i n ga b i l i t y p l a s m i dp h v12 4 9w h i c hc a r r y i n gt r a n s p o s o nm i n i t n jdw a st r a n s f e r r e di n t os t r a i nn c d - 2b ye l e c t r o t r a n s f o r m a t i o n ，a n dt h et r a n s p o s o nl i b r a r yo fn c d - 2w a sc o n s t r u c t e d t h r e em u t a n t sw i t l ld e f e c t i v eo fl e c i t h i n s o l u b i l i z i n ga b i l i t yw e r es e l e c t e df r o mm o r et h a n3 0 0 0m i n i t n l oi n s e r t e dm u t a n t s s o u t h e r nh y b r i d i z a t i o n 、加t 1 1m i n i - t n l of r a g m e n ta sap r o b es h o w e dt h a ta l lt h e s em u t a n t sc o n t a i n e ds i n g l ec o p yt r a n s p o s o ni n s e r t i o n ，w h i c hp o s s i b l yl o c a l i z e da tt h es a m ec h r o m o s o m a ll o c a t i o n o n em u t a n tm 216w a su s e df o rf u r t h e rs t u d y t h ef l a n k i n gs e q u e n c eo fi n s e r t i o ns i t ew a sc l o n e df r o mm u t a n tm 216b yn e s tp c r s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ei n s e r t e dg e n eh a so f9 8 i d e n t i t yw i t hp h o ri nb s u b t i l i ss t r a i n16 8 g e n e t i cc o m p l e m e n t a t i o nw a sc o n d u c t e db yc l o n i n gp h o rg e n ei n t op l a s m i dp h y 3 0 0 p l ka n dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f e r r e di n t om u t a n tm 216 t h el e c i t h i n - s o l u b i l i z i n ga b i l i t yo fm u t a n tm 216w a sr e s t o r e d r e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h el e c i t h i n s o l u b i l i z i n ga b i l i t yo fn c d 一2w a sr e l a t e dw i t hp h o rg e n e p u r i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fa n t i f u n g a ll i p o p e p t i d e sp r o d u c e db y 丑s u b t i l & n c d - 2w a sa l s os t u d i e di nt h i se x p e r i m e n t c r u d el i p o p e p t i d e sw e r ee x t r a c t e d 、析mm e t h a n o lf r o mt h ep r e c i p i t a t e ，w h i c hw a so b t a i n e db ya d d i n g6 m o l lh c lt ot h ec e l l - f r e ec u l t u r eb r o t ha n dt h e ns t o r e da t4 co v e r n i g h t t h ec r u d ee x t r a c ts h o w e da n t i f u n g a ia c t i v i t i e sa g a i n s t 矿d a h l i a ea n db o t r y t i sc i n e r e ao nt h ed o u b l el a y e rm e d i u m t h r e em a i n l yp e a kg r o u p sw e r eo b t a i n e db yh p l ca n a l y s i s ，a n do n l yt h es e c o n dc o m p o u n dh a di n h i b i t o r ya c t i v i t ya g a i n s t 矿d a h l i a ea n db c i n e r e a t h es e c o n dc o m p o u n dw a sa n a l y s i s e db ym a l d i - t o fm sa n dt w og r o u p so fh o m o l o g u e s 、析t 1 1ad i f f e r e n c eo f14d ai nm o l e c u l a rw e i g h t sw e r ei d e m i f i e d i nt h ef i r s tg r o u p ，t h e r ew e r e4k i n d so f h o m o l o g u e sw i t ht h em o l e c u l a rw e i g h t so f1 4 4 6 8 0 1 ，1 4 6 0 8 1 3 ，1 4 7 4 8 3 0 ，1 4 8 8 8 5 2 d a , r e s p e c t i v e l y ，w h i c hw e r ee s t i m a t e da s t h ei s o m e ro ff e n g y c i na ( c l s i g ) i nt h es e c o n dg r o u p ，t h em o l e c u l a rw e i g h t so f5k i n d so fh o m o l o g u e sw e r e1 4 6 2 7 9 8 ，1 4 7 6 8 1 7 ，1 4 9 0 8 3 9 ，1 5 0 4 8 5 5 ，1 5 1 8 8 6 7 d a , r e s p e c t i v e l y ，w h i c hw e r ei d e n t i f i e da sl i p o p e p t i d ea n t i b i o t i c sf e n g y c i nb ( c 1 4 1 8 ) k e yw o r d sb a c i l l u ss u b t i l i sl e c i t h i ns o l u b i l i z a t i o np h o rg e n ef e n g y c i ni i河北大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了致谢。作者签名：淹蕊日期：砸年厶月上日学位论文使用授权声明本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本学位论文属于1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。2 、不保密口。( 请在以上相应方格内打“ )保护知识产权声明本人为申请河北大学学位所提交的题目为燃的学位论文，是我个人在导师( 弓j 卜) 指导并与导师合作下取得的研究成果，研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。声明人：凌易v作者签名：导师签名：届晶e g y ：弘 年上月上日l日期：蜱年上月l 日日期：拗弘年l 月j 一日第一章文献综述第一章文献综述1枯草芽孢杆菌及其在生防中的应用枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 是一类可以产生内生孢子的革兰氏阳性细菌，不仅可以在土壤、植物根际等外界环境中广泛存在，而且是植物体内常见的内生细菌，尤其是在植物的根、茎部。其生理特征丰富多样，分布极其广泛，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，现已成为一种理想的生防细菌【l 】。作为开发生物农药的重要资源，美国迄今已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局( e p a ) 商品化或有限商品化生产应用许可，它们是g b 0 3 、m b l 6 0 0 、q s t 7 1 3 和q s t 2 8 0 8 2 , 3 1 ，根部施肥或拌种能够有效防治多种病原菌引起的植物病害。我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现已开发出多种商品化制剂如百抗【4 】、萎菌净5 1 、麦丰宁6 1 等。其中由河北省农林科学院植物保护研究所开发的以丑s u b t i l i sn c d 2 菌株为主要活性成分的微生物农药“1 0 亿芽孢克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂 田间对棉花黄萎病表现出较好的防效，通过安全性测定目前该产品已在农业部注册登记【5 】。总之，枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、极具开发潜力的微生物种类已广泛应用于工农业生产及科研诸领域。2 枯草芽孢杆菌的生防作用机制有关枯草芽孢杆菌的防病作用机制，国内外学者从各个角度进行了广泛探讨，概括起来主要有竞争、拮抗、诱导植物抗病性和促进植物生长等几个方面【7 1 。2 1竞争作用竞争作用是生防微生物发挥作用的重要机制之一，指生防微生物通过对营养、物理和生物位点的争夺等控制植物病原微生物的发展。枯草芽孢杆菌的竞争作用主要包括营养竞争和空间位点竞争，营养竞争只在少数菌株中发现【8 】，而以空间位点竞争占优势【9 】，最有效的例子是b a c o n 分离得到的玉米内生枯草芽孢杆菌与病原串珠镰孢菌有相同的生态位，由于枯草芽孢杆菌能在玉米体内迅速定殖和繁殖，从而有效降低串珠镰孢菌和它产生的毒素在其寄主体内的积累【1 0 1 。河北大学理学硕七学位论文2 2 拮抗作用生防细菌防治植物病害发生发展的一个重要机制是产生拮抗物质。拮抗作用是指生防微生物分泌胞外代谢产物抑制有害病原物的生长，或者直接杀死病原微生物的现象。1 9 4 5 年j o h n s o n 首次报道枯草芽孢杆菌产生抗菌物质【1 1 】，迄今为止人类在枯草芽孢杆菌中至少已分离发现了6 0 多种抗生物质，其中大多为低分子抗菌肽以及蛋白类拮抗物质。目前研究最多、最深入的是枯草芽孢杆菌分泌的三大类脂肽化合物：伊枯草菌素、表面活性素和芬枯草菌素。( 1 ) 伊枯草菌素( i t u r i n )i t u f i na 是众所周知的强效抗真菌物质，对镰刀菌( f u s a r i u m ) 、丝核菌( r h i z o c t o n i a ) 、曲霉菌( a s p e r g i l l u s ) 等植物病原菌有较强的拮抗活性。具有广谱的特性，且对哺乳动物毒性很低。i t u r i n 的作用机理是影响真菌细胞膜的表面张力，导致微孔的形成，从而使细胞内k + 及其它重要离子的渗漏，最后引起细胞死亡。其拮抗形式表现为强烈破坏芽管萌发，抑制新生菌丝生长，使菌丝顶端膨大形成泡囊，泡囊破裂后原生质外泄【1 3 】。( 2 ) 表面活性素( s u r f a c t i n )s u r f a c t i n 是迄今了解最详细的脂肽，它的研究已经深入到了基因水平，在枯草芽孢杆菌中己发现3 个s u r f a c t i n 合成必不可少的基因：s r f a 启动子，c o m a 和跏编码基因【1 4 】。s u r f a c t i n 没有直接的抑真菌活性，但是强生物表面活性剂【1 5 】。表现出抗病毒、抗肿瘤和抗支原体活性，作用机制是破坏病毒的脂膜。虽然s u r f a c t i n 不能直接抑制植物病原真菌的生长，但是它能有效的增强i t u r i na 的抗真菌活性【1 6 】。( 3 ) 芬枯草菌素( f e n g y c i n )另一类抗真菌脂肽抗生素芬枯草菌素包括f e n g y c i na 和b 【1 7 1 。在抑菌作用方面f e n g y c i n 具有特异地抑制丝状真菌的活性，而且具有很强的持久性。f e n g y c i n 处理的抑菌区域中新生菌丝顶端或者分枝顶端膨大，部分泡囊破裂后，细胞壁内含物流出，菌丝呈空瘪状和局部断裂。2 3 诱导植物抗病性诱导抗病性是指外界条件的干预改变了植株对病害的反应，原来的感病部位产生了局部或系统的抗病害能力。枯草芽孢杆菌不仅通过竞争、拮抗直接抑制植物病原菌，而2第一章文献综述且还能刺激诱发植物体的抗病潜能，这也是生防细菌发挥作用的一个重要方面。例如t a n g 等研究发现bs u b t i l i sb 3 能诱导小麦过氧化酶( p o ) 活性的增加【1 9 】。而丙氨酸解氨酶、过氧化酶、超氧化物歧化酶等都被认为是诱发植物系统抗病性的信号。2 4 促进植物生长除前面介绍过的竞争、拮抗、诱导三种作用机制外，枯草芽孢杆菌还具有植物根际促生菌的特性【2 0 】。植物根际促生细菌( p l a n tg r o w t hp r o m o t i n gr h i z o b a c t e r i a ) 简称p g p r ，指生长在植物根际周围、能抑制植物病原菌、促进植物生长的一类有益细菌。蔡学清等研究发现辣椒内生菌丑s u b t i l i sb s 2 能够通过诱导吲哚乙酸形成、降低脱落酸含量促进辣椒的生长【2 1 1 。可见菌株调节植物体内的内源激素可能是其促生作用的主要机制之一。综上所述，枯草芽孢杆菌能够发挥生防作用，不能单纯只依赖于某一种作用机制，而是竞争、拮抗、诱导、促生等各方面协同作用的结果【2 2 】。3 解磷细菌及其在植物生长中的作用3 1关于解磷细菌的研究状况磷是植物体生长发育必需的三大营养元素之一，当磷源成为限制植物生长的因子时，解磷微生物将发挥它的重要作用。国内对于磷细菌的研究始于2 0 世纪5 0 年代。2 0 0 4 年钟传青初步调查全国的微生物资源总结出难溶性磷酸盐易被酵母、霉菌溶解，而磷矿粉容易被芽孢杆菌溶解，还指出了g h a n ia ( 1 9 9 4 ) 和k u c e y ( 1 9 8 3 ) 报道的真菌解磷能力高于细菌的说法存在一定的片面性【2 3 1 。在国外，在解磷细菌的选育方面包括高效解磷菌的筛选【2 4 1 、诱变技术的利用以及各种因子对解磷能力的影响等。2 0 0 0 年n e e mn a r u l a 就利用诱变技术培育出较之母株具有更强解磷能力的菌株【2 5 1 。关于细菌磷代谢的分子调控机制夏琪等认为是由一种两组分调节系统磷酸盐调节子( p h or e g u l o n ) 所控制。它是由结构和功能类似的两种蛋白族成员组成的一类信号传导系统，两种蛋白分别起着传感器和调节器的作用【2 6 1 。目前在大肠杆菌中已经发现了31 个不相连的磷酸盐调节基因，这些调节基因在低浓度的磷酸盐条件下受到诱导，胁迫信号经过递级传导，使细菌细胞加快磷转运速率和诱导p h o a 基因合成大量碱性磷酸酶1 2 7 】。河北大学理学硕士学位论文3 2 解磷细菌对植物生长的作用尽管土壤中存在一些溶磷细菌，但它们数量太少不能够明显的发挥促进植物生长的作用。只有当磷细菌作为生物肥料施入田间，与植物根系则构成一个互惠互利的微生态环境，形成优势菌群之后才可发挥作用。c h a b o t 报道解磷菌的溶磷作用是中、低肥力土壤上促进植物生长最重要的机制之一【2 8 1 。目前已有报道发现解磷菌具有解磷和促进生长的双重作用口9 】，具有植物根围促生细菌的许多重要特性【3 0 1 ，能产生生长素( l 气a ) 、细胞分裂素( c k ) 、赤霉素( g a ) 等【3 l 】。能够增加植物体对各种营养元素c u 、f e 等的吸收利用3 2 1 。4 转座子和转座子标签法本论文采用转座子标签法来克隆枯草芽孢杆菌与解磷有关的基因，所以下面简要的介绍有关转座子和转座子标签技术的内容。4 1 细菌转座子转座子( t r a n s p o s a b l ee l e m e n tt e ) 是细胞中能改变自身座位的一段d n a 序列，它可以从复制子的一个座位跳跃到另一个座位，也可从同一个细胞的一个复制子跳跃到另一个复制子。己知的转座因子的转座途径主要有两种：复制型转座和非复制型转座。复制型转座发生转座后在原来的位置上仍然保留一份转座因子。而非复制型转座转座因子直接从原来位置上转座插入新的位置，原来位置丢失转座子，这种现象大多可造成表型的变化【3 3 】。4 2 转座子m i n i t n l o目前在功能基因组学研究中所用的转座子大都经过有目的的改造。芽孢杆菌研究中常用的转座子主要有t n 5 4 0 3 4 1 、t n j d ( 或m i n i t n l 0 ) 3 5 州、t n 9 1 7 【3 刀以及一些插入序列等。本实验所用的为t n l o 转座子改造后的1 1 1 i i l i t n l o 。t e t at e t dt n t o( 9 1 , 4 7 一b p ) 4 - i s i o l + i s ，p r 图1 - 1t n l o 转座子的结构f i g1 - 1t h es t r u c t u r eo f t n l 0t r a n s p o s o n4第章文献综述首先把t n l o 转座子内部的四环素抗性基因替换成了常用的抗性标记基因，在m i n i t n l o 中为氯霉素抗性标记，另外转座子内部增加了一个大肠杆菌的复制区，然后将转座酶基因用一个强启动子起始表达并放在转座子的外部的温敏自杀载体上【3 3 1 。这样经过改造后的m i n i 。t n l o 转座子不但提高了转座频率，而且也大大增强了转座子插入的随机性。4 3 转座子标签技术转座子标签技术的原理是利用转座子的随机插入造成基因突变，再以转座子为靶标对象，从突变株的基因文库中克隆出转座子插入基因序列，利用这部分序列则可从野生型基因文库中获得完整的目的基因。实际操作过程中，将构建好的含有m i n i t n l o 转座子的载体导入目标菌株，特定条件下诱导转座，使转座子随机插入目标菌株的染色体d n a 上。此方法运用成功的例子有s t e i n m e t z 3 3 1 诱导含转座子m i n i t n l o 的质粒p 1 c 3 3 3 随机插入至阳性杆菌的染色体d n a 上，构建突变体库、筛选突变株，最终克隆得到转座子插入位点的基因序列【3 8 3 9 1 。而k e 巧it s u g e 则利用p h v l 2 4 9 质粒携带的m i n i t n j 口转座子发现了在丑s u b t i l i s 与s u r f a c t i n 自卫相关的基因弦一【4 0 】。5 枯草芽孢杆菌中的双组分调控系统双组分调控系统由组氨酸蛋白激酶和反应调节蛋白组成，迄今为止在枯草芽孢杆菌中通过基因测序至少已经发现了3 5 对双组分调控系统，其功能包括使细菌适应环境压力、产生次生代谢物、调节细胞分裂【4 1 】等。在枯草芽孢杆菌及其它芽孢杆菌中p h o p p h o r 双因子调控系统是研究较多的一组 4 2 , 4 3 】，其功能预测为调节碱性磷酸酶的合成 4 4 1 ，作用机理可概括为：肋d r 为一种位于细胞膜上的组氨酸激酶，p 办o p 是p 办d r 的应答元件，是一种调控蛋白。当磷酸盐缺乏时，p h o p p h o r 双因子调控系统激活磷酸盐调节子( p h or e g u l o n ) ，p h 卯应答原件由它的传感激酶p h o r 激活，p h o p 磷酸化( p h o p p ) 诱导p h o p r 启动子至少高于正常水平三倍的表达，同时激活或抑制磷酸盐调节子所控制的其它基因的表达4 5 1 。6 本研究的目的和意义n c d 2 菌株是河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室筛选出来的一株能有效防治棉花黄萎病的枯草芽孢杆菌，以该菌株为主要活性成分的微生物农药“1 0s河北大学理学硕十学位论文亿芽孢克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂”在田间对棉花黄萎病表现较好的防病效果【5 】，并于2 0 0 6 年在农业部登记。研究发现该菌株不仅能够通过分泌抑菌肽类物质对棉花黄萎菌等病原真菌起到抑制作用，同时还具有降解蛋黄卵磷脂的能力。本试验利用转座子m i n i t n l o 构建了n c d 2 菌株的突变子库，筛选解磷突变株，利用分子遗传学手段确定n c d 2 菌株中与解磷能力相关的基因，为深入研究n c d 2 菌株的解磷机制，提高该菌株的解磷能力促进植物生长提供依据。同时还对n c d 2 菌株产生脂肽类抑菌活性物质进行分离、纯化、鉴定，为进一步分析其抑菌机理、克隆编码抑菌物质的基因奠定了基础。6第二章枯草芽孢杆菌n c d 2 解磷相关基冈的克隆及其特性研究第二章枯草芽孢杆菌n c d 2 解磷相关基因的克隆及其特性研究1 材料和方法1 1 材料1 1 1 菌株和质粒本研究所用的菌株和质粒见表2 - 1 。表2 1 菌株和质粒t a b l e2 - 1s t r a i n sa n dp l a s m i d su s e di nt h i ss t u d y1 1 2 培养基l b 培养基：胰蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c i5 9 ，固体培养基加入1 0 1 拘琼脂，蒸馏水定至10 0 0 m l 。生长培养基：胰蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c l5 9 ，山梨醇9 1 1 9 ，蒸馏水定至1o o o m l 。复苏培养基：胰蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c l5 9 ，山梨醇9 1 1 9 ，甘露醇6 9 2 9 ，蒸馏水定至10 0 0 m l 。蒙金娜基础培养基：( n h 4 ) 2 s 0 40 5 9 ，n a c l0 3 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 3 9 ，k c l0 3 9 ，7河北大学理学硕十学位论文f e s 0 4 7 h 2 00 0 3 9 ，m n s 0 4 4 h 2 0o 0 3 9 ，c a c 0 35 9 ，葡萄糖1 0 9 ，1 5 琼脂，p h 7 0 - 7 5 ，蒸馏水定至10 0 0 m l 。有机磷液体体培养基：在己灭菌蒙金娜基础培养基中加入细菌过滤器过滤的蛋黄卵磷脂，终浓度为0 2g l 。卵黄稀释液制法：将新鲜的鸡蛋放在酒精中浸泡3 0 m i n ，用灭菌刀敲破鸡蛋两端，去掉蛋清后将蛋黄流入已灭菌的锥形瓶中，加等量的无菌水后摇匀。蒙金娜固体培养基：将蒙金娜基础培养基融化，冷却至5 0 。c 后，每1 0 0 m l 的基础培养基中加入9 m l 卵黄稀释液，混匀后倒平板。h u l e t t ss a l t s ：t r i z r n a6 0 6 9 ，硫酸铵0 4 0 9 ，柠檬酸钠2 0 0 9 ，氯化铁0 8 2 9 ，硫酸锰0 2 2 9 ，硫酸镁o 8 6 9 ，氯化锌0 0 0 1 4 9 ，冰醋酸调p h 值至7 1 2 ，蒸馏水定至10 0 0 m l 。表2 - 2m h ml o p 培养基t a b l e2 2m h ml o pm e d i a1 1 3 抗生素及浓度本研究所用的抗生素见表2 3 。表2 3 抗生素贮液的配置及其应用t a b l e2 - 3a n t i b i o t i c sa n dt h e i ra p p l i c a t i o n s1 1 4 培养条件e s c h e r i c h i ac o l id h 5 a3 7 。cl b 培养基，丑s “6 疗胁3 7 l b 培养基8第二章枯草芽孢杆菌n c d ，2 解磷相关基冈的克隆及其特性研究1 1 5 主要药品及仪器( 1 ) 药品t a q 酶、d n t p sd n am a r k e rd l 2 0 0 0限制性内切核酸酶、t 4 d n a 连接酶g e n o m ew a l k i n g 试剂盒a g a r o s eg e ld n ap u r i f i c a t i o n 试剂盒碱性磷酸酶试剂盒地高辛标记试剂盒( 2 ) 仪器g e n ep u l s e r 电穿孔仪t u 19 0 1 双光束紫外可见光度计稳压稳流定时电泳仪m i n i p r o t e i 型电泳槽手持式超生波处理器e p p e n d o r fc e n t r i f u g e5 8 0 4 r 离心机1 1 6p c r 引物本文有关的p c r 引物见表2 - 4 。北京天根生化公司大连宝生物公司大连宝生物公司大连宝生物公司大连宝生物公司中生北控生物科技公司德国r o c h e美国b i o r a d北京普析通用仪器公司美国b i o 如美国b i o r a d德国h i e l s h e r德国e p p e n d o r f表2 - 4p c r 引物t a b l e2 - 4p r i m e r sf o rp c r9河北大学理学硕七学位论文1 1 7 溶液、缓冲液及试剂电击缓冲液：山梨醇9 1 1 9 ，甘露醇6 9 2 9 ，1 0 甘油t e 缓冲液( 1 ) ：1 0 m mt r i s h c l ，1 0 m me d t a ，p h 8 0p b s 缓冲液( p h 7 4 ) ：n a c l0 8 9 ，k c l0 2 9 ，n a h p 0 41 4 4 9 ，k h 2 p 0 40 2 4 9 ，蒸馏水定至10 0 0 m l 。1 0 0 9 l 碳酸钠溶液：1 0 9 无水碳酸钠溶于1 0 0 m l 水中。3 m o l l h 2 s 0 4 溶液：量取1 6 0 m l 浓硫酸缓缓加入到10 0 0 m l 水中，不断搅拌冷却。磷标准贮备液：准确称取经1 0 5 。c 下烘干2 h 的磷酸二氢钾0 4 3 9 9 ，用水溶解后，加入5 m l 浓硫酸，然后加水定容至10 0 0 m l ，该溶液含磷1 0 0 m g l ，放入冰箱可供长期使用。磷标准溶液：准确吸取5 m l 磷贮备液，放入1 0 0 m l 容量瓶中，加水定容，现用现配。二硝基酚指示剂：称取0 2 92 , 6 二硝基酚溶于1 0 0 m l 水中。5 9 l 酒石酸锑钾溶液：称取化学纯酒石酸锑钾0 5 9 溶于1 0 0 m l 水中。硫酸钼锑贮备液：量取1 2 6 m l 浓硫酸，缓缓加入到4 0 0 m l 水中，不断搅拌冷却。另称取1 0 9 钼酸铵溶于约6 0 。c 水中。然后将硫酸溶液缓缓倒入钼酸铵溶液中，再加入5 9 l 酒石酸锑钾溶液1 0 0 m l ，用水定容至10 0 0 m l ，置于棕色试剂瓶中。钼锑抗显色剂：称取1 5 9 抗坏血酸( 左旋，旋光度+ 2 1 2 2 。) 溶于1 0 0 m l 钼锑贮备液中，现用现配。1 1 8 碱裂解提取质粒所需主要试剂溶液i ：5 0 m m 葡萄糖，2 5 m m i r i s h c l ( p h 8 0 ) ，1 0 m me d t a ( p h 8 0 ) ，1 2 1 灭菌2 0 m i n ，4 c 保存。溶液i i ：0 2 m n a o h ，1 s d s ( 现配现用) 。溶液1 i ：5 m 乙酸钾6 0 m l ，冰醋酸1 1 5 m l ，蒸馏水定容至1 0 0 m l ，1 2 1 灭菌2 0 m i n ，4 c 保存。1 1 9d n a 提取试剂溶菌酶：用无菌水配成2 0 m g m l 溶液，小量分装，2 0 c 保存。1 0 s d s 缓冲液：1 0 9 的s d s 溶于1 0 0 m l 水中，6 8 c ) j n 热熔解，浓盐酸调p h 至7 2 。蛋白酶k ：用无菌水配成2 0 m g m l 溶液，小量分装，- 2 0 c 保存。1 0第二章枯草芽孢杆菌n c d 2 解磷相关基因的克隆及其特性研究c t a b n a c h4 1 9 n a c l 溶于8 0 m l 水中，缓慢加入1 0 9 c t a b ，定容至1 0 0 m l 。氯仿：异戊醇：按体积比2 4 ：1 配置混匀，4 。c 保存。酚：氯仿：异戊醇：按体积比2 5 ：2 4 ：1 配置混匀，4 c 保存。1 1 1 0s o u t h e r n 杂交所需试剂采用德国r o c h e 公司生产的高效d n a 地高辛标记和检测试剂盒，主要含有：( 1 ) 与探针标记有关的试剂：六核苷酸随机引物混合物( 2 ) s o u t h e r n 杂交反应和显色有关的试剂：地高辛标记的对照d n a ，抗体结合液，杂交液，封闭液，显色液。( 3 ) 另外需要准备的试剂：w a s h i n gb u f f e r ：0 1 mm a l e i ca c i d ，o 1 5 mn a c l ，0 3 v ) t w e e n2 0 ( p h 7 52 0 c )m a l e i ca c i db u f f e r ：0 1 mm a l e i ca c i d ，0 1 5 mn a c l ，n a o h 调p h 值至7 5 ( 2 0 )d e t e c t i o nb u f f e r ：0 1 mt r i s - h c l ，0 1 mn a c i ( p h 9 52 0 )2 0 x s s c ：3 0 mn a c l ，0 3 m 柠檬酸钠，h c l 调p h 值至7 o1 2 方法1 2 1 碱裂解法小量提取细菌质粒d n a( 1 ) 挑取单菌落接种到含适当抗菌素的5 m ll b 液体培养基中，3 7 。c 振荡培养过夜。( 2 ) 用1 5 m l 离心管在室温，1 20 0 0 r p m 离心l m i n 收集菌体，弃上清。( 3 ) 每个离心管中加入预冷的溶液i2 5 0 9 l ，在振荡器上彻底悬浮。( 4 ) 每管加入新配置的溶液1 1 2 5 0 p l ，轻轻转动离心管，充分混匀至澄清。( 5 ) 每管各加入2 5 0 p l 溶液，轻轻转动离心管，充分混匀至出现白色沉淀。( 6 ) 1 20 0 0 r p m 离心1 0 r a i n ，将上清吸至新的离心管中，弃沉淀。( 7 ) 加入5 0 0 9 l 异丙醇，颠倒充分混匀，1 20 0 0 r p m 离心1 5 m i n 后弃上清。( 8 ) 依次用8 0 乙醇和无水乙醇洗涤后，吹干，5 0 9 l 1 x t e 溶解，2 0 保存。1 2 2 细菌总d n a 的大量提取( 1 ) 从l b 平板培养基上挑取单菌落，接种子5 m l ( 含抗生素) l b 培养液中，3 7 振荡培养过夜。( 2 ) 将过夜培养液加入到1 0 0 r n l 含抗菌素的l b 中，3 7 c 振荡培养1 2 h 。( 3 ) 1 0 0 m l 细菌培养物4 c ，50 0 0 r p m ，离心1 0 r a i n ，弃上清。河北大学理学硕士学位论文( 4 ) 菌体用5 m l lx t e 充分悬浮，加入5 0 9 l 溶菌酶，3 7 温浴5 0 m i n 。( 5 ) 加入2 6 5 9 l 1 0 的s d s ，摇匀至透明后缓慢加入5 0 9 l 蛋白酶k ，3 7 c 温浴1 h 。( 6 ) 加入9 6 0 9 l 5 m o l l 的n a c l ，混匀后再加入7 9 0 9 l 已预热的c t a b n a c l ，6 5 。c水浴1 5 m i n 。( 7 ) 加入7 2 m l 的酚：氯仿：异戊醇混匀后，50 0 0 r p m 离心2 0 m i n( 8 ) 将上清转移至新的管中，加入9 m l 预冷的异丙醇，混匀，2 0 沉淀3 0 m i n ，50 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，弃上清。( 9 ) 依次用8 0 乙醇和无水乙醇洗涤后，吹干，2 m l l t e 溶解，2 0 。c 保存。1 2 3d n a 的纯化步骤( 1 ) 在1 x t e 溶解的d n a 溶液中加入r n a 酶( 1 0 m g m l ) ，3 7 。c 温浴1 h 。( 2 ) 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，快速摇晃混匀，1 20 0 0 r p m 离心5 m i n ，小心将上层液体转移至新的离心管中。( 3 ) 加入等体积的氯仿：异戊醇充分混匀，1 20 0 0 r p m 离心3 m i n ，小心取出上清，弃沉淀。( 4 ) 加入1 1 0 体积的醋酸钠溶液，再加入2 倍体积的无水乙醇，混匀，1 20 0 0 r p m离心5 m i n 弃上清。( 5 ) 分别用8 0 及无水乙醇洗涤一次后，吹干后加5 0 1 0 0 9 l 的1x t e 溶解，2 0 c保存。1 2 4n c d 2 菌株突变体库的构建1 2 4 1 转化子的获得采用电击转化的方法将质粒p h v l 2 4 9 转入枯草芽孢杆菌n c d 2 中。电击感受态的制备方法参照x u e h 6 】等方法，电击转化步骤如下：( 1 ) 挑取n c d 2 菌落接种于5 m l 的生长培养基中，3 7 c1 5 0 r p m 过夜培养种子液。( 2 ) 将种子液以1 1 6 接种于3 0 m l 的生长培养基中，3 7 c ，1 5 0 r p m 振荡培养至o d 6 0 0 0 8 5 - 0 9 5 。( 3 ) 冰浴冷却培养液2 0 3 0 m i n ，4 。c ，50 0 0 r p m 离心5 m i n 收集菌体。( 4 ) 反复用冰冷的电击缓冲液洗涤细胞收集物4 次。( 5 ) 用原培养液1 4 0 体积的电击缓冲液重新悬浮细胞收集物，细胞浓度应在l x l 0 1 01 3 1 0 1 0 c f u m l ，即为n c d 2 菌株的感受态细胞。1 2第二章枯草芽孢杆菌n c d 2 解磷相关基因的克隆及其特性研究( 6 ) 1 0 0 u , l 感受态细胞与l l u l 质粒d n a ( 5 0 n g t l ) 混匀后转移到冰冷的电转化杯中，冰浴l m i n 后开始电击，参数设置为：电阻2 0 0 f 2 ，电容2 5 灯，电场强度2 4k v 2 m m 。( 7 ) 电击后立即加入0 5 m l 的复苏培养基，3 7 震荡培养3 h 。( 8 ) 在l b 平板上筛选具有氯霉素抗性的转化子。( 9 ) 对转化子提取质粒，进行酶切验证和p c r 验证，含有完整质粒p h v l 2 4 9 的菌株即为阳性转化子。1 2 4 2 突变子库的构建将阳性转化子在l b 培养基中3 7 。c ，1 5 0 r p m 培养至对数生长初期( o d 6 0 0 o 8 ) ，然后转到5 l 继续培养3 h ，将培养液系列稀释后涂于含有氯霉素的l b 抗性平板上，5 1 培养过夜。对长出的菌落进行抗生素筛选，含有c m r e m 5 抗性特征的菌落即为转座子插入突变子。1 2 5 解磷能力的定性和定量测定1 2 5 1 解磷能力的定性测定在蒙金娜固体培养基上对n c d 2 菌株野生型、突变子及互补菌株的解磷能力进行定性比较。将各菌株点接到蒙金娜有机磷固体培养基上，3 7 培养5 7 d 后根据菌落周围是否形成透明圈及透明圈的大小比较各菌株的解磷能力。1 2 5 2 磷钼蓝比色法定量测定解磷能力【4 7 】( 1 ) 磷钼蓝比色法的原理溶液中磷的准确测定，一般都用磷钼蓝比色法。加钼酸铵于含磷的溶液中，在一定的酸度条件下，溶液中的正磷酸与钼酸络合形成磷钼杂多酸。h 3 p 0 4 + 1 2 h 2 m 0 0 4 = h 3 p m 0 1 2 0 4 0 + 1 2 h 2 0杂多酸是由两种或两种以上简单分子的酸组成的复杂的多元酸。在适宜的浓度下，加入适当的还原剂，磷铝酸中的一部分m 0 6 + 离子能够被还原为m 0 5 + ，生成一种叫做“钼蓝”的物质，这就是钼蓝比色法的基础。( 2 ) 方法细菌液的制备：挑取待测菌株菌落( 包括野生型、解磷突变株及互补菌株) 分别接种于5 m l 含相应抗生素的l b 液体培养基中，3 7 c ，1 5 0 r p m 过夜培养。细菌的摇瓶培养：将2 m l 培养好的磷细菌液接入5 0 m l 的蒙金娜有机磷液体培养基中，对照接等量的灭活菌液，3 0 c ，1 8 0 r p m 振荡培养7 d 。1 3河北大学理学硕士学位论文培养物的处理：培养好的磷细菌液和对照液用超声波破碎后50 0 0 r p m 离心3 0 m i n 。超声波破碎条件：2 0 0 2 4 0 v ，2 a ，5 0 6 0 h z ，作用3 0 m i n 。标准曲线的绘制：分别准确吸取5 m g l 磷标准溶液0 、2 、4 、6 、8 、1 0 m l 于5 0 m l容量瓶中，加入等体积二硝基酚指示剂2 3 滴，用l o o g l 碳酸钠溶液调至刚呈微黄色，加入5 m l 钼锑抗显色剂，摇匀后加水定容，即得含磷( p ) 量分别为0 o 、0 2 、0 4 、0 8 、1 0 m g l 的标准溶液系列。摇匀，室温放置3 0 m i n 。波长7 0 0 n m 测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，磷浓度( r a g l ) 为横坐标，绘制标准曲