（微生物学专业论文）脂肪酶产生菌的筛选及其在生产生物柴油中的应用.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：聋! 】! 当 e t 期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解t h u g 大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，- i 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定彩肛 论文作者签名：杠导师签名：兰陋日期：趋近立乒 山东大学顾士学位论文 摘要 在本论文中，主要从脂肪酶产生菌的筛选、发酵条件优化、诱变育种、对脂 肪酶进行固定化和分离纯化等几方面进行研究： ( 1 ) 进行了脂肪酶产生菌的大量筛选工作。经以橄榄油为唯一碳源 r h o d a m i n eb 为指示剂的平板初筛实验，摇瓶复筛及固定化脂肪酶粗酶催化转酯 反应生产生物柴油实验，最终筛选出一株所产生的脂肪酶可以有效催化转酯反应 生产生物柴油的真菌g 5 。通过对g 5 进行形态学观察，初步确定其属于地霉菌 属( g e o t r i c h u m ) 对其胞外粗酶液酶基本性质的研究表明：g 5 脂肪酶胞外粗酶 液作用的最适温度为4 0 ，最适作用p h 为7 5 ，在5 0 以内和p h 6 o 8 0 之间 有较好的稳定性。 ( 2 ) 对筛选到的g 5 菌株液体摇瓶产脂肪酶的条件进行了优化。确定其最 适产酶条件为：蔗糖1 o g ，黄豆粉2 0 8 ，蛋白胨o 5 9 ，( n h & s 0 40 2 5 9 ， k h 2 p 0 4o 1 9 ，m g s 0 4 7 i - 1 2 00 0 5 9 ，橄榄油0 5 m l ，水l o o m l ，p h6 o ；培养温 度2 8 ，摇床转速1 7 0 r p m ，摇瓶装液量为3 0 0 m l 三角瓶装液5 0 m l ，最佳培养时 间6 b 7 2 小时。 ( 3 ) 在确定了最佳发酵培养基的基础上，对于金属离子、油脂的添加对g 5 生长及产酶的影响进行了研究。结果表明，m g + 和f e 2 + 能够促进其生长及产酶， 其中m 矿的促进作用明显：而n r 、m n 2 + 、z l l 2 + 有不同程度的抑制作用，m n 2 + 的抑制作用较为明显。在没有油脂存在下，该菌株产生的脂肪酶活较低，而在添 加了天然油脂和合成油脂后，酶活大幅度提高。尤以橄榄油的诱导作用最为显著。 由以上结果推定g 5 菌株所产生的脂肪酶为诱导酶。 ( 4 ) 用紫外线及e m s 对g 5 进行诱变育种。结果证明e m s 诱变效果较好。 g 5 经e m s 诱变后传代3 次，酶活比出发菌株提高了1 7 8 6 。还需进一步的诱 变实验获得稳定遗传的高产脂肪酶菌株 ( 5 ) 通过对g 5 脂肪酶固定化酶条件的优化，初步确定了以硅藻土为载体 的固定化g 5 脂肪酶的方法：固定化缓冲体系p h7 o 磷酸缓冲溶液，固定化温 度3 7 c ，静置固定化，固定化酶量与载体的比例( g g ) 1 ：1 0 。 随后分别采用有溶剂体系和无溶剂体系两种反应体系，考察了上述硅藻土固 定化的g 5 脂肪酶对橄榄油、棉籽油和煎炸废油与甲醇反应生成油酸甲酯的反应 山东大学硕士学位论文 情况实验结果表明，g 5 脂肪酶对催化短链醇参与的转酯化有一定效果，同时， 此酶对催化煎炸废油甲酯化同样有效。在有溶剂反应体系中的转化效果优于无溶 剂体系 ( 6 ) 对g 5 脂肪酶进行了分离纯化，并对其酶学性质进行了研究。g 5 发酵 液经过硫酸铵分级沉淀、超滤浓缩、阴离子交换层析和凝胶过滤层析色谱，最终 得到了电泳纯的脂肪酶组分。用s d s p a g e 测定其分子量6 1 1 k d 。 关键词：地霉；脂肪酶；硅藻土固定化；生物柴油；分离纯化 山东大学顿士学位论文 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , s c r e e n i n go fl i p a s e - p r o d u c i n gs t r a i n s ，o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ，i m m o b i l i z a t i o no fl i p a s ea n dp u r i f i c a t i o no ft h ei s o l a t e dg 5l i p a s ew e r e i n v e s t i g a t e d ( 1 ) m a n yl i p a s e p r o d u c i n gs t r a i n sw e r cs c r e e n e d t h r o u g has e r i e so fs t e p s i n c l u d i n gp l a t ei s o l a t i o nu s i n go l i v eo i l 越s o l ec a r b o ns o u r c ca n dr h o d a m i n eb a s i n d i c a t o r , f l a s kf e r m e n t a t i o na n dd e t e c t i o no ft r a n s e s t e r i f i c a t i o na c t i v i t yt oc a t a l y z e t h ep r o d u c t i o no fb i o d i e s e l ，o n el i p a s e - p r o d u e i n gs t r a i ng 5w i t hh i g h e rl i p a s ea c t i v i t y w a ss c r e e n e d t h eg 5s t r a i nw a si d e n t i f i e da sg e o t r i c h u m s p a c c o r d i n gt o m o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n t h ep r o p e r t i e so f c r u d ee n z y m eo f t h i sg 5l i p a s ew a sa l s o i n v e s t i g a t e d t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp hf o rt h i sl i p a s ew e r e4 0 ca n d7 5 ， r e s p e c t i v e l y , a n dt h el i p a s es h o w e dh i g hs t a b i l i t yb e l o w5 0 ca n di nt h ep hr a n g eo f p h 6 o 8 0 ( 2 ) f l a s kf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fg 5l i p a s ew e r eo p t i m i z e d t h eo p t i m a l c o n d i t i o n sf o rt h ep r o d u c t i o no fg 5l i p a s ew a s 鹊f o l l o w s ：1 0gs u c r o s e 2 0g s o y b e a np o w d e r , 0 5 9p e p t o n e ，0 2 5 9 ( n h 4 ) 2 8 0 4 ，o 1 9k h 2 p 0 4 ，o 0 5 9 m g s 0 4 7 h 2 0 ，0 5m lo l i v eo i l ，l o o m lw a t e r t h ei n o c u l a t e dm e d i u mw a si n c u b a t e da t 2 8 ，1 7 0 r p mo f r o t a t i o ns p e e d ，5 0 r a lm e d i u mi n3 0 0 m lf l a s ka n d6 f l 一7 2 ho f c u l t u r e t i m e ( 3 ) b a s e d o i lt h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i u m , e f f e c t so fm e t a li o n s ，a d d i t i o no f o i l s f a t so nt h eg r o w t ha n dp r o d u c t i o no fl i p a s ew e r ec a r r i e do u t t h er e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a tm 矿a n df c 2 + w 瑟a b l et oe n h a n c et h eg r o w t ha n dp r o d u c t i o no f l i p a s e ，m 矿s h o w e dt h es t r o n g e s te n h a n c e m e n te f f e c t , o nt h ec o n t r a r y , n d ，m n 2 + ， z n 2 + s h o w e di n h i b i t i o ne f f e c t s e s p e c i a l l ym n 2 + s t r o n g l yi n h i b i t i o np r o d u c t i o no ft h i s l i p a s e i nt h ea b s e n c eo fo i l s f a t s ，l i p a s e sw a sr a t h e rl o wa n dl i p a s ea c t i v i t yw a s p r o m o t e dm a r k e d l yb yt h ea d d i t i o no f n a t u r a la n ds y n t h e t i co i l s f a t s o l i v eo i lw a st h e b e s ti n d u c t i v ec o m p o s i t i o nf o rg 5l i p a s ep r o d u c t i o n 3 山东大学硕士学位论文 ( 4 ) t h ei n d u c e dm u t a t i o nb r e e d i n gw a ss t u d i e d e m sh a db e t t e re f f e c tc o m p a r e d w i t hu l t r a v i o l e tm u t a t i o n l i p a s ea c t i v i t yw a sp r o m o t e dt o1 7 8 b ye m sm u t a t i o n a n dc o n t i n u o u sc u l t i v a t i o nf o rt h r e eg e n e r a t i o n f u r t h e rw o r ks h o u l db cd o n et o p r o m o t eg e n e t i cs t a b l eg 5l i p a w i t hh i g ha c t i v i t y ( 5 ) t h ei m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n sf o rg 5l i p a s eb ys i l i c aa l g i n a t e w e r e o p t i m i z e d ：t h ei m m o b i l i z a t i o ns y s t e mc o n t a i n e dp h7 0p h o s p h a t eb u f f e r , p r o p o r t i o n o fa m o u n to fe n z y m ea n ds i l i c aa l g i n a t e ( 1 ：1 0 ) ，t h ei m m o b i l i z a t i o ns y s t e mw a ss t o o d a t3 7 c w i t ht h es i l i c aa l g i n a t e i m m o b i l i z e dl i p a s e ，t h ec a t a l y t i ce f f i c i e n c yf o r b i o d i e s e lp r o d u c t i o ni ns o l v e n t - f l e ea n dn o n a q u e o u ss y s t e m sw a si n v e s t i g a t e d g 5 l i p a s es h o w e dt r a n s e s t e r i f i c a t i o na c t i v i t yu s i n gp l a n to i l si n c l u d i n gw a s t ef r i e do i l s a n da l c o h o l 鹪s u b s t r a t e s t h et r a n s e s t e r i f i c a t i o na c t i v i t yi nn o n a q u e o u ss y s t e mw a s b e t t e rt h a nt h a ti ns o l v e n t - f r e es y s t e m ( 6 ) g 5l i p a s ew a sp u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yc o n f i r m e db ys d s p a g eb yas e r i e s o fs t e p si n c l u d i n ga m m o n i u ms u l p h a t ef r a c t i o np r e c i p i t a t i o n , u l t r af i l t r a t i o n , a n i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y m o l e c u l a rw e i g h to fg 5 l i p a s ew a s6 1 1 k d k e yw o r d s ：g e o t r i c h u ms p ；l i p a s e ；i m m o b i l i z a t i o nb ys i l i c aa l g i n a t e ； t r a n s e s t e r i f i c a t i o n ；s o l v e n t - f r e es y s t e m ；p u r i f i c a t i o n t 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 脂肪酶( 1 i p a s e ，e c3 1 1 3 ，甘油酯水解酶) ，能够分解生物产生的各种天然 的油和脂肪，它们是一类特殊的酯键水解酶，主要水解由甘油和1 2 个碳原子以 上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，发生水解的部位是油脂的酯键。在不同 的水解阶段，可分解生成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯及甘油，水解反应过程可 由下列公式表示： 甘油三酯! ；篡甘油二酯+ 脂肪酸；争甘油单酯+ 脂肪酸；兰甘油+ 脂肪酸 脂肪酶在动植物各种组织及许多微生物中存在。它是最早研究的酶类之一， 已有上百年的历史。动物和植物脂肪酶于十九世纪被首次报道，微生物脂肪酶则 在本世纪初才被微生物学家z i j j k m a n n 发现，他报道一些细菌能够产生和分泌脂 肪酶，从此揭开了微生物脂肪酶研究的序幕。几乎所有的微生物都有合成脂肪酶 的能力，只是合成能力大小不同，由于微生物脂肪酶种类多、来源广、周期短， 具有比动植物脂肪酶广的p h 、作用温度范围以及对底物的专一性类型，又便于 进行工业化生产和获得高纯度制剂，所以比动植物脂肪酶在酶理论研究和实际应 用中有着更重要的作用( v a n e t et ，1 9 9 9 ：k c l a u s e n ，2 0 0 0 ；l i n k o ，y ，1 9 9 8 ； r d s c h m i d 。1 9 9 8 ；s v e np a n k e ，2 0 0 2 ；r k s a x e n a ；d e w e yd y ，2 0 0 0 ；彭立 凤，2 0 0 0 ) 。表1 1 列出了几种典型的商品化脂肪酶及在生物技术产业方面的应 用。 一 表1 - 1几种典型的商业化脂肪酶及在生物技术产业方面的应用 山东大学顾十学位论文 1 1 脂肪酶的分子催化机理 随着分子生物学技术的飞速发展，有关脂肪酶分子水平上的的研究也有了很 大进展。迄今为止，已克隆了包括微生物和动植物脂肪酶在内的许多脂肪酶基因， 测定了它们的核苷酸序列，确定了这些酶的氨基酸一级结构( j o r g e a n s e ns e ta 1 ， 1 9 9 1 ：b a t e n b u r g a m e ta 1 ，1 9 9 0 ；s c h r a gj d e ta i ，1 9 9 1 ；h o w a r dw o n g ，2 0 0 2 ；n r k a m i n i ，2 0 0 0 ) 。 研究表明多数脂肪酶都是糖蛋白。其糖基部分约占分子量的2 扣1 5 ，以 甘露糖为主，整个分子由亲水部分和疏水部分组成，活性中心靠近分子的疏水端。 酶分子空间结构的中央是一个疏水的b 折叠，其周围包绕着两亲的o 【螺旋，其催 化活性中心为一催化三联体，构成此催化三联体的三个氨基酸以高度保守的几何 取向位于中央d 折叠一侧的“环( 1 0 0 p ) ”中。大多数脂肪酶还有一个可移动的“盖 子( 1 i d ) ”，这个“盖子”是由两个短的0 螺旋构成，并通过一个灵活可动的结构 连接到脂肪酶分子主体上，在脂肪酶未活化时会盖住“环”中的活性催化部位( 见 图1 1 ) 。当脂肪酶与界面相接触时，覆盖活性中心的a 一螺旋发生了移动，通过 在丝氨酸残基的周围产生一个亲电子域，从而导致脂肪酶的构象改变，此亲电子 域通过疏水残基的暴露和亲水残基的包埋来形成。结构上的这些改变都会增强酶 对脂类底物复合物的亲和性，并能够稳定催化过程的过渡态中间产物。在脂肪酶 的催化过程中，界面的形成是至关重要的，即使是在疏水溶剂中，酶分子的结构 中通常也要存留一定量的水分，活性位点附近的这一水层是酶具有界面反应活性 所必需的( v i c t o rmb ，1 9 9 6 ：a l l a ns v e n d s e n ，2 0 0 0 ；k e j a e g e r ，1 9 9 9 ) 。 对脂肪酶活性中心的研究发现，s e r - a s p h i s 组成了有催化作用的三联体， 人胰脂肪酶( h p l ) 、米赫根毛霉r h i z o m u c o rm i e h e i 脂肪酶( r m l ) 的立体结构也 证明了这种三联体的存在( b r a d ye ta 1 ，1 9 9 0 ) 。地霉g e o 驴w h u ms p 脂肪酶的三联 体稍有不同，是s e r - g l u - h i s ，即g l u 取代了a s p 。上述3 种脂肪酶中，活性中 心丝氨酸残基的侧链构象在空间结构方面与丝氨酸蛋自酶的非常相似，所不同的 是脂肪酶的活性中心隐藏在酶蛋白分子内部。脂肪酶的活性中心是丝氨酸残基， 山东大学颂七学位论文 在正常情况下h p l ，r m l 的活性中心被亲水性的短a 螺旋覆盖，而g e o t r i c h u m s p 脂肪酶的活性中心被两个平行的o 【一螺旋覆盖( s c h r a gj d e ta 1 ，1 9 9 1 ：b r a d y l ，1 9 9 0 ：d n r u b i n g h ，1 9 9 7 ；k a w a u g u c h iy ，1 9 8 9 ) 。 图1 1 脂肪酶结构( 以t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s a 脂肪酶模型为代表) b 一折叠为蓝色，由许多螺旋所包围( 黄色) ，红色棒状为活性位点丝氨酸残基， 盖子( 1 i d ) 由红色表示盖子打开和芙闭结构分层表示 1 2 脂肪酶的底物特异性 脂肪酶多功能催化作用的开发很大程度上取决于它对底物的作用方式，即以 它的底物特异性为基础( d a v r a n o vk ，1 9 9 4 ) 。而底物特异性又与酶分子的结构， 特别是酶活性中心的结构、底物的结构以及影响酶结合到底物上的因素和其他影 响酶活性的因素有关。对各种脂肪酶同工酶的分离纯化和性质研究表明，不同的 同工酶具有不同的生化性质和底物专一性。各种不同基因的表达和( 或) 翻译后 修饰直接导致了多种同工酶的存在。脂肪酶的空问结构具有高度的相似性，所有 的脂肪酶都属于o a l 3 型水解酶家族，但是由于来源不同，其结构上的一些差异使 它们对不同底物的特异性也不同，具体说来，脂肪酶的底物特异性包括三个主要 山东大学硕- 1 。学位论文 方面：位置特异性、脂肪酸特异性，立体特异性。 1 2 1 位置特异性 位置特异性是脂肪酶的一个重要特性，它是指酶底物甘油三酯中s n - 1 ( 或3 ) 和s n - 2 位酯键的识别和水解能力的不同。目前已知关于位置特异性，有两种类型 的脂肪酶存在，一种是水解s n - 1 和3 位脂肪酸的脂肪酶( 称为a 型) ，另一种是水 解所有位置的脂肪酸( 称为a d 型) 。大多数脂肪酶作用于三酰甘油的初级位( 1 ， 3 位) 酯键( 伍型) ；但黄曲霉、黑曲霉和圆弧青霉等脂肪酶无位置专一性，即能 水解初级和次级位( 2 位) 的酯键( o 【d 型) ( b e n 2 0 n a n ag ，1 9 7 1 ) ；白地霉脂肪 酶则表现出另一种特殊的专一性，即专一作用于油酸所形成的三酰甘油的酯键( 0 【 型) ( m a t o r i ，1 9 9 1 ) 。 、 1 2 2 脂肪酸特异性 脂肪酸特异性是指酶对不同的脂肪酸( 碳链长度和饱和度不同) 所表现出的 特殊反应性，不周来源的脂肪酶水解甘油三酯的脂肪酸特异性有很大差异。例如， 圆弧青霉( p e n i c i l l i u mc y c l o p i u m ) 脂肪酶对短链脂肪酸( c s 以下) 、黑曲霉 ( a s p e r g i l l u sn i g e ) 脂肪酶对中等链长脂肪酸( c 8 一c n ) 以及白地霉( g e o t r i c h u m c a n d i d u m ) 脂肪酶对油酸甘油酯表现出强的特异性( j e n s e nr g ，1 9 7 4 ：岩井美枝 子，1 9 8 9 ) 。猪葡萄球菌s t a p h y l o c o c c u sh y i c u s 脂肪酶偏爱磷脂为底物，也可以水 解脂肪酸链长短不一的各种油脂；相反，金黄色葡萄球菌s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 脂肪酶专一作用于短链脂肪酸所形成的三酰甘油，而中、长链脂肪酸形成的三酰 甘油以及磷脂很难被水解。另外还存在一类较特殊的脂肪酶，它仅作用于单酰或 二酰甘油，而对三脂酰甘油完全不起催化作用，但它与三酰甘油脂肪酶 ( t r i a e y l g l y e e r o ll i p a s e ) 一起使用时，能协助或加速三脂酰甘油的彻底水解，被称 为单双脂酰甘油脂肪酶( m o n o d i a c y l g l y c e r o ll i p a s e ) 。例如，来源于沙门柏干酪青 霉n h c i l l i u mc a m e m b e r t i iu 2 1 5 0 和米曲霉a s p e r g i l l u so r y z a e 的脂肪酶就属于这 一类脂肪酶。 此外，某些脂肪酶对底物中不饱和脂肪酸的双键位置也呈现不同反应性，如 白地霉脂肪酶对c i s 9 一c 1 8l 酸和c i s 9 c 1 82 、e i s 1 2 一c 1 8 ：2 不饱和脂肪酸表现出特异 水解活性( 曹淑桂，1 9 9 5 ；m a t sh o l m q u i s t ，1 9 9 8 ) 。 山东大学预十学位论文 1 2 3 立体特异性 立体异构特异性是指酶作用的底物应具有特定的立体结构才能被催化。这种 异构性包括光学异构性和几何异构性。 1 3 脂肪酶的催化特性 几十年来，人们一直认为脂肪酶只能在水溶液中催化甘油三酯的水解反应， 但自从1 9 8 4 年美国k l i b a n o v a m 发现脂肪酶在有机介质中具有很高的活性( 也 就是超活性) 以来，脂肪酶的新特性、新用途就不断地被发现。与其他水解酶类 相比，脂肪酶具有以下主要的作用特点( d a v r a n o vk1 9 9 4 ；m a n t l e dt ，2 0 0 2 ) ： ( 1 ) 与其他多数水解酶的催化特性不同，脂肪酶催化的反应是在一种非均相 体系底物( 水不溶性) 和水的界面上催化底物反应，对均匀分散的或水溶性底物 不作用。脂肪酶在油_ 水界面上被激活的比率很高，可达( 水解活力) 的1 0 倍以上。 ( 2 ) 具有化学选择性和高度立体异构专一性。 脂肪酶能够辨别外消旋体中的两种对映体，并且能够以不同的反应速率选择 性催化两种对映体的转化反应，因而当底物为消旋体时，可利用脂肪酶的这种立 体选择特性进行动力学拆分得到高产率的光学活性产物。 ( 3 ) 酶催化反应时不需要辅酶。 依据脂肪酶在非均相体系中表现出的高催化活性，人们开始利用非水相中的 脂肪酶催化完成各种有机合成及油脂改性反应，如酯化、酸解、醇解、转酯、羟 基化、甲基化、环氧化，氨解、酰基化、开环反应、聚合等反应。 r l c o o h + r 2 c o hhr l c o o r 2 + h 2 0( 酯化反应) r l c o o r 2 + r 3 0 h hr l c o o r 3 + r 2 0 h( 醇解反应) r i c o o r 2 + r 3 c o o hh r l c o o r 3 + r 2 c o o h( 酸解反应) r l c o o r s + r 3 c o o r 4hr i c o o r 4 + r 3 c o o r 2( 转酯反应) 1 4 脂肪酶在非水相介质中的催化 1 4 1 非水相催化特性 制药、精细化工、食品和香料等工业中许多高附加值的产品是水不溶性的。 同时，许多有用化合物是用普通化学合成方法难以或无法合成的。为了生产和纯 化这些产品，人们把目光投向了利用脂肪酶在非水相介质( n o n a q u e o u sm e d i a ) q 】 山东大学坝士学位论文 催化生物化学反应的方法( c h a t t e i j e et ，1 9 9 8 ；l a n d e r e t a l ，1 9 8 4 ；m a u g a r d t ，1 9 9 7 ； 高修功，1 9 9 8 ) 。脂肪酶在非水相介质中的反应由于有机溶剂对酶的构象及催化环 境的影响，酶催化的性质及特点发生了明显的变化。在非水相介质中，酶促反应 具有以下几个重要特性( b u r k c l 9 8 9 ，a d r i ej ，1 9 9 9 ；k l i b a n o va m ，1 9 9 0 ；a s h o k p a n d e y ，2 0 0 4 ；e m a n d e r s o n , 1 9 9 8 ) ： ( 1 ) 酶分子中肽链某一部分的折叠和去折叠以及酶一底物复合物形成过程中， 将发生许多微环境上的变化，如氢键的形成或断裂等，这种过程由于水的 存在而增强。酶在非水介质中由于水分子的减少，相对来说酶分子的构象 表现出比水溶液中更具有“刚性”特点。因而人们可能通过选择不同性质 的溶剂来调控酶的某些特性。例如在有机溶剂中，可以利用酶与配体的相 互作用性质，诱导改变酶分子的构象，调控酶的底物专一性、立体选择性 和手性选择性等。 ( 2 ) 在适当的条件下，可以改变酶促反应的热力学平衡向有利于合成方向( 而不 是水解方向) 进行。因此可以利用脂肪酶在非水相介质中催化进行酯、聚酯、 内酯、酰胺和肽等化合物的合成。 ( 3 ) 由于引起酶变性的许多因素都与水的存在有关，因此在非水相介质中酶的 稳定性得到显著提高。 ( 4 ) 由于有机溶剂的存在，水量减少，大大降低了许多需要水参与的副反应， 如酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基转移等。 ( 5 ) 在非水相介质中进行的酶促反应，可以省略产物的萃取分离过程，提高收 率。 ( 6 ) 脂溶性底物和产物在有机溶剂中的高度溶解性，有利于提高底物浓度总的 水平。同时由于底物和产物的高脂溶性，使它们在酶分子表面的实际浓度 较低，可以减少底物或产物对酶引起的抑制作用。 ( 7 ) 在有机溶剂存在的情况下，一般不存在微生物污染问题。 ( 8 ) 由于酶不溶于有机溶剂中，所以反应体系是一个非均相反应体系。酶进行 固定化处理后，将使反应体系更加简单，酶的重复使用更加方便。 目前非水相介质中的酶催化反应的研究越来越受到各国研究者的重视，并成 功应用到了多肽合成、聚合物合成、药物合成、立体异构体拆分及油脂改性等领 山东大学硕十学位论文 域。 1 4 2 脂肪酶在非水相介质中催化的应用 1 4 2 1 在油脂改性中的应用 近年来，随着非水酶学的发展，在油脂加工、改良生产具有多不饱和的脂肪 酸的甘油酯、可可脂、色拉脂的工艺中，酶催化已逐步替代化学催化( s a l w a k a t b o u n e ，2 0 0 5 ；u t b o r n s c h c u e r ，1 9 9 9 ) 。表卜2 给出了脂肪酶催化油脂改性的应 用实例( g h o s hs ，1 9 9 7 ；s g h o s h ，1 9 9 7 ；彭立风，2 0 0 0 ；宋欣，2 0 0 0 ) 。 表l - 2 脂肪酶催化油脂改性的应用 1 4 2 2 在手性化合物制备中的应用 。 手性化合物的制备一直是有机合成的难题，非水介质中酶催化反应的发展提 供了一种合成手性化合物的新方法。脂肪酶在有机溶剂中对某些手性化合物表现 出高度的立体选择性，因而在手性化合物的拆分及催化合成等方面显示出广阔的 应用前景。脂肪酶催化合成手性化合物的基本类型有两个：( 1 ) 前手性底物的反 应；( 2 ) 外消旋化合物的动力学拆分。脂肪酶催化不对称合成反应可制备具有光 山东大学硕_ 卜学位论文 学活性的醇、脂肪酸、内酯等医药、农药中间体。近年来，已有不少关于利用脂 肪酶拆分外消旋布洛芬和萘普生的报道( d u c r e ta m e l i e ，1 9 9 8 ；a n n i k k a , 1 9 9 2 ；g u n h ，1 9 9 3 ) 。柱状假丝酵母的胞外脂肪酶( c a n d i d ac y l i n d r a c e al i p a s e ，c c l ) 固定 化后在柱反应器中用于拆分萘普生甲酯具有很好的立体选择性，可大规模生产( s ) 一( + ) 萘普生。 1 4 2 3 在肽合成的应用 低聚肽具有广泛的用途，在有机介质中除蛋白酶外，脂肪酶也能够催化多肽 合成。c h e n 等发现，在有肟存在的酶促合成肽的反应中，脂肪酶可以在甲苯或异 丙醚中催化n 2 保护的氨基酸或者肽的酰基与肟发生转酯反应生成一种活泼酯( 酰 基肟) ，此活泼酯再与非天然的或天然的氨基酸衍生物形成肽键，其中非天然氨 基酸可以是d p r o ，m e - g l y ，m e - a l a , p h e ( 2 一m e ) 等，是合成含非天然氨基酸衍生物 的一种有效途径。然而由于脂肪酶不具备蛋白酶所具有的对氨基酸的严格底物专 一性，因此在选择性肽类的合成上受到限制( 彭立凤，1 9 9 9 ) 。 1 4 2 4 在高分子合成中的应用 目前被广泛应用的人工合成高分子材料，绝大多数都是非生物降解或不完全 生物降解的材料，它们的使用造成了1 7 益严重的环境问题。因此，应用酶催化法 合成可以被微生物或细菌降解的高分子材料，越来越受到人们的重视。 脂肪酶不但可以催化羟基脂肪酸的环化形成内酯，也可以催化内酯的开环聚 合以及二羧酸与多元醇化合物的缩合反应形成聚合物。我国的曹淑桂教授用荧光 假单胞菌p s e u d o m o n o sf l u o r e s c e n s 脂肪酶和c c l 在6 0 c 条件下直接催化- 已内 酯、d 丁内酯、6 - 壬内酯聚合，分子量达到2 5 k d 。美国的学者m a c d o n a d 币u 用猪 胰脂肪酶催化已内酯在二氧六环、甲苯、庚烷等溶剂中开环聚合，反应温度6 5 ，单体含量为1 0 ，利用正丁醇作为亲核供体，得到聚酯的分子量为2 7 0 0d ( 罗 贵民，2 0 0 3 ) 。 表1 - 3 脂肪酶有机相催化反应的应用 应用举例 物质合成 油和脂肪的精制 肽的合成 羧酸和酯 棕榈油转化为可可油 脂肪水解 青霉素g 前体肤的合成 山东大学顼t 学位论文 外消旋混合物的分离 聚合 专一性合成 酸的外消旋混合物 醇的外消旋混台物 二酯和_ 二醇的选择性聚合 甘醇的酰基化 醇、甘油衍生物、糖和有机金属化合物的合成 近几十年来，脂肪酶在非水相催化中表现出的独特的催化能力引起人们的极 大兴趣，不仅在上述传统的催化领域中发挥越来越大的作用，也开始有许多新的 用途不断地被人们发现和开发应用近年来，由于能源危机已经成为一个世界性 的难题，人们开始致力于开发新的可再生性生物能源，脂肪酶在非水相介质中催 化转酯化反应生产生物柴油是目前各国学者研究的热点 1 5 生物柴油概述 近年来，随着石油储量的日益减少，以及人们对环境的关注，环境污染和能 源危机已成为当今世界上普遍存在的两个重大问题。开发新的对环境友好的可再 生清洁能源日益得到各国的重视，世界上许多国家都对生物柴油进行了开发与利 用针对我国石油资源有限，将长期依赖进口石油的国情，我国能源领域的著名 专家指出：发展立足于本国原料，大规模生产替代液体燃料一生物柴油，对增强 国家石油安全具有十分重要的战略意义( m o h a m e dm ，2 0 0 3 ；刘广志，2 0 0 3 ) 生物柴油，又称燃料甲酯，脂肪酸甲酯( f a m e ) ，属于可再生能源的一种 是由甲醇或乙醇等醇类物质与大豆油、蓖麻油、棕榈油、蔗渣等天然植物油或动 物脂肪等油脂类物质中主要成分甘油三酯发生酯交换反应。利用甲氧基取代长链 脂肪酸上的甘油基，将甘油基断裂为三个长链脂肪酸甲酯与甘油三酯相比，脂 肪酸甲酯碳链长度减短，油的粘度降低，其性能与零号柴油相近，只是燃烧热值 稍低，但可与石化柴油调配来克服生物柴油具有下列优点( m a c l e a n , 2 0 0 0 ； m c c o r m i c kr l 。2 0 0 l ；s h a i n e t y s o n , 1 9 9 7 ) ： ( 1 ) 采用生物柴油尾气中有毒有机物排放量仅为普通石化柴油的i 1 0 ，颗粒物 为普通柴油的2 0 ，s 0 2 释放也明显降低，生物柴油的优良性能使得采用 生物柴油的发动机废气捧放指标满足欧洲i i i 号捧放标准，是对环境友好的 清洁能源 ( 2 ) 无须改动柴油机可直接添加使用，同时无需另添设加油设备、储存设备 山东夫学顾l 学位论文 及人员的特殊技术训练( 通常的替代燃料均须修改引擎才能使用) ； ( 3 ) 生产生物柴油的同时，可获得其副产物一高附加值的甘油；用大豆油生产 生物柴油的同时，还能够制造可生物降解润滑油、清洁溶剂、工业溶剂等； ( 4 ) 生物柴油还具有比石化柴油更好的润滑性能，从而延长机动车的寿命： ( 5 ) 发展生物柴油可以调整农业产品结构，为农业发展开辟一条新路，增加农 民收入 对于我国来说，发展生物柴油具有尤其重大的意义，因为我们国家的石油储 备量少，从1 9 9 3 年起，我国就成为一个石油净进口国，今后我国对石油的进口量 将逐年增加，预计到2 0 1 0 年，我国石油缺口将达到2 亿吨。用植物油生产柴油， 为保障我国能源安全开辟了一条新途径 1 5 1 生物柴油的应用现状 在欧洲以过剩的菜子油为原料制造生物柴油，与轻油混合使用于柴油机，欧 洲许多城市的公共汽车也已经开始使用生物柴油；在北美则以过剩的豆油为原料 试生产生物柴油：日本植物油资源贫乏，用废食物油为原料，因此生物柴油也称 为再生燃油与发达国家相比，我国生物柴油的研制起步较晚在我国，目前也 已研制成功利用菜籽油、大豆油、米糠下脚料和野生植物小桐籽油等为原料生产 生物柴油的工艺( m af ，1 9 9 9 ) 我国有丰富的植物油脂及动物油脂资源，我国每年 豆油产量达6 0 0 0 万吨，棉籽油作为棉纺工业的副产品，价格低廉。而且餐饮业产 生大量的煎炸废油，如果加以很好利用，有很大的市场潜力 1 5 2 目前生物柴油的生产方法 目前较广泛使用的方法是以碱作为催化剂的化学转酯法，即醇解，是用另一 种醇置换甘油酯中的醇使用的醇是含l 8 个碳原子的级和二级一元脂肪醇， 主要有甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇甲酵和乙醇是应用较多的两种低碳醇， 尤其是甲醇，因为其价格便宜，且其物化性能( 极性短链醇) 有利于反应的进行 可以用于降低甘油三酯的黏度，加强可再生燃料的物化性能以改善发动机性能 因此。由转酯反应得到的脂肪酸甲酯完全可以作为柴油机的替代燃料 虽然利用碱作为催化剂的化学转酯化反应可以在短时阿内使甘油三酯转化 为相应的脂肪酸甲酯并且有较高的转化率，但化学法合成生物柴油有以下缺点： 工艺复杂、醇必须过量，后续工艺必须有相应的醇回收装置，能耗高；游离脂肪 山东大学硕十学位论文 酸和水分阻止反应的进行；酯化产物甘油难于回收：酸或碱催化剂要从产物中分 离；生成过程有废碱液排放( h i d i k if u k u d a , 2 0 0 1 ) 为解决上述问题，人们开始研究用生物酶法合成生物柴油，即用动植物油脂 和低碳醇通过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯及乙酯 ( s h i m a d a , ，1 9 9 9 ；2 0 0 2 ；l a r a , 2 0 0 3 ) 研究发现，胞内和胞外脂肪酶都能在有水或无 水体系中有效催化甘油三酯转酯反应如表1 4 所示，酶法催化转酯反应可以克 服上述弊端，特别是副产物一甘油无需复杂过程即可回收。在脂肪酶催化作用下， 三甘油酯与甲醇的转酯反应动力学表现为连续反应机理( c j s h i e h , 2 0 0 3 ) ，即三 甘油酯和部分甘油酯在酶作用下首先水解，分别生成部分甘油酯和游离脂肪酸， 游离脂肪酸和甲醇反应生成甲酯，这与碱催化不同。在酶催化反应过程中，植物 油中含有的游离脂肪酸可全部转化成甲酯酶法合成生物柴油具有条件温和、醇 用量小、无污染排放等优点 表l - 4 碱催化法与脂肪酶催化生物柴油生产的比较 但目前酶法合成生物柴油主要有以下问题：对甲醇及乙醇的转化率低，一般 仅为4 0 6 0 ，这是由于目前脂肪酶对长链脂肪醇的酯化或转酯化有效，而对 短链脂肪醇如甲醇或乙醇等转化效率低，而且由于短链酵对酶的毒性直接导致了 酶的使用寿命短，不能在大工业生产中反复使用此外，副产物甘油和水难于回 收。不但对产物形成抑制，而且由于甘油对固定化酶有毒性，固定化酶使用寿命 较短( y o m iw a t a n a b e ，2 0 0 2 ；韩德奇，2 0 0 2 ) 。以上问题也造成了目前酶法合成生物 柴油的成本相对较高，如何开发价廉低成本的生物柴油，仍在探索之中我国在 这方面的研究尚不太多通过大量筛选脂肪酶产生菌，利用脂肪酶在非水相催化 山东大学硕士学位论文 领域的优势，寻找能够催化脂肪酸高效酯化的脂肪酶，进行生物柴油的生产条件 的探索性研究，是我们目前要解决的问题 1 6 应用脂肪酶法制各生物柴油 各种直链醇或支链醇，包括伯醇( 甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丁醇) ，仲 醇( 异丙醇、2 丁醇) ，都可以用于脂肪酶催化转酯反应( 如表1 5 ) 。l i n k oe t a l 指出，在转酯化菜籽油和2 乙基1 己醇的反应中，用皱褶假丝酵母c a n d i d a r u g o s a 脂肪酶粉可以获得9 7 的转化率。d ee ta 1 发现在无溶剂体系中用固定 化米赫毛霉m u c o rm i e h e i 脂肪酶可转化脂肪醇酯( c 4 c 1 3 1 ) ，相应醇酯的摩尔转 化率达到8 6 8 , - - 9 9 2 在这些例子中，使用m u c o rm & h e i ( s e l m i 1 9 9 8 ) ，c a n d i d a r u g o s a